JPS6171000A - 歯肉疾患の存在を発見する方法及びそのためのキツト - Google Patents
歯肉疾患の存在を発見する方法及びそのためのキツトInfo
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- JPS6171000A JPS6171000A JP18593785A JP18593785A JPS6171000A JP S6171000 A JPS6171000 A JP S6171000A JP 18593785 A JP18593785 A JP 18593785A JP 18593785 A JP18593785 A JP 18593785A JP S6171000 A JPS6171000 A JP S6171000A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、中性蛋白分解酵素、特にコラゲナーゼの存在
を検出することによって歯肉疾患の存在を発見する方法
及びその次めのキットに関する。
を検出することによって歯肉疾患の存在を発見する方法
及びその次めのキットに関する。
成人人口の大部分（おそら＜７５％）が歯周疾患に冒さ
れている。これが３５才以上の成人が歯をなくす主な原
因である。歯周疾患と戦うために最も効果的な手段は歯
の衛生を良くし、かつ早期に発見することである。歯周
疾患になる前の状態は単純な歯肉の襄症（歯肉炎）であ
る。歯肉炎になると、「歯肉溝液（ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄ ）Ｊ （ｒａｃｐＪ
）として知られる滲出液の流出が増加する。ＧＣＦ中
に見られる成分を分析することが、客観的に識別できる
炎症が起こる前の早期の段階においてさえ、歯肉疾患の
存在を発見するのに非常に有用なものになるということ
が、多くの研究により示され次。例えば、Ｇｏｌｕｂ等
の［歯肉溝液：歯周炎患者を処置するＫあたっての新規
の診断用補助具Ｊ （ＧＩＮＧＩＶＡＬ ＣＲＥＶＩＣ
ＵＬ−ＡＲＦＬＵＩＤ： Ａ ＮＥｗＤＩＡＧＮＯ８
ＴＩＣＡＩＤ ＩＮ ＭＡＮＡＧＩＮＧＴＨＥ ＰＥ
ＲＩＯＤＯＮＴＡＬ ＰＡＴＩＥＮＴ ）、オーラル・
サイエンス・レビ：＝ −（０ｒａｌ ５ｃｉｅｎｃｅ
Ｒｅｖｉｅｗｓ）、８巻、４９〜６）ページ（１９７
６年）参照。ＧＣＦが中性蛋白分解酵素、特にコラゲナ
ーゼを含み、そして歯肉炎がある場合には、ＧＣＦ中の
そのような酵素の濃度が非常に増加するということ−が
わかつ九〇例えば、Ｑｏｌｕｂ等の「人間の歯肉溝液の
コラーゲン分解活性Ｊ （ＣＯＩ、ＬＡＧＫＮＯＬＹＴ
ＩＣＡＣＴＩＶＩＴＹＯＦ ＨＵＭＡＮ ＧＩＮＧＩＶ
ＡＬ ＣＲＥＶＩＣＦ２ ＦＬＵＩＤ ）、ジャーナル
・デンタル・リサーチ（Ｊ、Ｄｅｎｔ、 Ｒｅ５− ）
、５３巻１６号、１５（１１ページ（１９７４年）及
びゴルプ等の「歯肉溝液及び隣接する歯肉組織のコラー
ゲン分解活性Ｊ （Ｃ０ＬＬＡ（ＪＮＯＬＹＴＩＣＡＣ
ＴＩＶＩＴＹＯＦ ＣＲＥＶＩＣＵＬＡＲＦ’ＬＵＩＤ
ＡＮＤ ＯＦ ＡＤＪＡＣＥＮＴ ＧＩＮＧＩＶＡ−
Ｉ、 Ｔｌ５ＳＵＥ） 、ジャーナル・デンタル・リサ
ーチ、５８巻、１１号、２１３２ページ（１９７９年）
参照。
れている。これが３５才以上の成人が歯をなくす主な原
因である。歯周疾患と戦うために最も効果的な手段は歯
の衛生を良くし、かつ早期に発見することである。歯周
疾患になる前の状態は単純な歯肉の襄症（歯肉炎）であ
る。歯肉炎になると、「歯肉溝液（ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄ ）Ｊ （ｒａｃｐＪ
）として知られる滲出液の流出が増加する。ＧＣＦ中
に見られる成分を分析することが、客観的に識別できる
炎症が起こる前の早期の段階においてさえ、歯肉疾患の
存在を発見するのに非常に有用なものになるということ
が、多くの研究により示され次。例えば、Ｇｏｌｕｂ等
の［歯肉溝液：歯周炎患者を処置するＫあたっての新規
の診断用補助具Ｊ （ＧＩＮＧＩＶＡＬ ＣＲＥＶＩＣ
ＵＬ−ＡＲＦＬＵＩＤ： Ａ ＮＥｗＤＩＡＧＮＯ８
ＴＩＣＡＩＤ ＩＮ ＭＡＮＡＧＩＮＧＴＨＥ ＰＥ
ＲＩＯＤＯＮＴＡＬ ＰＡＴＩＥＮＴ ）、オーラル・
サイエンス・レビ：＝ −（０ｒａｌ ５ｃｉｅｎｃｅ
Ｒｅｖｉｅｗｓ）、８巻、４９〜６）ページ（１９７
６年）参照。ＧＣＦが中性蛋白分解酵素、特にコラゲナ
ーゼを含み、そして歯肉炎がある場合には、ＧＣＦ中の
そのような酵素の濃度が非常に増加するということ−が
わかつ九〇例えば、Ｑｏｌｕｂ等の「人間の歯肉溝液の
コラーゲン分解活性Ｊ （ＣＯＩ、ＬＡＧＫＮＯＬＹＴ
ＩＣＡＣＴＩＶＩＴＹＯＦ ＨＵＭＡＮ ＧＩＮＧＩＶ
ＡＬ ＣＲＥＶＩＣＦ２ ＦＬＵＩＤ ）、ジャーナル
・デンタル・リサーチ（Ｊ、Ｄｅｎｔ、 Ｒｅ５− ）
、５３巻１６号、１５（１１ページ（１９７４年）及
びゴルプ等の「歯肉溝液及び隣接する歯肉組織のコラー
ゲン分解活性Ｊ （Ｃ０ＬＬＡ（ＪＮＯＬＹＴＩＣＡＣ
ＴＩＶＩＴＹＯＦ ＣＲＥＶＩＣＵＬＡＲＦ’ＬＵＩＤ
ＡＮＤ ＯＦ ＡＤＪＡＣＥＮＴ ＧＩＮＧＩＶＡ−
Ｉ、 Ｔｌ５ＳＵＥ） 、ジャーナル・デンタル・リサ
ーチ、５８巻、１１号、２１３２ページ（１９７９年）
参照。
ＧＣＦの成分を検出するための実際の試験の進歩を妨げ
る主たるものは、１〜３分という臨床に量が少ないとい
うことであり友。液の量は０．１〜 −０．５マイクロ
リツトルの範囲でしか得ることかで ・また通常の分
析は複雑で、かつ高価な装置の使用、 ；長い試験、
時間、又は特別な取扱いを必要とする試薬（例えば、放
射性同位元素）の使用な必要とする。
る主たるものは、１〜３分という臨床に量が少ないとい
うことであり友。液の量は０．１〜 −０．５マイクロ
リツトルの範囲でしか得ることかで ・また通常の分
析は複雑で、かつ高価な装置の使用、 ；長い試験、
時間、又は特別な取扱いを必要とする試薬（例えば、放
射性同位元素）の使用な必要とする。
本発明は、ＧＣＦ中の中性蛋白分解酵素、特にコラゲナ
ーゼを検出する方法及びそのためのキットを提供するこ
とによって歯肉疾患の早期発見の次めの手段を提供する
。本発明はノ、簡単で、安価な装置が使用され、かつそ
の方法が、混合、秤量、ピペツ）Ｋよる取扱い又は分離
工程を必要としないので簡単であるという点で行いやす
い。この試験は、０．１マイクロリツトルという少ない
ＧＣＦ中の非常に少量の中性蛋白分解酵素の存在を検出
するという点で感度がよく、かつ試験が早いので患者に
直接行うことができ、患者がまだ歯科医院にいる間にそ
の結果が得られる。；ラゲナーゼ活性が正常なポケット
（ｐａｃｋｅｔ）と冒されているポケラトとの間に１０
〜１５倍もの相違を示すので、半定量法ではあるが、こ
の試験は患者の状態の程度を判断するのに非常に優れて
いる。試験が容易に行えるので、歯肉疾患の発見の次め
の他の試験よりも試験者の技量に依存しないですむ。
ーゼを検出する方法及びそのためのキットを提供するこ
とによって歯肉疾患の早期発見の次めの手段を提供する
。本発明はノ、簡単で、安価な装置が使用され、かつそ
の方法が、混合、秤量、ピペツ）Ｋよる取扱い又は分離
工程を必要としないので簡単であるという点で行いやす
い。この試験は、０．１マイクロリツトルという少ない
ＧＣＦ中の非常に少量の中性蛋白分解酵素の存在を検出
するという点で感度がよく、かつ試験が早いので患者に
直接行うことができ、患者がまだ歯科医院にいる間にそ
の結果が得られる。；ラゲナーゼ活性が正常なポケット
（ｐａｃｋｅｔ）と冒されているポケラトとの間に１０
〜１５倍もの相違を示すので、半定量法ではあるが、こ
の試験は患者の状態の程度を判断するのに非常に優れて
いる。試験が容易に行えるので、歯肉疾患の発見の次め
の他の試験よりも試験者の技量に依存しないですむ。
柔らかい歯肉組織で従来の視覚による検査は、歯科助手
ではなくて歯科医によってなされなければならなかった
。臨床医達の間でこれらの歯周炎の指標を基準化するこ
とは困難であるので、これらの観察の主観性がデータの
解釈を困難にし、様々な処理結果を得る結果となる。複
雑な装置がこの疾患を客観的に検出しようとして使用さ
れた・しかし、これらの装置、例えば、Ｋｅｙｅｓ法（
Ｋｅｙｅｓ等の「フレビクル又はジクラー感染の診断：
歯周疾患における宿主寄生体相互作用の疾患に関連する
細菌パターｙ （Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｅｖ
ｉｃｕｌ ｏｒ ａＤｉｃｕｌａｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎｓ： ｏｉｓｅａａｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂａ
ｃｔ−ｅｒｉａｌ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｐｅｒｉ
ｏｄｏｎｔａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ、 １ｎＨｏｓｔ−Ｐ
ａｒａｓｉｔｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐ
ｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＤｉｓｅａｓｅｓ） Ｊ 、編集
者、Ｇｅｎｃｏ及びＭｅｒｇｅｎｈａｇｅｎ 。
ではなくて歯科医によってなされなければならなかった
。臨床医達の間でこれらの歯周炎の指標を基準化するこ
とは困難であるので、これらの観察の主観性がデータの
解釈を困難にし、様々な処理結果を得る結果となる。複
雑な装置がこの疾患を客観的に検出しようとして使用さ
れた・しかし、これらの装置、例えば、Ｋｅｙｅｓ法（
Ｋｅｙｅｓ等の「フレビクル又はジクラー感染の診断：
歯周疾患における宿主寄生体相互作用の疾患に関連する
細菌パターｙ （Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｅｖ
ｉｃｕｌ ｏｒ ａＤｉｃｕｌａｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎｓ： ｏｉｓｅａａｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂａ
ｃｔ−ｅｒｉａｌ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｐｅｒｉ
ｏｄｏｎｔａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ、 １ｎＨｏｓｔ−Ｐ
ａｒａｓｉｔｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐ
ｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＤｉｓｅａｓｅｓ） Ｊ 、編集
者、Ｇｅｎｃｏ及びＭｅｒｇｅｎｈａｇｅｎ 。
１９８２年、アメリカン・ソサイテイ・フォー・ミクロ
バイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒ Ｍｉ−ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシント、Ｄ、
Ｃ，，３９５ページ〕に使用される位相差顕微鏡又はＧ
ＣＦの容量分析に使用する九めのペリオドロン（Ｐｅｒ
ｉｏｔｒｏｎ ）装置（米国特許第３．７５３．０９９
号）は、試験者にある程度の精通さな必要とし、かつし
ばしば装置の較正及び保守を必要とする。
バイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒ Ｍｉ−ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシント、Ｄ、
Ｃ，，３９５ページ〕に使用される位相差顕微鏡又はＧ
ＣＦの容量分析に使用する九めのペリオドロン（Ｐｅｒ
ｉｏｔｒｏｎ ）装置（米国特許第３．７５３．０９９
号）は、試験者にある程度の精通さな必要とし、かつし
ばしば装置の較正及び保守を必要とする。
本発明の方法は、吸収性の抽出具（例えば、細片紙）を
使用することによって患者から歯肉溝液の試料を採集す
る工程、前記試料を含有する吸収性の用具を共有結合さ
れ九染料のような結合標識を含む固定化不溶性コラーゲ
ンと作用を及ぼすように接触させて置く工程、及び前記
用具を所°定の時間、好ましくは体温（約３７℃）のよ
うな適度に加温され九温度で前記固定化不溶性コラーゲ
ンと接触させて保持する工程から成る。試料中にいくら
かのコラゲナーゼ又は他の中性蛋白分解酵素が存在する
場合は、標識を含むコラーゲンの分解物が吸収性の□抽
出具に移動させられて、そこで検出することができる。
使用することによって患者から歯肉溝液の試料を採集す
る工程、前記試料を含有する吸収性の用具を共有結合さ
れ九染料のような結合標識を含む固定化不溶性コラーゲ
ンと作用を及ぼすように接触させて置く工程、及び前記
用具を所°定の時間、好ましくは体温（約３７℃）のよ
うな適度に加温され九温度で前記固定化不溶性コラーゲ
ンと接触させて保持する工程から成る。試料中にいくら
かのコラゲナーゼ又は他の中性蛋白分解酵素が存在する
場合は、標識を含むコラーゲンの分解物が吸収性の□抽
出具に移動させられて、そこで検出することができる。
（中性蛋白分解酵素は生理的ｐＨ！ＩＩち中性のＩ）Ｈ
で最も活性であり、かつコラーゲンを減成することがで
きるような酵素である。）本発明は上記に概説した方法
を実施する几めのキットも提供する。前記キットは、吸
収性のＧＣＦ抽出具（好・ましくは吸収性の細片紙）及
び共有結合された染料のような結合標識を含む固定化不
溶性コラーゲンとから成る。前記キットは、試料と接触
状態に保持されているその期間中、適度に加温され次温
度に前記固定化不溶性コラーゲンを保持するｔめの手段
も含むのが好ましい。
で最も活性であり、かつコラーゲンを減成することがで
きるような酵素である。）本発明は上記に概説した方法
を実施する几めのキットも提供する。前記キットは、吸
収性のＧＣＦ抽出具（好・ましくは吸収性の細片紙）及
び共有結合された染料のような結合標識を含む固定化不
溶性コラーゲンとから成る。前記キットは、試料と接触
状態に保持されているその期間中、適度に加温され次温
度に前記固定化不溶性コラーゲンを保持するｔめの手段
も含むのが好ましい。
Ｋｌａｉｎｂｅｒｇ等の米国特許第３，７５３，０９９
号において、細片紙に吸収された液体の定量測定の友め
の装置及び方法が開示されている。この発明は炎症性の
歯肉疾患の診断における手助けとして吸収されたＧＣＦ
の量を測定する九めに使用される。
号において、細片紙に吸収された液体の定量測定の友め
の装置及び方法が開示されている。この発明は炎症性の
歯肉疾患の診断における手助けとして吸収されたＧＣＦ
の量を測定する九めに使用される。
カナダ、ウイニイペグのハルフ・エレクトロニクス社（
Ｈａｒｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｉｍ１ｔｅｄ
）から売に出されている市販の装置「ペリオドロン」
はこの特許に記載されている一般的な原理を明らかに利
用している。
Ｈａｒｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｉｍ１ｔｅｄ
）から売に出されている市販の装置「ペリオドロン」
はこの特許に記載されている一般的な原理を明らかに利
用している。
Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ等は、「蛋白分解活性を調ヘ
ルｆｒ−めの新規超感度法（、Ａ Ｎｆｆ ＵＬＴＲＡ
５ＥＮＳＩＴＩＶＥ ＭＥＴ−ＨＯＤ ＦＯＲＴ皿Ｄ
ＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＬＹＴ
ＩＣＡＣＴＩＶＩＴＹ ）Ｊ 、クリニカ・ヒミ：）’
Ｆ 畳７／ ｌ （ｃｔｉ−ｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ ）、２１巻、１９７〜２０３ページ（１９
６８）において、コラゲナーゼのような蛋白分解酵素の
存在を検出する几めの試験法ｌ記載している。この試験
はレマゾールブリリアントブルーで共有結合的に標識さ
れた外皮粉から得られた不溶性基質を利用している。基
質、酵素試料及び緩衝液が３７℃で３０分間培讐され、
その後、混合物はろ過され次。ろ液が、可溶化された不
溶性外皮基質の量の指標であるろ液に与えられ次色の量
について分光測光的に分析された。
ルｆｒ−めの新規超感度法（、Ａ Ｎｆｆ ＵＬＴＲＡ
５ＥＮＳＩＴＩＶＥ ＭＥＴ−ＨＯＤ ＦＯＲＴ皿Ｄ
ＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＬＹＴ
ＩＣＡＣＴＩＶＩＴＹ ）Ｊ 、クリニカ・ヒミ：）’
Ｆ 畳７／ ｌ （ｃｔｉ−ｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ ）、２１巻、１９７〜２０３ページ（１９
６８）において、コラゲナーゼのような蛋白分解酵素の
存在を検出する几めの試験法ｌ記載している。この試験
はレマゾールブリリアントブルーで共有結合的に標識さ
れた外皮粉から得られた不溶性基質を利用している。基
質、酵素試料及び緩衝液が３７℃で３０分間培讐され、
その後、混合物はろ過され次。ろ液が、可溶化された不
溶性外皮基質の量の指標であるろ液に与えられ次色の量
について分光測光的に分析された。
ｐｒｅｔｔ等の米国特許第４．３３４．５４０号におい
て、ピリジン化合物を検出することによる歯周疾患を診
断する方法が開示されている。
て、ピリジン化合物を検出することによる歯周疾患を診
断する方法が開示されている。
多くの米国特許が蛋白分解酵素を測定又は検出するため
の方法又は試験を開示している。それらの例トシては５
ａｋａｋｉｂａｒａ 等の第４．１７６．００９号、
１ｌＬｉｃｈａｒｄｓｏｎ 等の第４．３１８．９８６
°号、Ｍａｒｏｎ等の第４．３１４．９３６号、Ｓｍ１
ｔｈ等の第４゜２９４．９２３号、Ｂｅｒｇｅｒ 等の
第４．２７８．７６３号、Ｍｏｎｇｅｔ 等の第４．２
７７．５６）号及びＰｏ１ｌａｒｄ等の第４．２６０，
６８１号がある。
の方法又は試験を開示している。それらの例トシては５
ａｋａｋｉｂａｒａ 等の第４．１７６．００９号、
１ｌＬｉｃｈａｒｄｓｏｎ 等の第４．３１８．９８６
°号、Ｍａｒｏｎ等の第４．３１４．９３６号、Ｓｍ１
ｔｈ等の第４゜２９４．９２３号、Ｂｅｒｇｅｒ 等の
第４．２７８．７６３号、Ｍｏｎｇｅｔ 等の第４．２
７７．５６）号及びＰｏ１ｌａｒｄ等の第４．２６０，
６８１号がある。
上記に引用し７ＨＧｏｌｕｂ等のジャーナル・デンタル
・リサーチの二つの論文において、ＧＣＦ中のコラゲナ
ーゼの存在を検出するために不溶性コラーゲン繊維を利
用する方法が記載されている。１９７９年の論文におい
ては、放射性Ｃで標識され九コラーゲン繊維が使用され
ている。歯肉液試料で３日間培養し、引き続き基質が遠
心分離され、それから、可溶化されたコラーゲンの分解
物を含む上澄み液が集められて、ガンマ−線計数器又は
放射性同位元素検出器を使用して分析される。１９７４
年の論文くおいては、不溶性のコラーゲン繊維がゲルマ
トリックスに懸濁され、ＧＣＦ試料を含むろ紙がゲル上
に直接置かれ、それから３７℃で５日間培養される。次
いで、ゲルが遠心分離され、上澄み液と残留物が６Ｎの
ＨＣＩで加水分解され、それから加水分解物が、コラー
ゲンの減成物であるヒドロキシプロリフについて分析さ
れる。
・リサーチの二つの論文において、ＧＣＦ中のコラゲナ
ーゼの存在を検出するために不溶性コラーゲン繊維を利
用する方法が記載されている。１９７９年の論文におい
ては、放射性Ｃで標識され九コラーゲン繊維が使用され
ている。歯肉液試料で３日間培養し、引き続き基質が遠
心分離され、それから、可溶化されたコラーゲンの分解
物を含む上澄み液が集められて、ガンマ−線計数器又は
放射性同位元素検出器を使用して分析される。１９７４
年の論文くおいては、不溶性のコラーゲン繊維がゲルマ
トリックスに懸濁され、ＧＣＦ試料を含むろ紙がゲル上
に直接置かれ、それから３７℃で５日間培養される。次
いで、ゲルが遠心分離され、上澄み液と残留物が６Ｎの
ＨＣＩで加水分解され、それから加水分解物が、コラー
ゲンの減成物であるヒドロキシプロリフについて分析さ
れる。
ヒドロキシプロリフはコラーゲン及び数種類の植物性蛋
白質中にしか見られないので、減成されたコラーゲンの
良好な標識である。
白質中にしか見られないので、減成されたコラーゲンの
良好な標識である。
本発明の方法は吸収性の試料採集具を使用して患者から
ＧＣＦを採集する０好ましい試料採集具は、吸収性の細
片紙のような吸収性の細片である。
ＧＣＦを採集する０好ましい試料採集具は、吸収性の細
片紙のような吸収性の細片である。
これは、所定の期間、例えば、約３０〜約９０秒間歯肉
溝中に挿入される。ＧＣＦの試料を含有する吸収性の採
集具は歯肉溝から取り出され、それから染料のような結
合標識を含む固定化不溶性コラーゲンと直接接触させて
置かれる。ＧＣＦ試料と接触させｔ：！ラーゲンが適度
に加温され次温度、例えば、３７℃で、短時間、例えば
、１５分間培養され、それからＧＣＦ’試料を含む採集
具が取り出される。ＧＣＦ試料がコラゲナーゼのような
中性蛋白分解酵素を含有している場合は、ＧＣＦ試料と
接触させられた固定化不溶性コラーゲンのあるものが可
溶性にされ、吸収性の採集具中に吸収され、そしてそこ
で染料のような標識が可溶性化されたコラーゲンの検出
を容易にする。
溝中に挿入される。ＧＣＦの試料を含有する吸収性の採
集具は歯肉溝から取り出され、それから染料のような結
合標識を含む固定化不溶性コラーゲンと直接接触させて
置かれる。ＧＣＦ試料と接触させｔ：！ラーゲンが適度
に加温され次温度、例えば、３７℃で、短時間、例えば
、１５分間培養され、それからＧＣＦ’試料を含む採集
具が取り出される。ＧＣＦ試料がコラゲナーゼのような
中性蛋白分解酵素を含有している場合は、ＧＣＦ試料と
接触させられた固定化不溶性コラーゲンのあるものが可
溶性にされ、吸収性の採集具中に吸収され、そしてそこ
で染料のような標識が可溶性化されたコラーゲンの検出
を容易にする。
好ましい吸収性のＧＣＦ試料採集具は吸収性の細片紙で
ある。そのような細片を下記に説明する。
ある。そのような細片を下記に説明する。
好ましい細片紙は高純度及び低灰分のセルロース製ろ紙
〔例えば、シュライヒヤー・アンド・シｓ−工ｋ （５
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ３ｃｈｕｅｌｌ） Ｎ１４９
７又はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ ） ｆ’ｈ ５２
）から成る。両紙とも非常に優れた湿潤強度をもつ【
硬化されており、約０・１８ ｍｍの厚さである。この
細片の寸法及び形状は、歯の前及び裏の両方の溝の中に
容易に入れることができるようなものである。好ましい
細片は、取扱いを容易にし、かつ挿入中にまがるのを防
止するために紙の半分にビニル系の支持層を有する幅２
ｍｍ 、長さ１４ ｍｍの長方形の形状である。
〔例えば、シュライヒヤー・アンド・シｓ−工ｋ （５
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ３ｃｈｕｅｌｌ） Ｎ１４９
７又はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ ） ｆ’ｈ ５２
）から成る。両紙とも非常に優れた湿潤強度をもつ【
硬化されており、約０・１８ ｍｍの厚さである。この
細片の寸法及び形状は、歯の前及び裏の両方の溝の中に
容易に入れることができるようなものである。好ましい
細片は、取扱いを容易にし、かつ挿入中にまがるのを防
止するために紙の半分にビニル系の支持層を有する幅２
ｍｍ 、長さ１４ ｍｍの長方形の形状である。
本発明に使用されるコラーゲンは不溶性、即ち中性（例
えば、ｐＨ＝６〜８）の水性培地に実質的に溶解しない
ものである。このコラーゲンは固定化もされている。例
えば、寒天培地等の水性ゲル中に懸濁することによって
固定化される力が好ましい。コラーゲンとともに使用す
る好ましい標識は、共有結合された染料、即ち中性の水
性培地によって抽出されない染料である。レマゾールブ
リリアントブルーが、中性の水性培地中で切断しないエ
ーテル結合な形成することＫよってコラーゲンと結合す
るので好ましい染料である。オルセイン又はアゾ染料も
使用することができる。好ま ：しい標識された固定
化不溶性コラーゲンの製造法は次ぎの通りである。
えば、ｐＨ＝６〜８）の水性培地に実質的に溶解しない
ものである。このコラーゲンは固定化もされている。例
えば、寒天培地等の水性ゲル中に懸濁することによって
固定化される力が好ましい。コラーゲンとともに使用す
る好ましい標識は、共有結合された染料、即ち中性の水
性培地によって抽出されない染料である。レマゾールブ
リリアントブルーが、中性の水性培地中で切断しないエ
ーテル結合な形成することＫよってコラーゲンと結合す
るので好ましい染料である。オルセイン又はアゾ染料も
使用することができる。好ま ：しい標識された固定
化不溶性コラーゲンの製造法は次ぎの通りである。
好ましい組成 チ（Ｗ／Ｗ）アガ
ロース １．００カルボキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ） ０．８０染色され
九コラーゲン粉末 ４．００保存剤（例えば
、アジ化ナトリウム’） ０．（１４９ ４．１
６ トリス緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミツメク
ンの０．６）重量％水溶液である。アガロースは寒天か
ら単離された純粋な直鎖のガラクタンのヒドロコロイド
である。これは寒天より純粋であり、かつより限定され
たゲル特性（′例えば、ゲル強度、透明度並びにゲル化
及び溶融温度）を有する。
ロース １．００カルボキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ） ０．８０染色され
九コラーゲン粉末 ４．００保存剤（例えば
、アジ化ナトリウム’） ０．（１４９ ４．１
６ トリス緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミツメク
ンの０．６）重量％水溶液である。アガロースは寒天か
ら単離された純粋な直鎖のガラクタンのヒドロコロイド
である。これは寒天より純粋であり、かつより限定され
たゲル特性（′例えば、ゲル強度、透明度並びにゲル化
及び溶融温度）を有する。
染色され九コラーゲン粉末は、コラーゲンの主鎖にさら
に余分に染料分子を結合する次めに染料対コラーゲン比
及び反応時間が増加され几ことを除いて、上記に引用し
た１９６８年の論文中ＫＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ
Ｋよって示された方法に本質的に従って製造される。染
色された約９０〜１２５マイクロメートルの均一な粒径
にふるい分けされたコラーゲン粉末の上記組成全量を上
記組成の２／３の量の緩衝液中のＣＭＣと保存剤との混
合物に加える。次いで、その溶液を４０〜５０℃に加温
し、そこに上記組成の７３の量の緩衝液中でプレミック
スし九アガロースを加える。このコラーゲンゲルは便安
い単位用量容器中に分配することができ、かつ使用前に
一晩冷却する。最大のゲル強度は、三次元のゲル網目構
造が固く締るに十分長い時間ゲル化温度以下に冷却する
ことによって確実に得られる。ゲルが１日、例えば、４
℃で冷却される場合に１最大のゲル強度が生じる。吸収
性の試料採集細片下部の反応領域が２〜８ ｍｍ Ｋは
ば限定されているので、試料採集具中で均一な色の発現
を成す九めには、染色され九コラーゲン粉末が適切に粒
径な決められ、かつダルマ） ＩＪラックス面に均一に
分散されるということが重要である。
に余分に染料分子を結合する次めに染料対コラーゲン比
及び反応時間が増加され几ことを除いて、上記に引用し
た１９６８年の論文中ＫＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ
Ｋよって示された方法に本質的に従って製造される。染
色された約９０〜１２５マイクロメートルの均一な粒径
にふるい分けされたコラーゲン粉末の上記組成全量を上
記組成の２／３の量の緩衝液中のＣＭＣと保存剤との混
合物に加える。次いで、その溶液を４０〜５０℃に加温
し、そこに上記組成の７３の量の緩衝液中でプレミック
スし九アガロースを加える。このコラーゲンゲルは便安
い単位用量容器中に分配することができ、かつ使用前に
一晩冷却する。最大のゲル強度は、三次元のゲル網目構
造が固く締るに十分長い時間ゲル化温度以下に冷却する
ことによって確実に得られる。ゲルが１日、例えば、４
℃で冷却される場合に１最大のゲル強度が生じる。吸収
性の試料採集細片下部の反応領域が２〜８ ｍｍ Ｋは
ば限定されているので、試料採集具中で均一な色の発現
を成す九めには、染色され九コラーゲン粉末が適切に粒
径な決められ、かつダルマ） ＩＪラックス面に均一に
分散されるということが重要である。
ＧＣＦの試料を含有する吸収性細片を固定化不溶性コラ
ーゲンと接触して置き、次いで適度に加温され几温度に
約３０分間保持する。３７℃の温度が満足のいくもので
ある。通常のデザインの定温用オープンが培養の友めに
使用される。培養中に、ＧＣＦ中に存在するコラーゲン
分解酵素がゲル中に拡散して、染色されたコラーゲン繊
維を小さな可溶性分解物に分解し始める。ゲルはＧＣＦ
を含む吸収性採集具のちょうど下側の狭い領域に反応区
域を限定しがちである。コラゲナーゼ又は他の蛋白分解
酵素の酵素触媒作用によって生成した染色された可溶性
のコラーゲン分解物の画分は試料を含有する吸収性採集
具中に拡散する。試験の終了に際し採集具申の染料の色
の強度はＧＣＦ試料中に存在する初めの酵素の濃度に関
連し、染色される採集具の領域はＧＣＦ試料の量の半定
量的な目安となる。ＧＣＦ中のコラーゲン分解酵素の濃
度及びＧＣＦの量が炎症性の歯肉疾患の程度の指標とな
ると考えられるので、これは有用な情報である。
ーゲンと接触して置き、次いで適度に加温され几温度に
約３０分間保持する。３７℃の温度が満足のいくもので
ある。通常のデザインの定温用オープンが培養の友めに
使用される。培養中に、ＧＣＦ中に存在するコラーゲン
分解酵素がゲル中に拡散して、染色されたコラーゲン繊
維を小さな可溶性分解物に分解し始める。ゲルはＧＣＦ
を含む吸収性採集具のちょうど下側の狭い領域に反応区
域を限定しがちである。コラゲナーゼ又は他の蛋白分解
酵素の酵素触媒作用によって生成した染色された可溶性
のコラーゲン分解物の画分は試料を含有する吸収性採集
具中に拡散する。試験の終了に際し採集具申の染料の色
の強度はＧＣＦ試料中に存在する初めの酵素の濃度に関
連し、染色される採集具の領域はＧＣＦ試料の量の半定
量的な目安となる。ＧＣＦ中のコラーゲン分解酵素の濃
度及びＧＣＦの量が炎症性の歯肉疾患の程度の指標とな
ると考えられるので、これは有用な情報である。
Claims (20)
- （１）（ａ）吸収性の採集具中に歯肉溝液の試料を採集
し、 （ｂ）前記試料を含有する前記採集具を、結合標識を含
む固定化不溶性コラーゲンと作用を及ぼすように接触さ
せて置き、 （ｃ）前記試料を含有する前記採集具を、前記試料中に
存在する酵素が前記コラーゲンを水溶性の分解物に減成
するに十分な時間及び温度で前記コラーゲンと作用を及
ぼすように接触させて保持し、それによつて前記水溶性
分解物が前記試料採集具中に吸収され、かつそこで検出
される、 各工程から成る歯肉溝液中の蛋白分解酵素の検出方法。 - （２）前記標識が共有結合された染料である特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - （３）前記染料がレマゾールブリリアントブルーである
特許請求の範囲第２項記載の方法。 - （４）前記コラーゲンがゲル中に固定化されている特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - （５）前記コラーゲンがゲル中に固定化されている特許
請求の範囲第２項記載の方法。 - （６）前記コラーゲンがゲル中に固定化されている特許
請求の範囲第３項記載の方法。 - （７）前記吸収性試料採集具が細片紙である特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - （８）前記吸収性試料採集具が細片紙である特許請求の
範囲第２項記載の方法。 - （９）前記吸収性試料採集具が細片紙である特許請求の
範囲第３項記載の方法。 - （１０）前記吸収性試料採集具が細片紙である特許請求
の範囲第４項記載の方法。 - （１１）前記吸収性試料採集具が細片紙である特許請求
の範囲第５項記載の方法。 - （１２）前記吸収性試料採集具が細片紙である特許請求
の範囲第６項記載の方法。 - （１３）（ａ）歯肉溝液を採集するための吸収性の用具
、及び （ｂ）コラーゲンに結合された標識を含む固定化不溶性
コラーゲン から成る歯肉溝液中の蛋白分解酵素を検出するためのキ
ット。 - （１４）前記吸収性の用具が細片紙である特許請求の範
囲第１３項記載のキット。 - （１５）前記コラーゲンがゲル中に固定化されている特
許請求の範囲第１３項記載のキット。 - （１６）前記コラーゲンがゲル中に固定化されている特
許請求の範囲第１４項記載のキット。 - （１７）前記標識が前記コラーゲンに共有結合された染
料である特許請求の範囲第１３項記載のキット。 - （１８）前記標識が前記コラーゲンに共有結合された染
料である特許請求の範囲第１４項記載のキット。 - （１９）前記染料がレマゾールブリリアントブルーであ
る特許請求の範囲第１７項記載のキット。 - （２０）前記染料がレマゾールブリリアントブルーであ
る特許請求の範囲第１８項記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64474684A | 1984-08-27 | 1984-08-27 | |
| US644746 | 1984-08-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6171000A true JPS6171000A (ja) | 1986-04-11 |
Family
ID=24586171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18593785A Pending JPS6171000A (ja) | 1984-08-27 | 1985-08-26 | 歯肉疾患の存在を発見する方法及びそのためのキツト |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0176246A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6171000A (ja) |
| AU (1) | AU4666785A (ja) |
| BR (1) | BR8504077A (ja) |
| DK (1) | DK387485A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63277966A (ja) * | 1987-05-09 | 1988-11-15 | Sunstar Inc | 歯周疾患検査薬 |
| JP2011517488A (ja) * | 2008-03-28 | 2011-06-09 | デントグノステイツクス・ゲー・エム・ベー・ハー | 体液からのタンパク質を吸収するための装置 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5051358A (en) * | 1987-05-07 | 1991-09-24 | The Procter & Gamble Company | Diagnostic methods for detecting periodontal diseases |
| US4931386A (en) * | 1987-12-03 | 1990-06-05 | Frederick H. Silver | Method and collagen coated slide for assaying collagenase |
| GB9519393D0 (en) * | 1995-09-22 | 1995-11-22 | Univ Edinburgh | Novel compounds and assay method |
| WO1997032035A1 (fr) * | 1996-02-29 | 1997-09-04 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Procede d'analyse de proteases et membrane fine utilisee dans ce procede |
| AT403963B (de) * | 1996-12-18 | 1998-07-27 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung und bestimmung der funktionalität von kollagen-bindenden proteinen |
| US20130005048A1 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | Monika Felten | Indicator device |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1320086A (en) * | 1970-09-11 | 1973-06-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Agent and method for the determination of hydrolysing enzymes |
| DE2363854C3 (de) * | 1973-12-21 | 1980-01-03 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung |
-
1985
- 1985-08-23 EP EP85306021A patent/EP0176246A3/en not_active Withdrawn
- 1985-08-26 JP JP18593785A patent/JPS6171000A/ja active Pending
- 1985-08-26 AU AU46667/85A patent/AU4666785A/en not_active Abandoned
- 1985-08-26 BR BR8504077A patent/BR8504077A/pt unknown
- 1985-08-26 DK DK387485A patent/DK387485A/da not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63277966A (ja) * | 1987-05-09 | 1988-11-15 | Sunstar Inc | 歯周疾患検査薬 |
| JP2011517488A (ja) * | 2008-03-28 | 2011-06-09 | デントグノステイツクス・ゲー・エム・ベー・ハー | 体液からのタンパク質を吸収するための装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR8504077A (pt) | 1986-06-17 |
| DK387485A (da) | 1986-02-28 |
| AU4666785A (en) | 1986-03-06 |
| EP0176246A2 (en) | 1986-04-02 |
| EP0176246A3 (en) | 1988-08-31 |
| DK387485D0 (da) | 1985-08-26 |
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