DE3427290A1

DE3427290A1 - Verfahren zum bestimmen von formaldehyd

Info

Publication number: DE3427290A1
Application number: DE19843427290
Authority: DE
Inventors: Motoo Noda Nakajima
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1983-07-26
Filing date: 1984-07-24
Publication date: 1985-02-14
Also published as: US4552849A; DE3427290C2; JPS6027856A; JPH0354302B2

Description

HOFFMANN"·" EITLE '& PARTN'ER

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE 342/290

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE . DR. REF?. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ING. K. GORG DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

-3- 40 619 o/sm

KIKKOMAN CORPORATION Noda-Shi / JAPAN

Verfahren zum Bestimmen von Formaldehyd

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Bestimmen von Formaldehyd.

Da Formaldehyd als Reaktionsprodukt bei einer Reihe von enzymatischen Reaktionen gebildet wird, hat man die Bestimmung von Formaldehyd durchgeführt, um die enzymatische Aktivität bei diesen Umsetzungen oder die Substratkonzentrationen vor dem Auftreten einer enzymatischen Reaktion zu untersuchen.

Bei der Bestimmung von Triglyceriden in Plasma oder Gewebe werden die Triglyceride unter Bildung von Glycerin verseift, und das gebildete Glycerin wird zu Formaldehyd oxidiert, dessen Menge dann bestimmt wird, oder man bestimmt die Menge von Kreatinin im Serum oder Urin durch eine enzymatische Methode, wobei die Menge des Kreatinins durch den Formaldehyd, der bei der enzymatischen Reaktion gebildet wird, bestimmt wird.

Formaldehyd wird als Ausgangsmaterial bei der Herstellung von zahlreichen Harzen verwendet. Man verwendet es auch zur Verbesserung der Festigkeit von Textilfasern, oder um die Faserfestigkeit bei der Papierherstellung zu verbessern. Darüber hinaus verwendet man es auch als Fungizid oder als antiseptisches Mittel. Es ist auch bekannt, daß einige Haushaltsgegenstände wie Tafelgeschirr, Sperrholzmöbel und Kleidung geringe Mengen an Formaldehyd in Dampfform oder in Wasser gelöst abgeben. Der freigesetzte Form-

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aldehyd ist für den menschlichen Körper schädlich und verursacht manchmal eine Vergiftung, die 2u einem Hautausschlag führen kann.

Aus diesem Grund ist die Bestimmung von Formaldehyd auf den vorgenannten technischen Gebieten ebenso wie aus Gründen der Hygiene wichtig.

Zur Bestimmung von Formaldehyd sind eine Reihe von Methoden bekannt, darunter eine Reihe von kolorimetrischen Methoden, eine Methode, bei welcher man Formaldehyd mit einem Acetylacetonreagens in Gegenwart eines Ammoniumsalzes umsetzt und dann das gebildete Diacetyldihydrolutidin fluorimetrisch bestimmt (S. Belman, Anal. Chim. Acta, Band 29, Seiten 120-6 (1963)). Diese Methode ist jedoch aufgrund der nicht ausreichenden Empfindlichkeit aufgrund der niedrigen Fluoreszenzintensität der gebildeten fluoreszierenden Substanz nicht zur Bestürmung ^von extrem niedrigen Formaldehydmengen geeignet. Diese Methode hat auch den Nachteil, daß die Umsetzung zwischen Formaldehyd und Acetylaceton sehr langsam verläuft (sie benötigt 5 h bei 20⁰C) und daß, wenn man die Reaktionstemperatur zum Abkürzen der Reaktionszeit erhöht, eine Verfärbung des Reaktionsgemisches stattfindet, wodurch die Genauigkeit der Bestim- mung negativ beeinflußt wird.

Untersuchungen der vorliegenden Erfinder haben bereits zu einem Patent geführt, welches eine verbesserte Methode zur Bestimmung von Formaldehyd betrifft (US-PS 4 438 206) , bei dem man zur Formaldehydbestimmung die Fluoreszenz einer fluoreszierenden Substanz mißt, die gebildet wurde, indem mane Formaldehyd enthaltende Lösung mit einem Acetylacetonreagens umsetzt und die Fluoreszenz in Gegenwart von Serumalbumin , insbesondere von Rinderserumalbumin_/ mißt.

Diese Methode hat zwar eine hohe Nachweisempfindlichkeit und ermöglicht den Nachweis von extrem niedrigen Formaldehydmengen mit großer Empfindlichkeit, jedoch ist das Problem der langen Reaktionszeit noch nicht gelöst, und darüber hinaus benötigt man die Zugabe einer weiteren Substanz, nämlich von Serumalbumin zusätzlich zu dem fluoreszierenden Reagens.

Untersuchungen haben nun zu einer befriedigerenden Methode zur Bestimmung von Formaldehyd geführt. Es wurde gefunden, daß man die Bestimmung von Formaldehyd mit hoher Genauigkeit und hoher Geschwindigkeit durchführen kann, wenn man eine Verbindung der allgemeinen Formel CH-X (NH„) = CHCO₂R, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, als Fluoreszenzreagens, das in der Lage ist, eine fluoreszierende Substanz durch Umsetzen mit Formaldehyd zu bilden, verwendet. Hierauf beruht die vorliegende Erfindung.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine hochempfindliche Methode zum Nachweis vom Formaldehyd mit hoher Geschwindigkeit zur Verfügung zu stellen. Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

In den Zeichnungen bedeuten die Figuren 1 und 2 das Anregungsspektrum bzw. das Emissionsspektrum der durch die Umsetzung einer Standardlösung von Formaldehyd mit Methyl-3-aminocrotonat, einem fluoreszierenden Reagens, gebildeten fluoreszierenden Substanz.

Fig. 3 ist eine grapische Darstellung (eine Standardkalibrierungskurve) , in welcher die Beziehung zwischen der Men-

ge an Formaldehyd und der relativen Fluoreszenzintensität

gezeigt wird; Linie (1) (gezeigt durch ο ο )

erhält man, indem man Methyl-3-arninocrotonat als fluoreszierendes Reagens verwendet, Linie (2) (gezeigt durch

ο « ) erhält man bei Verwendung von Ethyl-

3-aminocrotonat und Linie (3) (angezeigt durch χ χ

) erhält man bei Verwendung von Acetylaceton.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Formaldehydbestimmung zur Verfügung gestellt, indem man die Fluoreszenz einer fluoreszierenden Substanz mißt, die gebildet wurde durch Umsetzung einer Formaldehyd enthaltenden Lösung mit einem fluoreszierenden Reagens, das in der Lage ist, die fluoreszierende Substanz durch Umsetzen mit Formaldehyd zu bilden. Die erfindungsgemäß erzielte Verbesserung besteht, darin, daß man als fluoreszierendes Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel CH₃C(NH₂)=CHCH₂R, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, verwendet.
20

Die Erfindung wird nachfolgend näher beschrieben.

(1) Herstellung des fluoreszierenden Reagens

Eine Verbindung der allgemeinen Formel CH₃C(NH₂)=CHCO₂R, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie Methyl-3-aminocrotonat (R in der obigen Formel bedeutet eine Methylgruppe) oder Ethyl-3-aminocrotonat (R in der obigen Formel bedeutet eine Ethylgruppe) wird in einem organischen Lösungsmittel unter Bildung einer Lösung, welche die Verbindung in einer Molarität von 0,01 bis 2 enthält, gelöst.

Geeignete organische Lösungsmittel für die vorliegende Erfindung sind beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Ethylenglykoldimethylether, Ethylenglykolmonomethylether, Triethylenglykol, Dioxan, Aceton, Pyridin, Acetontril, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.

(2) umsetzung und Bestimmung

Eine Probelösung, enthaltend Formaldehyd wird mit einer annähernd gleichen Menge einer Phosphat- oder Ammoniumacetatpufferlösung, die auf eine Konzentration von 0,01 bis 3, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 Molarität und einen pH-Wert von 4 bis 8 und vorzugsweise 5,0 bis 6,5 eingestellt ist, vermischt. Zu dieser Mischung gibt man 1 bis 50 % des zuvor hergestellten fluoreszierenden Reagens und die erhaltene Mischung läßt man dann T bis 60 min bei 20 bis 80°C reagieren.

Die Reaktionszeit kann durch Erhöhung der Reaktionstemperatur abgekürzt werden und beträgt beispielsweise bei 2o°C 60 min und bei 37°C 15 min.

Die obige Umsetzung ergibt die Bildung einer fluoreszierten Substanz in der Reaktionsmischung. Diese wird dann mit Licht mit einer Anregungswellenlänge, die für die fluoreszierende Substanz spezifisch ist (z. B. 320 bis 400 nm, insbesondere 370 bis 380 nm) bestrahlt und die Fluoreszenz der Reaktionsmischung wird dann als charakteristische Emissionswellenlänge (z. B. 430 bis 500 nm, insbesondere 460 bis 470 nm) gemessen, worauf man dann den Formaladehydgehalt unter Verwendung einer getrennt erhaltenen Kalibrierungskurve bestimmt.

Die vorerwähnte Methode zur Bestimmung von Formaldehyd gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Bestimmung von Formaldehyd mit erheblich verbesserter Genauigkeit und mit einer kurzen Reaktionszeit im Vergleich zu der zuvor bekannten fluorimetrischen Bestimmung von Formaldehyd.

Das erfindungsgemäße Verfahren und dessen Vorteile gehen aus den nachfolgenden Versuchsbeispielen hervor. 10

Versuchsbeispiel

(1) Herstellung einer Standardformaldehydlösung 15

Formaldehyd wurde in destilliertem Wasser unter Ausbildung von Lösungen enthaltend 10,67, 21,34, 53,35, 80,04 und 106,70 Nanogramm (ng) Formaldehyd in 2 ml.

(2) Herstellung des fluoreszierenden Reagens

(a) Herstellung von Methyl-3-aminocrotonat [CH₃C(NH₂)=CHCO₂CH₃]

Methyl-3-aminocrotonat (hergestellt von Aldrich Co.) wurde aus Ethylether umkristallisiert; 2,3 g des umkristallisierten Produktes wurden in Dimethylformamid bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml gelöst.

(b) Herstellung von Ethyl-3-aminocrotonat [CH₃C (NH₂)=CHCO₂C₂H₅]

Ethyl-3-aminocrotonat (hergestellt von Aldrich Co.) (2,5 ml) wurde in Dimethylsulfoxid bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml gelöst.

(c) Herstellung des Acetylacetonreagens

Eine 2 M Ammoniumacetatpufferlösung (mit Essigsäure auf den pH-Wert 6,0 eingestellt) wurde mit 0,2 ml Acetylaceton vermischt und unter Ausbildung einer Lösung gerührt und dann mit der gleichen Pufferlösung auf 100 ml aufgefu3.lt.

(3) Fluorimetrisehe Bestimmung von Formaldehyd 10

(a) Erfindungsgemäße Methode

Jeweils 2 ml der Standardformaldehydlösungen von unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt gemäß

(1) wurden mit 2 ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung (pH-Wert 5,5) vermischt, und die Mischung wurde dann mit 200 ml von entweder Methyl-3-aminocrotonat, hergestellt in (2)(a) oder Ethyl-3-aminocrotonat, hergestellt in (2)(b), vermischt. Nach gründlichem Rühren

ließ man die Mischung 15 min bei 37°C stehen und dann wurde die Fluoreszenzintensität durch die Fluoreszenzanregungs- und Emissionswellenlängen bei 375 bzw. nm bestimmt.

Das Anregungsspektrum (bei einer Emissionswellenlänge von 465 nm) und das Emissionsspektrum (bei einer Anregungswellenlänge von 375 nm) der durch Umsetzung mit Methyl-3-aminocrotonat gebildeten fluoreszierenden Substanz wird in den Fig. 1 bzw. 2 gezeigt.

(b) Kontrollmethode

Jeweils 2 ml der Standardformaldehydlösungen unterschiedlicher Konzentration, hergestellt in (1), wurden

mit 2 ml des in (2)(c) hergestellten Acetylacetonreagens vermischt. Nach gründlichem Rühren ließ man die Mischung min bei 37 C stehen und dann wurde die Fluoreszenzintensität bei den Fluoreszenzanregungs- und Emissionswellenlängen von 415 bzw. 510 nm bestimmt.

Die fluorimetrische Bestimmung wurde in allen Fällen unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 10

Spektrofluorimeter: Typ FP 550 der Nihon Bunko

K.K.

Anregungswellenlänge: Spalt 10 mm Emissionswellenlänge: Spalt 20 nm, Selektor χ 10; Empfindlichkeit χ 10; Varia

ble 8.

Die Blindwerte wurden in gleicher Weise, wie oben beschrieben, hergestellt, wobei jedoch 2 ml destilliertes Wasser anstelle von 2 ml der Standardformaldehydlösung verwendet wurden.

Die Beziehung zwischen der Menge des Formaldehyds und der relativen Fluoreszenzintensität (die man erhält, indem man die Blindwerte von der beobachteten relativen Fluoreszenzintensität abzieht) werden in Fig. 3 gezeigt.

Aus Fig. 3 geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine dreimal höhere relative Fluoreszenzintensität ergibt als die Kontrollmethode, und daß damit somit eine genauere Bestimmung des Formaldehyds möglich ist.

Beispiel

Zu 2 ml einer Probelösung enthaltend eine außerordentlich geringe Menge Formaldehyd wurden 200 μΐ des in (2)(a) des Versuchsbeispiels beschriebenen Methyl-3-aminocrotonatreagens sowie 2 ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung (pH-Wert 5,5) gegeben. Nach gründlichem Mischen ließ man die Mischung 15 min bei 37 C reagieren. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde einer fluorimetrischen Bestimmung bei Fluoreszenzanregungs- und Emissionswellenlängen von 375 bzw. 465 nm unterworfen. Der Blindwert wurde auf gleiche Weise, wie vorher angegeben, erhalten, wobei jedoch 2 ml destilliertes Wasser anstelle von 2 ml der Formaldehyd enthaltenden Probelösung verwendet wurden.

Nach dem Abziehen des Blindwertes betrug die Fluoreszenzintensität 2,34. Aus diesem Wert wurde die Menge an Formaldehyd anhand der graphischen Darstellung in Fig. 3 (Standardkalibrierungskurve) bestimmt. Der Formaldehydgehalt betrug 40,0 ng in 2 ml der Probe.

Claims

HOFFMANN"-'EITLEM PARTNER

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE J 42 I L 9 U

PATENTANWÄLTE DIPL.-ΙΝΘ. W. EITLE · DR. RI£R. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ING. K. GDRG DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

40 619 o/sm

KIKKOMAN CORPORATION Noda-Shi / Japan

Verfahren zum Bestimmen von Formaldehyd

Patentansprüche

Verfahren zur Bestimmung von Formaldehyd, bei dem man die Fluoreszenz einer fluoreszierenden Substanz, die durch Umsetzen einer Formaldehyd enthaltenden Lösung mit einem fluoreszierenden Reagens, welches in der Lage ist, die fluoreszierende Substanz durch Umsetzung mit Formaldehyd zu bilden, mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszierendes Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel CH₃C(NH₂)=CHCO₂R verwendet, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel, in welcher R eine Methylgruppe ist, verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel, in welcher R eine Ethylgruppe ist, ver-0 wendet.
4. Verfahren zur Bestimmung von Formaldehyd, dadurch gekennzeichnet , daß' man eine Formaldehyd

enthaltende Probelösung mit einer gleichen Menge einer Phosphat- oder Aminoniumacetatpufferlösung, die auf eine Konzentration von 0,01 bis 3 Molarität und einen pH-Wert von 4 bis 8 eingestellt ist, vermischt, daß man zu der Mischung 1 bis 50 % einer 0,01 bis 2 molaren Lösung von Methyl-3-aminocrotonat [CH₃C(NH₃)^CHCO₂CH₃] oder Ethyl-3-aminocrotonat [CH₃C(NH₂J=CHCO₂C₂H₅] in einem organischen Lösungsmittel zugibt, daß man die erhaltene Mischung 1 bis 60 min bei 20 bis 80 C umsetzen läßt und daß man die die Fluoreszenz der gebildeten fluoreszierenden Substanz bestimmt.