DE69028126T2

DE69028126T2 - Festephasentest zum Nachweis der periodentalen Krankheit in einem subgingivalem Fleck

Info

Publication number: DE69028126T2
Application number: DE69028126T
Authority: DE
Inventors: Daniel Kerschensteiner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1990-01-10
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2010-01-11
Also published as: DE69028126D1; JPH02261396A; EP0380932A2; EP0380932A3; AU4790090A; ATE141647T1; EP0380932B1; CA2008065A1; AU619070B2; CA2008065C; JPH07108234B2; ZA90593B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf eine verbesserte Feststoffprobe zum Nachweis der Anwesenheit von periodontalen Krankheitserregerorganismen im Subgingivabelag.

BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK

Als Indikatoren von periodontalen Erkrankungen wurden herkömmlicherweise die Sondiertiefe, der Verlust einer Zahnfassung und insbesondere das Bluten beim Sondieren benutzt. Diese klinischen Parameter spiegeln jedoch mehr einen vergangenen Krankheitsverlauf und den Entzündungszustand des Gewebes wieder, als daß sie eine Information über die bakterielle Zusammensetzung des Subgingivabelages darstellen.
Herkömmliche mikrobiologische Verfahren sind in der Lage, periodontale Krankheitserreger in dem Belag zu identifizieren, doch leiden sie an dem Nachteil, daß sie zeitaufwendig sind und für ihre Durchführung ein spezialisiertes Personal erfordern. Die Dunkelfeldmikroskopie gestattet es, Organismen mit einer charakteristischen Morphologie oder Motilität zu beobachten, zu zählen und mit klinischen Parametern zu korrelieren. Den Klinikern fehlt jedoch oftmals die Zeit, um eine kosteneffektive mikroskopische Untersuchung durchzuführen. Aus diesem Grund besteht ein großer Bedarf nach einem schnellen und einfachen bakteriologischen Test, welcher in der täglichen Praxis zur Identifizierung von Krankheitsindikator-Organismen zuverlässig verwendet werden kann.
Das Deutsche Patent DE 1 923 104 beschreibt einen Semi-Feststofftest zum Nachweis der Anwesenheit von β-D-Galactosidase im Zahnbelag mit Hilfe der Hydrolyse eines ihrer 6-Halogen-2-Naphthyl-β-D-Galactopyranosid-Substrate, welches ein chromaphores 6-Halogen-2-Naphthol erzeugt, das seinerseits mit einem Indikator nach einer zweistündigen Inkubationsperiode in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37ºC reagiert.
Bakteriologische Studien zeigen, daß Spirochäten, nämlich Bacteroides gingivales und Bacteroides forsythus in größeren Mengen bei Patienten mit klinischen Anzeichen einer periodontalen Erkrankung anwesend sind [Pickett u.a., J.Dent. Res., 65, 195 (1986); Dzink u.a., J.Clin. Periodontol., 12 (1986), 648-659 (1985) und Slots u.a., J.Clin. Periodontol 12, 540-552 (1985)] und daß diese Mikroorganismen nach einer erfolgreichen Behandlung und Nachbehandlung verringert werden [Loesche u.a., J. Periodontol., 55, 325-335 (1984)]. Aus diesem Grund könnte ein Test, welche ihre Anwesenheit bestätigt oder beseitigt, dem Kliniker helfen, die Angemessenheit von Behandlungsverfahren zu überwachen, da ein negativer Test anzeigen würde, daß jene Mikroorganismen in dem Subgingivabelag signifikant unterdrückt oder aus dem Subgingivabelag beseitigt worden sind.
Drei der für die Periodontitis wichtigsten Bakterien, nämlich Bacteroides gingivalis. Treponema denticola (ein Spirochät) und Bacteroides forsythus, haben die gemeinsame Eigenschaft, daß sie das N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA)-Trypsinsubstrat hydrolysieren.
Studien von Loesche u.a., J. Periodontol.. 58, 266-273 (1987) haben gezeigt, daß die Hydrolyse des N-Benzoyl-Naphthylamid (BANA)-Trypsinsubstrates durch einen von einer einzigen Stelle entnommenen Subgingivabelag bestens mit der Anzahl und den Eigenschaften von Spirochäten in Belagproben korrelieren und als Indikator einer klinischen Erkrankung dienen können. Bretz und Loesche, J.Dent.Res.. 66(11), 1668-1672 (1987) förderten diese Studien durch Verwendung von zusammengestellten Subgingivabelagsproben. Ihr Verfahren zur Krankheitser-kennung bestand in der Verwendung einer Flüssig-Phasen-Probe, bei welchem die Probestücke über Nacht mit einer BANA-Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 bebrütet werden und die Hydrolyse durch Zusatz eines lichtbeständigen granatfarbigen Farbentwicklers festgestellt wird. Die Bebrütung dieser Probe über Nacht hat sich für die zum Nachweis benützte Farbänderung bei 85% der Probestücke als notwendig herausgestellt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird eine Feststoffprobe zum Nachweis einer Hydrolyse von N- Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) zubereitet, welche zur Feststellung der Anwesenheit von periodontalen Krankheitserregerorganismen nützlich ist.
Die Probe umfaßt folgende Bestandteile:
a) Ein erstes Element, welches eine auf einen pH-Wert von 8-9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) zur Aufnahme von Untersuchungsproben des Subgingivabelages aufweist,
b) ein zweites Element mit einer Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane, welches einen adsorbierten Farbentwickler aufweist, der einen optimalen pH- Wert von 6-9 für eine Verbindungsreaktion mit β-Naphthylamin besitzt, wobei eine Aufbringung einer Subgingivabelagsprobe auf dem ersten Element mit nachfolgendem innigen Kontakt mit dem angefeuchteten zweiten Element und eine Inkubation von 5 bis 30 Minuten zu einem Farbumschlag an dem zweiten Element führt, woraus ersichtlich ist, daß eine BANA-Hydrolyse stattgefunden hat.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner ein Feststoff-Prüfverfahren für den Nachweis einer BANA-Hydrolyse zum Feststellen des Vorhandenseins von periodontalen Krankheitserregerorganismen, welches sich durch folgende Verfahrensschritte kennzeichnet:
a) Von einem Patienten werden eine oder mehrere Untersuchungsproben des Subgingivabelages gesammelt;
b) die Untersuchungsprobe(n) werden auf einem ersten Element einer Feststoffprobe angebracht, welches eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) aufweist;
c) die Feststoffprobe wird mit einem zweiten Element versehen, welches eine Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane mit einem adsorbierten Farbentwickler aufweist, der einen optimalen pH-Wert von 6 bis 9 für eine Verbindungsreaktion mit β-Naphthylamin besitzt;
d) das erste Element wird in innigen Kontakt mit dem zweiten Element gebracht, und
e) die miteinander vereinigten ersten und zweiten Elemente werden bei 50º bis 60ºC über eine Inkubationszeit von 5 - 30 Minuten bebrütet, wobei
f) das zweite Element beoachtet wird, um einen Farbumschlag festzustellen, welcher anzeigt, daß eine BANA-Hydrolyse stattgefunden hat.
Die Erfindung umfaßt ferner einen Bausatz zur Verwendung als Feststoffprobe zum Nachweis der Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA), mit
- einem ersten Element, auf dem eine auf einen pH-Wert von 8 - 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA) adsorbiert ist;
- einem zweiten Element mit einer Nylon- oder Nitrozellulosen-Membran, auf dem eine Lösung eines Farbentwicklers adsorbiert ist, welcher einen optimalen pH-Wert von 6 bis 9 für eine Verbindungsreaktion mit β- Naphthylamin aufweist.
Demzufolge besteht die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung darin, eine Feststoffprobe zum Nachweis einer BANA-Hydrolyse zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verwendung der Feststoffprobe zum Feststellen und Überwachen des Vorhandenseins von periodontalen Krankheitserregerorganismen anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Feststoffprobe zum Nachweisen und Überwachen einer periodontalen Erkrankung zu schaffen, welche in relativ kurzer Zeit, beispielsweise während eines üblichen Besuch einer Zahnarztpraxis, durchgeführt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Feststoffprobe zum Nachweisen und Überwachen einer periodontalen Erkrankung zu schaffen, welche leicht und sichtbar abgelesen werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Feststoffprobe zum Nachweisen und Überwachen einer periodontalen Erkrankung zu schaffen, welche eine dauerhafte, stabile Aufzeichnung darstellt, die in einem Krankenblatt leicht aufbewahrt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Feststoffprobe zum Nachweisen und Überwachen einer priodontalen Erkrankung zu schaffen, welche während routinemäßiger Zahnarztpraxisbesuche von dem Zahnarztpersonal leicht und schnell durchgeführt werden kann.
Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In ihrem weitesten Sinne bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Feststoffprobe zum Nachweis der Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-2- Naphthylamid (BANA), das Verfahren zu dessen Zubereitung und Verfahren zu dessen Anwendung.
Die Feststoffprobe umfaßt ein erstes Element, in welchem eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) adsorbiert ist, welche die Untersuchungsproben eines Subgingivabelages eines Patienten aufnimmt, und ein zweites Element, welches eine Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane ist, welche ein absorbiertes lichtbeständiges schwarzes K-Salz enthält. Wenn eine Untersuchungsprobe eines Subgingivabelages mit einem zur Hydrolysierung von BANA fähigen Mikroorganismus auf das erste Element gebracht wird, so findet die Hydrolyse statt. Wenn das zweite Element nach Aktivierung durch Wasser das erste Element kontaktiert, wandert das Reaktionsprodukt der Hydrolyse, nämlich β-Naphthylamin, auf die Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane des zweiten Elementes und erzeugt einen Farbumschlag in dem lichtbeständigen schwarzen K-Salz, welcher leicht beobachtet werden kann.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Zubereitung der Feststoffprobe, welches durch Adsorption einer auf einen pH-Wert von 8 - 9 gepufferten BANA-Lösung auf dem ersten Element und durch Adsorption einer Lösung eines lichtbeständigen schwarzen K-Salzes auf der Nylon- oder Nitrozellulose-Membran des zweiten Elementes durchgeführt wird. Beide Elemente werden getrocknet. Üblicherweise werden sie in der Weise verpackt, daß ihre Oberflächen gegen den Einfall von Licht, Luft, Wasser und andere Verunreinigungsstoffe geschützt sind, bis sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Desweiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Verwendung einer Feststoffprobe zum Nachweis einer BANA-Hydrolyse, um das Vorhandensein von periodontalen Krankheitserregerorganismen festzustellen.
Das Verfahren umfaßt das Sammeln von einer oder mehreren Untersuchungsproben des Subgingivabelages eines Patienten und das Aufbringen der Untersuchungsprobe(n) auf dem ersten Element der Probe, wobei dieses Element eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) enthält. Anschließend wird ein zweites Element der Feststoffprobe, welche eine Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane ist, die adsorbiertes lichtbeständiges schwarzes K-Salz enthält, angefeuchtet und in innigen Kontakt mit dem ersten Element gebracht. Die vereinigten Elemente werden dann bei 50ºC bis 60ºC über eine Inkubationszeit von etwa 5 bis 30 Minuten bebrütet. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die zusammengebrachten ersten und zweiten Elemente voneinander getrennt und das zweite Element wird beobachtet, um einen Farbumschlag festzustellen. Ein Farbumschlag an dem zweiten Element zeigt an, daß eine BANA-Hydrolyse stattgefunden hat. Dies zeigt wiederum das Vorhandensein eines periodontalen Krankheitserregerorganismus an, welcher in der Lage ist, BANA zu hydrolysieren.
Die Feststoffprobe gemäß der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, den Gesundheitszustand von periodontalem Gewebe vor, während und nach einer Behandlung zu bestätigen. Der Zahnarzt und der Patient sind daher in der Lage, den Zustand des periodontalen Gewebes schnell und objektiv einzuschätzen. Wenn nach einem Behandlungsverlauf die Testergebnisse positiv bleiben, kann der Behandlungsplan modifiziert werden, um eine zusätzliche Gewebezerstörung zu minimieren.
Die Feststoffprobe gemäß der Erfindung besitzt ferner die Fähigkeit, Stellen zu detektieren, welche tatsächlich mit den krankheitserregenden Mikroorganismen infiziert sind, welche jedoch noch keine klinischen Krankheitsanzeichen zeigen. Auf diese Weise kann die Probe eine Frühwarnung für den Zahnarzt, den Hygieniker und den Patienten darstellen, dahingehend, daß eine verstärke Mundhygiene und/oder Prophylaxe erforderlich ist, um das mögliche Auftreten einer klinischen periodontalen Erkrankung zu verhindern oder zu minimieren.
Eine mögliche Verwendung der vorliegenden Probe besteht darin, Zahnärzten und Hygienikern bei der Patientenerziehung zu helfen. Patienten haben oft Schwierigkeiten, die Ursachen einer periodontalen Erkrankung und ihre Behandlung zu verstehen, insbesondere, wenn sie noch keine Beschwerden oder andere Krankheitssymptome verspüren. Wenn ein Mittel zur Visualisierung des Vorhandenseins und des Ausmaßes ihrer Erkrankung auf einer ortsspezifischen Grundlage erhältlich ist, kann dies dazu dienen, ihr Verhalten gegenüber Mundhygiene und professioneller Zahnerhaltung zu ändern.
Das erste Element der Feststoffprobe gemäß der vorliegenden Erfindung besteht aus einem Grundmaterial, welches Wasser adsorbieren kann. Üblicherweise besteht ein derartiges Material aus einem Zellulose- oder Polyester-Papiermaterial. Papier und insbesondere Papierkissen haben den Vorteil, daß sie im Handel in einer Vielzahl von geeigneten Gewichts- und Adsorptionsklassen erhältlich sind und daß viele von ihnen zum diagnostischen Gebrauch behördlich zugelassen sind. Sie stellen ferner relativ billige Materialien dar, welche die Funktion haben, zu adsorbieren und beim Trocknen die wasserlöslichen enzym-empflindlichen Reagenzien zu stabilisieren, welche bei der erfindungsgemäßen Feststoffprobe verwendet werden. Geeignete Papiermaterialien sind Zellulosepapiere, welche von den Firmen Whatman Co. und Schleicher und Schuell Corp. erhältlich sind, ferner Polyester-Papiere, welche von der Firma E & D Corp. erhältlich sind. Besonders bevorzugte Zellulosepapiere sind jene, welche unter den Bezeichnungen S & S #903 und Whatman 3MM erhältlich sind. Selbstverständlich können auch äquivalente Papiermaterialmarken bei Anwendung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, ohne daß die Arbeitsweise der Feststoffprobe beeinflußt wird.
Das bei der Erfindung verwendete N-Bnzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA) ist ein kommerziell erhältliches Substrat, welches von Firmen wie beispielsweise Sigma Chemical Co. (St. Leuis, MO) hergestellt wird. Dieses Substrat wird durch seine entsprechenden Enzyme hydrolysiert, um β-Naphthylamin zu erzeugen. Diese Hydrolyse ist für das Verhalten dieser Probe kritisch. Sie tritt optimal auf bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 9. Aus diesem Grund verwendet die Feststoffprobe gemäß der vorliegenden Erfindung in der praktischen Anwendung einen Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 9. Ein Tris-Puffer ist ein bevorzugtes Puffermaterial aufgrund seiner Eignung für biologische Reaktionen und seiner allgemeinen Verfügbarkeit. Selbstverständlich können auch equivalente Puffermaterialien oder Pufferstoffe verwendet werden, beispielsweise Natrium- und Kaliumphosphate, -borate und -carbonate, welche den erforderlichen pH-Wert von 8 bis 9 haben. Vorzugsweise wird der pH-Wert im Bereich zwischen 8,5 und 8,8 gehalten. Das BANA-Substrat wird vorzugsweise auf dem ersten Element so angebracht, daß man eine Konzentration von etwa 1076 bis 2152 mg/m² (100-200 mg/ft²) oder etwa 30 bis 30 mg/Probe erhält.
Das zweite Element der erfindungsgemäßen Feststoffprobe umfaßt eine Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane. Diese Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane trägt das lichtbeständige schwarze K-Salz, welches der Farbentwickler für die erfindungsgemäße Feststoffprobe ist. Geeignete Nitrozellulose-Membranen sind solche, welche von der Firma Schleicher & Schuell Corp. unter der Bezeichnung BA95, 0,45 µm erhältlich sind. Geeignete Nylon-Membranen sind solche, welche von der Firma Schleicher & Schuell Corp. unter den Bezeichnungen "Nylon 66" oder "Pall Nylon 66" (Markenname: Biodyne A) verkauft werden. Die Nylon- oder Nitrozellulose- Membrane ist negativ geladen. Diese Materialien sind daher stark sauer und begünstigen die Kopplung des lichtbeständigen schwarzen K-Salz-Farbentwicklers mit dem β-Naphthylamin, welches das Produkt der Hydrolyse des BANA-Substrates darstellt. Ferner sind diese Nylon- und Nitrozellulose-Membranen in der Lage, eine große Menge des lichtbeständigen schwarzen K-Salz-Farbentwicklers zu adsorbieren. Dies ist kritisch für die Empfindlichkeit der Feststoffprobe. Die Nylon- oder Nitrozellulose-Membranen adsorbieren ferner das lichtbeständige schwarze K-Salz zusammen mit ihren Stabilisatoren, welche in dem kommerziellen Produkt mit enthalten sind. Diese Fähigkeit zur Adsorption der Stabilisatoren, beispielsweise Zinkchlorid (ZNCl&sub2;) des lichtbeständigen schwarzen K-Salz-Farbentwicklers (ebenso wie den lichtbeständigen schwarzen K-Salz-Farbentwickler selber) führt dazu, daß das fertige zweite Element die Stabilität der Ausgangsstoffe beibehält. Dies begünstigt ganz offensichtlich die Lagerbeständigkeit der fertigen Festphasenprobe.
Der lichtbeständige schwarze K-Salz-Farbentwickler, welcher bei der vorliegenden Erfindung als Komponente des zweiten Elementes verwendet wird, ist ein kommerziell erhältliches Produkt, welches von Chemieherstellern, wie der Firma Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen werden kann. Er gehört zur Kategorie eines Azodiazo-Trockenfarbentwicklers. Das pH-Optimum der Kopplungsreaktion des Diazonium-Salzes und des Arylamins liegt bei etwa 6. Dieses pH-Optimum verbessert in hohem Maße die Funktion und die Stabilität der Feststoffprobe nach der vorliegenden Erfindung. Da die erfindungsgemäße Hydrolyse bei einem optimalen pH-Wert von etwa 8 bis 9 erfolgt, ist es kritisch, daß es keinen breiten Bereich zwischen dem pH-Optimum des verwendeten Farbentwicklers und der Hydrolyse- Reaktion gibt. Wenn ein Farbentwickler mit einem geringeren pH-Optimum verwendet würde, gäbe es eine physikalische Verschlechterung des Farbentwicklers bei dem pH-Wert, bei welchem die Hydrolyse erfolgt. Dies würde offensichtlich zu einer falschen Ablesung bei der resultierenden Feststoffprobe führen. Andere äquivalente Farbentwickler, wie beispielsweise ein lichtbestandiges dunkelblaues R- Salz, kann in der Praxis den lichtbeständigen schwarzen K-Salz-Farbentwickler ersetzen, doch müssen diese ersatzweisen Farbentwickler die Anforderungen an das pH-Optimum erfüllen. Dies bedeutet, daß sie ein pH-Optimum zwischen 6 und 9 haben müssen. Das lichtbeständige schwarze K-Salz wird typischerweise bei der Feststoffprobe gemäß der Erfindung in einer Konzentration von etwa 215,2 bis 322,8 mg/m² (20-30 ft/²) oder 6 bis 9 mg/Probe verwendet.
Ein wahlweiser Zusatz bei der praktischen Zubereitung der Feststoffprobe nach der vorliegenden Erfindung ist der Zusatz von Stabilisierungsstoffen zu der lichtbeständigen schwarzen K-Salzlösung, welche von der Nylon- oder Nitrozellulose- Membran adsorbiert wird. Typischerweise wird ein polymeres Stabilisierungsmittel verwendet. Derartige Mittel sind kommerziell erhältliche Polyethylen-Glycole mit einem Molekulargewicht zwischen 6000 und 8000, wobei derartige Polyethylen- Säuren unter der Marke Gantrez, beispielsweise Gantrez S-95 (von der Firma GAF Corp. erhältlich) verkauft werden. Diese polymeren Stabilisierungsstoffe werden der Lösung von lichtbeständigem schwarzen K-Salz in einer Menge von etwa 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent zugesetzt. Der Polymerisat-Stabilisie-ungsstoff wirkt in der Weise, daß er dasaus einer Zersetzung stammende Wasser adsorbiert und das zweite Element (die Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane) während der Lagerung vor dessen Verwendung stabisisiert. Das polymere Stabilisierungsmittel dient ferner als Benetzungsmittel für eine übergangsfreie Aktivierung des aus der Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane und dem lichtbeständigen schwarzen K-Salz-Farbentwickler bestehenden Elementes unmittelbar vor dessen Gebrauch bei der Anwendung der Probe gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer, wahlweise Zusatz zu dem zweiten Element der erfindungsgemäßen Probe ist ein diazo-farbiger Stabilisator. Derartige diazo-farbigen Stabilisatoren werden allgemein den kommerziell erhältlichen Lösungen von gefärbten Farbentwicklern des Diazo-Typs zugesetzt. Lichtbeständiges schwarzes K-Salz ist eine Farbe vom Diazo-Typ. Typische diazo-farbige Stabilisatoren sind beispielsweise 1,5-Naphthylendisulfon-Säure und ihre Salze sowie Zinkchloride und andere Übergangsmetallchloride. Diese Farbstabilisatoren können in dem lichtbeständigen schwarzen K-Salz bereits bei der Lieferung durch den Hersteller vorhanden sein oder können während der Zubereitung des aus lichtbeständigem schwarzen K-Salz und der Nylon- oder Nitrozellulose-Membran bestehenden zweiten Elementes zugesetzt werden. Typischerweise werden derartige Farbstabilisatoren in einer Menge zugesetzt, welche etwa 0,1 bis 1,0 Gewichtsprozent beträgt.
Eine weitere wahlweise Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Probenhalteeinrichtung auf dem ersten Element. Eine derartige Probenhalteeinrichtung kann auf vielfache Weise verwirklicht werden. Ein besonders geeigneter Typ einer Probenhalteeinrichtung, insbesondere, wo das erste Element aus einem Papierkissen besteht, ist eine Probenhalteeinrichtung in Form einer eingeprägten Vertiefung. Derartige Vertiefungen werden typischerweise durch eine Herstellungsvorrichtung eingeprägt, welche die Vertiefung in das Papierkissen vor der Adsorption des Tris-gepufferter BANA-Lösung hineinpreßt. Solche in das Papierkissen eingeprägte Vertiefungen verringern das Reaktionsvolumen auf ein Minimum und erleichtern das Aufbringen der Subgingivabelagsprobe mit einem zahnärztlichen Instrument auf die Feststoffprobe.
Die durch die Kopplung des lichtbeständigen schwarzen K-Salzes mit dem β- Naphthylamin erzeugte Farbe ist blauschwarz auf einem lachsfarbigen Hintergrund. Diese Kombination läßt sich leicht unterscheiden, insbesondere, wenn die Untersuchungsproben eine kleine Größe haben und Tests hervorbringen, welche zu einer farbigen Nadelpunktierung führen.
Typischerweise werden bei der Durchführung der Zubereitung der erfindungsgemäßen Feststoffprobe zuerst die einzelnen Elemente zubereitet und anschließend durch Kleben auf einem Kunststoffmaterial oder einem anderem stabilen Trägermaterial befestigt. Typischerweise ist dieses Trägermaterial eine Polystyrolkarte und die Elemente werden unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebandes befestigt. Die Elemente werden symmetrisch zu beiden Seiten einer Perforationslinie in dem Trägermaterial so befestigt, daß beim Falten des Trägermaterials längs der Perforationslinie das mit der BANA-Lösung versehene erste Element unmittelbar über dem das lichtbeständige schwarze K-Salz enthaltende zweite Element zu liegen kommt. Damit erreicht man zwei Dinge: Beide Elemente der Probe sind zusammen in jeder Packung enthalten, so daß keine Möglichkeit besteht, daß ein zahnärztlicher Laborant zwei Elemente desselben Typs verwendet; und zweitens, daß der Kunststoffträger Perforationen aufweist, so daß das zweite Element exakt an dieser Knickstelle übergefaltet werden kann, um den Verfahrensschritt einer innigen Kontaktierung der beiden Elemente durchzuführen, welcher bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Probe erforderlich ist.
Ein derartiges Kunststoffmaterial oder anderes stabiles Trägermaterial erleichtert ferner die Einfügung der fertigen Probe in eine zahnärztliche Patientenkarte. Die Elemente sind in bequemen Größen erhältlich, beispielsweise in Form einer "Proben"-Karte (welche etwa 3 bis 5 Versuchsproben enthält) oder in Form einer "Ganz-Mund-Test"-Karte, welche etwa 30 bis 32 Versuchsproben enthält.
Die Hydrolyse der Feststoffprobe gemäß der vorliegenden Erfindung tritt am leichtesten bei einer Temperatur von etwa 50 bis 60ºC auf. Aus diesem Grund ist eine Wärmequelle für diesen Temperaturbereich zur Durchführung des Tests erforderlich. Typischerweise wird hierzu ein Trockenwärmeinkubator verwendet. Alternativ kann ein Warmwasserbad mit einer Temperatur von etwa 50 bis 60ºC zur Durchführung des Tests benutzt werden. Die Anwendung dieser Temperatur verringert die Gesamtdauer und verbessert die Empfindlichkeit des Tests, da die Hydrolyse schneller bei dieser Temperatur auftritt und andere Nebenprodukte verringert werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen die Zubereitung der Feststoff probe gemäß der vorliegenden Erfindung und die Anwendungsverfahren hierfür.

BEISPIEL 1

Zubereitung der Feststoffprobe

Materialien:

Papier #903 der Firma Schleicher und Schuell Corp.
reine Nitrozellulose BA 95, 0,45 µm der Firma Schleicher und Schuell Corp.
lichtbeständiges schwarzes K-Salz (Firma Sigma)
BANA-Substrat (Firma Sigma)
Tris-Base
1,0 M hydrochlorische Säure
Polyethylenglycol (6-8000 mw) [Firma Sigma]
Tiegel mittleren Gewichts
doppelt klebendes Klebeband (Firma 3M)
Warmwasserbad

Verfahren:

Das Papier und die Nitrozellulose-Membrane werden in 5 x 5 cm große Quadrate geschnitten.

BANA-Papierzubereitung:

Eine BANA-Lösung wird zubereitet durch Auflösen von 44 mg BANA-Substrat in 1 ml Dimethylsulfoxid. Diese Lösung wird dann im Verhältnis 1: 50 in 15 mM Tris-HCL mit einem pH-Wert von 8,5 verdünnt. Ein ml der resultierenden Lösung wird auf den Boden des Tiegels mittleren Gewichts gegeben und darauf wird ein Quadrat des Papiers #903 gelegt. Die Adsorption erfolgt in einer Zeit von etwa 2 Minuten. Das flüssigkeitsgefüllte Papier wird dann auf eine Glasoberfläche gebracht und das Wasser wird bei Raumtemperatur durch die Dehydration unter Verwendung eines Entfeuchters ausgetrieben.

Bemerkung:

Das Papier kann in flacher Form benutzt werden oder es kann eine Reihe von Vertiefungen unter Verwendung von Ösenzangen oder eines anderen geeigneten Prägewerkzeuges eingeprägt werden. Die erfolgt vor der Imprägnierung mit BANA durch teilweises Quetschen der Ösenzangen durch zwei Papierlagen hindurch unter Vermeidung einer Durchstoßung.

Zubereitung der Nitrozellulose-Membrane mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz:

Lichtbeständiges schwarzes K-Salz wird auf die Nylon- oder Nitrozellulose-Quadrate adsorbiert, indem neun Quadrate der Membrane mit 20 ml 10%igem Polyethylenglycol in wässriger Form (mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 8000) ersetzt werden, welches 0,2% lichtbeständiges schwarzes K-Salz enthält. Diese Lösung wird vor der Verwendung gereinigt, indem sie durch eine mit einem Baumwollstopfen verschlossene Säule geleitet wird, um unlösliches Material zu entfernen. Die Membranen werden zuerst für die Adsorption zubereitet, indem sie in destilliertem Wasser über eine Stunde angefeuchtet werden. Anschließend werden die nassen Membranen und die lichtbeständige schwarze K-Salzlösung in einem Tiegel mitfleren Gewichts miteinander vermengt, mit Aluminiumfolie bedeckt und für 2 bis 6 Stunden in ein 37ºC warmes Wasserbad gesetzt. Anschließend werden die Membranen unter Verwendung von Pinzetten auf ein Blatt Filterpapier übertragen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.
Der Test ist an dieser Stelle gebrauchsfertig, indem man je ein BANA-Papier und eine Nitrozellulose-Membran mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz verwendet.

Empfindlichkeit

Verwendet man diese 30-minütige Testprozedur um eine trypsin-ähnliche Aktivität mit bekannten, gemessenen Lösungen von Rinder-Pancrease-Trypsin (Typ III, Firma Sigma Chemical Co., etwa 11.680 BAEE Einheiten/mg Protein) abzuschätzen, so ergibt sich eine Detektionsgrenze von 10 bis 50 Nanogramm pro 5 µl Tropfen. Dies ist etwa eine 100-fache Verbesserung der Empfindlichkeit eines bei 37ºC über 18-22 Stunden durchgeführten Tests auf Flüssigbasis.
Das Verhältnis der Trypsin-Hydrolyse eines BANA-Substrates verglichen mit der Trypsin-Hydrolyse von gereinigtem Treponema denticola Enzym wurde bestimmt (vgl. "Purification and Characterization of an Enzyme Produced by Treponema denticola Capable of Hydrolyzing synthetic Trypsin Substrates" von Ohta, K., Makinen, K. K., und Loesche, W.J. "Infection and Immunity", 53, 213-220(1986). Das festgestellte Verhältnis von 11,7 bedeutet, daß die Empfindlichkeit des Testes für dieses Enzym 117-185 Nanogramm beträgt.

BEISPIEL 2

BANA-Papier-Zubereitung

Der Tris-Puffer wurde destiliertem Wasser zugesetzt und vermischt, bis er gelöst war. Die Lösung wurde auf einen pH-Bereich von 8 8 ± 0,2 mit 2N HCl titriert. Das BANA-Substrat (5,5 g/l) wurde Methanol (90 Gew.-%/Volumeneinheit) unter Mischen zugesetzt, bis das BANA-Substrat gelöst war. Die Tris-Pufferlösung (0,11) wurde der BANA-Methanol-Lösung (0,91) langsam unter sorgfältigem Mischen zugesetzt.
Unter Verwendung von Whatman 3MM Papier wurde die vorgenannte Lösung in einem Verhältnis von einem Liter/27,4 m (90 laufende Fuß) auf ein 15,24cm (6") breites Papiers aufgebracht und bei einer Temperatur von 82,2ºC (180ºF) getrocknet.

Zubereitung der Nylon-Membrane mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz

Gantrez S-95 wird langsam und unter Rühren dem Methanol zugesetzt. Anschließend wird destilliertes Wasser unter weiterem Rühren zugegeben. Dieser Lösung wird 1,5-NaphthylendiSO&sub3;Na zugesetzt. Nach erfolgtem Mischen wird dann das lichtbeständige schwarze K-Salz zugesetzt und über 15-20 Minuten gerührt. Die resultierende Lösung wird dicht und gegen Licht geschützt abgedeckt und so schnell wie möglich bei dem Beschichtungsvorgang verwendet.
Unter Verwendung einer "Pall Nylon"-Membrane (Markenname: Biodyne A) wird die oben genannte Lösung zunächst mittels eines 40 Mikrometer-Filters gefiltert und dann auf die Membrane bei einer Geschwindigkeit von 0,0305-0,305 m/min. (0,1-1 Fuß/Minute) und einem Verhältnis von 1 Liter/54,9 laufende Meter (1 Liter/180 laufende Fuß) auf eine 15,24 cm (6") breite Membrane aufgebracht und bei einer Temperatur von 76,7ºC (170ºF) getrocknet. Die Imprägnierung wird unter reduzierten Beleuchtungsbedingungen ausgeführt (Lichtintensitäten geringer als 21,52 Lux (2 Fußkerzen). Die getrocknete imprägnierte Nylon-Membrane wird bei einer relativen Feuchtigkeit ≤ 13% gelagert. Das beschichtete Papier und die integrierte Nylon-Membrane werden in 1,27 cm (1/2") breite Streifen geschnitten; hiervon werden jeweils zwei Streifen nebeneinander auf 11,43x13,34 cm (4,5" x 5,25") große Polystyrolkarten laminiert.

BEISPIEL 3

Test Verfahren:

Untersuchungsproben von Subgingivabelägen werden gesammelt und von drei oder vier Stellen pro Patient mittels einer Kurette zusammengestellt, nachdem der Supragingivabelag entfernt und abgesetzt wurde. Der Belag wird in Sorensen- Phosphat-Puffer gesammelt. Untersuchungsproben werden auf mehrere Abschnitte des ersten Elementes mit der BANA-Lösung appliziert. Das zweite Element mit dem lichtbeständigen schwarzen K-Salz und der Nylon- oder Nitrozellulose- Membrane (welche durch Befeuchten mit destilliertem Wasser aktiviert wurde) wird auf das mit den Untersuchungsproben versehene erste (BANA-) Element) gelegt. Die vereinigten Elemente werden dann in einen Trockenwärmeinkubator bei 55 ºC für fünfzehn Minuten gelegt. Alternativ können die vereinigten Elemente in ein Warmwasserbad (etwa 55-59ºC) für etwa 30 Minuten gelegt werden. Nach der erforderlichen Zeitspanne werden die Elemente aus dem Inkubator oder dem Wasserbad genommen, getrennt und das zweite Element aus lichtbeständigem schwarzen K-Saiz und der Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane untersucht. Das Vorhandensein von dunkelblauen Flecken auf dem zweiten Element mit dem lichtbeständigen schwarzen K-Salz und der Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane zeigt eine BANA-Hydrolyse und damit die Anwesenheit von periodontalen Krankheitserregerorganismen an.

BEISPIEL 4

Korrelation der Feststoffprobe mit der klinischen Diagnose einer periodontalen Erkrankung.

Zehn Belagsproben wurden von Laborpersonal in Michigan (#1-10) und 15 Belagsproben wurden von Patienten in Detroit (#11-25) entnommen. Die erfaßten Parameter enthalten die klinische Beurteilung "gesundt" oder "erkrankt", die Taschentiefe, Bluten beim Sondieren, die Anzahl von Spirochäten pro Hochleistungsmikroskopfeld (hpf) (ein Spirochät/hpf entspricht etwa 1x10&sup6; Organismen), die Farbintensitat der mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz versehenen Feststoffprobe sowie die Farbintensität der BANA-Reaktion, welche durch eine Flüssig-Phasen-Probe über Nacht durchgeführt wurde.
Der Belag wurde in 110 µl Flüssigkeit gesammelt und durch Verwirbelung dispergiert; hiervon wurden 10 µl nur für die mikroskopische zählung der Spirochäten entnommen; weitere 50µl wurden über Nacht mit der BANA-Lösung in einer Flüssig-Phasen-Probe bebrütet. Die restlichen 50µl wurden zentrifugiert und das resultierende Kügelchen wurde auf die Feststoffprobe appliziert und mit Hilfe der Wasserbadmethode 30 Minuten lang bebrütet. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle 1 wiedergegeben. TABELLE 1
Es gibt zwei Proben (Beläge), bei denen die Feststoffprobe mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz von der Flüssig-Phasen-Probe abweicht und bei denen sich die Feststoffprobe mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz als unrichtig erweist. Beim Beispiel 4 hielten die Kliniker den Belag als von einer gesunden Stelle stammend; es gab keine feststellbaren Spirochäten; die Flüssig-Phasen-Probe war negativ, doch die Feststoffprobe mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz war schwach positiv. Dies ist ein falscher posiver Wert. Bei der Probe 13 hielten die Kliniker die Stelle für erkrankt, sie blutete beim Sondieren, hatte hohe Werte von Spirochäten und war schwach positiv bei der Flüssig-Phasen-Probe, jedoch negativ bei der Feststoffprobe mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz. Dieses ist ein falscher negativer Wert.
Insgesamt gab es eine Übereinstimmung zwischen den beiden Tests und der Mehrzahl der klinischen Parameter in 23 von 25 Proben. Eine Serie von Chi- Quadrat-Analysen zeigt, daß es eine hoch signifikante Beziehung gibt zwischen diesen Tests und den verschiedenen klinischen Parametern. Es gibt drei Proben (#7, 8,19), bei denen die Feststoffprobe mit lichtbeständigem schwarzen K-Salz und die Flüssig-Phasen-Probe negativ waren, jedoch die Idinischen Befunde hauptsächlich auf eine erkrankte Stelle deuteten. In jedem Falle war die Anzahl der Spirochäten/hpf ≤ 1, was zeigte, daß die Belagsprobe zu klein war, um in der für die Inkubation benutzten Zeit eine Reaktion zu liefern. Dies wird stets ein Problem mit sehr kleinen Belagsproben sein, was durch die Entnahme von Mehrfachproben minimiert werden kann.

Claims

1. Feststoffprobe zum Nachweis einer Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-2- Naphthylamid (BANA), mit

- einem ersten Element, welches eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) zur Aufnahme von Untersuchungsproben eines Subgingivabelages aufweist, und

- einem zweiten Element mit einer Nylon- oder Nitrozellulose- Membrane, welches einen adsorbierten Farbentwickler aufweist, der einen optimalen pH-Wert von 6 bis 9 für eine Verbindungsreaktion mit β-Naphthylamin besitzt,

wobei eine Anbringung einer Subgingivabelagsprobe auf dem ersten Element mit nachfolgendem innigen Kontakt mit dem angefeuchteten zweiten Element und eine Inkubation von 5 bis 30 Minuten zu einem Farbumschlag an dem zweiten Element führt, woraus ersichtlich ist, daß eine BANA-Hydrolyse stattgefunden hat.

2. Feststoffprobe nach Anspruch 1, wobei der Farbentwickler ein Diazonium- Salz ist.

3. Feststoffprobe nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Farbentwickler ein lichtbeständiges schwarzes K-Salz oder ein lichtbeständiges dunkelblaues R-Salz ist.

4. Feststoffprobe nach Ansprüchen 1, 2 oder 3, wobei das erste Element ein Zellulosepapierkissen aufweist.

5. Feststoffprobe nach Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei das erste Element eine Probenhalteeinrichtung aufweist, die zur Aufnahme der Untersuchungsproben eines Subgingivabelages dient.

6. Feststoffprobe nach Anspruch 5, wobei die Probenhalteneinrichtung aus Vertiefungen besteht, die in das erste Element eingeprägt sind.

7. Feststoffprobe nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei als Puffer ein Tris- Puffer vorgesehen ist.

8. Feststoffprobe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das zweite Element zusätzlich zu der Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane einen polymeren Stabilisator aufweist.

9. Feststoff-Prüfverfahren für den Nachweis einer BANA-Hydrolyse zum Feststellen des Vorhandenseins von periodontalen Krankheitserregern, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

a) Von einem Patienten werden eine oder mehrere Untersuchungsproben eines Subgingivabelags gesammelt;

b) die Untersuchungsprobe(n) werden auf einem ersten Element einer Feststoffprobe angebracht, welches eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamid (BANA) aufweist;

c) die Feststoffprobe wird mit einem zweiten Element versehen, welche eine Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane mit einem adsorbierten Farbentwickler aufweist, der einen optimalen pH-Wert von 6 bis 9 für eine Verbindungsreaktion mit β-Naphthylamin besitzt;

d) das erste Element wird in innigen Kontakt mit dem zweiten Element gebracht, und

e) die miteinander vereinigten ersten und zweiten Elemente werden bei 50ºC bis 60ºC über eine Inkubationszeit von 5 - 30 Minuten bebrütet, wobei

f) das zweite Element beobachtet wird, um einen Farbumschlag festzustellen, welcher anzeigt, daß eine BANA-Hydrolyse stattgefunden hat.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei als Farbentwickler ein Diazonium-Salz vorgesehen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei als Farbentwickler ein lichtbeständiges schwarzes K-Salz oder ein lichtbeständiges dunkelblaues R-Salz vorgesehen wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Element vor dem Kontaktierungsschritt angefeuchtet wird.

13. Verfahren nach Ansprüchen 9 - 12, wobei als erstes Element ein Zellulosepapierkissen vorgesehen wird.

14. Verfahme nach den Ansprüchen 9 bis 13, wobei das erste Element eine Probenhalteeinrichtung aufweist, die zur Aufnahme der Untersuchungsproben von Subgingivaplaques dient.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei als Probenhalteeinrichtung Vertiefungen vorgesehen werden, die in das erste Element eingeprägt werden.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 15, wobei zur Herstellung der BANA- Lösung ein Tris-Puffer verwendet wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei das zweite Element zusätzlich mit einem polymeren Stabilisator versehen wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei die Inkubation in einem Trockenwärmeinkubator durchgeführt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei die Inkubation in einem waremen Wasserbad durchgeführt wird.

20. Verfahren zur Herstellung einer Feststoffprobe zum Nachweis einer Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA), welches folgende Schnitte aufweist:

- Auf einem ersten Element wird eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA) adsorbiert und das Element getrocknet, und

- auf einem zweiten Element mit einer Nylon- oder Nitrozellulose- Membrane wird eine Lösung eines Farbentwicklers adsorbiert, welche einen optimalen pH-Wert von 6 bis 9 für eine Verbindungsreaktion mit β-Naphthylamin aufweist, wobei anschließend das Element getrocknet wird.

21. Herstellungsverfahren nach Anspruch 20, wobei als Farbentwickler ein Diazonium-Salz vorgesehen wird.

22. Herstellungsverfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei als Farbentwickler ein lichtbeständiges scharzes K-Saiz oder ein lichtbeständiges dunkelblaues R-Salz vorgesehen wird.

23. Herstellungsverfahren nach den Ansprüchen 20 bis 22, wobei als erstes Element ein Zellulosepapierkissen vorgesehen wird.

24. Herstellungsverfahren nach den Ansprüchen 20 bis 23, wobei das erste Element zusätzlich mit einer Probenhalteeinrichtung versehen wird.

25. Herstellungsverfahren nach Anspruch 24, wobei als Probenhalteeinrichtung Vertiefungen vorgesehen werden, welche in das erste Element eingeprägt werden.

26. Herstellungsverfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei zur Herstellung der BANA-Lösung ein Tris-Puffer verwendet wird.

27. Herstellungsverfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 26, wobei die Lösung des Farbentwicklers zusätzlich mit einem polymeren Stabilisator versehen wird.

28. Bausatz zur Verwendung als Feststoffprobe zum Nachweis der Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA), mit

- einem ersten Element, auf dem eine auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin adsorbiert ist;

- einem zweiten Element mit einer Nylon- oder Nitrozellulose- Membran, auf dem eine Lösung eines Farbentwicklers adsorbiert ist, welcher einen optimalen pH-Wert von 6 bis 9 für eine Verbindungsreaktion mit β-Naphthylamin aufweist.

29. Bausatz nach Anspruch 28, wobei der Farbentwickler ein Diazonium-Salz ist.

30. Bausatz nach Anspruch 28 oder 29, wobei der Farbentwickler ein lichtbeständiges schwarzes K-Salz oder ein lichtbeständiges dunkelblaues R-Salz ist.

31. Bausatz nach den Ansprüchen 28 bis 30, wobei jedes Element derart verpackt ist, daß der Zutritt von Licht, Luft, Wasser und/oder anderen Verunreinigungen auf eine Oberfläche der Elemente vor deren Benutzung bei dem Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 17 vermieden wird.

32. Bausatz nach den Ansprüchen 28 bis 31, wobei das erste Element ein Zellulose- oder Polyesterpapiermaterial aufweist.

33. Bausatz nach den Ansprüchen 28 bis 32, wobei das erste Element eine Probenhalteeinrichtung aufweist, die zur Aufnahme der Untersuchungsproben eines Subgingivabelages dient.

34. Bausatz nach einem der Ansprüche 28 bis 35, wobei die Probenhalteeinrichtung aus Vertiefungen besteht, die in das erste Element eingeprägt sind.

35. Bausatz nach einem der Ansprüche 28 bis 34, wobei das zweite Element zusätzlich zu der Nylon- oder Nitrozellulose-Membrane einen polymeren Stabilisator aufweist.

36. Bausatz nach einem der Ansprüche 28 bis 35, wobei jedes Element auf einem stabilen Trägermaterial aus Kunststoff oder dergleichen festgeklebt ist.

37. Bausatz nach Anspruch 36, wobei das Trägermaterial eine Polystyrolkarte ist.

38. Bausatz nach einem der Ansprüche 36 oder 37, wobei die Elemente symmetrisch auf dem Trägermaterial zu beiden Seiten einer Perforationslinie derart befestigt sind, daß beim Falten des Trägermaterials längs der Perforationslinie das erste und zweite Element in direkten Kontakt miteinander gebracht werden.

39. Verwendung eines ersten Elementes bei einer Feststoffprobe zum Nachweis der Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-2-Naphthylamin (BANA) in Kombination mit einem zweiten Element, das einen adsorbierten Farbentwickler enthält, wobei in dem ersten Element eine auf einen pH-Wert von 6 bis 9 gepufferte BANA-Lösung adsorbiert ist.