DE2025236A1 - Verfahren zur Bestimmung des östrogengehalts im Urin von Schwangeren - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung des östrogengehalts im Urin von SchwangerenInfo
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Description
DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIl
ALFRED HOSP1-ENER
DR. JUR. DIPL.-CHEM. R-J. WOlFF
Unsere Nr. : 16 343
Searle Reference Laboratories, Inc. Powell, Ohio. V.St.A. -
Verfahren zur Bestimmung des Östrogengehalts im Urin von
Schwangeren
Die Erfinaung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung der
Konzentration der gesamten Östrogene, die im Urin einer schwangeren Frau enthalten sind.
Die meisten der Steroide im Urin liegen in Form eines konjugierten Derivats vor, das mit den üblichen organischen Lösungsmitteln
nicht extrahierbar ist. Gewisse Methoden zur Bestimmung von Steroidkonzentrationen setzen voraus, daß das Steroid
mittels Hydrolyse von dem konjugierenden Mittel befreit wird. Die Hydrolyse setzt das Steroid frei und ermöglicht dessen Extraktion
aus der wässrigen (Urin-)Probe in das ausgewählte organische Lösungsmittel. Auf diese Weise kann es aus der biologischen Flüssigkeit gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Hydrolyse
des Steroids ohne Verwendung einer starken Mineralsäure, sondern unter Verwendung der mäßig starken, kristallinen Dicarbonsäure
Oxalsäure (pK^= 1,42; pKp= 4,31.) Die Verwendung von
Oxalsäure anstelle von starken Mineralsäuren zum Zwecke der Hydrolyse des Steroids bringt folgende Vorteile:
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1) Fehlen von Artifact-Bildung;
2) Fehlen von unerwünschten chemischen Umwandlungen:
a) Isomerisierungen,
b) Dehydratationen,
c) Gesamtabbau des Steroids; ·
3) Schnelle Analyse;
4) Bequemer Transport;
5) Sicherer Transport;
6) Bequeme Analyse.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Oxalsäure zur Hydrolyse konjugierter Steroide zu freien Steroiden verwendet, die aus
der boilogischen Flüssigkeit extrahiert und mittels einer geeigneten chemischen Methode analysiert werden können.
Es ist bekannt, daß während der Schwangerschaft der Titer aller östrogene etwas ansteigt, während der Gehalt an Östriol, inabesondere
während des dritten Trimesters, in überwältigendem Maße zunimmt und alle Mengen übersteigt, die der mütterlichen Sekretion zugeordnet werden können. Neuere Untersuchungen haben gezeigt,
daß die große Menge an Östriol, die mit dem mütterlichen Urin ausgeschieden wird, das Ergebnis der plazentaren Umwandlung
von 16-OH-Dehydroepiandrosteron zu Östriol ist, welches auf
fötaler adrenaler Sekretion beruht. Auf dieser Erscheinung beruht die Bestimmung des "plazentaren östriols", einem der besten
Anzeichen für das Wohlbefinden des fötal-plazentaren Komplexes.
Obgleich es spezifische Methoden zur Bestimmung-von Östriol
gibt, ist es bequemer, die gesamten Östrogene zu messen. Die östriol-spezifischen Methoden sind komplizierter und dauern
langer, als die Gesamtöstrogen-Verfahren. Da der Kliniker häufig
auf eine rasche Mitteilung der Untersuchungsergebnisse angewiesen ist, ist es das Ziel dieser Erfindung, die Gesamtöstrogene
in relativ kurzer.Zeit zu bestimmen.
0 9 8 4 9/1371
Dtr Jehalt des Urins an Östrogenen nimmt während einer
Schwangerschaft, die durch Diabetes der butter, Schwangerschaf
tatoiikose oder vorzeitiges plazentares Altern verkompliziert
wird, ständig ab. Neuere Entwicklungen bei der Extraktion der Kober-Jhromogtne aus den nichtppezifischen Chroir.Of'fr.'n,
aie früher dem Analytiker gro^e Schwierigkeiten bereitete,
haben es nunmehr mörlich gemacht, Mengen zu bestimmen, nie tiiähcr in kleinen Urint.rcben ur.ir.Örlieh bestimmt werden
koi.nten.
Das erfindungsgemä^e Verfahren wird generell wie folgt durchgeführt:
Eine Milliliter-Froce einer ei:, konjugiertes Steroid
enthaltenden 24-Ütunder.-Urinprobe, wird ir.it kri.= tall int: r Cx'iloäure
h.yirolysiert, die sich oeim Erv.ärmen auflöst und bein- Abkühlen
wieder aunkristallisiert. Bit fr igesetzten Östrogene
.(üatriül macht über 95^ des Gesamten aur) werden mit einem ucrungi3mi*tel
extrahiert, vor. welchem ein aliquoter Teil in ein Färb gleichen übergeführt und getrocknet wird. Bekannte !«'engen
an wötriol werden in identische Hchrchon einpipettiert und die
Farben entwickelt, extrahiert und ir. einem Spektrophotometer bei verschiedener. Wellenlängen miteinander verglichen, wobei
man aion der Allen-Kcrrektar bedient, um den Hintergrundeffekt
zu mininmlieieren.
Eins oder mehrere der folgender, 3tercid-Kon,jugate, die im Urin
einer schwangeren 1-rau enthalten ^cin können, können mittels
Oxalsäure erfindungagemä3 hydrolysiert werden:
Üstra-1,3,5 (iO)-trien-i7-cn-3.vl-i:ulfat
östra-1,3,5 (K)-trien-17/?-oi-3-yl-sulfat
Östra-1,3,5 (lO)-trien-3,17/3 -diyl-suifat
Östra-1,3,5 (iO)-trien-16 x , 17,--diol-3-.yl-sulfat
Östra-1,3,5 (1C)-trier.-17-cn-3-yi- - -D-glucopyranosiduron-
■ säure
Östra-1,3,5 (10)-trien-3,17 3 -dicl-16^-yl-/3-D-glucopyra-
ncsiiuronsäure
Östra-1,3,5 (10)-trien-17 --cl-3,16->
-dij^l-j'-D-glucopyrsnc-
siduronsäure
Östra-1,3,5 (iO)-trien-3 ,16.X-OiCl-17 '^-yl- ^D-glucopyranc-
sidurcnsäure
0098^9/ 1371
BAD ORIGINAL·
BAD ORIGINAL·
Öetra-1,3,5 (10)-trien-16ot~oX-3-JSrX-euX£at-17A-yX-A-lK
gltio öpy ranoe i .dur on® äure
5/3 -A«drosta*!-1 7-»ojs»3 e€->yX*-/^-3D-
-Androstan-17-o»*3oC -»y X*-/^-D-gluoopyrattbsidunDinsäure
ry glucopyranosidurniin8äure
gnan-20-on-3^-yX-/^-D-glucopyranosidurminsa'ure
pregnan-.20*on-2X^yX-/3-D-glucopyranosiduraiinBäure
In jedem Fall liefert die Hydrolyse mit Oxalsäure ein freies
Steroid oder Ostrogen, das durch Messung der Gesamtöstrogen-Konzentration
kolorimetrisch analysiert werden kann.
Die Reaktion zwischen den vorstehend genannten, im Urin einer schwangeren Frau enthaltenen Steroiden und Oxalsäure gemäß dieser Erfindung sollte am Siedepunkt der Hyarolyselösung durchgeführt
werden. In dem angegebenen Testverfahren enthält die Hydrolyselösung 1 g Oxalsäure und 200 mg Natriumchlorid. Die !Siedetemperatur
liegt in den meisten Fällen, in Abhängigkeit vom atmosphärischen Druck und anderen Variablen, zwischen 90 und
110 C. Der am meisten bevorzugte Temperaturbereich liegt etwa zwischen 95 und 10O0C.
Das Mengenverhältnis von trockener, kristalliner Oxalsäure oder einer anderen zufriedenstellenden Säure zu der Urinprobe schwankt
von etwa 1/2 g/ml bis su etwa 2 g/ml. Die Erhitzungezeit für die aus Säure und konjugiertem Steroid bestehenden Hydrolyseprobe
liegt gewöhnlich zwischen 20 und 120 Minuten. Im nachfolgenden wird Stufe für Stufe die Technik erläuterte die erfißdungsgemäß
zur Bestimmung der üstrogeBkonzentrationen im Uriia ang©weudet
wird ι
/1371
EXTRAKT IOB
1. Urinzugabe. In das Hydrolyseröhrchen, das 200 mg NaGl
und 1 g Oxalsäure enthält, werden 1,0 ml Urin gegeben, das
Härchen wird verstöpselt,·, und ein Loch wird in den Stöpsel
gemacht.
2. 1 Std. Kochen. Während der ersten Minuten wird mehrere Haie gemischt, um die Säurekristalle' aufzulösen.
3. LANGSAMES Abkühlen auf Raumtemperatur, so daß sich große Kristalle bilden." (Röhrchen neigen, so daß sich die Kristalle
an der Seitenwandung des Röhrchens anstatt am Boden bilden.)
4. Zugabe des Extraktionslösungsmittels (Dichlormethan).
10,0 ml Extraktionslösungsmittels in das abgekühlte Röhrcnen geben. .
5. Röhrchen wieder verschließen5 Finger über das Loch legen
und 30 sek#heftig schütteln *
6* In der Zentrifuge schleudern, bis das Lösungsmittel klar
ist. ' ·
7. Urin vom Lösungsmittel absaugen,
ö. 5,0 ml Lösungsmittel aus dem Proberönrchen in ein Farb-
ö. 5,0 ml Lösungsmittel aus dem Proberönrchen in ein Farb-
röhrehen überführen.
9. 0,5 und 1,0 ml STANDARD-LÖSUNG (10/Ug/ml Östriol) in zwei
9. 0,5 und 1,0 ml STANDARD-LÖSUNG (10/Ug/ml Östriol) in zwei
andere Farbröhrchen einpipettieren.
10. Die drei Röhrchen trocknen. Die drei Farbröhrchen zur
i'rookne einengen.
F A R B E IT T ¥ I 0 K L U N G
1. Reagens zusetzen. In jedes Farbröhrchen 1,5 ml FARBREAGENS (Hydrochinon enthaltende Schwefelsäure) geben. Mischen,
2» 20 Minuten kochen| während der ersten 6 Minuten noch 2mal
aieohtn.
3« In Wasserbad abkühlen.
4. Waeaer zueetzeni 0,5 ml cieatillitrtes Wasser in jedes
Röhrchen. Mischen.
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5. Wieder ins Siedebad für 1u Minuten.
6. Im Eisbad abschrecken.
PAHB JS XTR A KTIO N
1. Lösung 1 zugeben. 1,2 ml FARBEXTRAKTIGNSluJÜNG 1 zusetzen
(2 η Trichloressigsäure). 15 Sek„ schütteln unä für 2 äiin,
ins Eisbad zurückstellen.
2. Lösung 2 zusetzen. 3,0 ml FARBEXTRAKTICNJLCSUiIG 2 (Chloroform)
zugeben. 15 3ek. sehwach schütteln.
3. 2 Min. schleudern. Obere Schicht absagen und untere
Schicht in Küvetten gießen. Bei,504, 534 und 564 m/U
gegen Wasser ablesen.
Die folgenden Reaktionsgleichungen sind typische Beispiele für die erfin dungs gemäß ablaufenden Hydrolysereaktioner,:
I I I I I I
»HOOO-C-C-C-C-C-Ö
I I I I OH H1
•»Oxalsäure (90-1100O
+ Glucoronsäure +
(17- β - ÖSTRADIOL-GtllCÜHOHlD)
+Oxalsäure (90-11O0C)*
+H2SO4
+2 CO2
!-ß~ ÖSTBADIOL-3-SUIFAT)
*Η+ kann auch ein einwertiges Metall, wie Ma oder K sein*
00984 9/1371
BAD ORIGINAL
1 al einer 24-Stundea-tirinprobe einer frau, die im dritten
Trimester der Schwangerschaft ist, wird in «in Reagenzglas gegeben
, das 1 g Oxalsäure und 200 mg Natriumchlorid enthält. Der
Inhalt dieses Reagenzglases wird 1 Std. bei 1GO0C gekocht» Während
des Kochens der Probe wird der Inhalt des Röhrenens mehrere
Male w&hrend der ersten Minuten vermischt, um die Säurekristalle
aufzulösen. I» Anschluß an die einstündige Kochzeit wird die Probe
langsam auf Rauutemperatur abgekühlt, so daß sich große Kristalle
an der fand des Glases anstelle des Bodens des Glases bilden. Danach werden 10 ml Dichlormethan zugesetzt.
PUr die Extraktion kann als Lösungsmittel Dichlormethan oder ein
äquivalentes Lösungsmittel, wie Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat verwendet werden.
Die Probe wird sorgfältig mit dem Extraktionslösungsmittel vermiBcht,
inden; 30 Sek. heftig geschüttelt wird; die Probe wird
dann in einer Zentrifuge geschleudert, bis das Lösungsmittel
klar ist. Der Urin wird danach von dem Lösungsmittel abgesaig.
An dieaerotelle werden 5 ml des Probenlösungsmittels aus dem
Frobenrohr in ein Farbgläachen übergeführt. Zu Vergleichszwecken
werden 0,5 und 1,0 ml Östriol-Standardlösung den beiden anderen
Parbtestgläschen zugesetzt. Die Konzentration der Östriol-Standardlösung
sollte etwa 10 /Ug/ml betragen. Nach einer bevorzugten
Methode zur Herstellung der Standardlösung werden 200 /ug
reines, festes Östriol in 20 ml reinem Äthylalkohol aufgenommen.
Danach werden die iarbentwicklung und Farbextraktion durchgeführt,
so daß die Östriol-Standardlösungen mit den östriolproben verglichen werden können, "die von der Urinprobe stammen. Die spektro-.
photometrischen Bestimmungen werden bei 532-534 m/U und bei
564 ffl/U in einem Hitachi-Perkin-Elmer-Spektrophotometer durchgeführt.
Die 504- und 564-lerte werden genommen, gemittelt
und von des 532-534-Peakwerten abgezogen.
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Die Kober-Methode der kalorimetrischen Analyse ist bekanntf
und die Ittrich-Kodifizierung wurde 1959 veröffentlicht.
Die Umrechnungen für 24-Stunden-Prbben auf die tatsächliche
Konzentration an Östriol in der Urinprobe können folgendermaßen durchgeführt werden:
BERECHHUNGEN PUR 24-STUNDEN-PROBEN
A m/U + k
A m/U + k
1 A - 504 /
1# A534 m /U
CA unbek. _ Konzentration unbek. (in /Ug/Rb'hrchen
OA Stndd. " Konzentration Stndd. '^
OA Stndd. " Konzentration Stndd. '^
/Ug/Röhrchen χ 2 χ T.V. «,„/m ν
/ Τΰΰΰ ' = mg/ x ·v ·
/ Τΰΰΰ ' = mg/ x ·v ·
wobeil A = Absorption , mg = Milligramm
CA ss korrigierte Absorption unbek, = unbekannt
in/U * Millimikron Stndd. = Standard
in/U * Millimikron Stndd. = Standard
/Ug 35 Mikrogramm T.V. -« 24-Stunden-Ge-
' samtvolumen
in ml.
In diesem Beispiel war mg/T.V. = 14,4; das ist eine durchschnittliche
östriolkonzentration für eine Frau im dritten Trimester.
Ein Laboratorium, das zur Bestimmung des Kreatinins im Urin
ausgerüstet ist, kann die Übermittlung der Testergebnisse an den Arzt dadurch beschleunigen, daß die Bestimmung des Ostriols und
des Kreatinine an einer Urln-Einmalprobe vorgenommen und das
Ergebnis als Oetrogen/Kreatinin-Verhältnis ausgedrückt wird
(A. J.Obst.4 Gynec, £4., 591, 1966) ι
009849/1371
1) mg Östrogene werden wie oben berechnet und in mg/T.V.
ausgedrückt}
2) Kreatinin wird in der Probe gemessen und in g/T.V.
-ausgedrückt;
■*\ Trotyl +r,*» ts/v mg Östrogen/T.V.
3) Verhältnis Ö/K = g\reati5in/T.Y.
Es ist zu beachten, daß diese Östrogen-Methode, ebenso wie die meisten anderen Schwangerschaftsgesamtöstrogen-Methoden
für sehr niedrige Östrogentiter nicht geeignet und für die
Bestimmung an normalen, nichtschwangeren Patienten nicht bestimmt sind.
Bei einer normalen Schwangerschaft steigt der Ostrogens.piegel
von weniger als 50 /Ug/24 Std. mit fortschreitender Schwangerschaft
auf Milligrammwerte an und erreicht eine Höhe von 8 mg
oder mehr zu Beginn des dritten Trimesters, um dann schnell zu Werten von 50 mg/24 Std. gegen Ende anzusteigen. Die diagnostische
Bedeutung der erfindungsgemäßen Hydrolysereak-täon liegt
in ihrem Zusammenhang mit dem Zustand der sich entwickelnden Föto-plazentralen Einheit.
Wenn der Wert während des dritten Trimesters ständig abfällt,
ist dies ein Anzeichen für einen schlechten Zustand des Fötus,
der eine vorzeitige Entbindung mittels Kaiserschnitt notwendig
machen kann, um ein Ableben des Fötus zu verhindern. f
Deshalb müssen alle Werte einer Patientin sorgfältig registriert
werden, insbesondere, wenn die Werte unter 12 mg/24 Std. fallen,
in welchem Falle sofort der Arzt zu benachrichtigen ist.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann in vielfaltiger Weise
abgeändert werden, ohne daß der Rahmen der Erfindung verlassen würde.
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Claims (9)
- PatentansprücheVerfahren zur Bestimmung der Gesaintöstroirene in. Urin einer Schwangeren, dadurch gekennzeichnet, da.: man (a) den die konjugierten Östrogene enthaltenden Urin mit Oxalsäure zu einer Hydrolyseprobe vermischt, (b) die Kydroljsecrooe solange kocht, bis alle anwe-3enden Östrogene nylrolysiert sind, (c) den Urin von den Lstrogenverbindungen abtrennt und (d) die Konzentration der Östrogene quantitativ bestimmt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, da3 man Steroide bestimmt, die mit Phosphorsäure, Schwefelsäure und Glucuronsäuren konjugiert sind.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 'laß man 20 bis 120 Minuten kocht.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3 man ein Mengenverhältnis von trockner, kristalliner Oxalsäure zu Urin von etwa 1/2 g/ml bis 2 g/ml anwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch I^ dadurch gekennzeichnet, da5 man nach dem Kochen die Probe mit einem Lösungsmittel für die Östrogene vermischt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Dichlormethan, Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat verwendet.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3 .τ.an die Hydrolyaeprobe bei 90 - 1100C kocht.00984971371
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse in Gegenwart eines Salzes wie z. B. Natriumchlorid durchführt.
- 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mana) eine 24-Stunden-Urin-probe der Schwangeren sammelt,b) eine 1 ml-Probe dieses Urins zu 200 mg Natriumchlorid und 1 g Oxalsäure zugibt, um eine Hydrolyaeprobe zu erhalten f c) die Hydrolyeeprobe hinreichend lange kocht, um alle in dem Urin enthaltenen konjugierten Steroide zu hydrolysieren, d) ein Lösungsmittel zusetzt, um die hydrolysieren Steroide zu extrahieren, e) das Extraktionalösungsmittel und die hydrclysierte Steroidprobe vermischt, f) den Urin von dem die gelösten, hydrolysieren Steroide enthaltenden Lösungsmittel:trennt* g) eine Standardlösung von Östriol in einem Lösungsmittel zubereitet und eine Farbentwickiungsflüasigkeit zusetzt, und h) einen kolorimetrischen Vergleich zwischen der bekannten östriolkonzentration und den hydrolysieren Steroiden in der Lösung durchführt.PurSearle Reference Laboratories, inc. dowell, Ohio, V.St.A.Hechtaanwalt009849/1371
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- 1970-05-26 GB GB2507770A patent/GB1317269A/en not_active Expired
Also Published As
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