DE1773330B1

DE1773330B1 - Reagenz und verfahren zur bestimmung von aldosen

Info

Publication number: DE1773330B1
Application number: DE19681773330
Authority: DE
Inventors: Arnold Dr Haertel; Roland Dr Helger; Hermann Dr Lang
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1968-05-02
Filing date: 1968-05-02
Publication date: 1972-01-20
Also published as: BE732223A; FR2007637A1; CH507519A; DE1773330C2; US3607077A; SE346387B; IL31981A0; NL6906734A; GB1248624A; IL31981A

Description

10 Teile o-Toluidin,

30 Teile Glykolsäure,

55 Teile Äthylenglykolmonomethyläther,

5 Teile Wasser.

11. Reagenz nach Anspruch 9, enthaltend jeweils

ungefähr

6 Teile o-Toluidin,
30 Teile Milchsäure,
60 Teile Glykol,

13 Teile Wasser,
0,1 Teil Thioharnstoff.

12. Reagenz nach Anspruch 9, enthaltend jeweils ungefähr 6 Teile o-Toluidin, 20 Teile Apfelsäure/ Glykolsäure, vorzugsweise im Verhältnis 1:1, 50 bis 70, vorzugsweise etwa 64 Teile Äthylenglykolmonomethyläther, bis zu 10, vorzugsweise etwa 5 Teile Methanol, bis zu 10, vorzugsweise etwa 5 Teile Wasser, bis zu 1, vorzugsweise etwa 0,1 Teil Thioharnstoff.

13. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 8, enthaltend jeweils ungefähr 2 bis 25 Teile eines aromatischen o-substituierten Amins, insbesondere o-Toluidin, bis zu 50, vorzugsweise 10 bis 30 Teile einer oder mehrerer hydroxylgruppenhaltiger Mono-, Di- bzw. Tricarbonsäuren, bis zu 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile Eisessig, 30 bis 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel vom Siedepunkt 90⁰C oder höher, gegebenenfalls bis zu 30 Teilen Wasser, gegebenenfalls bis zu 3 Teilen Thioharnstoff.

14. Verfahren zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere von Glucose, Galaktose oder Xylose, in gegebenenfalls enteiweißten Körperflüssigkeiten, durch Erhitzen der Probe mit der Lösung eines aromatischen o-substituierten Amins, insbesondere von o-Toluidin, und anschließende Extinktionsbestimmung des gebildeten Farbstoffs, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 13 anwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Extinktion bei Bestimmung von Aldohexosen im Bereich von 560 bis 680 nm und bei Bestimmung von Aldopentosen im Bereich von 440 bis 520 nm gemessen wird.

Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere Glucose, Galaktose oder Xylose, in Körperflüssigkeiten, enthaltend ein o-substituiertes aromatisches Amin, insbesondere o-Toluidin, eine Säure und gegebenenfalls Wasser und/oder Thioharnstoff.

In klinischen Laboratorien muß häufig die Konzentration von Aldosen in Körperflüssigkeiten bestimmt werden. Am wichtigsten ist die quantitative Bestimmung von Galaktose bzw. Xylose und insbesondere von Glucose, vorzugsweise im Blut. Glucosebestimmungen dienen vor allem der sicheren Diagnose und der Therapiekontrolle des Diabetes mellitus. Außerdem gibt der Blutzuckergehalt Hinweise auf eine Reihe anderer Stoffwechselstörungen (vgl. hierzu H. Hall-

mann, Klinische Chemie und Mikroskopie, S. 437, hundert Analysen pro Tag, wie es in großen Kliniken Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart [1950]). üblich ist, wird der Essigsäuredampf zum ernsten Pro-

Es sind schon eine große Zahl von Verfahren zur blem für die Arbeitskräfte.

Bestimmung von Aldosen, insbesondere zur Bestim- Es wurde schon vorgeschlagen, an Stelle von Eisessig

mung von Blutzucker, bekannt. 5 50%ige Essigsäure zu verwenden (Ärztl. Labor, 13,

Eine Reihe von bekannten Verfahren, beispielsweise S. 177 bis 180 [1967]), um die Geruchsbelästigung die aus Biochem. Zeitschrift, 135, S. 46 (1923); Bio- wenigstens teilweise zu verringern. Mit diesem Lösungschem. Zeitschrift, 320, S. 359 (1950), und Münch. med. mittel ergeben sich jedoch längere Reaktionszeiten und Wochenschrift, 75, S. 1301 (1928), bekannten Verfah- wesentlich geringere Farbausbeuten, so daß sich diese ren, beruhen auf dem Nachweis der reduzierenden Wir- io Methode in der Praxis nicht durchsetzen konnte,
kung der Glucose. Da bei diesen sogenannten Reduk- Es wurde nun gefunden, daß die oben angegebenen

tionsverfahren sämtliche reduzierende Stoffe mit erfaßt Nachteile für den Nachweis von Aldosen mit o-Toluiwerden, sind diese Bestimmungen jedoch unspezifisch. din vermieden werden können, wenn das Reagenz

Bei einer anderen Bestimmungsmethode wird die hydroxylgruppenhaltige Mono-, Di- und/oder Tri-Glucose mit entsprechenden Enzymen, beispielsweise 15 carbonsäuren und/oder gegebenenfalls Eisessig, gege-Glucoseoxydase, umgesetzt, und anschließend werden benenfalls zusammen mit einem Lösungsvermittler, die durch die Enzymreaktion entstandenen Produkte enthält.

gemessen. Die Enzymreaktion ist zwar spezifisch, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach

Indikatorreaktion aber störanfällig, z. B. gegenüber ein Reagenz zur Bestimmung von Aldosen, insbeson-Reduktionsmitteln, wie Ascorbinsäure. Deshalb kann 20 dere Glucosen, Galaktose oder Xylose, in Körperder Glucosegehalt mit Hilfe der Glucoseoxydase- flüssigkeiten, enthaltend ein o-substituiertes aromati-Methode z. B. in Urin nicht genau bestimmt werden. sches Amin, insbesondere o-Toluidin, eine Säure und Außerdem besitzt diese Methode ebenso wie auch die gegebenenfalls Wasser und/oder Thioharnstoff, das anderen enzymatischen Verfahren den Nachteil, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß die Säure aus einer die Enzyme nur begrenzt haltbar sind. 25 hydroxylgruppenhaltigen Mono-, Di- oder Tricarbon-

Ferner ist die Bestimmung von Glucose durch Um- säure oder aus einem Gemisch solcher Säuren besteht, setzung mit Anilin, p-Aminosalicylsäure, p-Bromanilin Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Ver-

oder Diphenylamin in Eisessig oder auch anderen fahren zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere von Säuren bekannt. Diese Reaktion wurde zum Sichtbar- Glucose, Galaktose oder Xylose, in gegebenenfalls entmachen von einzelnen getrennten Zuckern auf Papier- 30 eiweißten Körperflüssigkeiten, durch Erhitzen der zu und Dünnschichtchromatogrammen verwendet (vgl. untersuchenden Probe mit der Lösung eines aromatihierzu z. B. J. chrom., 24, S. 117 [1966], und Scand. sehen o-substituierten Amins, insbesondere von 0-T0-J. Clin. Lab. Invest., 20, S. 216 [1967]). Zur Bestim- luidin, und anschließende Extinktionsbestimmung des mung von nicht aufgetrennten Aldosengemischen ist gebildeten Farbstoffs, das dadurch gekennzeichnet ist, jedoch diese Methode schlecht geeignet, da die Reak- 35 daß man das vorstehend definierte und im folgenden tion unspezifisch ist. Unter den Bedingungen dieser näher beschriebene Reagenz anwendet.
Bestimmung absorbieren nämlich sowohl Aldohexosen, Ein Hauptvorteil des neuen Reagenzes besteht darin,

z. B. Glucose oder Galaktose, als auch Aldopentosen, daß der bisher verwendete Eisessig überflüssig ist bzw. Z. B. Xylose, und Ketosen, z. B. Fructose, im nahen nur in geringer Konzentration angewendet wird und UV-Bereich, so daß z. B. die Pentosen nicht getrennt 40 bei der Anwendung keine bzw. nur eine verminderte von den Hexosen gemessen werden können. Geruchsbelästigung auftritt und daß mit dem neuen

Gegenwärtig wird allgemein in den klinischen Labo- Reagenz eine günstige Reaktionsgeschwindigkeit und ratorien die beispielsweise in Nature, 183, S. 108 (1959), gute Farbausbeuten erzielt werden. Das neue Reagenz beschriebene Methode zur Blutzuckerbestimmung an- bietet die Möglichkeit, durch Veränderung der Kongewandt, bei der eine Lösung von o-Toluidin in Eis- 45 zentration seiner einzelnen Bestandteile die Geschwinessig als Farbreagenz verwendet wird. Dieses Reagenz digkeiten der Farbbildung und die Empfindlichkeit in kann durch einen Zusatz von Thioharnstoff, der einen weiten Grenzen den jeweiligen Erfordernissen anzu-Autoxydationsschutz bewirkt, stabilisiert werden, so passen. Man kann die Reaktion wesentlich empfindlidaß es gut haltbar ist (Clin. Chim. Acta, 7, S. 140 eher bzw. die Beständigkeit des gebildeten Farbstoffs [1962]). Der mit Glucose sich bildende Farbstoff wird 50 größer machen als bei den bisher bekannten Verfahren, bei der o-Toluidin-Methode bei 620 nm gemessen, Die glatte Bildung des spezifischen Farbstoffs mit

während mit dem Anilin-Eisessig-Verfahren im nahen dem Reagenz der vorliegenden Erfindung ist erstaun-UV-Bereich gemessen werden muß. Die o-Toluidin- lieh, da z. B. Halogenfettsäuren, Thiosäuren, nicht Methode hat den Vorteil, daß sie spezifisch für Aldo- hydroxylierte Dicarbonsäuren oder auch anorganische hexosen ist, wenn bei 620 nm gemessen wird, und daß 55 Säuren nicht die in dem Reagenz der vorliegenden Ersie für Aldopentosen weitgehend spezifisch ist, wenn findung vorzugsweise enthaltenen, gut wirksamen bei 480 nm gemessen wird. hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren vertreten kön-

Wegen der guten Spezifität gehört die o-Toluidin- nen. Außerdem können auch organische oder anorga-Methode heute zu den Standardmethoden im klini- nische Lösungsmittel ohne Säurezusatz nicht mit Erfolg sehen Laboratorium. Sie besitzt jedoch noch einen 60 für die Reaktion herangezogen werden, da mit ihnen großen Nachteil: Es ergeben sich große Schwierigkeiten keine meßbaren Farbausbeuten erhalten werden. Demdurch die Reizwirkung des als Lösungsmittel verwen- gegenüber liefert bemerkenswerterweise das Reagenz deten Eisessigs. Nahezu bei der gesamten Durchfüh- der vorliegenden Erfindung, in dem eine spezielle rung der Analyse, d. h. bei der Pipettierung des Rea- Gruppe von Säuren, gegebenenfalls in Kombination genzes, bei der Umsetzung der Glucose bei 100°C in 65 mit einem Lösungsvermittler, verwendet wird, ausge-Reagenzgläsern, bei der Messung im Photometer und zeichnete Meßergebnisse bei einfacher Handhabung beim Reinigen der Gefäße kommt es zu einer starken des Verfahrens.
Geruchsbelästigung. Bei der Durchführung von einigen Unter den für das erfindungsgemäße Reagenz zu

verwendenden aromatischen, in einer o-Stellung substituierten Aminen sind solche bevorzugt, die leicht destillierbar sind. Gegebenenfalls können die Amine auch in 3- und/oder 4- und/oder 5-Stellung zusätzlich substituiert sein. Die bevorzugt verwendeten Amine, insbesondere die durch niederes Alkyl, wie CH₃, C₂H₃, in o-Stellung oder in 2,3- oder 2,4- oder 2,5-Stellung substituierten Aniline, wie beispielsweise o-Toluidin, 2,3-Dimethylanilin, 2,5-Dimethylanilin, 2,5-Diäthyl-

mit Wasser mischbaren, hydroxylgruppenhaltigen organischen Lösungsmitteln enthalten. Bevorzugt sind hierbei Alkohole bzw. Polyole mit einem Siedepunkt über 90⁰C, insbesondere Diole. Vor allem sind niedere Alkohole und insbesondere niedere Diole mit bis zu 4 C-Atomen und mit einem Siedepunkt von 90³C oder höher, wie insbesondere Äthylan- und/oder Propylenglykol, geeignet. Weitere bevorzugte Lösungsvermittler sind Monoalkylglykoläther, insbesondere mit jeweils

anilin, 2,4-Xylidin, lassen sich leicht von den stets in io einem niederen Alkylrest verätherte niedere Glykole, größeren oder kleineren Anteilen enthaltenen stören- wie Methyl-, Äthyl- oder Butylglykoläther. Gegebenen

den Autoxydationsprodukten durch Destillation reinigen. Besonders bevorzugt ist o-Toluidin. Die Konzentration des Amins beeinflußt die Farbausbeute und die Beständigkeit des gebildeten Farbstoffes, so daß man durch Verändern der Konzentration ein den speziellen Erfordernissen angepaßtes Reagenz herstellen kann.

Die in dem Reagenz nach der Erfindung verwendeten Amine, in denen eine der beiden o-Stellungen substi-

Aldohexosen ein Maximum bei 620 nm (grüne Färbung) und können bei dieser Wellenlänge spezifisch gemessen werden, während Aldopentosen ein Maximum bei 480 nm bilden (rotbraune Färbung).

Unter den im Reagenz nach der Erfindung enthaltenen hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren werden kurzkettige Säuren, vor allem mit 2 bis 6 C-Atomen, bevorzugt. Geeignet sind z. B. Monohydroxymono-

falls können auch Gemische der vorstehend genannten Verbindungen als Lösungsvermittler verwendet werden. Bei Verwendung von Äthylenglykol-monomethyläther bildet sich vorteilhafterweise der Farbstoff außerordentlich rasch. Äthylenglykol besitzt den Vorteil, daß der Farbstoff in der Lösung außerordentlich beständig ist.

Zusätzlich zu den hydroxylgruppenhaltigen Mono-,

tuiert ist, insbesondere o-Toluidin, ergeben vorteil- 20 Di- bzw. Tricarbonsäuren kann das Reagenz nach der hafterweise nur mit Aldosen Färbungen. Dabei bilden Erfindung auch Eisessig als Säure enthalten. Bei Verwendung von Eisessig enthält das Reagenz stets einen Lösungsvermittler in Form von hydroxylgruppenhaltigen organischen Lösungsmitteln mit einem Siede-25 punkt von 90⁰C oder höher, insbesondere eines oder mehrere der oben aufgeführten bevorzugten Diole bzw. von deren Monoalkyläthern.

Neben dem Lösungsvermittler, der im allgemeinen aus hydroxylgruppenhaltigen organischen Lösungscarbonsäuren, vorzugsweise niedere «-Hydroxymono- 30 mitteln besteht — oder in einigen Fällen, beispielsweise carbonsäuren, insbesondere Glykolsäure und/oder bei Verwendung von Milchsäure, auch an Stelle dieses Milchsäure, ferner hydroxylierte Dicarbonsäuren, vor- Lösungsvermittlers — kann Wasser im Reagenz nach zugsweise eine bis zwei Hydroxylgruppen enthaltende der Erfindung enthalten sein. Durch Veränderung des niedere Dicarbonsäuren, insbesondere Apfelsäure und/ Wassergehalts in dem Reagenz läßt sich die Geschwin- oder Weinsäure. Geeignet sind ferner auch hydroxyl- 35 digkeit der Farbstoffbildung und die Empfindlichkeit gruppenhaltige Tricarbonsäuren, insbesondere Citro- des Reagenzes weitgehend den jeweiligen Erfordernensäure. Allerdings erhöhen Hydroxytricarbonsäuren
die Viskosität der Reagenzlösung, so daß hydroxylgruppenhaltige Mono- bzw. Dicarbonsäuren im Reagenz der Erfindung bevorzugt angewandt werden.

Durch Anwendung verschiedener hydroxylgruppenhaltiger Carbonsäuren im Reagenz der vorliegenden
Erfindung lassen sich unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten erzielen. Auch durch Verändern der
Konzentrationen der angewandten hydroxylgruppen- 45
haltigen Carbonsäuren läßt sich die Geschwindigkeit
der Farbstoffbildung und Empfindlichkeit des Reagenzes in weiten Grenzen variieren und an die jeweiligen Erfordernisse anpassen. Besonders bewährt haben
sich außerdem Gemische von Säuren, um das Kristalli- 5° Stoffs zu erzielen, sieren des Reagenzes auch unter extremen Bedingungen Im Reagenz können gegebenenfalls auch noch andere

zu verhindern und um soweit wie möglich leicht her- . organische Lösungsmittel enthalten sein, die die Farbstellbare bzw. leicht zu reinigende Säuren einsetzen zu stoff bildung und Extinktionsmessung nicht stören. Vor können, insbesondere Gemische gut kristallisierender allem hat sich der Zusatz einer geringen Menge von Säuren wie Äpfel- und Weinsäure untereinander, oder 55 Methanol (z. B. bis zu 15 Gewichtsprozent, vorzugs-Gemische dieser gut kristallisierenden Säuren mit weise etwa 5 Gewichtsprozent) zu dem Reagenz nach

40

nissen anpassen. Die Anwendung von Wasser ist besonders in den Fällen empfehlenswert, in denen die Bildung von inneren Estern aus den Hydroxycarbonsäuren bzw. von Estern aus diesen Säuren mit den hydroxylgruppenhaltigen organischen Lösungsmitteln verhindert werden soll. Außerdem ist die aus dem Amin und der Aldose gebildete farbige Verbindung in Gegenwart von Wasser etwas stabiler.

Durch geeignete Konzentrationsverhältnisse des Lösungsvermittlers bzw. des Wassers bzw. der hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren und/oder des Eisessigs bzw. des Amins ist es möglich, die optimale schnelle Bildung eines über längere Zeit stabilen Farb

schlechter kristallisierenden Säuren, wie Milchsäure oder Glykolsäure. Zum Beispiel kann man folgende Gemische verwenden: Äpfelsäure/Weinsäure; Apfelsäure und/oder Weinsäure mit Milchsäure und/oder Glykolsäure, oder auch Glykolsäure/Milchsäure. Die Konzentration, in der die Säuren zugesetzt werden, ist u. a. von der Löslichkeit der Säuren abhängig. Gut
lösliche Säuren, z. B. Milchsäure, können in einer

der Erfindung bewährt. Weitere geeignete Lösungsmittel, die in geringer Menge zugesetzt werden können, sind z. B. Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykolsäureester, z. B. Glykolsäuremethylester.

Zur Verbesserung der Stabilität kann das Reagenz nach der Erfindung außerdem noch Thioharnstoff enthalten.

Der im folgenden angegebene Gehalt der vorstehend

Konzentration bis zu 90 °/₀ im Reagenz enthalten sein. 65 aufgeführten einzelnen Bestandteile des neuen Rea-

Neben den hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren genzes hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. (Die

ist in dem Reagenz der Erfindung bevorzugt ein zusatz- Angaben im folgenden bedeuten Gewichtsteile pro

licher Lösungsvermittler, insbesondere in Form von 100 Gewichtsteile Reagenz.)

7 8

Mischung A

Aromatisches, in o-Stellung und gegebenenfalls in 3- und/oder
4- und/oder 5-Stellung substituiertes Amin, vorzugsweise
o-Toluidin 2 bis 25, insbesondere 4 bis 15 Teile

Hydroxylgruppenhaltige Carbonsäuren, wie vorzugsweise Glykolsäure, Milchsäure, Apfelsäure und/oder Weinsäure 5 bis 90, insbesondere 15 bis 50 Teile

Lösungsvermittler, vorzugsweise hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel mit Siedepunkt 90° oder höher bis zu 85, insbesondere 40 bis 80 Teile

Gegebenenfalls Wasser bis zu 70, insbesondere 0,2 bis 10 Teile

Gegebenenfalls Thioharnstoff bis zu 3, insbesondere 0,02 bis 0,5 Teile

Gegebenenfalls zusätzliche inerte organische Lösungsmittel,
insbesondere Methanol bis zu 15, insbesondere 5 Teile

Lösung B
Sofern Eisessig als zusätzliche Säure verwendet wird, ändert sich der Gehalt der Einzelbestandteile wie folgt:

Eisessig bis zu 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile

Hydroxylgruppenhaltige Mono-, Di- bzw. Tricarbonsäuren bis zu 50, vorzugsweise 10 bis 30 Teile

Hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel (Kp. 90° oder

höher) als Lösungsvermittler 30 bis 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile

Aromatisches, o-substituiertes Amin, Wasser, Thio- doch auch mit kürzeren Zeiten arbeiten, da Standardharnstoff und gegebenenfalls zusätzliches inertes orga- und Analysenproben stets gleich behandelt werden und nisches Lösungsmittel sind in derselben Konzentration da in das Ergebnis nur das Verhältnis der Extinktionen wie in Mischung A enthalten. 25 eingeht. Nach dem Abkühlen des Gemisches wird die Für die Herstellung des Reagenzes nach der Erfin- Extinktion der Lösung gegen eine Blindprobe bei einer dung können die Bestandteile in beliebiger Reihenfolge geeigneten Wellenlänge gemessen. Bei Verwendung zusammengegeben werden. Vorteilhafterweise löst man von o-Toluidin mißt man beispielsweise bevorzugt in die hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren bzw. den einem Bereich von 540 bis 700 nm, beispielsweise bei Eisessig in dem angewandten Lösungsvermittler, der 30 dem Maximum von etwa 620 nm. Der Gehalt an im allgemeinen aus einem hydroxylgruppenhaltigen Aldose, z. B. Glucose, ergibt sich durch Vergleich des organischen Lösungsmittel (Kp. 90 C oder höher), ermittelten Wertes mit dem Meßwert einer Standardgegebenenfalls zusammen mit Wasser und/oder Thio- probe bekannten Gehalts. Die Reaktion kann in übliharnstoff, besteht, auf und gibt danach das aroma- eher Weise, z. B. von Hand, in Reagenzgläsern oder tische o-substituierte Amin zu. Die einzelnen Bestand- 35 mit Hilfe eines Analysenautomaten, beispielsweise in teile des Reagenzes sollten in reiner Form eingesetzt Analogie zu dem in Clinica Chimica Acta, 11, S. 88 werden, um die Blindwerte bei der Messung niedrig (1965), angegebenen Verfahren, durchgeführt werden, zu halten. Zur Galaktosebestimmung wird die eventuell vor-Die Anwendung des Reagenzes für die Bestimmung handene Glucose vorher mit Glucoseoxydase selektiv von Aldosen, insbesondere von Glucose, Galaktose 40 oxydiert. Die Messung des Galaktosegehalts erfolgt bzw. Xylose, in Körperflüssigkeiten, erfolgt in an sich dann bei 620 nm wie bei der Glucosebestimmung. Bei bekannter Weise. Als Körperflüssigkeiten können ins- der Xylosebestimmung empfiehlt sich auch die vorbesondere Blut, Plasma, Serum, Liquor oder Urin herige Anwendung der Glucoseoxydase-Oxydation. untersucht werden. In den meisten Fällen, insbesondere Die Messung des Xylosegehalts erfolgt bei 480 nm im bei der Untersuchung von Blut, ist die zu untersuchende 45 Bereich des Extinktionsmaximums des rotbraunen Probe zuerst mit einem üblichen hierfür angewandten Farbstoffs.

Mittel, insbesondere Trichloressigsäure, Perchlorsäure Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläute-

oder Uranylacetat zu enteiweißen. Nach der Enteiwei- rung der Erfindung, ßung wird zweckmäßigerweise der Eiweißniederschlag

abfiltriert oder abzentrifugiert, bevor die Aldosen- so B e i s ρ i e 1 1

bestimmung ausgeführt wird. Bei Verwendung von _, _ . „.

Serum, Plasma oder Liquor und Urin kann gegebenen- ^Rea8^{enz zur} Bestimmung von Glucose

falls auf die Enteiweißung verzichtet werden. _{a) Zusammense}tzung des Reagenzes

Zur Bestimmung wird ein aliquoter Teil der Vorzugs- ^o ml o-Toluidin

weise enteiweißten Lösung mit einer abgemessenen 55 35 _mj Milchsäure (85°/ ig)

Menge einer Lösung des Reagenzes nach der Erfindung _{50 ml} Äthylenglykolmo°nomethyläther

versetzt und in üblicher Weise anschließend fur eine 3 1 Wasser bestimmte Zeit auf eine feststehende Temperatur, z. B.

etwa 100⁰C, erhitzt. Die angewandten Zeiten liegen, _{b) Durchführung einer} Glucosebestimmung

sofern der Wassergehalt gering ist, bei etwa 4 bis 60 j_m ßj_ut 10 Minuten bzw., sofern der Wassergehalt höher oder

die Temperatur niedriger ist, bei bis zu etwa 60 Minu- 0,05 ml Blut und 0,5 ml 3%ige Trichloressigsäure

ten. Die genaue optimale Erhitzungszeit wird für die werden vermischt und zentrifugiert. Anschließend

betreffende Reagenzzusammensetzung und Reaktions- mischt man 0,2 ml des erhaltenen eiweißfreien Uber-

temperatur jeweils ermittelt. Man wählt zweckmäßiger- 65 stands mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenzes

weise die Zeit, in der bei der betreffenden Reaktions- und erhitzt die Lösung 10 Minuten lang im siedenden

temperatur mindestens 98 °/o der maximalen Farbaus- Wasserbad. Nach dem Abkühlen wird die Extinktion

beute erreicht ist. In dringenden Fällen kann man je- der Lösung bei 578 nm gegen einen Blindwert ge-

messen. Die Berechnung erfolgt durch Vergleich mit oxydase. Das Gemisch wird 1/2 Stunde lang stehen-

dem Meßergebnis einer Standardprobe.

Beispiel 2

Reagenz zur Bestimmung von Glucose
a) Zusammensetzung des Reagenzes

6 ml o-Toluidin
30 ml Milchsäure
60 ml Glykol
13 ml Wasser

0,1 g Thioharnstoff

b) Durchführung einer Glucosebestimmung

im Serum

0,02 ml Serum werden mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenzes gemischt und 20 Minuten lang auf 90° C erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 623 nm gegen einen Blindwert. Der Gehalt wird an einer Eichkurve abgelesen, die mit Lösungen bekannten Glucosegehaltes in entsprechender Weise erhalten wurde.

Beispiel 3

Reagenz zur Xylosebestimmung
a) Zusammensetzung des Reagenzes

0,6 ml o-Toluidin
1,2 g Apfelsäure
1.2 g Glykolsäure

6 ml Äthylenglykolmonomethyläther
0,5 ml Methanol
0,5 ml Wasser
10 mg Thioharnstoff

b) Durchführung einer Xylosebestimmung
bei Xylosebelastungsversuchen

0,1 ml Urin werden mit 1 ml Phosphatpuffer (pH = 7.0, 0,1 Mol) und — zur Zerstörung der in der Probe enthaltenen Glucose — mit 0,5 mg Glucoseoxydase (30 μ/mg) versetzt. Man läßt die Lösung 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen und vermischt 0,2 ml dieser Lösung mit 2 ml des vorstehend unter a) beschriebenen o-Toluidin-Reagenzes. Das Gemisch wird 6 Minuten im siedenden Wasserbad oder 30 Minuten auf 8O⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 480 nm in einer 1-cm-Küvette gegen einen Blindwert. Der Gehalt ergibt sich durch Vergleich mit dem Meßwert einer Standardprobe.

Beispiel 4

Reagenz zur Galaktosebestimmung
bei Galaktosebelastungsversuchen

a) Zusammensetzung des Reagenzes

Für das Reagenz werden die im Beispiel 3. a) aufgeführten Bestandteile verwendet.

b) Durchführung der Galaktosebestimmung
bei Galaktosebelastungsversuchen

0,1 ml Blut werden mit 1 ml einer Lösung von 160 mg Uranylacetat und 900 mg Natriumchlorid in 100 ml Wasser versetzt. Man zentrifugiert und vermischt 0,5 ml des erhaltenen eiweißfreien Überstands mit 0,5 ml Phosphatpuffer (pH = 7.5, 0,2 Mol) und gelassen. Anschließend werden 0,5 ml dieser Lösung mit 5 ml Reagenzlösung 8 Minuten lang auf lOOC erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 620 nm gegen einen Blindwert (2-cm-Küvette). Der Gehalt ergibt sich durch Vergleich mit dem Meßwert einer Standardprobe.

Beispiel 5 10

Reagenz für Glucosebestimmung

a) Zusammensetzung des Reagenzes

0,60 ml o-Toluidin
[₅ Ig Apfelsäure

1 g Glykolsäure

6,4 ml Äthylenglykolmonomethyläther 0.5 ml Methanol

0,05 ml Wasser
0.01 g Thioharnstoff

b) Durchführung einer Glucosebestimmung

im Urin

0.2 ml einer 1:10 verdünnten Diabetiker-Urinprobe werden mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenzes 5 Minuten lang auf 100^c C erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 623 nm gegen einen Blindwert und berechnet hieraus durch Vergleiche mit einer Standardprobe den Glucosegehalt. In analoger Weise kann mit dem unter a) beschriebenen Reagenz auch der Glucosegehalt im Plasma, Serum oder Liquor bestimmt werden.

Beispiel 6 Reagenz für Glucosebestimmung

a) Zusammensetzung des Reagenzes

0,6 ml o-Toluidin
1 g Apfelsäure
1,5 g Milchsäure (80%ig)
6 ml Äthylenglykolmonomethyläther 10 mg Thioharnstoff

b) Glucosebestimmung im Vollblut

0.1 ml der Probe werden mit 1 ml einer Lösung von 5 g Trichloressigsäure in 100 ml Wasser versetzt. Man zentrifugiert, versetzt 0.2 ml des erhaltenen eiweißfreien Überstandes mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenzes und erhitzt das Gemisch 6 bis 8 Minuten lang im siedenden Wasserbad. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 578 nm gegen einen Blindwert. Die Berechnung erfolgt an Hand einer Eichkurve oder durch Vergleich mit den Meßwerten einer Standardprobe.

Beispiel 7

Reagenz zur Bestimmung von Glucose bzw. Galactose oder Xylose

Zusammensetzung des Reagenzes

1 ml o-Toluidin

2 ml Eisessig und 2 ml Glycolsäure 5 ml Äthylenglykolmonoäthyläther 1 ml Wasser

10 mg Thioharnstoff

Die Durchführung der Bestimmungen mit dem Rea-

zur Zerstörung von Glucose — mit 0,5 mg Glucose- genz erfolgt analog Beispiel 4.

11 12

Beispiel 8 Die Durchführung der Bestimmungen mit dem

Zusammensetzung des Reagenzes ^ReaS^{enz εΓίοΙ}§^{1 analo}S ^BeisP^iel *» ^{3 oder 5}·

2 g Mandelsäure Beispiel 11

8 ml Äthylenglykolmonomethyläther 5

0,1 ml 10%ige Thioharnstofflösung Zusammensetzung des Reagenzes

0,6 ml o-Toluidin _{25g Salic}y_lsäure

An Stelle von Mandelsäure kann das Testreagenz ⁰^ ml ip⁰A>ige Thioharnstofflösung

auch 2 g p-Methoxysalizylsäure enthalten. 7,5 ml Äthylenglykolmonomethyläther

Die Durchführung der Bestimmungen mit dem ¹⁰ ¹ ^ml o-Toluidin

Reagenz erfolgt analog Beispiel 1, 3 oder 5.

Die Durchfuhrung der Bestimmungen mit dem

„ . . , „ Reagenz erfolgt analog Beispiel 2, 3 oder 4.

Beispiel9

Zusammensetzung des Reagenzes 15 B e i s ρ i e 1 12

0,8 g Apfelsäure, 0,8 g Glykolsäure und 0,8 g Salicyl- Herstellung des Reagenzes

säure werden in einem Gemisch von 6 ml Äthylen- ^ „,.,.. , . , _TT. . . . , ·.· ,

glykolmonomethyläther, 0,6 ml einer 2%igen wäßrigen , ⁵ f Sa icylsaure werden in der Hitze in 4,5 ml Athy-

Thioharnstofflösung, 0,6 ml Methanol und 1 ml 0-T0- ^englykolmonomethyla her gelost Man _glbt 0,1 ml

luidin eelöst ²⁰ /0¹S⁶ Thioharnstofflösung und 0,6 ml o-Toluidin

Die Durchführung der Bestimmungen mit dem Rea- ^hinA^u _n ^{und f},^{ÜIlt mit} Äthylenglykolmonomethyläther

genz erfolgt analog Beispiel 1 oder 5. ^auLf^ü™ ¹⁸T' , _D ,. . , _D

Die Durchfuhrung der Bestimmungen mit dem Rea-

„ . . , _Λ „ genz erfolgt analog Beispiel 1 oder 6.

Beispiel 10

Zusammensetzung des Reagenzes Beispiel 13

2 g 2,4-Dihydroxybenzoesäure . . _ .. . .. ₁ ·.· „ . .. , _Λ „, , .

8 ml Äthylenglykolmonomethyläther .. °'⁴ § Salicylsäure Ig Apfelsaure und I gGlykol-

0,1 ml 10»/₀ige Thioharnstofflösung saure werden in 5 ml Äthylenglykolmonomethyläther,

0,1 ml 10/₀ige Thioharnstofflösung

0,6 ml o-Toluidin ³° ^{2 ml P} _c ^roP^ano1 ^d.⁰'?-?¹¹ o-Toluidin gelost.

An Stelle von Salicylsäure kann das Testreagenz auch

An Stelle von Mandelsäure kann das Testreagenz 0,4 g p-Hydroxybenzoesäure enthalten, auch 2 g Dimethylsalicylsäure (Isomerengemisch) ent- Die Durchführung der Bestimmungen mit dem

halten. Reagenz erfolgt analog Beispiel 1, 5 oder 7.

Claims

Patentansprüche:

1. Reagenz zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere Glucose, Galaktose oder Xylose, in Körperflüssigkeiten, enthaltend ein o-substituiertes aromatisches Amin, insbesondere o-Toluidin, eine Säure und gegebenenfalls Wasser und/oder Thioharnstoff, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure aus einer hydroxylgruppenhaltigen Mono-, Di- oder Tricarbonsäure oder aus einem Gemisch solcher Säuren besteht.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Lösungsvermittler enthält.

3. Reagenz nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als zusätzliche Säure Eisessig enthält.

4. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als hydroxylgruppenhaltige Mono-, Di- oder gegebenenfalls auch Tricarbonsäuren vorzugsweise niedere Monohydroxymonocarbonsäuren und/oder niedere Mono- oder Dihydroxydicarbonsäuren, insbesondere Glykolsäure, Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure und/oder Zitronensäure, enthalten sind.

5. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Apfelsäure und/oder Weinsäure, gegebenenfalls in Mischung mit Milchsäure und/oder Glykolsäure enthalten sind.

6. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel, vorzugsweise mit einem Siedepunkt von 90⁰C oder höher, gegebenenfalls unter Zusatz einer geringen Menge Methanol, enthalten sind.

7. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler Monoalkylglykoläther und/oder Glykole, insbesondere niedere Monoalkylglykoläther und/oder niedere Glykole, enthalten sind.

8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler Äthylenglykolmonomethyl- und/oder -äthyläther und/oder Äthylen- und/oder Propylenglykol enthalten sind.

9. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Bestandteile in den nachstehend angegebenen ungefähren Gewichtsteilen pro 100 Gewichtsteile Reagenz enthalten sind: 2 bis 25 Teile eines aromatischen o-substituierten Amins, insbesondere o-Toluidin, 5 bis 90 Teile einer oder mehrerer hydroxylgruppenhaltiger Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren, gegebenenfalls bis zu 85 Teilen hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel, insbesondere mit Siedepunkt 90⁰C oder höher, gegebenenfalls bis zu 70 Teilen Wasser, gegebenenfalls bis zu 3 Teilen Thioharnstoff, gegebenfalls zusätzliches organisches Lösungsmittel: bis zu 15 Teilen.

10. Reagenz nach Anspruch 9, enthaltend jeweils ungefähr