DE2646033B2

DE2646033B2 - L-Leucin-p-aminoanilide, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase

Info

Publication number: DE2646033B2
Application number: DE19762646033
Authority: DE
Inventors: Tetsuya Amagasaki Matsuo; Xoshinobu Osaka Miyashita; Hisahiko Ashiya Shimada; Norikazu Hirakata Taketani
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1975-10-14
Filing date: 1976-10-12
Publication date: 1978-11-02
Also published as: FR2347334A1; DE2646033A1; DE2646033C3; FR2347334B1

Description

R³

R¹

(I)
R²

in der bedeuten:

R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁- bis C₄-Alkyl, das durch eine Hydroxylgruppe oder eine Methansulfonamidogruppe substituiert sein kann; R³ Wasserstoff oder C₁- bis C₄-Alkyl.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein p-Phenylendiaminderivat der allgemeinen Formel

R³

H, N

R¹

R²

(H)

worin R¹, R² und R³ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit L-Leucin, in dem die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, umsetzt und die Schutzgruppe entfernt.

3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase.

Die Erfindung betrifft L-Leucin-p-aminoanilide-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Substrate zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Leucylaminopeptidase, die im folgenden als LAP bezeichnet wird, ist ein Enzym, das Leucin aus einem Peptid freisetzt, das Leucin als N-endständige Aminosäure enthält. Sie ist weit verbreitet in jedem Gewebe eines lebenden Körpers, ist auch im Blutserum vorhanden und man weiß, daß ihre Aktivität in Abhängigkeit von pathologischen Zuständen ansteigt. So wird die Aktivität von LAP im Falle einer Verletzung des Leberparenchyms, einer Blockierung von Gallenwegen, einschließlich d'js Gallenganges in der Leber, bei Diabetes mellitus, Gastritis, Krebs und Schwangerschaft, erhöht. Daher ist die Messung der Aktivität von LAP eine unerläßliche klinische, biochemische Untersuchung in solchen Fällen und zwar nicht nur zur Diagnose einer Änderung zum krankhaften Zustand hin, sondern auch für die prognostische Beobachtung.

Bisher wurden verschiedene Methoden zur Messung der Aktivität von LAP vorgeschlagen, die viele Vorteile, jedoch auch viele Nachteile besitzen. Die gegenwärtig am häufigsten verwendete Methode ist die colorimetrische Bestimmung einer Aminverbindung, die aus einem synthetischen Substrat durch LAP erzeugt wird. Bei dieser colorimetrischen Bestimmung wird bei Verwendung von L-Leucin-p-nitroanilid als synthetisches Substrat die gelbe Farbe des erhaltenen p-Nitroanilins bestimmt; es ist jedoch nicht möglich, die Einflüsse von Serumkomponenten auszuschalten. Verwendet man das gegenwärtig häufig eingesetzte L-Leucin-/i-naphthylamid a!s synthetisches Substrat, so erhält man ein farbiges Produkt durch Kupplung des erhaltenen /J-Naphthylamins mit einem Diazoniumsalz oder durch Diazotieren des erhaltenen /S-Naphthylamins und anschließende Kupplung mit einer Verbindung, die zu einem Chromogen werden kann, oder auch durch Kondensieren mit p-Dimethylaminobenzaldehyd oder p-Dimethylaminozimtaldehyd. Sei dieser colorimetrischen Bestimmung kann die Aktivität von LAP auf einfache Weise und mit hoher Präzision gemessen werden, jedoch ist die Verwendung von /S-Naphthylamin als Standardsubstanz problematisch. Es ist bekannt, daß /S-Naphthylamin carcinogen ist, seine Herstellung in Japan beispielsweise gesetzlich verboten ist und es vorsichtig unter Anwendung einer Schutzvorrichtung gehandhabt werden sollte.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde daher versucht, die vorstehenden Nachteile üblicher Verfahren zur Messung der Aktivität von LAP auszuschalten und es wurde gefunden, daß neue L-Leucinp-aminoanilide wirksam als Substrat zur Messung der Aktivität von LAP sind.

Die Erfindung betrifft daher L-Leucin-p-aminoanilide der allgemeinen Formel

O R¹ R²

H₃C-CH-CHt-CH-C-NH-^ VN (I)

CH₃

NH,

in der bedeuten:

R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁- bis C₄-Alkyl, das durch eine Hydroxylgruppe oder eine Methansulfonamidgruppe substituiert sein kann; R³ Wasserstoff oder C₁- bis Q-Alkyl.

In der vorstehenden Formel I kann die Alkylgruppe

mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl sein.

Die L-Leucin-p-aminoanilide der allgemeinen Formel I umfassen beispielsweise folgende Verbindungen:

L-Leucin-4-dimethylaminoanilid,

L-Leucin-4-diäthylaminoanilid,

L-Leucin-4-dipropylaminoanilid,

L-Leucin-2-methyl-4-diäthylaminoanilid,

L - Leucin - 2 - methyl - 4 -(N - äthy 1 - N - β - methansulfonamid-äthyl)-aminoanilid,

L - Leucin - 2 - methyl - 4 - (N - äthyl - N - β - hydroxyäthyl)-aminoanilid.

Die L-Leucin-p-aminoanilide der Formel I werden hergestellt durch in an sich bekannter Weise vorgenommene Umsetzung eines p-Phenylendiaminderivates der allgemeinen Formel

R³

H₂N

R¹

R²

(II)

worin R¹, R² und R³ wie vorstehend definiert sind, mit

L-Leucin, worin die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist und Entfernen der N-Schutzgruppe.

Die Kondensationsreaktion des p-Phenylendiaminderivats der Formel II mit dem geschützten L-Leucin kann bei einer Temperatur von 0 bis 20⁰C, vorzugsweise von 5 bis 10⁰C, durchgeführt werden. Falls erforderlich, kann die Umsetzung in einem Lösungsmittel, wie aliphatischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Estern, Äthern, Ketonen, Alkoholen oder Wasser, z. B. Methylenchlorid, Toluol, η-Hexan, Cyclohexan, Aceton, Äthylacetat, Äthyläther, Äthylalkohol unter Zugabe eines Dehydratisierungsmittels, wie Ν',Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid, Ν',Ν'-Di-p-toluoylcarbodiimid, Tetraäthylpyrrophosphit, 1 -Äthyl - 3 - (3 - dimethylaminopropyl)-carbodiimid -HCl, 1 - Cyclohexyl - 3 - (2 - morpholino)-carbodiimid, meso-p-Toluolsulfonat durchgeführt werden. Das Reaktionsprodukt kann, falls erforderlich, in üblicher Weise, wie Filtrieren, Waschen mit Wasser, Kondensieren behandelt werden, um nicht umgesetzte Reaktionskomponenten, Verunreinigungen und das Lösungsmittel zu entfernen.

Die Entfernung der N-Schutzgruppe von dem Reaktionsprodukt kann in üblicher Weise erfolgen, wie durch Einbringen des Reaktionsprodukts in ein Lösungsmittel, wie Äthylacetat, das Chlorwasserstotf enthält. Bei dem Verfahren kann L-Leucin verwendet werden, das mit jeglicher üblichen Schutzgruppe geschützt ist.

L-Leucin-p-aminoanilide der allgemeinen Formel I können als Substrate zur Messung der Aktivität von LAP verwendet werden.

Sie werden durch die Einwirkung von LAP zu dem p-Phenylendiaminderivat und L-Leucin hydrolysiert. Zur Bestimmung der Aktivität von LAP kann die Substratabnahme oder die Menge des gebildeten p-Phenylendiaminderivats oder L-Leucins gemessen werden, jedoch besteht die bevorzugte Methode darin, die gebildete Menge des p-Phenylendiaminderivats zu bestimmen.

Die meisten erfindungsgemäßen L-Leucin-p-aminoanilide zeigen im Vergleich mit L-Leucin-^-naphthylamid die gleiche oder eine verbesserte Reaktivität mit LAP, wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist. Selbst wenn die Substratreaktivität mit LAP nicht so groß ist wie in der Tabelle 1 gezeigt, können die erfindungsgemäßen L-Leucin-p-aminoanilide zur Messung der Wirksamkeit von LAP verwendet werden.

Tabelle 1

Substrat	Umgesetzte Menge*)	Verhältnis
	(_μΜο1 *χ ΙΟ")**	(%)
L-Leucin-4-dimethylamino- anilid	1090	100
L-Leucin-4-diäthylaminoanilid	1145	105
L-Leucin-4-dipropylamino- anilid	1090	100
L-Leucin-2-methyl-4-diäthyl- uminoanilid	1070	98
L-Leucin-2-methyl-4-(N-äthyl- N-^-methansuIfonamido-äthyl)- uminoanilid	271	25

Substrat	5	L-Leucin-2-methyl-4-(N-äthyl-	Umgesetzte	Verhältnis
	N-ß-hydroxy-äthyl)-amin ο	Menge')
ίο anilid	(_μΜο1 *χ 10")**	<%)
L-Leucin-/*- naphthylamid	243	22
(Vergleich)

1090	100

·) Die Menge an Substrat, freigesetzt durch 0,05 ml (etwa 600 GR-Einheiten) Serum bei 37° C während 15 Minuten.

Die Umsetzung eines Substrats mit LAP führt man vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 bei einer Temperatur von 10 bis 45°C, vorzugsweise von 35 bis 40°C, durch. Um den pH-Wert im bevorzugten Bereich zu halten, kann man einen Puffer, wie einen Phosphatpuffer, einen tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanpuffer, einen Barbital- bzw. 5,5-Diäthylbarbitursäurepuffer, einen Boratpuffer, einen Aminomethylpropanolpuffer und dergleichen verwenden.

Zur Bestimmung der Menge des gebildeten p-Phenylendiaminderivats kann dieses in alkalischem Zustand oxidiert werden unter Bildung einer Verbindung, die eine rote Farbe entwickelt, oder kann vorzugsweise ein Kupplungsmittel, wie Phenole und Naphthole zu dem p-Phenylendiaminderivat zugesetzt werden, um durch oxidative Kondensation einen Farbstoff zu bilden. Als derartige Kupplungsmittel können Phenol, a-Naphthol, /^-Naphthol und ihre Derivate, z. B. Monosulfonsäurederivate, wie l-Naphthol-2-sulfonsäure, l-Naphthol-4-sulfonsäure, 2-Naphthol-7-sulfonsäure, 2-Naphthol-8-sulfonsäure und dergleichen, Disulfonsäurederivate, wie 2-Naphthol-3,6-disulfonsäure, 2-Naphthol-6,8-disulfonsäure und dergleichen, Carbonsäurederivate, wie 1-Naphthol-2-carbonsäure, Salicylsäure und dergleichen, mehrwertige Phenole, wie Brenzkatechin, Pyrogallol und dergleichen, verwendet werden. Der zu einer roten Farbe entwickelte Farbstoff kann in üblicher Weise bei 510 nm gemessen werden. Eine bevorzugte Methode zur Messung liegt darin, einen Farbstoff zu verwenden, den man zu einer blauen Farbe entwickelt hat. Da alle Farbstoffe, die durch oxidative Kondensation des p-Phenylendiaminderivats und des Kupplungsmittels hergestellt wurden, eine blaue Farbe annehmen, die eine maximale Absorption bei etwa 660 nm aufweisen und die Färbung bemerkenswert stabil ist, kann die Messung der Aktivität von LAP an Proben von lebenden Körpern vorteilhaft durchgeführt werden, ohne daß andere Bestandteile der Proben einen Einfluß ausüben würden.

Die Farbentwicklung durch Oxidation wird unter Anwendung eines Oxidationsmittels und Einstellen

des pH-Wertes auf 9—12 unter Anwendung eines üblichen alkalisch machenden Mittels, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat oder dergleichen durchgeführt. Als Oxidationsmittel können übliche, wie Natriummetaperjodat, Ammonium-

b5 persulfat, Wasserstoffperoxid, Natriumhypochlorit, Kaliumferricyanid verwendet werden.

Insbesondere wird die Aktivität von LAP wie folgt gemessen. Zu 1,0 ml einer 0,1 m-Phosphatpufferlösung,

die 1,0 mMol von beispielsweise L-Leucin-4-N,'N-diäthylaminoanilid enthält und einen pH-Wert von 7,0 aufweist, fügt man 0,05 ml Blutserum und erwärmt die Mischung 15 Minuten lang in einem Thermostaten auf 37'¹¹C. Zu der Reaklionslösung lügt man 1,0 ml 5 0,2%igen Phenollösung und 1,0 !TiI einer 0,5%igen Natriummetaperjodatlösung in 0,15 n-Kaliumhydroxid. Die Reaktionslösung nimmt sofort eine blaue Farbe mit einem Absorptionsmaximuin bei 06O nm an. Die Absorption bei 660 nm wird sowohl an einer Probe oer resultierenden Lösung, die das Serum enthält, als auch an einer Kontrollösung gemessen, die Wasser anstelle des Serums enthält und in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt hergestellt wurde. Außerdem wird eine Kontrollösung, die ein Serum enthält, dessen LAP-Aktivität bekannt ist, in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt, hergestellt und seine Absorption gemessen. Die LAP-Aktivität der Serumprobe kann durch eine Dreisatzrechnung aus den erhaltenen Daten berechnet werden.

Wie die folgende Tabelle 2 am Beispiel von L-Leucin-4-N,N-diäthylaminoanilid zeigt, stimmen die mit der vorstehend genannten Methode erhaltenen Ergebnisse gut mit den nach der derzeit weit verbreitet verwendeten Methode von Takenaka-Takah a s h i unter Anwendung von L-Leucin-/J-naphlhylamid als Substrat (Igaku to Seibutsugaku 65, 74—78 (1962) erhaltenen überein.

Tabelle 3 Tabelle 2

Probe Nr.

Erfindungsgemäße
Methode

Takenaka-Takahashi-Methode

1	450 GR-Einheiten	479 GR-Einheiten
2	520	510
3	124	114
4	480	470
5	234	220
6	371	378
7	365	360
8	873	880
9	161	159
10	137	138

20 Anmerkung: Als Proben wurden menschliche Sera verwendet.

Da L-Leucin-4-N,N-diäthylaminoanilid, wie Tabelle 3 zeigt, sehr stabil ist, kann es als Lösung verwendet werden. Wird eine langzeitige Lagerung gewünscht, so kann es mit einem Quellmittel vermischt und zu Tabletten geformt werden, oder kann es mit ei iem Puffer vermischt und unter Bildung von Feststoffen lyophilisiert werden, die unmittelbar vor der Anwendung zur Auflösung in Wasser gelangen.

Zeitraum	Unmittelbar danach	Nach 1 Woche	Nach 1 Monat	Nach 2 Monaten	Nach 3 Monaten
Kontrolluntersuchung¹) LAP-Aktivität des Serums (GR-Einheitcn)²) Retention des Substrats (%)	0,020 137 100	0,020 138 100	0,020 137 100	0,022 136 99,9	0,025 137 99,9

') L-Leucin-4-N,N-diäthylaminoanilid wird in einer 0,1 m-Phosphatpufferlösung beim pH-Wert 7,0 bei 2 bis 10°C gelagert. ) Die LAP-Aktivität des gleichen Serums wird zu verschiedenen Zeiten nach der vorstehenden Methode gemessen.

Die Messung der LAP-Aktivität nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß Verunreinigungen, die gewöhnlich in einer Probe aus einem lebenden Körper vorhanden sind, praktisch keine Wirkung auf die Messung aufweist. Verwendet man L-Leucyl-ß-naphthylamid oder L-Leucyl-p-nitroanilid als Substrat so wendet man Wellenlängen von 450 nm oder 410 nm für die Messung an, so daß durch Absorptionen von Verunreinigungen in der Probe bei 400 — 500 ηm Irrtümer auftreten. Es ist daher notwendig, Kontrolltests mit dem Reagens und Kontrolltests mit der Probe durchzuführen, wodurch die Messung kompliziert wird. Da jedoch bei der erfindungsgemäßen Methode Wellenlängen von 660 nm verwendet werden, wirken sich Farbstoffe in Proben praktisch nicht auf die Messung aus. Liegen darüber hinaus in einer Probe reduzierende Substanzen, wie Harnsäure, Ascorbinsäure und dergleichen vor, so werden sie durch überschüssiges Oxidationsmittel zerstört und beeinträchtigen die Messung nicht. Wie aus der Tabelle 4 deutlich hervorgeht, können erfindungsgemäß genaue Daten erzielt werden, selbst wenn in der Probe reduzierende Substanzen vorhanden sind.

45 Tabelle Zusatz

Konzentration LAP-Aktivität
(mg/dl) (GR-Einheiten)

Keiner	—	7,5	160
Ascorbinsäure	25	160
Creatinin	500	160
Glukose	10	159
Harnsäure	5	158
Bilirubin	500	160
Hämoglobin	156

50

55 Wie vorstehend erwähnt, können durch das erfindungsgemäße Verfahren bei LAP-Aktivitätsmessungen an Serum-Proben genaue Daten rasch und einfach in sicherer Weise erzielt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der

Erfindung. . ,

B e 1 s ρ 1 e 1 1

Zu einer Suspension von 15,0 g tert.-ButöXycarbonyl-L-leucinhydrat und 9,9 g Ν,Ν-Diäthyl-p-pheny-

IR (KBrI cm
1145 (SO₂I.

2(1

lendiamin in Methylenchlorid wurde cine Lösung von 14,9g N.N-Dicyclohcxylcarbodiimid in Methylcnchlorid tropfenweise unter Rühren bei 5 bis iO C während I bis 2 Stunden gefügt und das Lösungsmittel wurde durch Destillieren entfernt. Zu dem Rückstand wurde Athylacetat, das 22 g gasförmigen Chlorwasserstoff enthielt, getropft, wodurch man Kristalle erhielt. Durch Umkristallisieren aus Methanol erhielt man 14.8 g (70.2% Ausbeute) L-Leucin-4-diäthylaminoanilid-dihydroehlorid. F-" = 278 bis 260 C (Zcrs.). in Form von farblosen Prismen.

Analyse C„,H₂₇N.,O · 2HCI:

Berechnet ... C 54.86. H 8.34. N 11,99%:
gefunden .... C 54.76. H 8.39. N 11.96%.

IR(Nujol)cm"': 1690. 1620(-CO-NH-).
'/Si?: 243 mn.

Beispiel 2

Unter Anwendung der vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des N.N-Diäthyi-p-phenylcndiamins durch 3.6 g 2-Methyl-4-diäthylaminoanilin erhielt man 3.1 g (42,5% Ausbeute) L - Leucin - 2 - methyl - 4 - diäthylaminoanilid - dihydroehlorid. F = 184 186 C. in Form eines weilten Pulvers.

Analyse C₁-H₂₄NjO · 2HCl:

Berechnet ... C 56.04. H 8.58. N 11.53%:
gefunden .... C 55.74. H 8.41. N 1 1.27%.

IR (KBr) cm"¹: 1685. 1620 (-CO-NH-).
/.Ui?: 230 mn.

Beispiel 3

Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen r> Arbeitsweise, jedoch unter Ersatz des N.N-Diäthylp-phenylendiamins durch 5.4 g 2-Mcthyl-4-(N-äthyl-N-,i-methunsulfonamido-äthyi)-aminoanilin. erhielt man 5.0 g (54.6% Ausbeute) L-Lcuein-2-mcthyl-4 -1N -äthyl -N- \'>- mcthansulfonamido -äthyl) - ami- 4n noanilid-dihydrochlorid. F = 144 — 146 C. als weißes Pulver (A'thanol-Äthyläthcr).

Analyse C_1HH._UN₄O.,S · 2HCl:

Berechnet ... C 47.26. H 7.49. N 12.25%:
uefunden .... C 46.98. H 7.51. N 12.36%.

1685. 1620 1 - CO —Nil—I. 1315.

B e i s ρ i e 1 4

(Hler Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des 4.4-Diäthyl-p-pheinlcndiitmins durch 4.4 g N.N-Di-n-biUvl-p-phemlcndiamin erhielt man 2.4 g (Ausbeute 29,7%) L-Lcucin- v, 4-di-ii-buiylaminoanilid-dihydrochlorid in Form eines weißen Puhers. F = 215 bis 217 C.

Analyse C_:„H.,₅N.,O ■ 2HCl:

Berechnet ... C 59.10. H 9.18. N 10.34%:
gefunden . . . . C 5X.97. 119.10, N 10.31%.

IRlNujnlicm ' 1690. 1618 ( -CO- NH-).

H e i s ρ i e 1 5

I inter Anwendung tier in Beispiel 1 beschriebenen ι>^Γι Methode, jedoch unter Ersatz des 4.4-Diäthvl-p-pheinlendiainins durch 2.7 g N.N-Dimclhyl-phenylendiamin erhielt man 3.6 u !Ausbeute 55.l%| l.-l.euciii-4-dimcthyiaminoanilid-dihydrochlorid in Form weißer Nadeln. F = 193 bis 197 C. [Die Kristalle.sind aus Mcthanol-Isopropanol umkristallisiert worden.

Analyse C₁₄H₂₁N₁O · 2HCI ■ ¹Z₄H₂O:

Berechnet ... C 51.46, H 7,87. N 12,86%;
gefunden .... C 51,18. H 7.69. N 13.06%.

IR (Nujol) cm ': 1687. 161 5 ( — CO NH-).

Beispiel 6

Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des N,N-Diäthylp-phenylendiamins durch 3.8 g N.N-Di-n-propylp-phenylendiamin erhielt man 4.2 g (Ausbeute 56,1 %) L - Leucin - 4 - di - η - propylaminoanilid - dihydroehlorid in Form eines weilten Pulvers. F = 163 bis 167 C.

Analyse C,₈H₃₁N.,O · 2HCl:

Berechnet ... C 57.14. H 8.79. N 11,10%;
gefunden .... C 56.89. H 8.72. N 11,05%.

IR (Nujol) cm"¹: 1690, 1620 (—CO —NH-).
B e i s ρ i e 1 7

Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des N,N-Diälhylp-phenylendiamins durch 3,9 g 2-Methyl-4-(N-äthyl-N-/(-hydroxyäthyl)-aminoaniIin erhielt man 2.3 g(Ausin beute 30,0%) L-Lcucin-2-methyl-4-(N-äthyl-N-/i-hydroxyäthyll-aminoanilid-dihydroehlorid in Form eines hcll-rosa "Pulvers. F = 150 bis 152 C.

Analyse C,₇H_MN.,O₂ · 2HCl:

Berechnet ... C 53.68. H 8,22, N 11,05%;
gefunden .... C 53.40. H 8.09. N 11,04%.

IR (KBr) cm ': 1680. 1620 (-CO-NH-), 3360 (-OFi. breit).

Beispiel 8
Bestimmung der Aktivität von LAP

Reagenticn

Eine Pufferlösung des Substrats: 0,1 m-Phosphalpuffcrlösung. pH-Wert 7.0, enthaltend 1.0 mMol L-Leucin-4-N.N-dimcthylaminoanilid.

Oxidationslösung: Ö. I η-Kaliumhydroxidlösung, enthaltend 0.2% Natriummetapcrjodat.

Arbeitsweise

Zu 2.0 ml der Pufferlösung des Substrats wurden 0,05 ml menschliches Serum unter ausreichendem Rühren gefügt und die Mischung wurde anschließend in einem Thermostaten 15 Minuten auf 37" C erwärmt. Anschließend wurden 1,0 ml der Oxidationslösiing zur I⁷arbbildung zu tier resultierenden Mischung gefügt. Außerdem wurde die gleiche Arbeitsweise wiederholt, wobei man jedoch 0,05 ml Wasser anstelle der Serumprobc zur Verwendung als Reagens für den Konlrolltesl verwendete. Es wurde die Absorption dieser Testproben bei 510 mn gemessen. Gleichzeitig wurde eine Konlrolllösung, die Serum, dessen I.AP-Aklivilät bekannt war, enthielt, in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt hergestellt und seine Absorption wurde gemessen. Die LAP-Aklivitäl der Serumprobc erhielt man durch Dreisatzrechnung aus den vorstehenden Daten.

9 10

Beispiel 9 einem Thermostaten 15 Minuten lang auf 37 C er-

Bcslimmiing der LAP-Aktivität ™^UT.^ml *^urde- Anschließend wurden 1,(11 ml der Oxi-

dationslosung zu der resultierenden Mischung zu ι

Reagentien Farbbildung zugefügt. Außerdem wurde die Arbeits-

Pufferlösung eines Substrats: 0,1 m-Phosphatpuffer- -> weise wiederholt, wobei jedoch 0,05 ml Wasser an-

lösung, pH 7,0, enthaltend 1,0 mMol L-Leucin- stelle der Serumprobe verwendet wurden, um cir

4-N,N-diälhylaminoanilid und 0,1% Phenol. Reagens für den Kontrolltest zu erhalten. Für diese

Oxidationslösung:0,l η Kaliumhydroxidlösung, ent- Testproben wurde die Absorplion bei 660 ηm gc·

haltend 0,5% Natriummetaperjodal. messen. Gleichzeitig wurde eine Kontroilösung, die

αϊ·.·. '" Serum enthielt, dessen LAP-Aktivität bekannt war

Arbeitsweise _jn g|_ej_ci_lcr Weise wie vorstehend erwähnt, hergestellt

Zu 2,0 ml der Pufferlösung des Substrats wurden und ihre Absorplion wurde ebenfalls gemessen. Die

unter ausreichendem Rühren 0,05 ml einer Probe von LAP-Aktivität in der Scrumprobe erhielt man durch

menschlichem Serum gefügt, worauf die Mischung in Dreisatzrechnung aus den erhaltenen Daten.

Claims

Patentansprüche:

1. L-Leucin-p-aminoanilide
Formel

H₃C-CH-CH₂-CH-C-NH
CH₃ NH₂

der allgemeinen