JPH02503058A - 自己免疫疾患の治療のための臨床試験方法、モニター方法、及び医薬用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患の治療のための臨床試験方法、モニタ一方法、及び医薬用組成物 本発明は主に（排他的ではないが）自己免疫疾患の治療のための臨床学的に重要 な部分の検出、臨床試験方法及びモニタ一方法並びに医薬用組成物に関する０本 発明は、１つの観点において、血液細胞中の細胞障害作用に関連するセリンエス テラーゼの局在性及び分布を測定する方法に関する。

近年、悪性化及び形質転換された細胞障害Ｔ細胞系、クローン化された細胞障害 Ｔ細胞系並びに生体外の細胞調製物の溶解物中にセリンエステラーゼ（ＳＦ、） 即ち推定のプロテアーゼが存在することが文献に記載されている。このセリンエ ステラーゼの活性は、通常はヘルパー機能を示す表現型を有するいくつかの、細 胞系において見出されているが、これらは、特定の抗原を存する標的細胞を死滅 させる能力をも有している。　　− ＳＥと細胞融解能力との関係は、さらにメツセンジャーＲＮＡ転写脚ＣＴＬＡ− １、ＨＦ％ＢＩＯ及びＣ１ｌの同時出現及び同時誘導性によって例証されており 、これら全ては、他の哺乳動物のＳＥといく分かの相同性を有しており、ハッカ ネズミ及びヒトの両者のリンパ球に細胞障害能力を示している。

細胞質プロテアーゼが、細胞媒介の細胞障害作用において重要な役割を果たすこ とが実証されている。細胞障害Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）とその標的細胞の相互作 用によって、後者の特定の溶解が起こる。サガリー（Ｓａｇｕｒｙ）　　（１９ ８２）は、エフェクター細胞による標的細胞の致死ヒントは、ＣＴＬからの細胞 融解分子のエキソサイトシス現象によるものであることを提案した最初の者であ る。

その後の研究によって、複製ＣＴＬ及び死滅過程に関連すると考えられている天 然のキラー（ＮＫ）細胞中の多数の高電子密度の細胞内顆粒中に含まれているい くつかの成分が明らかにされている。

このような成分の１つであるベルフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）と呼ばれるタン パク質（バトックら、（１９８３））については、数多くの研究者によって研究 がなされている。これは非還元条件下で７０−７５．０００の分子量及び還元条 件下では６２−６５．０００の分子量を有しており（ヤングら、（１９８６）） 、体液性補体系のＣ９成分に対して機能及び構造上の類似点を示す（チョップら 、（１９８６）、ヤングら、（１９８６）及びザルマンら（１９８６））。ベル フォリンは、エフェクター標的細胞相互作用に続く脱顆粒反応過程によって、Ｃ ＴＬ及びＮＫ細胞から、細胞間空間中に分泌され、次いでカルシウムイオンの存 在によって、標的細胞の膜の内部でリング様構造を形成する（バトック（１９８ ５）、・ヘンカル）（１９８５）、チョップ及びコンザルマン（１９８６）、ヤ ング及びコーン（１９８６））。これらの構造は、約１６ｎｍの内径を有する膜 内外の孔を形成しくデンネルト、及びバトック（１９８５）。原形質膜の機能的 破壊をもたらし、細胞死滅につながる。

ベルフォリンの他に、ＣＴＬの細胞内顆粒は、高度に一致した１群のセリンエス テラーゼ酵素を含んでおり、これらは、グランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ）　 Ａ　−Ｈと称されている。これらのグランザイムは、メイソン及びチョップ（１ ９８７）によって近年単離され、ある程度特性が決定されており、抗原交差反応 性によって示されるようにある程度の構造的相同及びＮ−末端アミノ酸配列の相 同を示している。これらは、セリンエステラーゼ親和性標識ジイソプロピルフル オロホスフェートと一定の範囲の反応性を示した；グランザイムＡ及びＤは最も 強く反応し；１３．　Ｅ、　Ｆ、　Ｇ及びＨは反応が弱＜；Ｃ及びＦは全く反応 しなかった。

これらの酵素のうちで、Ａが最も広汎に研究されている。これは分子量６０．０ ００のジスルフィド結合二量体であり、数種の天然ペプチ触媒することが示され ている（マラソンら、１９８６ａ、１９８６ｂ及びパステルナクら１９８６）。

これは細胞溶解活性を伴ってＣＴＬやＴヘルパー細胞中に発現され、未だ細胞を 介した細胞毒性におけるタンパク分解酵素の正確な役割は明らかになっていない が、標的細胞の溶解のために誘導されたＣＴＬやＮＫ細胞をアルファー１−アン チトリプシンや他のプロテアーゼ阻害剤が抑制するということが示されている（ チャン及びアイセン、１９８０；レーデルマン及びヒュディック、１９８０；ベ ティら、１９８４；ラビーら、１９８５；及びゴールドファルブ、１９８５）。

従前には、すべての手法は細胞融解物を用いた該酵素の活性レベル及びタンパク 特性を評価するための分光学的評価若しくはＳＤＳポリアクリルアミド法並びに 種々の細胞型の全細胞調製物におけるクロム５１の放出細胞毒性試験に依存して いた。これらの手法は大量の細胞とともに熟練技術及び装置を必要とするもので ある。加えてこの様な評価法では細胞の完全性が維持されているかについて疑わ しい点もあった。

本発明者は該セリンエステラーゼ酵素系の存在ならびに活性を検出するための簡 易かつ迅速な細胞化学的染色方法を見いだしたが、該方法は例えば血中の全細胞 や骨髄の塗抹標本、パラフィン包埋切片、凍結組織切片、及び極く少量の細胞し か入手できない例えば脳を髄液等の場合にさえも使用できる。本染色方法を常法 の対比染色、若しくはモノクローナル抗体とともに伴用するとセリンエステラー ゼ陽性の細胞を容易に特定することができる。

本発明の一態様によれば、動物細胞若しくは細胞抽出物中のセリンエステラーゼ を検出する方法であって、（ａ）被検試料を例えばホルマリンで固定する工程、 及び（ｂ）固定された上記の試料をＮ−アルファーベンジルオキシカルボニル− し−リジンチオベンジルエステル及び色素原（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）　（例えば ファスト　ブルーＢＢ）に接触させる工程を含む方法が提供される。使用可能な 他の固定試薬としては乾燥アセトン、エタノール、メタノール及びバラホルムア ルデヒドを挙げることができる。

好ましくは、細胞調製物のセリンエステラーゼ活性は、酵素基質として０．２Ｍ 　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！緩衝液（ｐＨ＝　８．１　）中の２Ｘ１０−’ＭのＮ− α−ベンゾキシカルボニル−し−リジンチオベンジルエステル（ＢＬＴ）を使用 して、３７℃で１５分処理することにより分析される。この基質は、この条件下 では低速の非酵素的加水分解を受け、酵素的加水分解は基質とともに系内に０． ２ｍｇ　　ｙｄ−’の量で色素原を配合することにより検出される。該色素原は 反応生成物であるベンジルメルカプタンと結合して、一旦細胞から過剰の未結合 色素を洗浄して除去すると、被検細胞内に強く染色された局在化領域として酵素 活性部位を可視化させる。所定時間よりもかなり長時間反応を進行させると、色 素を単独で使用した場合に明らがなように、色素が他の細胞成分と反応するので 、弱い均一でしがも非特異的な染色が現われる。

次ニ、個々ノ細胞の表現型を、アルカリホスファターゼ／抗アルカリホスファタ ーゼ（ＡＰＡＡＰ）技術を使用して特異的モノクローナル抗体染色により決定し てもよい、セリンエステラーゼに対する染色はＡＰＡＡＰ染色では効果はないが 、ＡＰＡＡＰ染色はセリンエステラーゼ染色を阻害するので、染色をこの順序で 行なうことは重要である。

典型的に現われるときに、ＢＴＬ／色素混合物を細胞成長培地に添加することに よって、生きた細胞上で行なうこともできる。色素単独では、この場合全く染色 はできない。

緩衝液の性質とは独立に、ｐＨが７．０〜８．５で染色を達成できるが、ｐＨ８ ，１のときがセリンエステラーゼの染色にとって最適である。しかしながら、こ の範囲のはずれで染色の強度の僅かな低下が見られる。この低下により、ある条 件下では酵素特異的染色を非特異的染色と区別することが困難となり得る。従っ て、ｐＨ８，１が好ましい。

染色のための最適の緩衝強度（ｂｕｆｆｅｒ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）は、０．２Ｍ である。ただし、染色は０．０１Ｍ（染色はやや弱い）〜０．４Ｍ（酵素の正確 な局在化がやや劣る。即ち、やや散漫な染色となる。）で達成することはできる 。

ＢＬＴの構造 ＢＬＴの化学構造は以下の式で表わされる。

ＣｂＨｓ　　ＧＨｚ　　ＯＣｏ　　ＨＮ　　ＣＨＣｏ　　Ｓ　　ＣＨｚ　　Ｃ６ Ｈ５ＣＨ７ ＣＨ２ ■ ＣＨ２ ＣＨ１ Ｈｚ 色素原 現在、好ましい色素原はファストブルーＢＢである。本発明の検出法において、 この色素原及び他の色素原について試験を行った。

その結果を以下の表に挙げる。

染色強度 ファストガーネットＧＢＣ− ファストコリンス（Ｋｏｒｉｎｔｈ）　Ｖ　　　　　　±エルマン試薬（Ｅｌ１ ｍａｎ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ）　　　　−化合物ＢＬＴが、全てではないが、い くつかのセリンエステラーゼに対する基質であることが分った。そのため、白血 球及び例えば精子細胞のようなある種の他の細胞型中におけるある種のエステラ ーゼを認識することができる。これらのエステラーゼは機能的な要件として膜貫 入容量（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ）を有す る。

酵素染色の用途 通常のリンパ組織に関して、ある細胞はセリンエステラーゼ活性を連続的に発現 させるが、そうでない細胞もある。ある条件下では、セリンエステラーゼを発現 しなかった細胞が多くの染色を示し、例えば増大した酵素発現を示すかもしれな い一方、通常酵素活性を示さない細胞が活性化されて酵素を発現するように誘導 される。好酸球はマクロファージや３９７８球と同様に通常セリンエステラーゼ 陰性である。一方、好塩基球及び好中球はセリンエステラーゼ陽性であり、Ｔリ ンパ球はそのサブクラスに応じて陰性であったり、陽性であったりする。これら の細胞型の内、マクロファージ及びＴリンパ球は活性化されるとセリンエステラ ーゼ陽性となる。この技術を使用することにより、組織切片を検討したり、活性 化細胞と密接に関連している細胞を同定したり、また血液もしくは他の体液塗抹 標本における活性を示すことで、細胞活性の原因を局在化することが可能となる 。

新規技術を使用することにより、橋本病や、インシュリン依存性糖尿病、シュー グレン症候群、ＳＬＥ、慢性関節リウマチを含む若干の自己免疫疾患の患者の周 辺循環におけるヘルパーＴ細胞中のセリンエステラーゼ活性が同定される。更に 、白血病のＭｌ及びＭ５型はセリンエステラーゼ活性を示さず、一方Ｍ２及びＭ ４型はそのような活性を示すことから、白血病の種々の型、特に骨髄細胞系の型 を区別できる。更に、セリンエステラーゼ活性に対する証拠は腎移植の拒絶を受 ける患者において見い出されている。この方法は、早期骨髄拒絶の簡便な検出方 法となるかもしれない、また、これにより医者は拒絶と免疫抑制剤、例えばサイ クロスポリンにより起される腎毒とを区別することができる。

セリンエステラーゼ活性法の他の可能な応用としては、再発性ウィルス及びバク テリア感染症の患者におけるＳＥ活性の低下を発見することが含まれる。同様に 、数多くの悪性状態、特に白血病における処置に対する応答をモニターすること が可能であろう、αインターフェロンを有する有毛細胞の白血病の処置はナチュ ラルキラー細胞活性及びナチュラルキラー細胞におけるセリンエステラーゼ測定 と互いに関係のあることが見出されている。

本発明の第２の態様によれば、自己免疫疾患により特徴的な影響を受けた組織若 しくは身体の部分（例えばリンパ球）から得た細胞のセリンエステラーゼ活性を 定期的に評価することを含む自己免疫疾患の治療をモニターする方法が提供され る。本発明は同様にセリンエステラーゼ活性を特徴とする、他の非自己免疫疾患 の処置をモニターすることにまで拡張される。

以下の実施例は、これらの技術を臨床環境で用いたものである。

各実施例において、末梢血のスミア、骨髄吸引液、単核細胞の細胞遠心調製物（ ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）及び凍結組織切片 が適切なものとして使用され、セリンエステラーゼ活性が決定された。

これらをホルマリン蒸気中で固定し、０．２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液＋）Ｈ８ ，１中の基質（Ｎ−アルファーベンジルオキシカルボニル−し−リジンチオベン ジルエステル（Ｂ　ＬＴ）　２　Ｘ　１０−’モル濃度中にファストブルーＢＢ 色素（０，２ｍｇ／ｄ）とともに浸漬した。サンプルを１５分間３７℃で基質溶 液中に浸漬した。ヘモトキシリンで対比染色し、水性封入液中に封入した後、ス ライドを油に浸漬した状態で観察した。

実施例　ｌ リンパ球は局在化しており、浸潤固形腫瘍（モノクローナル／ＡＰＡＡＰ）と同 定された。良性腫瘍はリンパ球の凝集を示さず、一方、悪性腫瘍は、セリンエス テラーゼ陽性のマクロファージ（正常なマクロファージは陰性である）による、 特に腫瘍内の壊死中心の周囲での浸潤が見られた。それ故、マクロファージは刺 激されて悪性腫瘍中の組織を破壊するのであり、このことは、本発明に従って治 療に対する応答若しくはその他の指示薬として、また悪性疾患の初期指示薬とし てもおそらく使用可能である。

実施例　２ 細胞の数が増加しており、この変化は本発明に従って診断に使用可能であった。

ａ）橋本甲状腺炎（サイログロブリンに対する自己免疫）は、甲状腺に浸潤する セリンエステラーゼ耐性リンパ系細胞の数の増加を示した。

ｂ）インシュリン依存性糖尿病は、膵臓に浸潤するセリンエステラーゼ陽性細胞 と末梢リンパ系細胞の増加を示した。

ｃ）リウマチ性関節炎においては、過剰の（正常に比べて末梢リンパ球がセリン エステラーゼの染色を示した。

実施例　３ この実施例は白血病に関するものである。

ａ）慢性リンパ系白血病及び骨髄系白血病により、病変した細胞においてセリン エステラーゼ発現が増加した。

ｂ）急性Ｂリンパ芽球白血病においては、これらの細胞数が比較的増加するにも 拘らず、酵素発現の増加は見られない。酵素活性を発現するＴ’Ｊンパ球の数は 増加し、同様にこの型のリンパ球の数も比較的増加した。

それ故、このことは、本発明に従って、鑑別診断を目的として、治療をモニター するために用いることが可能であった。

Ｃ）急性巨人芽胞細胞白血球の鑑別診断（例えば骨髄系対顆粒系）は、細胞の形 態を基礎とするために困難で、細胞化学染色性を用いるために複雑である。しか しながら、本発明記載の技術によれあることが簡単に示される。

実施例　４ 臓器移殖拒絶反応をモニターする際に、移植された器官に対するの攻撃を区別す ることが可能であることがわかった。両者の場合とも、末梢血中の１９７８球の 数が増加した。前者の場合には、セリンエステラーゼ陽性Ｔ　ＩＪンパ球の相対 数の増加は見られず、治療としては、サイクロスポリンの投与量を減らせばいい ように見える。

しかしながら、後者の場合には、セリンエステラーゼ陽性細胞の相対数の増加が 見られ、治療としては、サイクロスポリン投与量を増加すればいいように見える 。

もっと一般的な言葉で言うと、セリンエステラーゼ陽性Ｔリンパ球の相対数の増 加は移殖拒絶の攻撃を示している。

実施例　５ 婦人の不妊に関しては、成熟していない精子におけるセリンエステラーゼ活性の 欠如が不完全な細胞であることの指標になる。というのはこの酵素が成熟過程、 及びおそらく受精においても重要であるからである。従って、不妊の原因を調べ るために精液サンプルに本発明の試験を用いることができるのである。

セリンエステラーゼ系を阻害することができる薬剤は上記の様な自己免疫不全の 治療や、アレルギー性脳炎、限局性回腸炎（クローン病）及び潰瘍性大腸炎の治 療に有用であることが期待される。従って本発明はさらに自己免疫疾患の治療方 法を提供するものであり、該方法はセリンエステラーゼ活性を阻害可能な化合物 若しくは組成物を活性な形態で含有する医薬用組成物の薬用量を投与することを 含む。

本発明は、さらにセリンエステラーゼ阻害可能な化合物若しくは特許庁長官　吉 　１）文　毅゛′殿 １、事件の表示　　ＰＣＴ／ＧＢ８９１００１４０３、補正をす−る者 事件との関係　　出願人 名　称　　　サーヴエイス　リミテッド５、補正命令の日付　　自　　発 国際調査報告 １、、、、、、、引、、Ａ帥、、、、、、、、、、、ＰＣＴ／Ｇヨ　ε９１００ １４０国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）動物細胞若しくは細胞抽出物中のセリンエステラーゼを検出する方法であ って、以下の工程 （ａ）被験試料を、例えばホルマリンで固定する工程、及び（ｂ）上記の固定さ れた試料をＮ−アルファーベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンチオベンジル エステル及び色素原（例えばファストブルーＢＢ）を含む溶液と接触させる工程 を含む方法。
2. （２）自己免疫疾患の治療をモニターする方法であって、該自己免疫疾患が特徴 的に影響を与える組織や身体のある部位から得た細胞（例えばリンパ球）のセリ ンエステラーゼ活性を周期的に評価することを含む方法。
3. （３）自己免疫疾患を治療する方法であって、セリンエステラーゼ活性を阻害可 能な化合物若しくは組成物を活性な形態で含む医薬用組成物の薬用量を投与する ことを含む方法。
4. （４）セリンエステラーゼ活性を阻害可能な化合物若しくは組成物の有効量を含 有する医薬用組成物。
5. （５）分析の対象である腫瘍の組織試料を請求の範囲第１項記載の方法に付する 、悪性及び良性腫瘍の判定方法。
6. （６）悪性疾患の治療のモニタ−方法であって、該疾患で特徴的に影響を受ける 組織や身体のある部位から得た細胞（例えばリンパ球）のセリンエステラーゼ活 性を周期的に評価することを含む方法。
7. （７）移植組織において移植拒絶反応の発現をモニターする方法であって、該移 植組織の組織試料を請求の範囲第１項の方法に付する方法。
8. （８）精子の完全性を試験する方法であって、試験すべき精子からの細胞抽出物 を請求の範囲第１項の方法に付する方法。
9. （９）動物細胞若しくは細胞抽出物中のセリンエステラーゼを検出する方法であ つで、以下の工程 （ａ）被験試料を固定する工程、及び （ｂ）上記の固定された試料をＮ−アルファーベンジルオキシカルボニル−Ｌ− リジンチオベンジルエステル及び色素原としてファストブルーＢＢを含むｐＨ７ ．０ないし８．５の範囲の緩衝溶液と接触させる工程 を含む方法。
10. （１０）工程（ｂ）を約３７℃の温度で約１５分間行う、請求の範囲第９項記載 の方法。
11. （１１）工程（ｂ）を０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液中の該ＢＬＴエステルと色素 原を用いて行う、請求の範囲第９項記載の方法。
12. （１２）工程（ｂ）をそれぞれ２×１０−４Ｍ及び０．２ｍｇ／ｍｌの濃度の該 ＢＬＴエステルと色素原を用いて行う、請求の範囲第９項記載の方法。
13. （１３）セリンエステラーゼ活性の指標としてのＮ−アルファーベンジルオキシ カルボニル−Ｌ−リジンチオベンジルエステル及び色原体ファストブルーＢＢの 使用。