Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób oznaczania aktywnosci a-amylazy w materiale po¬ chodzenia ludzkiego lub zwierzecego za pomoca testu barwnego, przy którym jako substrat stosuje sie nowy nierozpuszczalny w wodzie zwiazek kom¬ pleksowy rozpuszczalnego w wodzie barwnika i materialu, zawierajacego amyloze.Stwierdzono, ze mozna oznaczac aktywnosc amy¬ lazy z bardzo dobra powtarzalnoscia, a mianowicie ze srednim bledem granicznym, wynoszacym 2—4%, jezeli mierzy sie intensywnosc zabarwienia, pow¬ stajacego wówczas, gdy rozpuszczalny w wodzie barwnik, który stal sie nierozpuszczalny w wodzie przez polaczenie z amyloza, zostaje rozpuszczony w srodowisku wodnym wskutek dzialania amylazy.Przez pomiar intensywnosci zabarwienia srodowi¬ ska wodnego i przez porównanie tej intensywnosci zabarwienia z próbka standardowa oznacza sie stopien solubilizacji, który jest miara hydrolizy spowodowanej dzialaniem amylazy i tym samym — miara aktywnosci amylazy. 80 21180 211 3 Barwniki, nadajace sie do tworzenia zwiazków kompleksowych z amyloza w ramach niniejszego wynalazku, sa to rozpuszczalne w wodzie barwniki, które reaguja z celuloza, to znaczy tak zwane bar¬ wniki reaktywne. Najkorzystniejsze sa przy tym barwniki monochlorotriazynowe, a najbardziej przydatne sa takie barwniki monochlorotriazyno¬ we, które zawieraja jako skladniki antrachinono- dwusulfonian. Przykladami takich znanych barwni¬ ków sa: Cibacron Brilliant-orange G.P. (Reakti- vorange 5) i Cibacron Brilliant — blau F3GA (Reaktivblau2). \ Te barwniki reaktywne charakteryzuja sie tym, ze sa one rozpuszczalne w wodzie, ze zawieraja zdolny do reakcji podstawnik chlorowiec i ze za¬ wieraja jako skladnik antrachinonodwusulfonian.Barwniki te sa dostepne w*postaciach ich soli z metalami ciezkimi, na przyklad w postaci soli z miedzia, manganem i podobnymi.Stosowany w ramach mniejszego wynalazku nie¬ rozpuszczalny zwiazek kompleksowy uzyskuje sie w ten sposób, ze barwnik reaktywny poddaje sie reakcji z amyloza lub z materialem, zawierajacym amyloze. Typowymi przykladami materialów, za¬ wierajacymi amyloze, sa skrobie owoców roslin ce¬ bulkowych lub ziarno zbóz, na przyklad skrobia ku¬ kurydziana, ziemniaczana, pszeniczna i ryzowa.Barwnik mozna poddawac reakcji z materialem, zawierajacym amyloze, w srodowisku wodno-alka- licznym. Stosunki ilosciowe reagujacych skladników nie musza byc scisle zachowane, gdyz lacza sie one ze soba w sposób niezmienny, totez mozna usunac nadmiar jednego z nich. Zmiany stosunków iloscio¬ wych reagujacych skladników nie powoduja zmia¬ ny charakteru produktu reakcji. W celu osiagnie¬ cia mozliwie calkowitego przereagowania stosuje sie najkorzystniej jeden z obu reagujacych skla¬ dników w nadmiarze.Zwiazek kompleksowy mozna uzyskac przez rea¬ kcje barwnika z materialem, zawierajacym amylo¬ ze, w slabo alkalicznym srodowisku wodnym w podwyzszonych temperaturach, na przyklad w tem¬ peraturach powyzej 50°C, a korzystnie w tempera¬ turach od okolo 50°C do okolo 90°C. W zbyt ostrych warunkach reakcji, na przyklad w zbyt wysokiej temperaturze lub przy zbyt duzej alkalicznosci, atom chlorowca reaguje raczej z jonem wodoro-tlenowym srodowiska zasadowego, niz ze skladnikiem amylo¬ zowym. W celu osiagniecia dobrej wydajnosci w ciagu krótkiego czasu reakcji dodaje sie korzystnie naj¬ pierw rozpuszczalna sól, na przyklad siarczan sodo¬ wy, chlorek wapniowy, chlorek sodowy, chlorek po¬ tasowy i podobne, korzystnie siarczan sodowy. Po dodaniu soli dodaje sie korzystnie zasade w celu doprowadzenia wartosci pH co najmniej do wartosci 9—12, przez co rozpoczyna sie reakcja. Jako zasade stosuje sie najkorzystniej fosforan trójsodowy, przez co mozna uzyskac szczególnie duze wydajnosci.Uzyskany produkt jest to trwaly nierozpuszczalny zwiazek kompleksowy, który mozna wydzielic w zwykly sposób, na przyklad przez filtracje, wirowa¬ nie, dialize lub temu podobne. Kompleks ten ma takie same zabarwienie, jak uzyty barwnik. Udzial barwnika w produkcie jest zwiazany z grupa wodo- 4 rotlenowa cukrowego skladnika amylozy, przy czym na czasteczke barwnika przypada od okolo 7 do oko¬ lo 10 reszt sukru, co mozna stwierdzic przez po¬ miar stosunku ilosci fragmentów, zawierajacych 5 solubilizowany barwnik, do ilosci substancji redu¬ kujacych, oznaczonych w postaci glikozy, wytwo¬ rzonej przez hydrolize pod dzialaniem enzymów endo-amylazy i exo-amylazy.Sposób oznaczania aktywnosci amylazy wedlug wynalazku jest specyficzny dla rodzaju wystepuja¬ cej amylazy i musi byc wykonywany w podanych warunkach, aby mozna bylo uzyskac dokladne i powtarzalne wyniki.Jako zródlo enzymów mozna stosowac kazdy material, zawierajacy a-amylaze, na przyklad ciecz lub tkanke biologiczna. Przykladami materialów, zawierajacych a-amylaze, sa: osocze krwi, mocz, slina i podobne. W ramach dalszego opisu wyna¬ lazku zilustrowano oznaczenie aktywnosci a-amy- lazy przy zastosowaniu cieczy biologicznej, a mia¬ nowicie ekstraktu trzustki.Test sluzacy do oznaczania aktywnosci a-amyla- zy przeprowadza sie w taki sposób, ze sporzadza sie zawiesine kompleksu barwnika ze skrobia w obojetnym w zasadzie wodnym roztworze buforo¬ wym, który zawiera katalizator, a mianowicie chlo¬ rek metalu alkalicznego, a nastepnie ogrzewa sie uzyskana zawiesine, dodaje sie badany roztwór, po¬ zostawia sie mieszanine na okreslony okres czasu, przerywa sie reakcje, zlewa sie ciecz z wierzchu i porównuje sie zabarwienie tej cieczy z próbka standartowa w celu oznaczenia ilosci materialu, za¬ wierajacego solubilizowany barwnik. Zabarwienie wywolane przez material, zawierajacy solubilizo¬ wany barwnik, jest miara aktywnosci enzymu.Ilosci róznych skladników, stosowanych w tym tescie, na aktywnosc enzymów nie maja decydu¬ jacego znaczenia z punktu widzenia mozliwosci wykonania testu. W miare moznosci stosuje sie jednak mozliwie male ilosci tych skladników tak, aby test byl wykonany w mozliwie ekonomiczny sposób. Stosunki ilosciowe skladników, jak równiez warunku pH i temperatury, maja istotne znaczenie z punktu widzenia mozliwosci wykonania sposobu wedlug wynalazku, podczas, gdy czas reakcji ma znaczenie tylko o tyle, ze testy nalezy wykonywac w ciagu mozliwie krótkiego okresu czasu, a czas trwania testu winien byc kazdorazowo mozliwie jednakowy.Warunki reakcji przy oznaczania aktywnosci enzymów mozna ustalic w taki sposób, ze powstaje uklad statyczny albo dynamiczny. W ukladzie sta¬ tycznym, który jest najkorzystniejszy, stosuje sie male objetosci, przy czym odpada koniecznosc mie¬ szania. Najkorzystniejsze warunki reakcji przy oznaczaniu aktywnosci a-amylazy ustala sie wiec w ten sposób, aby mozna bylo uzyskac koncowa objetosc okolo 6—10 ml do pomiarów spektrofoto- metrycznych. Najkorzystniej stosuje sie okolo 200 mg nierozpuszczalnego kompleksu barwnika z amy¬ loza w okolo 0,8 ml 0,04-molowego buforowego roztworu fosforanu przy wartosci pH okolo 6,9— 7,1, a najkorzystniej 7,0, przy czym roztwór ten zawiera 0,05 mola chlorku sodowego w temperatu- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6080 211 Tze 37—40°C, a takze stosuje sie 0,1—0,4 ml, a naj¬ korzystniej okolo 0,1 ml roztworu enzymu. Jezeli -zwieksza sie ilosc kompleksu barwnika z amyloza, to trzeba równiez zwiekszyc ilosc pozostalych sto¬ sowanych materialów.Wzgledna ilosc i stezenie buforu fosforanowego w ukladzie statycznym powinna byc zawarta w sto¬ sunkowo waskich granicach. Tak wiec przy ozna¬ czaniu a-amylazy mozna dodawac na 200 mg sub- stratu od okolo 0,7 do okolo 1,5 ml 0,04-molowego buforu fosforanowego. Objetosc i stezenie buforu powinny jednak byc wystarczajace do tego, aby wartosc pH utrzymywala sie w granicach od 6,9 przebiegu oznaczania. Stosowanie buforu fosforano¬ wego jest najkorzystniejsze ze wzgledu na jego dobra tolerancje z roztworem, mozna jednak takze stosowac inne uzywane zazwyczaj bufory, na przy¬ klad trój-(hydroksymetylo)amino-propan i bufor maleinianowy, który jest mieszanina maleinianu sodowego i kwasu maleinowego. Przy oznaczeniu 6-amylazy objetosc i stezenie buforu powinny byc wystarczajace do tego, aby wartosc pH utrzymy¬ wala sie w granicach 4,4—4,6, a najkorzystniej oko¬ lo 4,5, podczas calego czasu trwania oznaczania.Ilosc zawartego w ukladzie chlorku sodowego przy tescie na a-amylaze winna byc scisle prze¬ strzegana i nie powinna wynosic mniej niz 0,01 mola, a najkorzystniej 0,05 mola. Stosowanie chlor¬ ku sodowego jest najkorzystniejsze, ale mozna tak¬ ze stosowac inne katalizatory — chlorki metali alkalicznych np. chlorek potasowy.W ukladzie dynamicznym, w którym niezbedne jest urzadzenie do mieszania ukladu, stosuje sie wieksze objetosci, niz w ukladzie statycznym.Zwiekszenie objetosci uzyskuje sie przez to, ze zwieksza sie objetosc roztworu buforowego. Tak wiec w tescie na a-amylaze mozna zastosowac okolo 0,7—1,5 ml buforu na 200 g nierozpuszczalne¬ go kompleksu barwnika z amylaza — okolo 1,0— 5.0 ml, a najkorzystniej 4,5 ml buforu. Wszystkie pozostale warunki reakcji, stezenia, ilosci i mate¬ rialy sa takie same, jak w ukladzie statycznym.Zarówno w ukladzie dynamicznym, jak tez w ukladzie statycznym, istotne znaczenie ma utrzy¬ mywanie stosunkowo waskiego zakresu temperatu¬ ry przy oznaczaniu a-amylazy dla unikniecia wply¬ wu na trwalosc ukladu. Ten zakres temperatur lezy miedzy 37 i 40°C, przy czym najkorzystniejsza jest temperatura 40°C. Testmozna jednak takze wyko¬ nywac w temperaturze 20—25°C, przy czym trwa on wówczas dluzej. Ilosc stosowanego roztworu enzy¬ mu ma znaczenie tylko z uwagi na ekonomicznosc, prostote wykonania testu i przypuszczalna wielkosc aktywnosci enzymu. W normalnych warunkach mozna w zadowalajacy sposób wykonac test bar¬ wny, stosujac okolo 0,1—0,4 ml roztworu na 200 g substratu. Czas trwania testu, to znaczy okres cza¬ su, na który pozostawia sie mieszanine roztworu •enzymu i kompleksu barwnika z amyloza, wynosi na ogól okolo 15 min. Czas ten jest wystarczajacy do okreslenia wzglednej aktywnosci i ilosci zawar¬ tego w ukladzie enzymu. Dluzszy czas bylby nie¬ ekonomiczny, podczas gdy krótsze czasy sa na ogól 25 30 niewystarczajace do solubilizacji takiej ilosci bar¬ wnika, która umozliwilaby wykonanie dokladnych pomiarów.W celu zahamowania aktywnosci enzymu w odpo- 5 wiednim momencie konieczne jest przerwanie rea¬ kcji, to znaczy „zamrozenia" ukladu. Mozna to osiagnac na rózne sposoby, np. przez zmiane war-* tosci pH ukladu lub przez usuniecie produktu. Naj¬ korzystniejszy sposób przerywania reakcji czyli 10 „zamrazania" ukladu polega na zmianie wartosci pH. W przypadku oznaczania a-amylazy mozna to przeprowadzac albo w ten sposób, ze alkalizuje sie mieszanine reakcyjna, np. do wartosci pH = 9, a , najkorzystniej do wartosci pH od 10 do 11, albo 15 przez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej, np. do wartosci pH 3,5—4,5, a najkorzystniej do wartosci pH = 4,0. Przerwanie reakcji przez zalkalizowanie nadaje sie do ukladów, zawierajacych liczne ilosci protein, podczas gdy przerwanie reakcji przez 20 zakwaszenie nadaje sie do takich ukladów, które zawieraja tylko niewielkie ilosci protein lub nie zawieraja ich wcale.Przerwanie reakcji przez zalkalizowanie mozna przeprowadzic w ten sposób, ze dodaje sie sub¬ stancje alkaliczna, która jest tak silnie alkaliczna, ze niewielka jej objetosc wystarcza do podwyzsze¬ nia wartosci pH. Najkorzystniej stosuje sie w tym celu substancje organiczne, na przyklad nizsze al- kanoloaminy, jak 2-amino-2-metylopropanol-l i trój- - (hydroksy-metylo)-aminometan.Przerwanie reakcji przez zakwaszenie mozna przeprowadzic w ten sposób, ze dodaje sie substan¬ cje kwasna, która jest tak silnie kwasna, ze nie- oe wielka jej objetosc wystarcza do obnizenia wartosci pH ukladu, która jednak nie jest tak silnie kwasna, aby mogla w jakikolwiek sposób uszkodzic poszcze¬ gólne skladniki ukladu. Takze w tym przypadku najkorzystniejsze sa substancje organiczne, na przy¬ klad nizsze kwasy alkanokarboksylowe, jak kwas octowy.Po przerwaniu reakcji doprowadza sie mieszani¬ ne do odpowiedniej objetosci, do okolo 10 ml, i odwirowuje lub przesacza w celu usuniecia wszy- 45 stkich nierozpuszczalnych skladników. Ciecz znad osadu, lub przesacz sa przezroczyste i maja takie samo zabarwienie, jak uzyty barwnik. Porównuje sie absorpcje swiatla dla cieczy znad osadu lub przesaczu z absorpcja dla próbki standardowej. 50 Barwnik ulega solubilizacji wskutek tego, ze en¬ zym atakuje skladnik skrobiowy kompleksu. Po¬ niewaz enzym hydrolizuje liniowa skrobie w spo¬ sób regularny, to ilosc barwnika, która do okreslo¬ nego momentu ulega solubilizacji w wyniku okre- 55 slonej aktywnosci enzymu, jest powtarzalna. Przy wykonywaniu testu sposobem wedlug wynalazku powtarzalnosc znajduje sie srednio w granicach 2—4% wartosci sredniej.Substrat, skladajacy sie z zabarwionego substratu 60 niu amylazy mozna korzystnie umieszczac w je¬ dnym zbiorniczku, który zawiera substrat, rozcien¬ czalnik i próbke standardowa.Substrat, skladajacy sie zabarwionego substratu amylazy, chlorku sodowego i buforu, mozna przy es tym umiescic na przyklad w jednej kapsulce.80 211 7 Rozcienczalnik mozna równiez umiescic w odpo¬ wiednim zbiorniczku, na przyklad w woreczku, za¬ wierajacym krysztaly substancji buforowej, która nalezy rozpuscic w wodzie przed uzyciem.Roztwór standardowy mozna umiescic na przy¬ klad w probówce lub w buteleczce; sklada sie on z odwazonej ilosci roztworu barwnika.Kompleks barwnika z amyloza nadaje sie do oznaczania amylazy sposobem wedlug wynalazku w materialach pochodzenia ludzkiego lub zwierze¬ cego.Przyklad I. Wytwarzanie kompleksu barwni¬ ka ze skrobia. a) 10 g barwnika Cibacron Brillant blau F3GA w 1 litrze wody dodaje sie mieszajac do zawiesiny 100 g amylozy w 1 litrze wody w temperaturze 50°C. Nastepnie dodaje sie powoli mieszajac w cia¬ gu 30 min. 200 g bezwodnego siarczanu sodowego, a potem 150 ml 10 %-owego roztworu fosforanu trójsodowego. W celu calkowitego przeprowadzenia reakcji miesza sie mieszanine reakcyjna w ciagu 75 min w temperaturze 50°C. Uzyskana zawiesine miesza sie przez noc w temperaturze pokojowej, przenosi do wirówki i odwirowuje w ciagu 20 min przy 2500—3000 obrotów na minute. Uzyskana sub¬ stancje stala przemywa sie, jeszcze raz odwirowuje i suszy. Uzyskuje sie w ten sposób niebieski produkt w postaci proszku, który jest kompleksem amy¬ lozy i barwnika Cibacron Brillantblau F3GA i któ¬ ry zawiera na mol czasteczek barwnika od okolo 7 do okolo 10 reszt cukru w amylozie. b) Jezeli zamiast barwnika Cibacron Brilliantblau F3GA uzyje sie jako barwnik Cibacron Brilliant orange G.E., a poza tym postepuje sie wedlug opisu, (podanego w przykladzie la), to uzyskuje sie po¬ maranczowy produkt w postaci proszku, który jest kompleksem amylozy i barwnika Cibacron Brilliantorange G.E. i który zawiera na mol czaste¬ czek barwnika od okolo 7 do okolo 10 reszt cukru w amylozie.Przyklad II. Oznaczanie aktywnosci amylazy. a) W kolbie stozkowej o pojemnosci 25 ml sporza¬ dza sie zawiesine 200 mg kompleksu amylozy z barwnikiem Cibacron Brilliantblau F3GA, uzyska¬ nego wedlug przykladu I, w 4,5 ml 0,04 molowego roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,0, który zawiera 0,05 mola chlorku sodowego, przy czym ogrzewa sie zawiesine do temperatury 40°C. Do tej zawiesiny dodaje sie nastepnie 0,1—0,4 ml ba¬ danego roztworu enzymu, po czym poddaje sie mieszanine reakcji w temperaturze 40°C w ciagu 15 min. w wytrzasarce. Nastepnie dodaje sie 1 ml 2-amino-2-metylopropanolu-l (0,5 mola; pH wyno¬ si 10,25), rozciencza mieszanine do objetosci 10,0 ml i odwirowuje. Mierzy sie absorpcje przy dlu¬ gosci fali 625 m dla cieczy znad osadu w porów¬ naniu z próbka standartowa. Próbke standartowa wytwarza sie wedlug powyzszego przepisu, po czym zamiast próbki enzymu stosuje sie 0,1—0,4 ml wody.' Przez pomiar absorpcji dla roztworów barwnika Cibaaron Brilliaintiblau F3GA, zawierajacych 100— 400[j, g barwnika w 10 ml mieszanego buforu fos¬ foranowego — alkanoloaminowego, sporzadza sie krzywa wzorcowa. 8 Wynik: a-amylaze z trzustki wieprzowej, roz¬ cienczona w stosunku 1 :10 000, uzyto jako zródlo enzymu; w ponizszej tabeli aktywnosc wyrazona za pomoca ilosci barwnika (w mg), która zostala 5 uwolniona przez 1 ml próbki enzymu.Tabela Roz¬ twór enzy¬ mu w ml 0,1 0,2 0,3 0,4 A625IX1 0,22; 0,43; 0,60; 0,80; 0,21 0,41 0,61 0,83 Uwolniony barwnik w mg 0,137; 0,131 0,256; 0,269 0,375; 0,381 0,500; 0,519 Wartosc srednia 0,134 0,262 0,378 0,509 Ilosc 1 bar¬ wnika mg/ /ml 1,34 1,31 1,26 1,27 b) 0,2 ml roztworu enzymu, zawierajacego 50— 250 ml jednostek amylazy (oznaczono reduktome- trycznie), dodaje sie do 4,5 ml 0,5—2,5%-owej za¬ wiesiny kompleksu amylozy Cibacron Brillant- orange G.E., uzyskanego wedlug przykladu I,, a 0,02—0,1 molowym buforze fosforanowym o pH = 7,0, który zawiera 0,01—0,05 mola chlorku sodo¬ wego. Mieszanine ogrzewa sie w ciagu 30 min w temperaturze 40°C.Przy koncu tego czasu reakcji dodaje sie 2 ml 1 n kwasu octowego i usuwa powstaly nierozpusz¬ czalny produkt. Mierzy sie absorpcje pozostalego roztworu w porównaniu z próbka kontrolna w spektrofotometrze przy dlugosci fali 490 m^i.Próbke wzorcowa sporzadza sie w taki sam spo¬ sób, przy czym jednak zamiast próbki enzymu stosuje sie wode destylowana.Wyniki podane w ponizszej tabeli jako ilosc uwol¬ nionego barwnika w stosunku do ilosci redukuja¬ cego cukru, wyrazonej jako glikoza.Tabela Jednostki enzymu glukoza/100 ml ' 50 125 250 Jednostki barwnika A490-X-103 80 345 680 Stosunek barwnik : I : glikoza [ 1,6 I 2,76 2,72 c) 1,0 ml ekstraktu grzybowego zawierajacego (3-amylaze (Diazym L30) dodaje sie mieszajac do zawiesiny 2,0 g kompleksu amylozy i barwnika Cibacron Brilliantblau F3GA w 100 ml 0,04 molo¬ wego buforu fosforanowego o wartosci pH = 4,5.Czesc tej mieszaniny w ilosci 2 ml stosuje sie jako próbke kontrolna i dodaje sie do niej 0,5 ml 0,1 molowego roztworu 2-amino-2-metylopropanolu-l.Mieszarie kontynuuje sie w temperaturze poko¬ jowej, pobierajac w okreslonych odstepach czasu kazdorazowo po 0,2 ml mieszaniny, na która dziala sie porcjami po 0,5 ml 0,1 molowego roztworu 2-amino-2-metylopropanolu-l w celu przerwania, reakcji. 15* 20 25 30 35 40 45 50 55 6080 211 9 Poszczególne próbki analizuje sie na zawartosc redukujacych cukrów (wyrazona jako glikoza) i na ilosc solubilizowanego barwnika.Wyniki przedstawione w ponizszej tabeli jako ilosc uwolnionego cukru w stosunku do ilosci redu¬ kujacego cukru wyrazonej jako glikoza.Tabela Próbka numer 1 2 3 4 5 Czas reakcji minuty 15 60 90 120 150 Glikoza mg/ /100 ml 55 162 227 260 312,5 Barwnik mg/ /100 ml 7,0 23,0 33,75 37,25 44,25 Stosunek barwnik: : glikoza l 0,13 0,14 0,15 0,14 0,14 Przyklad III. Zestaw odczynników do wyko¬ nania 100 testów na amylaze zawiera na przyklad nastepujace skladniki: a) Substrat: 200 kapsulek, z których kazda zawiera nastepujace substancje (w mg na kapsulke): substrat amylazy 200 jednozasadowy fosforan sodowy 1,94 bezwodny dwuzasadowy fosforan sodowy, chlorek sodowy 2,99 b) Rozcienczalnik: 1,38 g krystalicznego NaH2P04* * H20 do rozcienczania woda (pH = 4,2). c) Standard 15 ml standartowego roztworu o za¬ wartosci, odpowiadajacej 29,2 mg/100 ml, który sporzadza sie w nastepujacy sposób: 292,0 mg barwnika Cibacron Brilliantblau F3GA rozpuszcza sie w 1 1 wody destylowanej i roztwór ten dzieli na porcje 15 ml, którymi napelnia sie zamykane zbiorniczki szklane.Przyklad IV. Oznaczenie aktywnosci amylazy.Zawartosc kapsulki z substraitem, sporzadzonej we¬ dlug przykladu III, i 0,8 ml wody destylowanej umieszcza sie w 2 szklanych probówkach, z któ¬ rych jedna oznakowuje sie napisem „test", zas druga — napisem „slepa próba". Uzyskana zawie¬ sine miesza sie dokladnie i obie probówki ogrzewa sie w ciagu 10 min w temperaturze 37°C. Do pro¬ bówki oznakowanej napisem „test" dodaje sie 0,1 mola osocza i wytrzasa sie ja silnie. Obie pro¬ bówki sie ogrzewa nastepnie w ciagu dokladnie 15 min w temperaturze 37°C. 10 ml rozcienczalnika sporzadzonego przez roz¬ puszczenie 1,38 g NaH2P04 • H20 w pozbawionej jonów i przedestylowanej wodzie i dopelnienie do 100 ml dodaje sie do obu probówek. Nastepnie do probówki oznakowanej napisem „slepa próba" do¬ daje sie 0,1 ml osocza. Zawartosc probówek miesza sie dokladnie i odwirowuje w celu uzyskania kla¬ rownej cieczy nad osadem.Nastepnie porównuje sie przy dlugosci fali 625 mu (filtr czerwony) gestosc optyczna roztworu oznako- 10 wanego napisem „test" i roztworu oznakowanego napisem „slepa próba", po czym oznacza sie akty¬ wnosc amylazy na podstawie krzywej wzorcowej.W ponizszej tabeli podano wyniki wyrazone jako s ilosc uwolnionego barwnikaw przeliczeniu na 0,1 ml badanego roztworu przy zastosowaniu róznych pró¬ bek osocza.Tabela Próbka nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kontrolna próbka osocza Wartosc srednia Barwnik mg/0,1 ml 0,085 0,074 0,077 0,110 0,103 0,069 0,118 0,072 0,118 0,072 0,089 PL PL