DE69227769T2 - Verbessertes verfahren und mittel zur bestimmung eines analyten - Google Patents
Verbessertes verfahren und mittel zur bestimmung eines analytenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe und eine Reagenzienzusammensetzung, die bei diesem Verfahren brauchbar ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Reagens mit verbesserter Stabilität wie auch ein Reagens, das einen erweiterten dynamischen Bereich der Änderung der Ansprecheigenschaften oder der Ansprechkurve aufweist.
- Das Hauptanliegen der Klinischen Chemie ist die qualitative und quantitative Bestimmung bestimmter Analyten in Proben. Von spezieller Bedeutung ist die Analyse von Körperflüssigkeitsproben wie Blut, Serum, Urin usw.. Die Bestimmung der Gegenwart und/oder Menge verschiedener Analyten, gefolgt vom Vergleich mit festgelegten Parametern bestimmt die Diagnose von krankhaften oder abnormen Zuständen.
- Die Literatur über analytische Bestimmungen von Körperflüssigkeitsproben ist umfangreich, da in der Fachwelt die Bestimmungen von z. B. Glucose, Cholesterin, Kreatin, Sarcosin, Harnstoff und anderen Substanzen in Blut-, Serum-, Urinproben usw. untersucht wurden.
- Es gibt viele Arten von Assays zur Durchführung derartiger analytischer Bestimmungen. Eine Art Assay beruht auf einer Abfolge von Reaktionen. Die erste Reaktion ist die zwischen einem Analyten und einem Enzym, das für diesen Analyten spezifisch ist. Bei dieser Reaktion "oxidiert" das Enzym den Analyten und veranlaßt ihn, ein Elektron abzugeben. In einer Folgereaktion wird das Elektron von einem Vermittler aufgenommen, der auf diese Art reduziert wird. Der redu zierte Vermittler kann dann in einer Fülle von Indikator- Systemen verwendet werden, um die Gegenwart und die Konzentration des Analyten zu bestimmen.
- Eines dieser Indikatorsysteme ist im gemeinsam übertragenen US-Patent Nr. 4 929 545 beschrieben. Bei diesem System wird ein Eisen(III)-cyanid durch das vom Analyten abgegebene Elektron zu einem Eisen(II)-cyanid reduziert. Das Eisen(II)-cyanid verbindet sich mit einer Eisen(III)-Verbindung unter Bildung einer Färbung. Das Vorliegen und der grad der Farbänderung sind Angaben zur Gegenwart beziehungsweise Konzentration des Analyten in einer Probe.
- Der Grad der Farbänderung kann mit einem Reflexionsphotometer gemessen werden. Das Photometer ist normalerweise ein Teil eines Meßgeräts, bei dem eine interne "Such"-Tabelle oder ein Algorithmus verwendet wird, um die Änderung des Reflexionsvermögens in die Analytkonzentration umzurechnen.
- Bei anderen ähnlichen Systemen wird Ferrocen oder eines seiner Analoga als Vermittler verwendet.
- Ein anderes System für die Verwendung des reduzierten Vermittlers zur Bestimmung der Gegenwart oder Konzentration eines Analyten ist beschrieben in der gemeinsam übertragenen, anhängigen US-Patentanmeldung USSN 07/451 671, eingereicht am 15. Dezember 1989, entsprechend EP 0 505 494 B1. Bei diesem System wird der reduzierte Vermittler durch Anlegen eines Stroms wieder oxidiert, und es wird die Abnahme des Stroms nach einer bestimmten Zeit gemessen und zur Bestimmung der Konzentration des Analyten verwendet.
- Erhöhte Stabilität des den Vermittler enthaltenden Reagens ist bei beiden Systemen stets wünschenswert. Stabilität ist notwendig, um eine wirtschaftlich interessante Haltbarkeitsdauer zu erhalten. Wie bei jedem System, bei dem eine Änderung des Lichtreflexionsvermögens über einen Bereich gemessen wird, ist es auch bei dem in US-Patent Nr. 4 929 545 beschriebenen System wünschenswert, den Bereich zu erweitern. Ein größerer Bereich macht die Inkremente des gemessenen Reflexionsvermögens größer und erhöht somit die Genauigkeit.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Erhöhung der Stabilität eines Reagens, das einen reduzierbaren Vermittler enthält.
- Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Erweiterung des Bereichs der Änderung des Lichtreflexionsvermögens eines Reagens, das einen reduzierbaren Vermittler und eine Komponente enthält, die ihre Farbe aufgrund der Reduktion des Vermittlers ändert.
- Diese und andere Aufgaben werden mit Hilfe einer Reagenzienzusammensetzung gelöst, die einen reduzierbaren Vermittler und ein Oxidationsmittel umfaßt, das die Stabilität des Reagens vor dessen Verwendung bei einer Analyse verbessert und die Reduktion des Vermittlers bei der Ausführung der Analyse nicht merklich stört.
- Weitere Aufgaben dieser Erfindung sind insbesondere:
- - Eine Reagenzienzusammensetzung, die für die Verwendung bei Farbänderungsanalysen zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe geeignet ist und einen erweiterten dynamischen Bereich der Änderung des Lichtreflexionsvermögens und/oder der -extinktion aufweist, umfassend ein Enzym, das auf einen in der Probe vorhandenen Analyten einwirkt, eine lösliche Eisen(III)-cyanid- Vermittlerverbindung, die infolge der Einwirkung des Enzyms auf den Analyten reduziert wird, um eine Farbän derung im Reagens zu bewirken, die der Gegenwart oder Konzentration des Analyten entspricht, sowie etwa 0,9 · 10&supmin;&sup4; bis etwa 17,5 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym eines Alkalimetalldichromats, das in der Reagenzienzusammensetzung löslich ist.
- - Ein Verfahren zur Verbesserung des dynamischen Bereichs der Lichtextinktion einer Zusammensetzung, die zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe brauchbar ist, wobei die Zusammensetzung ein Enzym umfaßt, einen löslichen Eisen(III)-cyanid-Vermittler, der infolge einer Reaktion zwischen einem Analyten und dem Enzym reduzierbar ist, sowie einen Reaktionsteilnehmer, der mit der reduzierten Form des Vermittlers eine Änderung der Lichtextinktion der Zusammensetzung über einen Bereich bewirkt, umfassend die Zugabe eines Alkalimetalldichromats zu der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,9 · 10&supmin;&sup4; bis etwa 17,5 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym, wodurch sich der dynamische Bereich erweitert, über den die Änderung der Lichtextinktion auftritt.
- Die speziellen Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
- Die Erfindung beruht auf der überraschenden und unerwarteten Entdeckung, daß ein derartiges Oxidationsmittel ausgewählt werden kann und das ausgewählte Oxidationsmittel den Bereich der Änderung des Reflexionsvermögens eines Bestandteils erweitert, der seine Farbe infolge der Reduktion des Vermittlers ändert.
- Jedes Oxidationsmittel, das die vorzeitige Reduktion des reduzierbaren Vermittlers hemmt, aber nicht erfolgreich mit der Reduktion des Vermittlers während der Ausführung einer Analyse konkurriert, ist bei der Erfindung brauchbar. Bei der auf Färbung beruhenden Analyse, die in US-Patent Nr. 4 929 545 beschrieben ist, wobei der Vermittler ein Eisen(III)-cyanid ist, der Indikator eine lösliche Eisen(III)-Verbindung wie etwa Eisen(III)-chlorid oder Eisen(III)-sulfat und das Enzym Glucoseoxidase oder Cholesterinoxidase ist, wurde entdeckt, daß ein Alkalimetalldichromat wie etwa Natrium- oder Kaliumdichromat zur Verwendung bei der Erfindung geeignet ist.
- Ein bevorzugtes Reagens zur Verwendung bei einer solchen auf Färbung basierenden Analyse auf Glucose in Blut umfaßt Kaliumeisen(III)-cyanid, eine lösliche Eisen(III)-Verbindung, Glucoseoxidase und Kaliumdichromat in einer Konzentration von Spuren bis zu etwa 17,5 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Glucoseoxidase. Ein solches Reagens hat eine Stabilität, die um ein Mehrfaches größer ist als die desselben Reagens ohne das Dichromat und hat einen erweiterten dynamischen Bereich der Änderung in der fraglichen Region des Reflexionsvermögens.
- Die Wirkungsweise des Oxidationsmittels hinsichtlich verbesserter Stabilität wird nicht völlig verstanden, doch geht man davon aus, daß das Oxidationsmittel Verunreinigungen in den anderen Reagenzienkomponenten oxidiert, die eine vorzeitige Farbänderungen im Indikator verursachen könnten. Es wird auch angenommen, daß das Oxidationsmittel den Vermittler gegenüber der reduzierenden Wirkung von Licht, Wärme und Luftfeuchtigkeit stabilisiert, aber nicht gegenüber der reduzierenden Wirkung des von der Reaktion zwischen Analyt und Enzym gelieferten Elektrons, und überraschenderweise all dies, ohne das Enzym zu inaktivieren.
- Die Wirkungsweise des Oxidationsmittels bei der Erweiterung des dynamischen Bereichs der Reagenziendosis-Ansprechkurve wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht völlig verstanden. Obwohl es ein beobachtetes Phänomen ist, wäre anzunehmen, daß zum Beispiel in der bevorzugten Ausführungsform das Oxidationsmittel den Bereich der Farbänderung einschränkt, weil es auf das reduzierte Eisen(II)-cyanid in der Weise einwirken könnte, daß es die Reaktion zwischen dem Eisen(II)-cyanid und der Eisen(III)-Verbindung, die Berliner Blau ergibt, unterdrückt.
- Durch Experimentieren wurde gefunden, daß Spurenanteile eines Dichromats die Stabilität des Reagens verbessern, daß Mengen von 1,3 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym die Stabilität bei erhöhten Temperaturen um etwa das Zwölffache steigern, und daß Mengen bis zu 17,5 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym verwendet werden können, ohne die Farbentwicklung zu hemmen.
- Auch wurde gefunden, daß Dichromat-Mengen von nur 0,9 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym den dynamischen Bereich der fraglichen Region des Reflexionsvermögens um etwa fünf Prozentpunkte erweitern, was eine Zunahme von etwa 10% in der Größe des Bereichs bedeutet.
- Die Reagenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung findet vorteilhafte kommerzielle Anwendung in der Analyse auf Bestandteile flüssiger Proben. Eine bevorzugte Anwendung ist diejenige in einer Analysenvorrichtung, wie sie etwa beschrieben ist in einer gemeinsam anhängigen, gemeinsam übertragenen Patentanmeldung, hiermit eingereicht am gleichen Datum wie USSN 07/661 788, eingereicht von Ralph McCroskey et. al. am 27. Februar 1991, nunmehr US-Patent Nr. 5 272 895, wobei das Reagens auf einen Träger in einem neuartigen Teststreifenaufbau aufbeschichtet ist. Bei dieser Ausführungsform kommt die Reagenzienschicht mit Vollblut in Berührung, das mit vorbestimmtem Volumen an die Reagenzienschicht gehalten wird.
- Die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen erläutert, die erklärend aber nicht einschränkend sein sollen.
- Die Teststreifen wurden hergestellt und eingesetzt, um die Anwendung der Erfindung bei Assays mit Hilfe des Reflexionsvermögens zu zeigen.
- Es wurde eine Beschichtungsmasse hergestellt, die pro Kilogramm Beschichtungsmasse 30 g 4-Aminobuttersäure, 3,9 g Eisen(III)-sulfat, 36 g Eisen(III)-cyanid-Salz und 1000 kE Glucoseoxidase enthielt. Nichtreaktive Bestandteile, die den Rest der Masse ausmachten, umfaßten TiO&sub2; als Weißpigment, TWEEN®-20 (nichtionisches Tensid), PROPIOFAN® 70D (Filmbildner) und NATROSOL® (Verdickungsmittel). Der pH dieser Masse war 4,1.
- Kaliumdichromat wurde in Konzentrationen im Bereich von einer Spur bis 17,52 · 10&supmin;&sup4; Gramm aliquoten Teilen der Beschichtungsmasse zugesetzt, wie in den nachstehenden Tabellen 1a und 1b gezeigt. Einige der aliquoten Teile wurden dann beschleunigten Abbautests in einer Wärmebelastungskammer unterzogen. Durch das beschleunigte Testen wird das Reagens erhöhten Temperaturen ausgesetzt, um so die normale Gebrauchsfähigkeitsdauer vorherzusagen.
- Nach der Belastung wurden die aliquoten Teile auf Stabilität geprüft. Eine Farbänderung im Reagens vor Kontakt mit einer flüssigen Probe, die einen für das Enzym spezifischen Analyten enthält, zeigt Instabilität und verkürzte Gebrauchsfähigkeitsdauer an. Die Konzentrationen an Dichromat in den verschiedenen aliquoten Teilen, die Dauer des Tests, die erhöhte Temperatur der Belastungskammer und die resultierende Zunahme der Gebrauchsfähigkeitsdauer gegenüber dem Aliquot ohne Dichromat sind in nachstehender Tabelle 1a gezeigt. Die Beobachtungen zeigen, daß sich die Stabilität bei Zugabe eines Dichromats bereits in Spurenmengen bedeutend verbessern kann, während größere Mengen die Stabilität für längere Zeiten verbessern.
- Weitere aliquote Teile wurden Proben einer Glucose enthaltenden Kontrollösung zugesetzt, die Glucose im gleichen Bereich wie normales menschliches Blut enthielt. Tabelle 1b zeigt die Dichromat-Konzentrationen der verschiedenen aliquoten Teile und gibt an, ob die Farbentwicklung annehmbar oder gehemmt ist. Die Ergebnisse zeigen, daß das Dichromat die Farbentwicklung des Reagens nicht hemmt, bis relativ hohe Konzentrationen erreicht sind.
- Dichromat-Konzentration (Gramm/kE Enzym) Stabilität (standardisiert)
- 0 x bei 25ºC. y bei 35ºC.
- Spur 3x 3y
- 0,4 · 10&supmin;&sup4; 5x 8y
- 1,3 · 10&supmin;&sup4; 6x 12y
- Dichromat (Gramm/kE Enzym) Farbleistung
- 4,83 · 10&supmin;&sup4; annehmbar
- 8,76 · 10&supmin;&sup4; annehmbar
- 13,14 · 10&supmin;&sup4; annehmbar
- 17,14 · 10&supmin;&sup4; Farbentwicklung
- verlangsamt.
- Dieser Versuch zeigt, daß der Zusatz eines löslichen Dichromats zu einem Reagens, welches einen Vermittler, ein für einen Analyten spezifisches Enzym und einen Indikator enthält, der mit der reduzierten Form des Vermittlers eine Färbung ergibt, die Stabilität des Reagens verbessert, ohne das Enzym zu inaktivieren und ohne die Farbentwicklung über einen brauchbaren Konzentrationsbereich zu unterdrücken.
- Es wurden Teststreifen angefertigt und eingesetzt, um die Verbesserung bezüglich des Änderungsbereichs im Reflexions vermögen aufzuzeigen, wenn das Dichromat-Oxidationsmittel dem Reagens zugesetzt wird.
- Zwei Ansätze Teststreifenreagens wurden hergestellt wie in Beispiel 1. Der eine Ansatz enthielt kein Dichromat und der andere Ansatz enthielt etwa 0,9 · 10&supmin;&sup4; Gramm Dichromat pro kE Enzym.
- Jeder Ansatz wurde in aliquote Teile aufgeteilt und auf transparente Trägerschichten aufbeschichtet, die Teil der Teststreifen waren. Die mit dem jeweiligen Reagensansatz hergestellten Teststreifen wurden Proben einer Glucoselösung ausgesetzt, die unterschiedliche Konzentrationen an Glucose enthielten. Die Schichten wurden dann von der der beschichteten Seite gegenüberliegenden Seite mit einem Reflexionsphotometer abgetastet. Die Bereiche des Lichtreflexionsvermögen bei 660 nm für das Reagens, das Dichromat enthielt, und für das Reagens, welches kein Dichromat enthielt, sind in nachstehender Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
- Dieser Versuch zeigt, daß der Zusatz des Dichromats zum Reagens den dynamischen Bereich der Änderung des Reflexionsvermögens um fünf Prozentpunkte erweitert, was eine Zunahme von etwa 10 Prozent in der Größe des Bereichs bedeutet.
Claims (20)
1. Reagenzienzusammensetzung, die für die Verwendung bei
Farbänderungsanalysen zur Bestimmung eines Analyten in
einer flüssigen Probe geeignet ist und einen
erweiterten dynamischen Bereich der Änderung des
Lichtreflexionsvermögens und/oder der -extinktion aufweist,
umfassend ein Enzym, das auf einen in der Probe
vorhandenen Analyten einwirkt, eine lösliche Eisen(III)-
cyanid-Vermittlerverbindung, die infolge der Einwirkung
des Enzyms auf den Analyten reduziert wird, um eine
Farbänderung im Reagens zu bewirken, die der Gegenwart
oder Konzentration des Analyten entspricht, sowie etwa
0,9 · 10&supmin;&sup4; bis etwa 17,5 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym eines
Alkalimetalldichromats, das in der
Reagenzienzusammensetzung löslich ist.
2. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das
Enzym Glucoseoxidase oder Cholesterinoxidase ist.
3. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das
Enzym Glucoseoxidase ist und das Alkalimetalldichromat
Natriumdichromat oder Kaliumdichromat ist.
4. Reagenzienzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die
lösliche Eisen(III)-cyanid-Verbindung in Gegenwart der
Reaktion zwischen dem Enzym und dem Analyten unter
Bildung einer Eisen(II)-cyanid-Verbindung reduzierbar ist,
des weiteren umfassend eine lösliche
Eisen(III)-Verbindung, die mit einer Eisen(II)-cyanid-Verbindung
reagiert, um ein visuell oder optisch erfaßbares
Reaktionsprodukt daraus zu bilden, welches die
Licht
extinktion der Reagenzienzusammensetzung relativ zur
Konzentration des Analyten verändert, sowie einen
Puffer, der die Bildung des Reaktionsprodukts nicht
verhindert, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa
3,0 bis etwa 7,0 aufweist.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das
Alkalimetalldichromat Natriumdichromat oder Kaliumdichromat
ist.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Enzym
Glucoseoxidase oder Cholesterinoxidase ist.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Enzym
Glucoseoxidase ist und das Alkalimetalldichromat
Kaliumdichromat ist.
8. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 4, die auf
einen Träger aufbeschichtet ist.
9. Verfahren zur Verbesserung des dynamischen Bereichs der
Lichtextinktion einer Zusammensetzung, die zur
Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration eines
Analyten in einer flüssigen Probe brauchbar ist, wobei
die Zusammensetzung ein Enzym umfaßt, einen löslichen
Eisen(III)-cyanid-Vermittler, der infolge einer
Reaktion zwischen einem Analyten und dem Enzym reduzierbar
ist, sowie einen Reaktionsteilnehmer, der mit der
reduzierten Form des Vermittlers eine Änderung der
Lichtextinktion der Zusammensetzung über einen Bereich
bewirkt, umfassend die Zugabe eines
Alkalimetalldichromats zu der Zusammensetzung in einer Konzentration
von etwa 0,9 · 10&supmin;&sup4; bis etwa 17,5 · 10&supmin;&sup4; Gramm pro kE Enzym,
wodurch sich der dynamische Bereich erweitert, über den
die Änderung der Lichtextinktion auftritt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Enzym
Glucoseoxidase oder Cholesterinoxidase ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das
Alkalimetalldichromat Natriumdichromat oder Kaliumdichromat ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Enzym
Glucoseoxidase ist und das Alkalimetalldichromat
Kaliumdichromat ist.
13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die lösliche Eisen-
(III)-cyanid-Verbindung in der Zusammensetzung in
Gegenwart der Reaktion zwischen dem Enzym und dem
Analyten unter Bildung einer Eisen(II)-cyanid-Verbindung
reduzierbar ist, wobei die Zusammensetzung des weiteren
eine lösliche Eisen(III)-Verbindung umfaßt, die mit
einer Eisen(II)-cyanid-Verbindung reagiert, um ein
visuell oder optisch erfaßbares Reaktionsprodukt zu
bilden, sowie einen Puffer, der die Bildung des
Reaktionsprodukts nicht verhindert, wobei die
Zusammensetzung einen pH von etwa 3,0 bis etwa 7,0
aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das
Alkalimetalldichromat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Kaliumdichromat und Natriumdichromat.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Enzym
Glucoseoxidase oder Cholesterinoxidase ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Enzym
Glucoseoxidase ist und das Alkalimetalldichromat
Kaliumdichromat ist.
17. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, der mit dem
Enzym der Zusammensetzung nach Anspruch 4 in einer
flüssigen Probe reagiert, umfassend das Zusammenbringen
der flüssigen Probe mit der Zusammensetzung nach
Anspruch 4 und das Bestimmen der Bildung des
Reaktionsprodukts als Maß für den Analyten.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die flüssige Probe
eine Körperflüssigkeit ist.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Analyt Glucose
oder Cholesterin ist.
20. Analytisches Element, das zur Bestimmung eines Analyten
in einer Probe brauchbar ist, umfassend
(a) einen Auflageträger
(b) eine auf den Auflageträger aufgebrachte
Reagenzienschicht, wobei die Reagenzienschicht die
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 4 umfaßt.
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