DE2025236A1 - Verfahren zur Bestimmung des östrogengehalts im Urin von Schwangeren - Google Patents

Description

RECHTSANWALT!

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIl

ALFRED HOSP₁-ENER

DR. JUR. DIPL.-CHEM. R-J. WOlFF

DR. JUR. HANS CHR. BEIL FRANKFURTAM MAIN-HOCHS? ADOONSTKASSt SB '

Unsere Nr. : 16 343

Searle Reference Laboratories, Inc. Powell, Ohio. V.St.A. -

Verfahren zur Bestimmung des Östrogengehalts im Urin von

Schwangeren

Die Erfinaung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der gesamten Östrogene, die im Urin einer schwangeren Frau enthalten sind.

Die meisten der Steroide im Urin liegen in Form eines konjugierten Derivats vor, das mit den üblichen organischen Lösungsmitteln nicht extrahierbar ist. Gewisse Methoden zur Bestimmung von Steroidkonzentrationen setzen voraus, daß das Steroid mittels Hydrolyse von dem konjugierenden Mittel befreit wird. Die Hydrolyse setzt das Steroid frei und ermöglicht dessen Extraktion aus der wässrigen (Urin-)Probe in das ausgewählte organische Lösungsmittel. Auf diese Weise kann es aus der biologischen Flüssigkeit gewonnen werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Hydrolyse des Steroids ohne Verwendung einer starken Mineralsäure, sondern unter Verwendung der mäßig starken, kristallinen Dicarbonsäure Oxalsäure (pK^= 1,42; pKp= 4,31.) Die Verwendung von Oxalsäure anstelle von starken Mineralsäuren zum Zwecke der Hydrolyse des Steroids bringt folgende Vorteile:

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1) Fehlen von Artifact-Bildung;

2) Fehlen von unerwünschten chemischen Umwandlungen:

a) Isomerisierungen,

b) Dehydratationen,

c) Gesamtabbau des Steroids; ·

3) Schnelle Analyse;

4) Bequemer Transport;

5) Sicherer Transport;

6) Bequeme Analyse.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Oxalsäure zur Hydrolyse konjugierter Steroide zu freien Steroiden verwendet, die aus der boilogischen Flüssigkeit extrahiert und mittels einer geeigneten chemischen Methode analysiert werden können.

Es ist bekannt, daß während der Schwangerschaft der Titer aller östrogene etwas ansteigt, während der Gehalt an Östriol, inabesondere während des dritten Trimesters, in überwältigendem Maße zunimmt und alle Mengen übersteigt, die der mütterlichen Sekretion zugeordnet werden können. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß die große Menge an Östriol, die mit dem mütterlichen Urin ausgeschieden wird, das Ergebnis der plazentaren Umwandlung von 16-OH-Dehydroepiandrosteron zu Östriol ist, welches auf fötaler adrenaler Sekretion beruht. Auf dieser Erscheinung beruht die Bestimmung des "plazentaren östriols", einem der besten Anzeichen für das Wohlbefinden des fötal-plazentaren Komplexes.

Obgleich es spezifische Methoden zur Bestimmung-von Östriol gibt, ist es bequemer, die gesamten Östrogene zu messen. Die östriol-spezifischen Methoden sind komplizierter und dauern langer, als die Gesamtöstrogen-Verfahren. Da der Kliniker häufig auf eine rasche Mitteilung der Untersuchungsergebnisse angewiesen ist, ist es das Ziel dieser Erfindung, die Gesamtöstrogene in relativ kurzer.Zeit zu bestimmen.

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Dtr Jehalt des Urins an Östrogenen nimmt während einer Schwangerschaft, die durch Diabetes der butter, Schwangerschaf tatoiikose oder vorzeitiges plazentares Altern verkompliziert wird, ständig ab. Neuere Entwicklungen bei der Extraktion der Kober-Jhromogtne aus den nichtppezifischen Chroir.Of'fr.'n, aie früher dem Analytiker gro^e Schwierigkeiten bereitete, haben es nunmehr mörlich gemacht, Mengen zu bestimmen, nie tiiähcr in kleinen Urint.rcben ur.ir.Örlieh bestimmt werden koi.nten.

Das erfindungsgemä^e Verfahren wird generell wie folgt durchgeführt: Eine Milliliter-Froce einer ei:, konjugiertes Steroid enthaltenden 24-Ütunder.-Urinprobe, wird ir.it kri.= tall int: r Cx'iloäure h.yirolysiert, die sich oeim Erv.ärmen auflöst und bein- Abkühlen wieder aunkristallisiert. Bit fr igesetzten Östrogene .(üatriül macht über 95^ des Gesamten aur) werden mit einem ucrungi3mi*tel extrahiert, vor. welchem ein aliquoter Teil in ein Färb gleichen übergeführt und getrocknet wird. Bekannte !«'engen an wötriol werden in identische Hchrchon einpipettiert und die Farben entwickelt, extrahiert und ir. einem Spektrophotometer bei verschiedener. Wellenlängen miteinander verglichen, wobei man aion der Allen-Kcrrektar bedient, um den Hintergrundeffekt zu mininmlieieren.

Eins oder mehrere der folgender, 3tercid-Kon,jugate, die im Urin einer schwangeren 1-rau enthalten ^cin können, können mittels Oxalsäure erfindungagemä3 hydrolysiert werden:

Üstra-1,3,5 (iO)-trien-i7-cn-3.vl-i:ulfat östra-1,3,5 (K)-trien-17^/?-oi-3-yl-sulfat Östra-1,3,5 (lO)-trien-3,17/³ -diyl-suifat Östra-1,3,5 (iO)-trien-16 x , 17,--diol-3-.yl-sulfat Östra-1,3,5 (1C)-trier.-17-cn-3-yi- - -D-glucopyranosiduron-

■ säure

Östra-1,3,5 (10)-trien-3,17 ³ -dicl-16^-yl-/³-D-glucopyra-

ncsiiuronsäure

Östra-1,3,5 (10)-trien-17 --cl-3,16-> -dij^l-j'-D-glucopyrsnc-

siduronsäure

Östra-1,3,5 (iO)-trien-3 ,16.X-OiCl-17 '^-yl- ^D-glucopyranc-

sidurcnsäure

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BAD ORIGINAL·

Öetra-1,3,5 (10)-trien-16ot~oX-3-JSrX-euX£at-17A-yX-A-lK

gltio öpy ranoe i .dur on® äure

5/3 -A«drosta*!-1 7-»ojs»3 e€-^>yX*-/^-3D-

-Androstan-17-o»*3oC -»y X*-/^-D-gluoopyrattbsidunDinsäure

ry glucopyranosidurniin8äure

gnan-20-on-3^-yX-/^-D-glucopyranosidurminsa'ure

pregnan-.20*on-2X^yX-/3-D-glucopyranosiduraiinBäure

In jedem Fall liefert die Hydrolyse mit Oxalsäure ein freies Steroid oder Ostrogen, das durch Messung der Gesamtöstrogen-Konzentration kolorimetrisch analysiert werden kann.

Die Reaktion zwischen den vorstehend genannten, im Urin einer schwangeren Frau enthaltenen Steroiden und Oxalsäure gemäß dieser Erfindung sollte am Siedepunkt der Hyarolyselösung durchgeführt werden. In dem angegebenen Testverfahren enthält die Hydrolyselösung 1 g Oxalsäure und 200 mg Natriumchlorid. Die !Siedetemperatur liegt in den meisten Fällen, in Abhängigkeit vom atmosphärischen Druck und anderen Variablen, zwischen 90 und 110 C. Der am meisten bevorzugte Temperaturbereich liegt etwa zwischen 95 und 10O⁰C.

Das Mengenverhältnis von trockener, kristalliner Oxalsäure oder einer anderen zufriedenstellenden Säure zu der Urinprobe schwankt von etwa 1/2 g/ml bis su etwa 2 g/ml. Die Erhitzungezeit für die aus Säure und konjugiertem Steroid bestehenden Hydrolyseprobe liegt gewöhnlich zwischen 20 und 120 Minuten. Im nachfolgenden wird Stufe für Stufe die Technik erläuterte die erfißdungsgemäß zur Bestimmung der üstrogeBkonzentrationen im Uriia ang©weudet wird ι

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EXTRAKT IOB

1. Urinzugabe. In das Hydrolyseröhrchen, das 200 mg NaGl

und 1 g Oxalsäure enthält, werden 1,0 ml Urin gegeben, das Härchen wird verstöpselt,·, und ein Loch wird in den Stöpsel gemacht.

2. 1 Std. Kochen. Während der ersten Minuten wird mehrere Haie gemischt, um die Säurekristalle' aufzulösen.

3. LANGSAMES Abkühlen auf Raumtemperatur, so daß sich große Kristalle bilden." (Röhrchen neigen, so daß sich die Kristalle an der Seitenwandung des Röhrchens anstatt am Boden bilden.)

4. Zugabe des Extraktionslösungsmittels (Dichlormethan).

10,0 ml Extraktionslösungsmittels in das abgekühlte Röhrcnen geben. .

5. Röhrchen wieder verschließen5 Finger über das Loch legen und 30 sek#heftig schütteln *

6* In der Zentrifuge schleudern, bis das Lösungsmittel klar

ist. ' ·

7. Urin vom Lösungsmittel absaugen,
ö. 5,0 ml Lösungsmittel aus dem Proberönrchen in ein Farb-

röhrehen überführen.
9. 0,5 und 1,0 ml STANDARD-LÖSUNG (10/Ug/ml Östriol) in zwei

andere Farbröhrchen einpipettieren. 10. Die drei Röhrchen trocknen. Die drei Farbröhrchen zur i'rookne einengen.

F A R B E IT T ¥ I 0 K L U N G

1. Reagens zusetzen. In jedes Farbröhrchen 1,5 ml FARBREAGENS (Hydrochinon enthaltende Schwefelsäure) geben. Mischen,

2» 20 Minuten kochen| während der ersten 6 Minuten noch 2mal aieohtn.

3« In Wasserbad abkühlen.

4. Waeaer zueetzeni 0,5 ml cieatillitrtes Wasser in jedes Röhrchen. Mischen.

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5. Wieder ins Siedebad für 1u Minuten.

6. Im Eisbad abschrecken.

PAHB JS XTR A KTIO N

1. Lösung 1 zugeben. 1,2 ml FARBEXTRAKTIGNSluJÜNG 1 zusetzen (2 η Trichloressigsäure). 15 Sek„ schütteln unä für 2 äiin, ins Eisbad zurückstellen.

2. Lösung 2 zusetzen. 3,0 ml FARBEXTRAKTICNJLCSUiIG 2 (Chloroform) zugeben. 15 3ek. sehwach schütteln.

3. 2 Min. schleudern. Obere Schicht absagen und untere Schicht in Küvetten gießen. Bei,504, 534 und 564 m/U

gegen Wasser ablesen.

Die folgenden Reaktionsgleichungen sind typische Beispiele für die erfin dungs gemäß ablaufenden Hydrolysereaktioner,:

I I I I I I

»HOOO-C-C-C-C-C-Ö I I I I OH H₁

•»Oxalsäure (90-110⁰O

+ Glucoronsäure +

(17- β - ÖSTRADIOL-GtllCÜHOHlD)

+Oxalsäure (90-11O⁰C)*

+H₂SO₄ +2 CO₂

!-ß~ ÖSTBADIOL-3-SUIFAT) *Η⁺ kann auch ein einwertiges Metall, wie Ma oder K sein*

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BAD ORIGINAL

Beispiel

1 al einer 24-Stundea-tirinprobe einer frau, die im dritten Trimester der Schwangerschaft ist, wird in «in Reagenzglas gegeben , das 1 g Oxalsäure und 200 mg Natriumchlorid enthält. Der Inhalt dieses Reagenzglases wird 1 Std. bei 1GO⁰C gekocht» Während des Kochens der Probe wird der Inhalt des Röhrenens mehrere Male w&hrend der ersten Minuten vermischt, um die Säurekristalle aufzulösen. I» Anschluß an die einstündige Kochzeit wird die Probe langsam auf Rauutemperatur abgekühlt, so daß sich große Kristalle an der fand des Glases anstelle des Bodens des Glases bilden. Danach werden 10 ml Dichlormethan zugesetzt.

PUr die Extraktion kann als Lösungsmittel Dichlormethan oder ein äquivalentes Lösungsmittel, wie Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat verwendet werden.

Die Probe wird sorgfältig mit dem Extraktionslösungsmittel vermiBcht, inden; 30 Sek. heftig geschüttelt wird; die Probe wird dann in einer Zentrifuge geschleudert, bis das Lösungsmittel klar ist. Der Urin wird danach von dem Lösungsmittel abgesaig.

An dieaerotelle werden 5 ml des Probenlösungsmittels aus dem Frobenrohr in ein Farbgläachen übergeführt. Zu Vergleichszwecken werden 0,5 und 1,0 ml Östriol-Standardlösung den beiden anderen Parbtestgläschen zugesetzt. Die Konzentration der Östriol-Standardlösung sollte etwa 10 /Ug/ml betragen. Nach einer bevorzugten Methode zur Herstellung der Standardlösung werden 200 /ug reines, festes Östriol in 20 ml reinem Äthylalkohol aufgenommen.

Danach werden die iarbentwicklung und Farbextraktion durchgeführt, so daß die Östriol-Standardlösungen mit den östriolproben verglichen werden können, "die von der Urinprobe stammen. Die spektro-. photometrischen Bestimmungen werden bei 532-534 m/U und bei 564 ffl/U in einem Hitachi-Perkin-Elmer-Spektrophotometer durchgeführt. Die 504- und 564-lerte werden genommen, gemittelt und von des 532-534-Peakwerten abgezogen.

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Die Kober-Methode der kalorimetrischen Analyse ist bekannt_f und die Ittrich-Kodifizierung wurde 1959 veröffentlicht.

Die Umrechnungen für 24-Stunden-Prbben auf die tatsächliche Konzentration an Östriol in der Urinprobe können folgendermaßen durchgeführt werden:

BERECHHUNGEN PUR 24-STUNDEN-PROBEN
A m/U + k

1 A - 504 /

^{1# A}534 m /U

CA unbek. _ Konzentration unbek. (in /Ug/Rb'hrchen
OA Stndd. " Konzentration Stndd. '^

/Ug/Röhrchen χ 2 χ T.V. «,„/m ν
/ Τΰΰΰ ' ^{= mg/ x} ·^v ·

wobeil A = Absorption , mg = Milligramm

CA ss korrigierte Absorption unbek, = unbekannt
in/U * Millimikron Stndd. = Standard

/Ug 35 Mikrogramm T.V. -« 24-Stunden-Ge-

' samtvolumen

in ml.

In diesem Beispiel war mg/T.V. = 14,4; das ist eine durchschnittliche östriolkonzentration für eine Frau im dritten Trimester.

BERECHNUNGEN FÜR EINMALPROBEN

Ein Laboratorium, das zur Bestimmung des Kreatinins im Urin ausgerüstet ist, kann die Übermittlung der Testergebnisse an den Arzt dadurch beschleunigen, daß die Bestimmung des Ostriols und des Kreatinine an einer Urln-Einmalprobe vorgenommen und das Ergebnis als Oetrogen/Kreatinin-Verhältnis ausgedrückt wird (A. J.Obst.4 Gynec, £4., 591, 1966) ι

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1) mg Östrogene werden wie oben berechnet und in mg/T.V. ausgedrückt}

2) Kreatinin wird in der Probe gemessen und in g/T.V.

-ausgedrückt;

■*\ Trotyl +r,*» ts/v mg Östrogen/T.V.

3) Verhältnis Ö/K = _g\_reati5in/T.Y.

Es ist zu beachten, daß diese Östrogen-Methode, ebenso wie die meisten anderen Schwangerschaftsgesamtöstrogen-Methoden für sehr niedrige Östrogentiter nicht geeignet und für die Bestimmung an normalen, nichtschwangeren Patienten nicht bestimmt sind.

Bei einer normalen Schwangerschaft steigt der Ostrogens.piegel von weniger als 50 /Ug/24 Std. mit fortschreitender Schwangerschaft auf Milligrammwerte an und erreicht eine Höhe von 8 mg oder mehr zu Beginn des dritten Trimesters, um dann schnell zu Werten von 50 mg/24 Std. gegen Ende anzusteigen. Die diagnostische Bedeutung der erfindungsgemäßen Hydrolysereak-täon liegt in ihrem Zusammenhang mit dem Zustand der sich entwickelnden Föto-plazentralen Einheit.

Wenn der Wert während des dritten Trimesters ständig abfällt, ist dies ein Anzeichen für einen schlechten Zustand des Fötus, der eine vorzeitige Entbindung mittels Kaiserschnitt notwendig

machen kann, um ein Ableben des Fötus zu verhindern. f

Deshalb müssen alle Werte einer Patientin sorgfältig registriert werden, insbesondere, wenn die Werte unter 12 mg/24 Std. fallen, in welchem Falle sofort der Arzt zu benachrichtigen ist.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann in vielfaltiger Weise abgeändert werden, ohne daß der Rahmen der Erfindung verlassen würde.

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Bestimmung der Gesaintöstroirene in. Urin einer Schwangeren, dadurch gekennzeichnet, da.: man (a) den die konjugierten Östrogene enthaltenden Urin mit Oxalsäure zu einer Hydrolyseprobe vermischt, (b) die Kydroljsecrooe solange kocht, bis alle anwe-3enden Östrogene nylrolysiert sind, (c) den Urin von den Lstrogenverbindungen abtrennt und (d) die Konzentration der Östrogene quantitativ bestimmt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, da3 man Steroide bestimmt, die mit Phosphorsäure, Schwefelsäure und Glucuronsäuren konjugiert sind.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 'laß man 20 bis 120 Minuten kocht.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3 man ein Mengenverhältnis von trockner, kristalliner Oxalsäure zu Urin von etwa 1/2 g/ml bis 2 g/ml anwendet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch I^ dadurch gekennzeichnet, da5 man nach dem Kochen die Probe mit einem Lösungsmittel für die Östrogene vermischt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Dichlormethan, Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat verwendet.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3 .τ.an die Hydrolyaeprobe bei 90 - 110⁰C kocht.

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8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse in Gegenwart eines Salzes wie z. B. Natriumchlorid durchführt.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) eine 24-Stunden-Urin-probe der Schwangeren sammelt,

   b) eine 1 ml-Probe dieses Urins zu 200 mg Natriumchlorid und 1 g Oxalsäure zugibt, um eine Hydrolyaeprobe zu erhalten f c) die Hydrolyeeprobe hinreichend lange kocht, um alle in dem Urin enthaltenen konjugierten Steroide zu hydrolysieren, d) ein Lösungsmittel zusetzt, um die hydrolysieren Steroide zu extrahieren, e) das Extraktionalösungsmittel und die hydrclysierte Steroidprobe vermischt, f) den Urin von dem die gelösten, hydrolysieren Steroide enthaltenden Lösungsmittel:trennt* g) eine Standardlösung von Östriol in einem Lösungsmittel zubereitet und eine Farbentwickiungsflüasigkeit zusetzt, und h) einen kolorimetrischen Vergleich zwischen der bekannten östriolkonzentration und den hydrolysieren Steroiden in der Lösung durchführt.

   Pur

   Searle Reference Laboratories, inc. dowell, Ohio, V.St.A.

   Hechtaanwalt

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