DE69020496T2

DE69020496T2 - Vermessung von Diaphoraseaktivität und Reagenz dazu.

Info

Publication number: DE69020496T2
Application number: DE69020496T
Authority: DE
Inventors: Mihoko Era; Naoko Kenmotsu; Akihiro Shinzaki; Tadao Suzuki
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1989-11-08
Filing date: 1990-11-08
Publication date: 1996-01-25
Anticipated expiration: 2010-11-09
Also published as: US5166049A; DE69020496D1; EP0427252A3; EP0427252B1; EP0427252A2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Messen der Diaphorase-Aktivität unter Verwendung von Nitroblau- Tetrazolium (nachfolgend abgekürzt als NBT) als Substrat und auf Reagenzien zum Messen der Diaphorase-Aktivität. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Diaphorase akkurat und mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diaphorase ist ein Enzym, das die Reduktion eines Pigments mit Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (nachfolgend abgekürzt als NADH) oder Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (nachfolgend abgekürzt als NADPH) katalysiert (die Abkürzung NAD(P)H wird nachfolgend benutzt, um eines der beiden Moleküle NADH oder NADPH zu bezeichnen).
Messungen der Diaphorase-Aktivität wurden generell durch colorimetrische Analyse der Veränderungen in der Absorption ausgeführt, die bei der Reduktion von Pigmenten auftreten. Pigmente, die in Anwesenheit von Diaphorase reduzierbar sind, schließen beispielsweise Dichlorphenolindophenol (nachfolgend abgekürzt DCIP) und NBT ein.
Bei der Verwendung von DCIP als reduzierbares Pigment (Substrat), weist DCIP eine Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm auf und wird mit NAD(P)H zu reduzierter DCIP reduziert, die keine Absorption bei 600 nm aufweist, und die Abnahme der Absorption bei 600 nm wird daher benutzt, um die Diaphorase-Aktivität zu bestimmen (Biochem. J., Vol. 191, S. 457-465 (1980)). Bei dieser Methode ist es erforderlich, die Messung mit einer Pigmentlösung zu beginnen, die eine hohe Absorption aufweist. Daher ist die zu Beginn der Messung vorliegende Absorption bei 600 nm nicht konstant und variiert bei jeder Messung. Weiterhin wird selbst bei Abwesenheit eines Enzyms in der Lösung DCIP von NAD(P)H in einer nichtenzymatischen Reaktion reduziert, wodurch ebenfalls eine Abnahme in der Absorption bei 600 nm hervorgerufen wird.
Alternativ kann die Messung der Diaphorase-Aktivität unter Verwendung von NBT ausgeführt werden durch Messen der Zunahme der Absorption bei 550 nm, und zwar aufgrund der Bildung von Diformazan aus der Reduktion von NBT. Entsprechend sollte jede Pigmentlösung keine Absorption bei 550 nm zu Beginn der Messung aufweisen. Ein Verfahren unter Verwendung von NBT als Substrat erzielt deshalb akkuratere Ergebnisse bei der Diaphorase-Bestimmung als bei Verwendung von DCIP als Substrat. Aus diesem Grund wird, wenn bei der Verwendung von Diaphorase Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig sind, beispielsweise in einem Enzym-Immunoassay, NBT häufiger als DCIP als Substrat benutzt (siehe beispielsweise JP-A-60- 214900 und JP-A-60-58097) (der hier benutzte Term "JP-A-" bedeutet eine nicht geprüfte publizierte japanische Patentanmeldung)).
Trotz der oben beschriebenen Vorteile ist es aber auch bekannt, daß NBT eine Reihe von Nachteilen aufweist, wie etwa die nicht-enzymatische Umwandlung zu Diformazan in Anwesenheit von NAD(P)H, wodurch die Absorption bei 550 nm fortschreitend verstärkt wird. Aus diesem Grund werden bei der Bestimmung der Diaphorase-Aktivität unter Verwendung von NBT eine Diaphorase-haltige Lösung und eine Referenzlösung, die keine Diaphorase enthält, untersucht, um die Zunahme der Absorption in jeder Lösung zu bestimmen, und die Zunahme der Absorption in der Referenzlösung wird von derjenigen in der NBT-Lösung abgezogen. Das heißt, daß der gemessene Wert die Summe der Zunahme der Absorption stammend aus (A) der Enzymreaktion der Diaphorase und (B) der nicht-enzymatischen Reaktion der Referenzlösung ist, so daß die Subtraktion des Werts der Referenzlösung von dem gemessenen Wert akkuratere und genauere Diaphorase-Aktivitäten ergibt. Rine solche Meßmethode jedoch zeigt bei der Bestimmung einer kleinen Menge an Diaphorase das zusätzliche Problem, daß das Verhältnis der Werte der Referenzlösung zu dem real der Enzymreaktion zuzurechnenden Wert hoch wird, so daß der Blindwert (Referenzwert) um ein Vielfaches höher sein kann als der Wert der Enzymaktivität selbst, wodurch es schwierig wird, eine exakte Messung der Diaphorase-Aktivität vorzulegen, selbst wenn eine Referenzlösung benutzt wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden zur Messung der Diaphorase-Aktivität mit erhöhter Genauigkeit, Spezifität und Präzision zur Verfügung zu stellen derart, daß akkurate und präzise Messungen sogar mit sehr geringen Mengen oder Konzentrationen an Diaphorase durchgeführt werden können, indem die Blindwerte unterdrückt und die die Diaphorase-Aktivität anzeigenden Absorptionswerte erhöht werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Reagenzien zur Verfügung zu stellen, die bei den hier beschriebenen Verfahren benutzt werden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Messung der Diaphorase-Aktivität zur Verfügung zu stellen, mit denen die Werte der Diaphorase-Aktivität erhöht werden, um akkurate Werte der Diaphorase-Aktivität mit erhöhter Empfindlichkeit zu erhalten, und in denen die Adsorption von Diformazan an einer Kunststoff-Festphase verringert oder im wesentlichen eliminiert wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Messung der Diaphorase-Aktivität, in denen NBT benutzt wird und in denen die zu bestimmende Lösung EDTA oder ein Salz davon enthält, sowie Reagenzien dafür zur Verfügung zu stellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren und Reagenzien zur Messung der Diaphorase-Aktivität unter Verwendung von NBT in Assay-Lösungen zur Verfügung zu stellen, die EDTA und kationische oberflächenaktive Mittel, umfassend einen geradkettigen, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit zwischen 14 und 28 Kohlenstoffatomen und einer terminalen Trimethylammoniumgruppe (nachfolgend TACD genannt), enthalten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren und Reagenzien zur Verfügung zu stellen, in denen die Blindwerte merklich unterdrückt werden, so daß die Diaphorase-Aktivität mit erhöhter Genauigkeit, Empfindlichkeit und Präzision gemessen werden kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Verfügung zu stellen, in denen eine Kunststoff- Festphase in solchen Meßsystemen verwendet werden kann derart, daß die Adsorption von Diformazan an der der Festphase im wesentlichen eliminiert oder deutlich vermindert wird, so daß Messungen erstellt werden können, die überlegene Genauigkeit, Empfindlichkeit und Präzision gegenüber Verfahren aufweisen, in denen kein EDTA und/oder kein TACD vorliegt.
Die oben dargelegten Aufgaben der vorliegenden Erfindung wurden gelöst durch ein Verfahren zum Messen der Diaphorase- Aktivität, umfassend das Mischen einer Diaphorase-haltigen Probe mit Nitroblau-Tetrazolium, EDTA oder einem Salz davon, mindestens einem der beiden Reagentien Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat und einem oberflächenaktiven Mittel zu einer Assay-Lösung sowie Messen der Zunahme der Absorption in der Assay-Lösung aufgrund der Bildung von Diformazan.
Die oben dargelegten Aufgaben der vorliegenden Erfindung wurden ebenfalls gelöst mit den oben dargelegten Verfahren, bei denen das oberflächenaktive Mittel ein kationisches oberflächenaktives Mittel, umfassend einen unverzweigten, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit zwischen 14 und 28 Kohlenstoffatomen und einer terminalen Trimethylammoniumgruppe, ist.
Die oben dargelegten Aufgaben der vorliegenden Erfindung wurden ebenfalls gelöst durch Reagentien zum Messen der Diaphorase-Aktivität, die eine erste Lösung, eine zweite Lösung, EDTA und ein oberflächenaktives Mittel umfassen, wobei die erste Lösung wenigstens eines der beiden Reagentien Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid und Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid-Phosphat und die zweite Lösung Nitroblau- Tetrazolium enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die den Zusammenhang zwischen der EDTA-Konzentration und den Blindwerten zeigt.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die den Zusammenhang zwischen den Diaphorasemengen und den Absorptionen zeigt. In Figur 2 zeigen die schwarzen Punkte die der Diaphorase- Aktivität entsprechende Absorption einschließlich der Blindwerte für den Fall, daß die Assaylösungen EDTA enthalten, und die weißen Punkte zeigen die der Diaphorase- Aktivität entsprechende Absorption einschließlich der Blindwerte, wenn die Assaylösungen kein EDTA enthalten.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die den Zusammenhang zwischen der Menge an Diaphorase und den aus den Absorptionen errechneten Diaphorase-Aktivitäten zeigt. In Figur 3 zeigen die schwarzen Punkte bzw. die schwarzen Dreiecke die Diaphorase-Aktivität, wenn die Assaylösungen Cetyltrimethylammoniumbromid (nachfolgend abgekürzt als CTAB) (als TACD-oberflächenaktives Mittel) und EDTA enthalten, bzw. wenn die Assaylösungen Stearyltrimethylammoniumchlorid (nachfolgend abgekürzt als STAC) (als TACD-oberflächenaktives Mittel) und EDTA enthalten, und die weißen Punkte zeigen die Diaphorase-Ativität, wenn die Assaylösungen Triton X-100 als oberflächenaktives Mittel enthalten.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die den Zusammenhang zwischen der Menge an carcinoembryonischem Antigen (nachfolgend abgekürzt als CEA) und den Absorptionen zeigt. In Figur 4 zeigen die schwarzen Punkte die der Diaphorase- Aktivität entsprechende Absorption einschließlich der Blindwerte für den Fall, daß die Assaylösungen CTAB (als TCAD-oberflächenaktives Mittel) und EDTA enthalten, und die weißen Punkte zeigen die der Diaphorase-Aktivität entsprechende Absorption einschließlich der Blindwerte, wenn die Assaylösungen Triton X-100 als oberflächenaktives Mittel enthalten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Von den Erfindern wurden ausgedehnte Untersuchungen mit der Aufgabe durchgeführt, Blindwerte zu unterdrücken. Als Ergebnis wurde jetzt gefunden, daß sich die Blindwerte verringern, wenn Ethylendiamintetraessigsäure oder ein Salz davon (nachfolgend abgekürzt als EDTA) einer Assaylösung zugefügt wird.
Von den Erfindern wurden ebenfalls ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt mit der Aufgabe, die Diaphorase-Aktivität zu erhöhen und gleichzeitig die Adsorption von Diformazan an Kunststoff-Festphasen zu eliminieren. Als Ergebnis wurden Verfahren und Reagentien gefunden, die die Blindwerte wesentlich vermindern und die Absorptionswerte der Diaphorase-Aktivität erhöhen, während ebenso die Adsorption von Diformazan an Kunststoff-Festphasen wesentlich vermindert wird. Diese Verfahren und Reagentien liefern die oben erwähnten, unerwartet überlegenen Ergebnisse dadurch, daß in den Assaylösungen EDTA und ein kationisches oberflächenaktives Mittel, umfassend einen unverzweigten, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit zwischen 14 und 28 Kohlenstoffatomen und einer terminalen Trimethylammoniumgruppe, an Stelle von Triton X-100, das üblicherweise als oberflächenaktives Mittel benutzt wurde, enthalten ist.
Bei der Durchführung der Messungen der Diaphorase-Aktivität wird eine Diaphorase-haltige Probe mit NBT, EDTA, NAD(P)H, einem oberflächenaktiven Mittel, einer Pufferlösung und anderen Komponenten gemischt, um eine Meßlösung zu erhalten, und eine Erhöhung der Absorption aufgrund der Bildung von Diformazan durch Reduktion von NBT wird bestimmt.
Die Form, in der EDTA bei der vorliegenden Erfindung benutzt werden kann, schließt die freie Säure und beliebige Salze davon ein, beispielsweise Kalium- und Natriumsalze. Eine geeignete EDTA-Endkonzentration in einer Meßlösung liegt zwischen 1 und 50 mM und vorzugsweise zwischen 3 und 10 mM.
Andere, für die Lösung benutzte Komponenten außer EDTA werden aus denen ausgewählt, die in den üblichen, unten beschriebenen Verfahren zur Diaphorase-Bestimmung benutzt werden.
Pufferlösungen, die bei der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, schließen solche ein, deren Pufferbereich nahe am Neutralbereich liegt, wie beispielsweise eine Phosphorsäure- oder ein Triethanolamin-Pufferlösung. Vorzugsweise hat die Pufferlösung einen pH-Wert zwischen etwa 5 und 10, besonders bevorzugt zwischen etwa 6 und 8. Eine geeignete Konzentration der Puffersubstanzen in den Pufferlösungen von Assaylösungen der vorliegenden Erfindung liegen zwischen 10 und 500 mM und vorzugsweise zwischen 50 und 100 mM.
Eine bevorzugte NBT-Konzentration in der Assaylösung liegt zwischen 0,1 und 10 mM, besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 1 mM.
Das NAD(P)H, das bei der vorliegenden Erfindung benutzt werden kann, kann entweder NADH oder NADPH sein, wobei das letztere bevorzugt ist. Eine geeignete NAD(P)H-Konzentration in der Lösung liegt zwischen etwa 0,1 und 5 mM, bevorzugterweise zwischen 0,5 und 2 mM.
Oberflächenaktive Mittel, die bei der vorliegenden Erfindung benutzt werden können mit dem Zweck, die Blindwerte zu unterdrücken, schließen vorzugsweise Mittel der Triton -Serie ein, ohne auf diese beschränkt zu sein; dabei ist Triton X- 100 besonders bevorzugt.
Die oberflächenaktiven Mittel, die benutzt werden können, um die Werte der Diaphorase-Aktivität zu erhöhen und die Adsorption von Diformazan an Kunststoff-Festphasen im wesentlichen zu eliminieren oder zu vermindern, schließen TACD-Spezies ein, in denen der Kohlenwasserstoff zwischen 14 und 28 Kohlenstoffatome, vorzugsweise zwischen 14 und 18 Kohlenstoffatome, enthält. Spezifische Beispiele für TACD- Spezies schließen ein: Myristyltrimethylammoniumhalogenide, Cetyltrimethylammoniumhalogenide, Stearyltrimethylammoniumhalogenide, Arachidyltrimethylammoniumhalogenide, Behenyltrimethylammoniumhalogenide, Lignoceryltrimethylammoniumhalogenide, Cerotyltrimethylammoniumhalogenide und Montanyltrimethylammoniumhalogenide. Von diesen sind Cetyltrimethylammoniumchlorid, CTAB, STAC und Stearyltrimethylammoniumbromid bevorzugt.
Eine geeignete Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln in den Assaylösungen nach der vorliegenden Erfindung liegt zwischen 0,05 und 5 Gew./Vol%, vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 Gew./Vol%.
Die Messungen der Diaphorase-Aktivität nach der vorliegenden Erfindung sollten Assaylösungen verwenden, die zu Beginn der wMessung einer Zunahme der Absorption Diaphorase und die oben erwähnten Komponenten umfassen. Die Reihenfolge der Mischung der Komponenten ist nicht besonders beschränkt.
Die Messung der Diaphorase-Aktivität nach der vorliegenden Erfindung kann wie nachfolgend beschrieben durchgeführt werden.
Eine Diaphorase-haltige Probe wird vorzugsweise so hergestellt, daß sie zwischen etwa 0,002 und 0,2 Einheiten Diaphorase pro ml enthält. Um eine derartige Konzentration zu erreichen, wird die Probe, falls notwendig, mit einer Pufferlösung verdünnt, deren Pufferwirkung in der Nähe des Neutralpunkts liegt, um eine Diaphorase-Konzentration von nicht mehr als ungefähr 2 Einheiten/ml zu haben, und die eingestellte Probe wird in einer Menge von 100 ul oder weniger benutzt.
Zu der derart in der Konzentration eingestellten Probe werden ungefähr 800 bis 900 ul einer Pufferlösung zugegeben, die EDTA, NAD(P)H und ein oberflächenaktives Mittel in den entsprechenden Konzentrationen enthält, wie oben angegeben, so daß eine Gesamtmenge von 900 ul erhalten wird.
Die erhaltene Lösung wird dann vorinkubiert auf eine Temperatur von ungefähr 20 bis 40ºC. Inkubationszeit ist die Zeit, die die Lösung zum Erreichen des oben angegebenen Temperaturintervalls benötigt, gewöhnlich zwischen 3 und 5 Minuten.
Zu der vorinkubierten Lösung werden dann ungefähr 100 ul einer NBT-Lösung einer Konzentration von etwa 1 bis 100 mM gegeben, vorzugsweise 2 bis 10 mM, gefolgt von einer colorimetrischen Bestimmung.
Die colorimetrische Bestimmung kann in einem sogenannten Rate-Assay, in dem eine Absorption in Abhängigkeit von der Zeit gemessen wird, und/oder in einem sogenannten Endpunkt- Assay, in dem die Absorption nach Fortsetzung einer enzymatischen Reaktion über einen bestimmten Zeitraum und anschließendem Abbruch der Reaktion gemessen wird, wobei die Enzymaktivität aus der Veränderung in der Absorption berechnet wird. Bei jeder der Colorimetrie-Verfahren kann die Absorption bei einer Wellenlänge zwischen etwa 520 und 550 nm mit einem kommerziell erhältlichen Spektrophotometer gemessen werden. Der Abbruch der Reaktion im Endpunkt-Verfahren wird dadurch erreicht, daß beispielsweise Salzsäure benutzt wird, um den pH-Wert der Lösung auf beispielsweise 3 oder weniger zu erniedrigen.
Ein Blindversuch kann auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchgeführt werden, mit der Ausnahme, daß die Assaylösungen keine Diaphorase enthalten.
Die Diaphorase, die mit den Verfahren nach der vorliegenden Erfindung geeigneterweise untersucht werden kann, ist nicht besonders beschränkt und schließt beispielsweise Diaphorase bakteriellen Ursprungs ebenso ein wie Diaphorase tierischen Ursprungs.
Der hierin benutzte Term "eine Einheit" bedeutet eine Enzymmenge, die 1 umol NBT pro Minute bei einer Temperatur von ungefähr 30ºC und einem pH von ungefähr 7,0 reduziert, wobei Triton X-100 als oberflächenaktives Mittel benutzt wird.
Die Aktivität der Diaphorase sollte nach der Formel (1) berechnet werden:
Diaphorase-Aktivität (Einheiten) ΔA x V/ 12,4 x 1 (1)
Dabei ist ΔA die Änderung der Absorption pro Minute; V ist die Gesamtmenge an Reaktionslösung (ml): 1 ist der Weg, den das Licht zurücklegt (cm), und 12,4 ist der molare Absorptionskoeffizient von NBT.
Reagentien zur Messung der Aktivität nach der vorliegenden Erfindung schließen die oben beschriebenen Verbindungen ein. Derartige Reagentien bestehen aus zwei separat hergestellten Lösungen, wobei eine NBT und die andere NAD(P)H enthält; die beiden Lösungen werden zusammengegeben, wodurch die Assaylösungen zur Durchführung der Messungen entstehen. Beispielsweise besteht ein Reagens aus dem Reagens A, das zwischen etwa 2 und 100 mM EDTA, zwischen etwa 0,2 bis 10 mM NADH und zwischen etwa 10 bis 500 mM einer Pufferlösung (pH = 5 bis 10) enthält, und aus Reagens B, das zwischen 0,2 und 20 mM NBT, wenigstens ungefähr 0,02 Gew./Vol.% eines oberflächenaktiven Mittels und zwischen ungefähr 10 bis 500 mm einer Pufferlösung (pH = ungefähr 5 bis 10) enthält. Die Reagentien A und B werden in einem Volumenverhältnis von ungefähr 1:1 miteinander vermischt.
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter verdeutlicht mit Hilfe von Beispielen, aber es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt ist.

REFERENZBEISPIEL 1

Eine Lösung der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:
500 mM Triethanolamin-HCl (pH = 7,0) 60 ul
20 mM NADH 60 ul
1% Triton X-100 60 ul
H&sub2;O 300 ul
Zu der erhaltenen Lösung wurden 60 ul EDTA(Na&sub2;) in den Konzentrationen von 0, 20, 50 oder 100 mM zugegeben, so daß die Endkonzentration an EDTA(Na&sub2;) 0, 2, 5 bzw. 10 mM betrug. Nach Inkubation bei 30 ºC über 3 Minuten wurden 60 ul einer Lösung, die 5 mM an NBT enthielt, zugegeben und enzymatische Reaktionen bei 30ºC durchgeführt. Die Erhöhung der Absorption bei 550 nm wurde in Minutenabstand gemessen, um den Effekt der EDTA-Zugabe auf die Blindkontrollwerte zu untersuchen.
Die erhaltenen Resultate sind unten in der Tabelle 1 und in Figur 1l gezeigt. Tabelle 1 Endkonzentration an EDTA (mM) Blindwert
Wie aus der Tabelle 1 und der Figur 1 entnommen werden kann, nahmen die Blindwerte bei steigender EDTA-Konzentration ab. Der Blindwert bei der Endkonzentration an EDTA von 5 mM war ungefähr zwei Fünftel so hoch wie derjenige der Lösung, die kein EDTA enthielt.

BEISPIEL 1 UND VERGLEICHSBEISPIEL 1

Ein Reagens zur Aktivitätsmessung, das EDTA in einer Endkonzentration von 5 mM enthielt (wobei ein Blindwertunterdrückender Effekt wie in Referenzbeispiel 1 auftrat), wurde wie folgt hergestellt:

Reagens A:

50 mM Triethanolamin-HCl (pH = 7,0)
4 mM NADH
10 mM EDTA

Reagens B:

50 mM Triethanolamin-HCl (pH = 7,0)
0,2% Triton X-100
1,0 mM NBT
Zu Vergleichszwecken wurde Reagens A' der gleichen Zusammensetzung wie Reagens A, aber ohne EDTA, hergestellt.
Zu 1 ul von Proben, die 0, 1,0, 2,0, 3,0 oder 4,0 ng Diaphorase (aus bacillus thermophilus, 120 Einheiten/mg, Molekulargewicht 30,000) enthielten, wurden 300 ul Reagens A oder Reagens A' zugegeben, mit nachfolgender Inkubation bei 30ºC während 3 Minuten. Danach wurden dem System 300 ul Reagens B zugegeben. Nach 10 minütiger Inkubation bei 30ºC wurden 150 ul 1-n HCl zum Abbruch der Reaktion zugegeben, und die Absorption bei 550 nm wurde gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 und Figur 2 gezeigt. TABELLE 2 Diaphorase-Gehalt (ng) (Blind-wert)
Wie der Tabelle und der Figur 2 entnommen werden können, wurde der Blindwert (bei einem Diaphorase-Gehalt von 0 ng) des EDTA-haltigen Reagenssystems nach der vorliegenden Erfindung auf fünf Neuntel des Wertes des Vergleichsreagenssystems vermindert, das kein EDTA enthielt. Als Ergebnis war die Enzymaktivität, also diejenige, die von dem Absorptionswert angezeigt wird, der durch Subtraktion des Blindwertes vom Meßwert erhalten wurde, im wesentlichen unverändert, und der Anteil des Blindwerts an der Totalabsorption wurde vermindert, wodurch eine genauere Bestimmung der Diaphorase ermöglicht wird.

BEISPIELE 2 BIS 3 UND VERGLEICHSBEISPIEL 2

Drei Lösungen der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt.
500 mM Triethanolamin-HCl (pH = 7,0) 60 ul
20 mM NADH 60 ul
Oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus 1% Triton X-100 (Vergleichsbeispiel 2), 5% CTAB mit 50 mM EDTA (Beispiel 2), und 5% STAC mit 50 mM EDTA (Beispiel 3) 60 ul
H&sub2;O 350 ul
Lösung enthaltend 0, 10, 20, 30 oder 40 ng Diaphorase (aus bacillus thermophilus, 120 Einheiten/mg, Molekulargewicht: 30,000) 60 ul
Nachdem jede Lösung bei 30ºC 3 Minuten inkubiert worden war, wurden 60 ul einer Lösung, die 5 mM NBT enthielt, hinzugegeben; anschließend ließ man die Lösung 10 Minuten bei 30ºC reagieren. Dem Reaktionssystem wurden 150 ul einer 1-n HCl zugegeben, um die Reaktion abzubrechen, und die Absorption bei 550 nm wurde gemessen. Die nach Formel (1) erhaltenen Diaphorase-Aktivitäten (Einheit) sind unten in Tabelle 3 und in Figur 3 gezeigt. In Figur 3 wurde der Diaphorase-Gehalt als Abszisse gezeichnet, und die aus der Absorption bei 550 nm bestimmte Diaphorase-Aktivität als Ordinate. Die schwarzen Punkte bzw. die schwarzen Dreiecke zeigen Diaphorase-Aktivitäten an, die erhalten wurden unter Verwendung der Lösungen nach der vorliegenden Erfindung, die CTAB als oberflächenaktives Mittel sowie EDTA enthielten bzw. der Lösung, die STAC als oberflächenaktives Mittel sowie EDTA enthielt. Die weißen Punkte zeigen Diaphorase-Aktivitäten, die unter Verwendung der Lösung, die Triton X-100 als oberflächenaktives Mittel enthielt, erhalten wurden. TABELLE 3 Diaphorase-Gehalt (picomol) oberflächenaktives Mittel Triton X-100
Wie der Tabelle 3 und der Figur 3 entnommen werden kann, erhöhte sich den Fällen, in denen ein Reagens nach der vorliegenden Erfindung, enthaltend CTAB (Beispiel 2) oder STAC (Beispiel 3) und EDTA, verwendet wurde, die Enzym- Aktivität, die mit einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung gemessen wurde (also wie durch die Absorptionswerte angezeigt, die erhalten wurden durch Subtraktion der entsprechenden Blindwerte von den entsprechenden gemessenen Werten), um das 1,7-fache des Wertes des Vergleichsbeispiels bei einem Diaphorasegehalt von 10 ng und das 2,2-fache des Vergleichsbeispiels bei einem Diaphorasegehalt von 40 ng, wobei das Reagens des Vergleichsbeispiels 2 Triton X-100 enthielt, was eine Erhöhung der Empfindlichkeit der Diaphorase-Aktivitätsmessung zeigt.

REFERENZBEISPIEL 2

Polystyrol-Perlen (erhältlich von Ichiko K.K.; Durchmesser: 6,5 mm) wurden über Nacht in eine Lösung eingetaucht, die 0,1 mg/ml Lösung eines anticancerogenen embryonalen Antikörpers (nachfolgend abgekürzt als Anti-CEA-Antikörper; erhältlich von Medics Co.) enthielt und mit 1%igem Rinderserumalbumin blockiert, um Polystyrolperlen mit fixierten Anti-CEA- Antikörpern herzustellen.
Ein Milligramm Diaphorase (aus bacillus thermophilus; erhältlich von Unitika Ltd.) wurde mit 30 ug Succinimidyl-4- (N-maleinimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (erhältlich von ZIEBEN Chemical Co.) bei pH 7 umgesetzt, um eine Maleimid- Funktion in die Diaphorase einführen. Die erhaltene modifizierte Diaphorase wurde mit 1,5 mg des Anti-CEA- Antikörpers Fab' (hergestellt durch Verdauen des Antikörpers mit Pepsin und nachfolgender Reduktion) bei pH 6 gemischt, um die Maleinimid-Funktion und die SH-Funktion zu vernetzen und so einen mit Diaphorase markierten Anti-CEA-Antikörper herzustellen.

BEISPIEL 4 UND VERGLEICHSBEISPIEL 3

Zu den nach Referenzbeispiel 2 hergestellten, mit fixierten Anti-CEA Antikörpern versehenen Polystyrolperlen wurden 50 ul einer Lösung gegeben, die 0, 5, 10 oder 20 ng/ml CEA enthielt sowie jeweils 200 ul einer Lösung, die den nach Referenzbeispiel 2 hergestellten, mit Diaphorase markierten Anti-CEA-Antikörper in einer Konzentration von 100 ng/ml enthielt, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC während 18 Stunden zum Durchführen der Antigen-Antikörper-Reaktion. Die flüssige Phase wurde enfernt, und die Perlen wurden sorgfältig mit einer 20 mM-Natriumphosphat-Pufferlösung (pH=7,2), die 0,2% Tween 20, 0,2 % Rinderserumalbumin und 0,15 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen.
Die nachfolgend angegebenen Reagentien wurden hergestellt.

REAGENTIEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG:

Reagens A: 50 mM Triethanolamin-HCl (pH=7,0)
4 mM NADH
10 mM EDTA
Reagens B: 50 mM Triethanolamin-HCl (pH=7,0)
10 mM NBT
2% CTAB

VERGLEICHSREAGENTIEN:

Reagens A': 50 mM Triethanolamin-HCl (pH=7,0)
4 mM NADH
Reagens B': 50 mM Triethanolamin-HCl (pH=7,0)
10 mM NBT
2% Triton X-100
Zu den Perlen wurden 300 ul Reagens A oder A'gegeben, gefolgt von Inkubation bei 30ºC über 30 Minuten. Anschließend wurden 300 ul Reagens B oder B'zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 30ºC. Nach weiteren 10 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 150 ul einer 1-n HCl abgebrochen und die Adsorption der Assaylösung bei 550 nm gemessen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 4 und Figur 4 gezeigt. In Figur 4 wurde der CEA-Gehalt auf der Abszisse aufgetragen, und die Absorption bei 550 nm auf der Ordinate. Die schwarzen Punkte zeigen die Diaphorase-Aktivitäten einschließlich der Blindwerte, die bei Verwendung der CTAB- und EDTA-haltigen Reagentien erhalten wurden, und die weißen Punkte zeigen die Aktivitäten, die bei Verwendung des Vergleichsreagens erhalten wurden, das Triton X-100 enthielt. TABELLE 4 CEA-Konzentration (ng/ml) oberflächenaktives Mittel nicht vorh. Triton X-100
Weiterhin wurde ein Verfärben der Polystyrolperlen aufgrund der Adsorption von Diformazan in Beispiel 4, in dem EDTA- haltiges CTAB benutzt wurde, im wesentlichen nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu war im Vergleichsbeispiel 3, in dem Triton X-100 benutzt wurde, der Grad der Verfärbung der Perlen erhöht, als die Konzentration an CEA erhöht wurde.
Der Tabelle 4 und der Figur 4 kann also entnommen werden, daß die Diaphorase-Aktivität sogar in den Fällen akkurat gemessen werden kann, in denen Polystyrolperlen als Festphase in dem Diaphorase-Meßsystem benutzt werden.

Claims

1l. Verfahren zum Messen der Diaphorase-Aktivität, umfassend:

(A) Mischen einer Diaphorase-haltigen Probe mit Nitroblau-Tetrazolium, EDTA oder einem Salz davon, mindestens einem der beiden Reagentien Nicotinamid- Adenin-Dinucleotid und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid- Phosphat und einem oberflächenaktiven Mittel zu einer Assay-Lösung; sowie

(B) Messen der Erhöhung der Adsorption aufgrund der Bildung von Diformazan in der erwähnten Assaylösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erwähnte Assaylösung etwa 1,0 bis 50 mM EDTA oder ein Salz davon enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erwähnte Assaylösung etwa 3,0 bis 10 mM EDTA oder ein Salz davon enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erwähnte oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 5,0 Gew.% pro Volumen vorhanden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das erwähnte oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.% pro Volumen vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Diaphorase in einer Konzentration von etwa 0,002 bis 0,2 Einheiten/ml vorliegt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erwähnte oberflächenaktive Mittel ein kationisches oberflächenaktives Mittel ist, das einen geradkettigen, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff umfaßt, wobei der erwähnte Kohlenwasserstoff

(a) 14 bis 28 Kohlenstoffatome; und

(b) eine terminale Trimethylammoniumgruppe aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das erwähnte kationische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cetyltrimethylammoniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Stearyltrimethylammoniumchlorid und Stearyltrimethylammoniumbromid.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das EDTA oder ein Salz davon in einer Konzentration von etwa 1 bis 50 mM und das erwähnte kationische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 5,0 Gew.% pro Volumen vorliegt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das EDTA oder ein Salz davon in einer Konzentration von etwa 3 bis 10 mM und das kationische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.% pro Volumen vorhanden ist.

11. Reagens zum Messen der Diaphorase-Aktivität, umfassend eine erste Lösung, eine zweite Lösung, EDTA und ein oberflächenaktives Mittel, wobei

(A) die erwähnte erste Lösung wenigstens eines der beiden Reagentien Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat enthält und

(B) die zweite Lösung Nitroblau-Tetrazolium enthält.

12. Reagens nach Anspruch 11, wobei das erwähnte Reagens eine Endkonzentration an Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid oder Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat von etwa 0,1 bis 5,0 mM aufweist.

13. Reagens nach Anspruch 12, wobei das erwähnte Reagens eine Endkonzentration an Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid oder Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat von etwa 0,5 bis 2,0 mM aufweist.

14. Reagens nach Anspruch 11, wobei das erwähnte Reagens eine Endkonzentration an EDTA oder einem Salz davon von etwa 1,0 bis 50 mM aufweist.

15. Reagens nach Anspruch 14, wobei das erwähnte Reagens eine Endkonzentration an EDTA oder einem Salz davon von etwa 3,0 bis 10 mM aufweist.

16. Reagens nach Anspruch 11, wobei das erwähnte Reagens eine Endkonzentration des erwähnten oberflächenaktiven Mittels von etwa 0,05 bis 5,0 Gew.% pro Volumen und eine Endkonzentration an Nitroblau-Tetrazolium von etwa 0,1 bis 10 mM aufweist.

17. Reagens nach Anspruch 11, wobei das erwähnte Reagens eine Endkonzentration des erwähnten oberflächenaktiven Mittels von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.% pro Volumen und eine Endkonzentration an Nitroblau-Tetrazolium von etwa 0,1 bis 10 mM aufweist.

18. Reagens nach Anspruch 11, wobei das erwähnte oberflächenaktive Mittel ein kationisches oberflächenaktives Mittel ist, das einen geradkettigen, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 14 bis 28 Kohlenstoffatomen umfaßt, wobei der erwähnte Kohlenwasserstoff eine terminale Trimethylammoniumgruppe aufweist.

19. Reagens nach Anspruch 18, wobei das erwähnte kationische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cetyltrimethylammoniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid,

Stearyltrimethylammoniumchlorid und

Stearyltrimethylammoniumbromid.