FR2466976A1 - Appareils et procedes pour prelever du sang et inhiber la liberation des principes actifs plaquettaires - Google Patents
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Abstract
Des appareils et des procédés pour prélever du sang et inhiber la libération des principes actifs plaquettaires utilisent du p-aminobenzoyldiéthylaminoéthanol (procaïne) ou un de ses sels d'addition d'acides convenant en biologie pour stabiliser les échantillons de sang contre les réactions de libération plaquettaire et sont particulièrement utiles pour recueillir des échantillons de sang destinés à la détermination du facteur plaquettaire 4.
Description
La présente invention concerne des appareils et des procédés pour prélever
du sang et inhiber la libération des principes
actifs plaquettaires.
Plus particulièrement, l'invention concerne des appa-
reils et des procédés pour prélever du sang destiné à ftre utilisé pour l'analyse de l'activation du système de coagulation. Le facteur plaquettaire 4 (PF4) est une protéine de bas poids moléculaire sécrétée par les granules e des plaquettes lors de la libération des principes actifs plaquettaireso Ce phénomène se produit lorsque les plaquettes sont activées après contact avec le tissu sous-endothélial et divers autres agents physiologiques tels que la thrombine, l'adénosine-diphosphate et l'épinéphrine. On mesure le PF4 d'un échantillon de sang selon des techniques classiques de ddtermination radio-immunologiqueo Malheureusement les techniques classiques de prélèvement du sang provoquent une activation du mécanisme de lib& ration dans l'échantillon recueilliio On doit veiller soigneusement à ce que la réaction de libération mesurée soit le résultat de
l'activation in vivo et non in vitro de la réaction de libération.
On connaît dans l'art antérieur une grande diversité de techniques et de voies d'approche pour stabiliser les échantillons
de sang prélevés, contre les réactions de libération plaquettaire.
Il est nécessaire de manipuler les échantillons de sang avec beaucoup de précautions pour inhiber la réaction de libération plaquettairec Généralement, on prélève le sang selon des techniques de ponction
veineuse avec des récipients de prélèvement de sang sous vide clas-
siques contenant de l'EDTA (acide éthylènediamine.-titraacétique). On mélange le sang à l'EDTA dans le récipient par retournement ménag4 et on place le récipient au b2in-marie glacéo Après 30 min, on centrifuge l'échantillon 3 2 000 x g et entre 2 et 4 C pendant 20 min. On doit centrifuger dans les 2 h qui suivent le pré!èvement. On sépare le plasma et on l'analyse immédiatement ou oa le conserve
entre 2 et 40C, pendant 24 h. ou à -20 C pendant 3 mois.
Thrombosis Research, 6, 543-548 (1975) décrit une technique de prélèvement du sang en présence d'EDTA et de théophylline
nécessitant une centrifugation h OC.
Thrombosis Research, 12, 851-861 (1978) décrit une technique de prélèvement du sang pour l'analyse du PF4 en présence
d'inhibiteur de la libération plaquettaire, d'EDTA, de prostaglan-
dine E et de théophilline. Cette technique nécessite également une centrifugation malaisée à basse température. Niemetz et coll., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 658 (1968) décrivent les effets de divers anesthésiques sur la rétraction du caillot'et l'agglutination plaquettaire provoquée par l'adénosine-diphosphate et la thrombine. Ces études montrent que le chlorhydrate de p-aminobenzoyldiéthylaminoéthanol (procaine)et
des homologues apparentés tels que le p-aminobenzoyldibutylamino-
éthanol (butacaine) et le p-butylamino-benzoyldiméthylaminoéthanol (tétracaine) inhibent l'agglutination plaquettaire provoquée par la thrombine. La butacaine et la tétracaine inhibent l'agglutination plaquettaire provoquée par l'adénosinediphosphate, tandis que la procaine ne l'inhibe pas. La butacaine, la tétracaine et la procaine
inhibent l'agglutination plaquettaire provoquée par la thrombine.
La demanderesse a découvert que, de façon inattendue, la procaine, mais ni la butacaïne,.ni la tétracaine, inhibe la libération du
facteur plaquettaire 4 pendant l'opération de prélèvement.
L'invention concerne des appareils et des procédés pour inhiber la réaction de libération plaquettaire provoquée par la manipulation in vitro d'échantillons de sang et permet donc
d'obtenir un échantillon de sang dans lequel les composants plasma-
tiques tels que le facteur plaquettaire 4 résultent de la libération
in vivo. La demanderesse a découvert que le p-aminobenzoyldiéthyl-
aminoéthanol et ses sels d'addition d'acides convenant en biologie (procaine) sont étonnamment efficaces pour inhiber la réaction de libération plaquettaire, ce qui facilite beaucoup la manipulation
des échantillons de sang à la température ordinaire en vue de l'ana-
lyse ultérieure des principes actifs de la libération plaquettaire
tels que le facteur plaquettaire 4.
L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. Le paminobenzoyldiéthylaminoéthanol et ses sels
d'addition d'acides convenant en biologie se sont révélés particu-
lièrement efficaces pour inhiber la réaction de libération plaquet-
taire. De façon générale,une concentration finale dans le sang,environ
à 30 millimolaires, inhibe de façon efficace la réaction de libé-
ration plaquettaire et la concentration efficace préférée est envi-
ron 15 millimolaires. Les sels d'addition d'acides convenant en
biologie consistent en une grande diversité de sels d'acides orga-
niques et minéraux tels que les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, sulfurique, phosphorique, nitrique, acétique, benzoïque,
toluènesulfonique, formique et similaires, qui sont utiles pour pré-
parer des sels d'addition ne détruisant pas l'activité biologique
de protéines telles que le facteur plaquettaire 4.
Selon un mode de réalisation préféré, on utilise de la chloro-2 adénosine à des concentrations d'environ 0,05 à
1 millimolaire et, de préférence, environ 0,1 millimolaire en combi-
naison avec le chlorhydrate de p-aminobenzoyldiéthylaminoéthanol
pour obtenir un réactif stabilisant particulièrement efficace.
On utilise de façon appropriée ces réactifs dans des dispositifs classiques de prélèvement du sang sous vide partiel
contenant des anticoagulants tels que l'acide éthylènediaminetétra-
acétique (EDTA). On peut injecter dans ces dispositifs classiques de prélèvement du sang des quantités efficaces des agents inhibant la libération plaquettaire précédemment décrits ou préparer un
dispositif de prélèvement contenant ces agents.
De façon générale, l'invention concerne un dispo-
sitif de prélèvement du sang sous vide partiel contenant une quan-
tité efficace de p-aminobenzoyldiéthylaminoéthanol ou de ses sels d'addition d'acides convenant en biologie pour inhiber la réaction de libération plaquettaire. En particulier, l'invention concerne un tube de verre bouché silicone sous vide partiel contenant de 'EDTA comme anticoagulant et des quantités efficaces de chloro-2 adénosine et de paminobenzoyldiéthylaminoéthanol ou de ses sels d'addition
d'acides convenant en-biologie pour inhiber la réaction de libéra-
tion plaquettaire.
Selon le mode de réalisation particulièrement pré-
féré, un tube de verre bouché partiellement sous vide de 10 ml conve-
nant au prélèvement du sang contient 0,6 ml d'un réactif constitué
2466976.
de 2,50%î d'EDTA, 0,025% de chloro-2 adénosine, 6,60% de chlorhydrate de p-aminobenzoyldiéthylaminoéthanol et 0,3% de chlorure de sodium dont le pH a été ajusté à 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium. Les
pourcentages précités sont des pourcentages poids/volume.
Les appareils et les procédés de l'invention sont
particulièrement utiles pour les déterminations du facteur plaquet-
taire 4, car ils facilitent beaucoup lé prélèvement et la manipula-
tion du sang et, en particulier, ils évitent la centrifugation à
basse température.
Selon des techniques classiques de ponction veineuse permettant de prélever plusieurs échantillons, on prélève deux
échantillons de sang. On prélève le premier pour débarrasser le sys-
tème des facteurs d'activation et on prélève le second dans le tube
de verre précédemment décrit constituant le mode de réalisation parti-
culièrement préféré de l'appareil de l'invention. On mélange l'échan-
tillon par retournement ménagé et on place le tube au bain-marie glacé pour l'incuber pendant au moins 30 min (pas plus de 2 h). On centrifuge ensuite le tube à la température ordinaire à 2 500 x g pendant 20 min ou à 1 500 x g pendant 30 min avec un séparateur de plasma. On transfère le plasma dans un tube de matière plastique avec une pipette en matière plastique. On peut conserver l'échantillon
entre 2 et 40C pendant 24 h ou à -200C pendant 3 mois.
On détermine le facteur plaquettaire 4 selon des techniques classiques de détermination radio-immunologique. Lorsqu'on utilise les appareils et les procédés de l'invention, les teneurs normales du facteur plaquettaire 4 sont inférieures a 5 ng/ml. Les malades atteints d'affection des artères coronaires, ayant subi une opération portant sur les valvules cardiaques ou un pontage des artères coronaires ayant présenté un infarctus du myocarde ou atteints de diabète, ont des teneurs élevées en facteur plaquettaire 4 pouvant
atteindre 100 ng/ml.
Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs
sans sortir du cadre de l'invention.
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Claims (4)
1 - Appareil de prélèvement du sang sous vide partiel,
caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace de p-amino-
benzoyldiéthylaminoêthanol ou d'un de ses sels d'addition d'acides convenant en biologie pour inhiber la réaction de libmration plaquettaire.
2 - Procédé pour inhiber la réaction de libération plaquettaire dans un échantillon de sangs caractérisé en ce qu'il consiste a traiter l'échantillon de sang avec une quantité efficace de paminobenzoyldidthylaminodthanol ou d'un de ses sels d'addition d'acides convenant en biologie pour inhiber la rdacionri de libéras
tion plaquettaire.
3 - Procdd4 pour déterminer le facteur plaquen-
taire 4 dans un échantillon de sang, caractdrisé en ce qu'on traite
l'échantillon de sang avec une quantit efficace de p=aminobensoyl-
diéthylaminoêthanol ou d'un de ses sels d'addition d'acides conve-
nant en biologie pour inhiber la liberation du facteur plaquet-
taire 4.
4 - Appareil pour le prdlêvement du sang, caractd-
risê en ce qu'il est constitud d'un tube de verre bouche sous vide partiel contenant de 1'EDTA comme anticoagulant et une quantité
efficace de chloro-2 adénosine et de p-aminoberzoyldiéthylamino-
éthanol ou d'un de ses sels d'addition d'acides convenant en biologie
pour inhiber la libération plaquettaire du facteur plaquettaire 4.
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