JPH02261396A - 歯周病診断用アッセイ装置及びｂａｎａ加水分解検出方法及びｂａｎａ加水分解検出用アッセイ装置の利用方法及び歯周病決定方法及びｂａｎａ加水分解検出用固相アッセイ装置の調整方法及びｂａｎａ加水分解検出用アッセイ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は歯肉下歯垢内の歯周疾患の原因となる微生物の
存在を確認する改良固相アッセイに関するものである。

探針深さ（ｐ「ｏｂｉｎｇ　ｄｅｐｔｈ）　、付着損失
（！目ｘｃｈ−ｍｅｎｊ　１ｏｓｓｌ及び、特に探針時
の出血が伝統的に歯周疾患のインジケーターとして用い
られている。

しかしながら、これらの臨床的パラメーターは歯肉下歯
垢内の細菌組成物に関する情報を提供するよりもむしろ
、過去の疾患経験及び組織の炎症状態を反映するもので
ある。

一般的微生物学的方法は歯垢中の歯周疾患病原体の確認
のために有効であるが、時間がかかり、その実施には専
門家を必要とする、という欠点を有する。暗視野顕微鏡
を用いると、特徴的形態又は運動を示す微生物を観察、
計数することができ、臨床パラメーターと相関づけるこ
とができる。しかしながら臨床医は顕微鏡検査を費用効
率的に（ｃｏｓｔ　ｅ目ｅｃｔｉマｅ）行う時間がない
ことが多い。そこで、疾患のインジケーター微生物を確
認できる、日常的に使用しやすい迅速且つ簡単な微生物
学的試験が強く所望される。

微生物学的研究の結果、歯周疾患の臨床症状をもった患
者ではスピロヘータ、Ｂａｃｆｅｒｏｉｄｅｓ　　ｉｎ
−〔１すＤ−及びｌ１１ｃｆｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｕｒｓ
’ｋｈａｔが高い比率で存在し［ＰｉｃｋｅＮ　ｅｊ　
ｓｌ、、　　Ｊ、ＤｅＮ、Ｒｅ’ｓ、、　　６５゜１９
５（１９）１６）；Ｄｓｉｎｋ　　ｅｔ　　ｓｌ、　　
　　Ｊ、Ｃｈｉｏ、　　　Ｐｅｔｉｏｄｏｎｔａ１１２
（１９８６）、　６４８−６５９（１９１１５）及び５
ｌｏｔｓ　ｅｔ　！ｌ　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　［’ｅｒｉｏｄｏｎｊｏ１．．１２．５４
０−５５２（１９８５）　］　、これら微生物は効果的
治療及び保守（メンテナンス）の後に減少することが判
明した［Ｌｏｅｓｃｂｅ　Ｎ　！＋、。

ＬＰｅ＋１ｏｄｏｎｔｏ１．、　５５．　３２５−３３
５（１９８４）コ。したがって、これらの存在を確認、
或いは除去する試験は、臨床医が治療法が正しいかどう
かを調べるのに役立つ。なぜならば試験結果が陰性なら
ば、これらの微生物が顕著に抑制され、又は歯肉下歯垢
から除去されたことが明らかになるからである。

歯周炎と関係す゛る最も重要な三種類の細菌、８ａｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ　　ｉｎ　ｉｗ！ｌｉｓ、　Ｔｒｃｐｏ
ａｅｍａ　ｄｅｎｌｉｃｏｌａ（スピロヘータ）及びＢ
ｉｅｊｅｒｏｉｄｅｓ　（ｏｒｓＴｔｈａｓは、トリプ
シン基質Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフ
チルアミド（ＢＡＮＡ）を加水分解する特異な能力をも
っている。

Ｌｏｅｓｃｂｅ　らによる研究［１，Ｐｅｔｉｏｄｏｎ
ｔｏｌ、、　　５８＋２６６−２７３　（１９８７）Ｊ
は、成る単一の部位から得られる歯肉下歯垢によるトリ
プシン基質Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナ
フチルアミド（ＢＡＮＡ）の加水分解が、歯垢サンプル
中のスピロヘータの数及び割合と非常によく相関してお
り、臨床疾患のインジケータとして役立つことを示した
。

ＢｒＮ５及びＬｏｅｓｃｂｅ、　　Ｊ、Ｄｅｎｔ、　Ｒ
ｅｓ、、６６（１１）　１６６ｇ−１６７２（１９８７
）は、集めた（ｐｏｏ！ｅｄ）歯肉下歯垢サンプルを用
いてこのような研究を進めた。彼等の疾患発見法は液相
アッセイの利用を含み、このアッセイはサンプルを一晩
ＢＡＮＡ溶液と共にｐＨ７，０でインキニーベートし、
変色しない深紅色発色剤の添加によって加水分解を検出
するものである。

このアッセイでは、これらサンプルの８５％において指
標的色変化をおこすのに一晩のインキュベーションが必
要であることがわかった。

本発明によると、歯周疾患の原因となる微生物の存在の
検出に役立つ、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２
−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）加水分解を発見する固相
アッセイが提供される。

そのアッセイは、 ａ）歯肉下歯垢サンプルを得るために、Ｎ−ベンゾイル
−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）
のｐＨ８〜９−緩衝溶液を浸み込ませた第一の要素と； ｂ）吸着ファスト・ブラックに塩を含むナイロン−又は
ニトロセルロース膜から成る第二の要素から成り：歯肉
下歯垢サンプルを第一の要素上に置き、それから濡れて
いる第二の要素と密に接触させ、一緒にした要素をイン
キュベーション時間５〜３０分間５０〜６０℃でインキ
ュベートすると、第二の要素に色の変化がおき、ＢＡＮ
Ａ加水分解がおきたことを示す。

本発明は、歯周疾患をおこす微生物の存在を見つけるＢ
ＡＮＡ加水分解を発見する固相アッセイを用いる。

ａ）患者から歯肉下歯垢のサンプル（一つ又は複数）を
集め； ｂ）上記サンプルをＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン
−２−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）のｐＨ８〜９−緩衝
溶液を浸み込ませたこのアッセイの第一要素に塗布し； Ｃ）吸着ファスト−ブラックに塩を含むナイロン−又は
ニトロセルロース膜から成るアッセイの第二要素を濡ら
し； ｄ）上記第一要素を上記第二要素と密に接触させ； ｅ）一緒にした第−及び第二の要素をインキュベーショ
ン時間５〜３０分間５０〜６０℃でインキュベートシ； ｆ）第二要素を観察して、ＢＡＮＡ加水分解がおきたこ
とを示す色の変化を見出す 諸段階から成る方法をも含む。

よって、本発明の主な目的は、ＢＡＮＡ加水分解を発見
する固相アッセイを提供することである。

発明のもう一つの目的は、固相アッセイを用いて歯周疾
患の原因となる微生物の存在を見つけ、モニターする方
法を提供することである。

発明のもう一つの目的は、−数的歯科診療所訪間のよう
な比較的短時間に実施し得る、歯周疾患発見並びにモニ
ターのための固相アッセイを提供することである。

発明のまた別の目的は、目で容易に読める歯周疾患の発
見及びモニターのための固相アッセイを提供することで
ある。

発明のまた別の目的は、日常的歯科医訪問中に歯科職員
によって容易に且つ速かに行われ得る、歯周疾患の発見
及びモニターのための固相アッセイを提供することであ
る。

発明のもう一つの目的は、患者のファイルに保存しやす
い永久的安定的記録をつくる、歯周疾患の発見及びモニ
ターのための固相アッセイを提供することである。

本発明のまた別の目的は、日常的歯科診療時間中に歯科
職員が容易かつ速かに行うことのできる、歯周疾患発見
およびモニターのための固相アッセイを提供することで
ある。

本発明のこれらの及びその他の目的及び利点は次の発明
の詳細な説明からより明らかになる。

広義では、本発明はＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン
−２−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）加水分解を発見する
ための固相アッセイ、その製法及びその使用法に向けら
れている。

固相アッセイは、患者の歯肉下歯垢サンプルを受けとっ
た、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチル
アミド（ＢＡＮＡ）　ｐＨ８〜９−緩衝溶液を吸着した
第一要素と、吸着ファスト・ブラックに塩を含むナイロ
ン−又はニトロセルロース膜である第二要素とを含んで
成る。ＢＡＮＡを加水分解する微生物を含む歯肉下歯垢
サンプルを第一要素上に置くと加水分解がおきる。水で
活性化した第二要素が第一要素と接触すると、加水分解
反応生成物、β−ナフチラミンが第二要素であるナイロ
ン−又はニトロセルロース膜に移動し、ファスト・ブラ
ックに塩を変色させる。これは容易に認められる。

発明は固相アッセイの製法にも関係している。

これを達成するにはＢＡＮＡのｐＨ８〜９−緩衝溶液を
第一要素に吸着させ、ファスト・ブラックに塩溶液をナ
イロン−又はニトロセルロース第二要素に吸着させる。

両要素共乾燥している。概してそれらは、本発明の方法
により使用するまで、光、空気、水、その他の汚染物が
それらの表面に達しないような方法で包装される。

その上本発明はＢＡＮＡ−加水分解を発見する固相アッ
セイを用いて歯周疾患の原因となる微生物の存在を発見
する方法に関係している。

この方法は、患者から歯肉下歯垢サンプル（１又は複数
）を集め、上記サンプルをＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アル
ギニン−２−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）のｐＨ８〜９
−緩衝溶液を浸み込ませたアッセイの第一要素に塗布す
ることを含む。その後、吸着ファスト・ブラックに塩を
含むナイロン−又はニトロセルロース膜であるアッセイ
の第二要素を濡らし、第一要素と密に接触させる。一緒
にした要素を、約５〜３０分間のインキュベーション時
間、５０〜６０℃でインキュベートする。インキュベー
ション時間の終了後、一緒になっている第−及び第二要
素を分離し、第二要素を観察して色の変化を見つける。

第二要素の色の変化はＢＡＮＡの加水分解がおきたこと
を示す。これは、ＢＡＮＡを加水分解できる歯周疾患を
おこす微生物の存在を示す。

本発明の固相アッセイは、治療前、治療中及び治療後の
歯周組織の健康を確かめることができる。

こうして歯科医と患者は歯周組織の状態を速かに客観的
に評価することができる。治療期間後、試験結果が陽性
のままである場合、その後治療計画を改良してその後の
組織破壊を最小にすることができる。

その上、本発明の固相アッセイは、実際に疾患関連性微
生物に感染しているがまだその疾患の臨床的微症をあら
れしていない部位を見出す能力をもっている。この方法
で、アッセイは、歯科医、衛生士及び患者に、おこり得
る臨床的歯周疾患の発現を阻止又は最小にするためには
口腔衛生及び／又は予防の強化が必要であることを早期
に警告することができる。

このアッセイの潜在的用途は、患者の教育に関して歯科
医及び衛生士を助けることである。患者は歯周疾患の原
因及びその治療を理解することがむづかしいことが多い
。

彼等が不快又は病気を示唆するその他の症状を感じてい
ない場合は特にそうである。彼等の疾患の存在及び程度
を部位特異的に可視化する手段があれば、それは口腔衛
生及び専門的歯の手入れに向けて彼等の行動を改善する
のに役立つ。

本発明の固相アッセイの第一要素は、水吸着性基質材料
から成る。このような材料は典型的にはセルロース−又
はポリエステル紙材料から成る。

紙及び、特に、紙パッドは、種々の適した重さ及び吸収
性のものが市販されているという点で便利である；これ
らの多くはＦＤＡが診断的使用を承認している。それら
は比較的安い材料であり、本発明の固相アッセイに用い
られる水溶性、酵素感受性試薬を吸収し、乾燥後安定化
させるという機能をもっている。適した紙材料は、ワッ
トマン社（Ｗｈｓｊａｕ　Ｃｏ、）及びシュライへル・
ジュール社（Ｓｃｈｌｃｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈａ
ｅｌｌ　Ｃｏｒｐ、）から入手できるセルロース紙、及
びＥ＆Ｄ、コーポレーションから販売されているような
ポリエステル紙である。

特に好ましいセルロース紙はＳ＆Ｓ＃９０３及びワット
マン３ＭＭと呼ばれるものである。もちろんこれらの代
りに他の同様の商標の紙材料を、固相アッセイの実地可
能性に影響を与えることなく本発明の実施に用いること
ができる。

本発明に用いられるＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン
−２−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）は、ジグ７−ケミカ
ル社（ＳｉｇＩｌｓ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、）（
ＳｔＬｏａｉｓ、　ＭＯ）のような会社から供給される
市販の基質である。この基質はそれに対応する酵素によ
って加水分解され、β−ナフチラミンを生成する。

この加水分解はこのアッセイの振舞にとって重要である
。それはｐＨ約８〜９で最適におこる。この理由で、本
発明の実施において、発明の同相アッセイはｐＨ８〜９
のトリス緩衝液を用いる。この緩衝液は、生物学的反応
に対する適性及び−数的入手し易さのために、非常に好
ましい緩衝材料である。必要な８〜９のｐＨを提供する
その他の同様な緩衝性材料又は−作用物質、たとえば燐
酸ナトリウム及び−カリウム、硼酸塩及びカルボン酸塩
を使用できるのはもちろんである。ｐＨが８．５ないし
８．８の範囲に保たれるのが好ましい。

ＢＡＮＡの第一要素に、約Ｉｎ〜２（ｔｏ■／１１２（
０，１ｔ−０，２２ｍｇ／ａｌ）又は約３０〜６０　ｍ
ｇ　／アッセイの濃度を与えるように塗布するのが好ま
しい。

本発明の第二要素はナイロン−又はニトロセルロース膜
から成る。このナイロン−又はニトロセルロース膜は、
本発明の固相アッセイの発色剤であるファスト・ブラッ
クに塩を担持する。適したニトロセルロース膜は、シュ
ライヘル＆ジュール社から供給される。ＢＡ９５．０．
４５μ臘と呼ばれるものである。適したナイロン膜は、
シュライヘル＆ジュール社から“ナイロン６６”又はボ
ールナイロン６６　（Ｂｉｏｄ７ｏ　Ａ？Ｍ）として販
売されテイルモのである。ナイロン−又はニトロセルロ
ース膜は負に帯電している。したがってこれらの材料は
著しく酸性で、ファスト・ブラックに＃１発色剤をＢＡ
ＮＡの加水分解産物であるβ−ナフチラミンに結合させ
るには好都合である。その上これらのナイロン及びニト
ロセルロース膜は多量のファスト・ブラックに塩発色剤
を吸着することができる。

これは固相アッセイの感度にとって重要である。

ナイロン−又はニトロセルロース膜は、ファスト・ブラ
ックに塩を市販製品に含まれるその安定剤と共に吸着す
ることもできる。フシスト・ブラックに塩発色剤の安定
剤、たとえば塩化亜鉛（ＺｎＣ１２）と、ファスト・ブ
ラックに塩とを共に吸着する能力があれば、最初の試薬
の安定性をもった最終第二要素が生成する。これは明ら
かに最終（完成）固相アッセイの保存寿命に貢献する。

本発明において第二要素の一成分として用いられるファ
スト藝ブラックに塩は、シグマケミカル１社（Ｓｔ、　
Ｌｏｎｉｔ、　ＭＯ）のような化学品会社から供給され
る市販品である。それは、アゾ−ジアゾ色素発色剤のカ
テゴリーに入る。ジアゾニウム塩とアリルアミンとのカ
ップリング反応の至適ｐＨは約６である。この至適ｐＨ
は、本発明の固相アッセイの実施可能性及び安定性に大
きく貢献する。本発明の加水分解は約８〜９という至適
ｐＨでおこるから、使用する発色剤の至適ｐＨと加水分
解反応との間にはあまり差がないということが重要であ
る。これより低い至適ｐＨをもった発色剤を用いたなら
ば、加水分解がおきるｐＨでは発色剤の物理的劣化がお
こるであろう。これは明らかに、結果的に、固相アッセ
イの正しくない読みに通ずる。ファスト−ダーク・ブル
ーＲのような他の等価の発色剤をファスト・ブラックに
塩発色剤の代りに本発明の実施に用いることができるが
、それらは至適ｐＨの要求を満していなければならない
。

すなわちそれらは、約６〜９の間の至適ｐＨをもってい
なければならない。ファスト・ブラックに塩は、一般的
には約２０〜３０■／Ｈ’　　（０，Ｈ〜０．０３■／
ｃｆ）又は６〜９■／アツセイの濃度で本発明の固相ア
ッセイに使用される。

本発明の固相アッセイの製造の実施に任意に加えられる
ものは、ファスト・ブラックに塩溶液に加えられる、ニ
イロンー又はニトロセルロース膜によって吸着される安
定剤である。一般的には、ポリマー安定剤が用いられる
。これらは分子量６０００〜８０００をもつ市販のポリ
エチレングリコールで、ガントレツ’　（Ｇｘｎｔｔｅ
ｓ’　）の商標で売られているようなポリエチレン酸、
たとえばガントレ’／”　Ｓ　−９５（ＧＡＦ　Ｃｏｔ
ｐ、　から供給される）である。

これらのポリマー安定剤を、約０．０５〜１．０重量％
ファスト・ブラックに塩溶液に加える。ポリマー安定剤
は、分解により生じた水を全部吸着し、使用するまでの
貯蔵期間中第二要素（ナイロン−又はニトロセルロース
膜）を安定化する。ポリマー安定剤はその他に、ナイロ
ン−又はニトロセルロース膜−ファスト・ブラックに塩
発色剤要素を、本発明のアッセイの実地に使用する直前
に円滑に活性化する湿潤剤としてもはたらく。

その他に、本発明のアッセイの第二要素への任意の添加
物はジアゾ染料安定剤である。このようなジアゾ染料安
定剤は、普通、ジアゾ型の色素発色剤の市販溶液に加え
られている。ファスト・ブラックに塩はジアゾ型染料で
ある。典型的なジアゾ染料安定剤は、１．５−ナフチレ
ンジズルフォン酸及びその塩、並びに塩化亜鉛及びその
他の遷移金属塩化物のようなのものである。これらの染
料安定剤はメーカーから購入したファスト−ブラックに
塩中に存在しているかも知れないし、ファスト・ブラッ
クに塩−ナイロン−又はニトロセルロース第二要素の製
造中に加えてもよい。このような染料安定剤は約０．１
−１．０重量％加えられるのが普通である。

本発明のその他の任意の実施態様は、第−要素上のサン
プル保持手段の使用である。このようなサンプル保持手
段にはいろいろの種類がある。特に適したサンプル保持
手段の種類は特に、第一要素が紙パッドから成る場合に
は型押えくぼ（ｃｍｂｏｓｓａｄ　ｄｉａ＋ｐｌｅ）の
型のサンプル保持手段である。典型的には、このような
えくぼは、トリス・緩衝ＢＡＮＡを吸着する前の紙パッ
ドに、えくぼを型押する装置を製造することによって型
押される。紙パッドに型押されたごのようなえくぼは反
応容量を減らして最小にし、歯肉下歯垢サンプルを歯科
器具から固相アッセイに塗布するのを容易にする。

ファスト−ブラックに塩とβ−ナフチラミンとのカップ
リングによって生成する色は、サーモン色を背景にした
暗藍色である。この組み合わせは、サンプルサイズが小
さいときは特に、識別しやすく、刺し跡のような色を生
成する。

概して、本発明の固相アッセイの準備をする場合、個々
の要素をつくり、それからプラスチック−又はその他の
しっかりした裏張りに接着剤でくっつける。概してこの
裏張りはポリスチレン−カードであり、要素を両面接着
テープを用いて付着する。要素はそれぞれ裏張りのミシ
ン目（ｐｅ＋ｆｏｒ−１目ｏｍ）の各側に付着し、裏張
りがミシン目に沿って折りたたまれたときＢＡＮＡ第一
要素がファスト・ブラックに塩第二要素上に直接型なる
ようにする。これにより二つのことが達成される：各包
装に、アッセイの二要素が両方共金まれるから、歯科開
業医が同じ型の二つの要素を使用する機会はない；そし
て概してプラスチック裏張りがミシン目を含み、第二要
素がこのヒンジ点で正確に“折りたたまれ”、このアッ
セイの実施に必要な二要素を密に接触させる段階を行う
ことができる。

このようなプラスチック−又はその他のしっかりした裏
張りのおかげで完成アッセイを患者の歯科的記録へ挿入
することもできる。要素は、“サンプリングカード（約
３〜５サンプルを保管する）又は“全口腔−ｙ−ｘト（
ｗｈｏｌｅ−ｍｏｎｔｈ　ｊｅｓｔ）″カード（約３０
〜３２サンプルを保管）をつくるのに都合のよい大きさ
である。

本発明の固相アッセイの加水分解は約５０〜６０℃の温
度で最も容易におこる。したがって、この温度範囲の熱
源がアッセイの実施のために必要である。−数的にはこ
れはドライヒート−インキュベーターによって提供され
る。この代りに、熱い水道水浴（約５０〜６０℃の温度
）をアッセイの実施のために用いることができる。この
温度の使用は完了までの時間を短縮し、試験の感度を改
善する。

なぜならばこの温度で加水分解が最も速くおこり、その
他の副産物が減少するからである。

４、好ましい実施例 以下の実施例は、本発明の固相アッセイの製法及びその
使用法を詳細に説明する。本開示の目的及び意図から逸
脱することなく材料並びに方法に多くの変更が加えられ
得ることは熟練せる当業者には当然理解できる。

実施例１ 固相アッセイの製法 材料： シュライヘル・ジュール紙＃９０３ シュライヘル・ジュール純ニトロセルロースＢＡ９５．
０．４５μ国 ファスト・ブラックに塩（シグマ） ＢＡＮＡ基質（シグマ） トリス塩基 １．０Ｍ塩°酸 ポリエチレングリコール（６−８００ｈｖ）　　Ｃシグ
マ］中−秤量皿（ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｌＨｂ　ｐｕｔ）
両面接着テープ（３Ｍ） 熱水浴 方法： 紙及びニトロセルロース膜を５Ｘ５ａ１１平方に切る。

ＢＡＮＡ紙の製造 ４４■ＢＡＮＡを１　ｔｓｌジメチルズルフオキシドに
溶かすことによってＢＡＮＡ溶液をつくる。その後この
溶液を１５ａ＋Ｍ）リス−ＨＣ１，，ｐＨ８，５゜で１
：５０に希釈する。生成溶液ｌｌ１ｌ！を中−秤量皿の
底に入れ、この上に正方形の紙＃９０３を置く。

約２分間で吸収がおきる。液体を含んだこの紙をそれか
らガラス面上に置き、室温で脱水機を用いて脱水するこ
とによって水分を除去する。

注意：紙は平らで用いてもよいし、グロメットプライヤ
ー又はその他の適当な成形器具を用いて一連のえくぼを
その上に成形してもよい。これを行うには、ＢＡＮＡ含
浸前に、グロメットプライヤーを部分的に二層の紙に押
し込み貫通を避ける。

ファスト−ブラック−ニトロセルロース膜の製法 ファスト・ブラックをナイロン−又はニトロセルロース
正方形膜に吸着させる。そのためには正方形の膜９枚を
、０．２％ファスト・ブラックに塩を含む１０％ポリエ
チレングリコール水溶液（６０００〜８０００分子量）
　２０　ｍｌ中に入れる。この溶液を、使用前に、綿栓
をしたカラムを通過させて不溶性物質を除去することに
よって澄明にする。

膜を蒸溜水中で１時間濡らすことによって吸着の準備を
する。それから濡れた膜とファスト・ブラック溶液とを
中−秤量皿中で一緒にし、アルミホイールでおおい、３
７℃水浴中に２〜６時間置装。

この後、ピンセットを用いて膜を一枚の濾紙上に置き、
−晩、周囲室温で乾かす。

この時点で、ＢＡＮＡ紙及びファスト・ブラック−ニト
ロセルロース膜をそれぞれ１枚づつ用いる試験の用意が
できたことになる。

感度 この３０分試験法を用いて、濃度既知のウシ膵トリプシ
ン（■型シグマケミカル、約１１．６１１０ＢＡＥＥ単
位／■蛋白質）のトリプシン様活性を評価した場合、検
出限界は５μ！スポツトあたりｌＯ〜５０ナノグラムで
ある。これは、３７℃で１８〜２２時間行われる液体ベ
ース試験の感度の約１００倍の改善を示す。

ＢＡＮＡ基質のトリプシン加水分解速度を、精製Ｔ＋ｅ
ｐｏｎｅｍｔ　ｄｅｎｔｉｃｏｌｔ酵素のそれと比較し
て測定した；参照、オーク（ｏｈ目、ｋ）、マキネン（
Ｍ！−ｋｉｎｅｎ、　Ｋ、に、　）及びロッシュ（Ｌｏ
ｅｓｃｈｅ、　Ｗ、Ｊ、）の“合成トリプシン基質を加
水分解できるＴｒｅｐｏｎｅ−ａ＋ａ　ｄｅｎｔｉｃｏ
ｌｘによって産生される酵素の精製及び特徴づけ（Ｐａ
ｒｉｆｉｃｒｆｉｕ　ｔ＋＋ｄ　Ｃｈｕａｃ＋ｅｒｉｘ
ｊｊｉａｎａｔ　ｇｎ　Ｅｎｘ７ｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｅ
ｄ　ｂ７　Ｔｔｃｐｏｎｅａ＋ｘ　ｄｅａｔｉｃｏｌｘ
Ｃｇｐｉｂｌｅ　ｏｆ　Ｈ７ｄｒｏｌｙｓｉｎｇ　ｓｙ
ｎ＋ｈｅｊｉｃ　ＴＨｐｓｉｎ　Ｓ＋＋−ｂｓｔｒＮｃ
ｓ）　”　、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｕｄ　Ｉｍ＋ａｍ
ｎｉｔｙｓ　５３巻２＋３−２２０ページ、（１９８６
）。この１１．７という比は、試験の感度がこの酵素で
は１１７−５８５ナノグラムであることを意味する。

実施例２ ＢＡＮＡ紙の製法 トリス緩衝液を蒸溜水に加え、溶解するまで混合する。

その溶液に２ＮＨＣ１を滴下して、ｐＨ範囲８．８±０
．２にする。ＢＡＮＡ（５，５ｇ／Ｉ”）をメ９　／　
−）Ｉ、　（９０％Ｗ／Ｖ）　ニ加え、ＢＡＮＡが溶解
するまで混合する。トリス緩衝溶液（０，ＩＬ）をＢＡ
ＮＡメタノール溶液（（１，９Ｌ）にゆっくり加える。

徹底的に混合する。

ワットマン３ＭＭ紙を用い、６インチ（１５，２ｃｍ）
幅の紙９０直線フィート（２７，４ｍ）あたり１リツト
ルの割合で上記溶液を紙にコーティングする。温度１８
０’Ｆ　（８２℃）で乾かす。

ファスト番ブラックに塩−ナイロンの製法ガントレツ’
５−９５をゆっくりと、撹拌しながらメタノールに加え
る。この溶液に１．５−ナフチレンジスルフオン酸ナト
リウムを加える。混合後、ファスト・ブラックに塩を加
え、１５〜２０分間振とうする。生成した溶液をぴった
りおおい、遮光し、できるだけ早くコーディングプロセ
スに用いる。

Ｐ！１１ナイロン膜（Ｂｉｏｄ７ｎｃ　Ａ”）を用い、
上記溶液を先ず４０ミクロンフィルターを通し、それか
らこの膜に、　１１．１〜１フイート（３〜３０ａＩ＋
）７分の速度、１リツトル／１８Ｇ直線フイート（５４
，９ｍ）×６インチ（１５，２ｍ）膜の割合でコーディ
ングし、温度１７０″Ｆ（７７℃）で乾燥する。含浸は
光を減らした条件下で行われる（光度は２フツトカンデ
ラ以下である）。乾燥した含浸ナイロン膜は＜、１３％
の相対温度で保存される。コーテツド紙及び含浸ナイロ
ン膜を幅２インチ（５ａｎ）の片に切り、各１片づつを
、４．５インチ（１１，４ａｎ）　Ｘ５．２５インチ（
１３Ｊａｎ）ポリスチレンカード上で重ねる（Ｉａｍｉ
ｎｘｊｅ）。

実施例３ 試験法： 歯肉上歯垢を除去し、棄てた後、キューレットを用いて
１患者につき３〜４箇所から歯肉下歯垢サンプルを集め
、合一する。歯垢はソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）燐
酸緩衝液中に集める。サンプルをＢＡＮＡ含有−第一要
素の数箇所に塗布する。ファスト・ブラック−ナイロン
−又はニトロセルロース膜第二要素（蒸溜水で濡らすこ
とによって活性化する）を、サンプル含有ＢＡＮＡ第−
要素上に置く。一緒にした要素を５５℃の乾燥熱インキ
ュベーター中に１５分間置く。別法として、一緒にした
要素を熱い水道水浴中に（約５５〜５９℃）約３０分間
室いてもよい。必要な時間経過後、要素をインキュベー
ター又は浴からとり出し、分離し、ファスト・ブラック
−ナイロン−又はニトロセルロース膜第二要素を調べる
。ファスト・ブラック−ナイロン−又はニトロセルロー
ス膜第二要素上に暗青色のスポットが存在すれば、それ
はＢＡＮＡ加水分解を示し、かつ歯周疾患をおこす微生
物の存在を示す。

実施例４ 固相アッセイと、歯周疾患の臨床診断との相関性 １０歯垢サンプルをミシガンの研究所職員から得（＃　
１−ＩＱ）　、！５歯垢サンプルをデトロイトの患者か
ら得た（＃ｌｌ−２５）。測定パラメーターとして、健
康か病気かの臨床医の判断、ポケット深さ、探針時の出
血、張拡大視野（ｈｐｆ）あたりのスピロヘータ数（１
スピロヘータ／ｈｐ＋は約１×１０６微生物である）、
ファスト・ブラック固相アッセイの色の強さ、−晩液相
アッセイによって行われたＢＡＮＡ反応の色の強さが含
まれる。

歯垢を１１０μ！の液体中に集め、渦状に撹拌すること
によって分散させ、ｌＯμｌをとり、スピロヘータのみ
を顕微鏡で数えた。別に５０μｌをとり、液相アッセイ
でＢＡＮＡと共に一晩インキユベートした。残る５０μ
ｌを遠沈し、生成したペレットを固相アッセイにかけ、
水を用いる方法で３０分間発現させる。結果を以下の１
表に示す。

１表 ファスト・ブラック固相アッセイが液相アッセイとは異
なり、ファスト・ブラック固相アッセイが正しくないよ
うにみえる試料（歯垢）が二つある。サンプル４では、
臨床医は歯垢を健康な部位からのものと判断し、スピロ
ヘータは検出されず、液相アッセイは陰性であった。し
かしファスト・ブラック固相アッセイは弱い陽性であっ
た。これは間違った陽性である。サンプル１３では、臨
床医はその部位を疾患と判断し、それは探針で出血し、
高レベルのスピロヘータをもち、液相アッセイで弱い陽
性であった。しかしファスト−ブラック固相アッセイに
よると陰性であった。これは間違った陰性である。

全体として、２５サンプル中２３において、二つの試験
と大部分の臨床パラメーターとは一致した。

一連のχ二乗分析は、これらの試験と種々の臨床的パラ
メーターとの間に高度に有意な関係を示している。ファ
スト・ブラック固相アッセイ及び液相アッセイが陰性で
あるのに、臨床的指標は主として疾患部位のそれである
というサンプルが三つある（＃７．　８．１９）。その
いづれの場合にもスピロヘータ数／ｈｐｊは１以下か又
は１であり、歯垢サンプルが少な過ぎて、用いたインキ
ュベーション時間では、反応を与えることができなかっ
たことを示唆している。これは、マルチ−サンプリング
法によって最小にすることができる非常に少量の歯垢サ
ンプルでは、常に問題となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチル
   アミド（ＢＡＮＡ）の加水分解を見出すための固相アッ
   セイであって、 Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミ
   ド（ＢＡＮＡ）のｐＨ８〜９緩衝溶液を浸み込ませた、
   歯肉下歯垢サンプルを受けとるための第一要素と、 ファスト・ブラックＫ塩を吸着して含むナイロン又はニ
   トロセルロース膜から成る第二要素とから成り、 歯肉下歯垢サンプルを第一要素上に置き、その後濡れた
   第二要素と密に接触させ、合一した要素を５０〜６０℃
   で５〜３０分間インキュベーションすると、第二要素に
   変色がおこり、それによってＢＡＮＡ加水分解がおきた
   ことが示される、固相アッセイ。 ２、第一要素がセルロース紙パッドを含んで成る請求項
   １に記載のアッセイ。 ３、第一要素が、歯肉下歯垢サンプルを受けとるのに適
   したサンプル保持手段を含む請求項２に記載のアッセイ
   。 ４、サンプル保持手段が、第一要素に型押されたえくぼ
   （ｄｉｍｐｌｅ）である請求項３に記載のアッセイ。 ５、緩衝液がトリス緩衝液である請求項１に記載のアッ
   セイ。 ６、ナイロン−又はニトロセルロース膜から成る第二要
   素が付加的にポリマー安定剤を含む請求項１に記載のア
   ッセイ。 ７、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチル
   アミド（ＢＡＮＡ）−ｐＨ８〜９緩衝溶液を浸み込ませ
   た、歯肉下歯垢サンプルを受けとるための第一要素と、 ファスト・ブラックＫ塩を吸着して含むナイロン−又は
   ニトロセルロース膜から成る第二要素とから成り、 その際歯肉下歯垢サンプルを第一要素上に置き、その後
   、濡れた第二要素と密に接触させ、一つにした要素を５
   ０〜６０℃で５〜３０分間インキュベートすると、第二
   要素に色の変化がおこり、それによってＢＡＮＡ加水分
   解がおきたことが示される固相アッセイから成る、Ｎ−
   ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド（
   ＢＡＮＡ）加水分解の発見法。 ８、第一要素がセルロース紙パッドである請求項７に記
   載の方法。 ９、第一要素が歯肉下歯垢サンプルを受けとるのに適し
   たサンプル保持手段を含む請求項８に記載の方法。 １０、サンプル保持手段が第一要素に型押されたえくぼ
   である請求項９に記載の方法。 １１、緩衝液がトリス緩衝液である請求項７に記載の方
   法。 １２、ナイロン−又はニトロセルロース膜から成る第二
   要素がその他にポリマー安定剤も含む請求項７に記載の
   方法。 １３、ＢＡＮＡ加水分解を確認するための固相アッセイ
   を利用して歯周疾患の原因となる微生物の存在を知るた
   めの方法であって、 ａ）患者から歯肉下歯垢サンプル（１又は複数）を集め
   ； ｂ）上記サンプルを、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニ
   ン−２−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）−ｐＨ８〜９、緩
   衝溶液を含浸させた第一要素に塗布し； ｃ）ファスト・ブラックＫ塩を吸着して含むナイロン−
   又はニトロセルロース膜から成るアッセイの第二要素を
   濡らし； ｄ）第一要素を第二要素と密に接触させ； ｅ）一緒にした第一−及び第二要素を５０〜６０℃の水
   浴で、インキュベーション時間５〜３０分間インキュベ
   ートし； ｆ）第二要素を観察して、ＢＡＮＡ加水分解がおきたこ
   とを示す変色を発見する 諸段階から成る方法。 １４、第一要素がセルロース紙パッドを含んで成る請求
   項１３に記載の方法。 １５、第一要素が付加的にサンプル保持手段を含む請求
   項１４に記載の方法。 １６、サンプル保持手段が第一要素に型押されたえくぼ
   である請求項１５に記載の方法。 １７、緩衝液がトリス緩衝液である請求項１１に記載の
   方法。 １８、ナイロン−又はニトロセルロース膜から成る第二
   要素が付加的にポリマー安定剤を含む請求項１１に記載
   の方法。 １９、インキュベーションが乾燥熱インキュベーターで
   行われる請求項１１に記載の方法。 ２０、インキュベーションが熱水道水浴中で行われる請
   求項１１記載の方法。 ２１、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチ
   ルアミド（ＢＡＮＡ）加水分解を利用する歯周疾患発見
   法において、 Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミ
   ド（ＢＡＮＡ）−ｐＨ８〜９緩衝溶液を浸み込ませた、
   歯肉下歯垢サンプルを受けとるための第一要素と； ファスト・ブラックＫ塩を吸着して含むナイロン−又は
   ニトロセルロース膜から成る第二要素とから成り、 歯肉下歯垢サンプルを第一要素上に置き、その後、濡れ
   た第二要素と密に接触させ、一つにした要素を５０〜６
   ０℃でインキュベーション時間５〜３０分間インキュベ
   ートすると第二要素に変色がおこり、それによってＢＡ
   ＮＡ加水分解の発生が示されるという固相アッセイを利
   用することを含んで成る改良。 ２２、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチ
   ルアミド（ＢＡＮＡ）加水分解の発見のための固相アッ
   セイの製法であって、 第一要素にＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナ
   フチルアミド（ＢＡＮＡ）−ｐＨ８〜９緩衝溶液を吸着
   させ、この要素を乾燥し、 ナイロン−又はニトロセルロース膜から成る第二要素に
   ファスト・ブラックＫ塩溶液を吸着させ、この要素を乾
   燥する ことから成る製法。 ２３、第一要素がセルロース紙パッドである請求項２２
   に記載の製法。 ２４、第一要素が付加的にサンプル保持手段を含む請求
   項２３に記載の製法。 ２５、サンプル保持手段が第一要素に型押されたえくぼ
   である請求項２４に記載の製法。 ２６、緩衝液がトリス緩衝液である請求項２２に記載の
   製法。 ２７、ファスト・ブラックＫ塩溶液が付加的にポリマー
   安定剤を含む請求項２２に記載の製法。