JPH03500369A - 内毒素及び炎症物質を監視することによる歯周病監視方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内毒素及び炎症物質を監視することによる歯周病監視方法発明の背景 細菌内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）は、グラム陰性細菌によって産生されるが、 その多数はヒト及び動物には非常に危険であるか又は致死的である。歯周ポケッ ト（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｐｏｃｋｅ＋）内では、グラム陰性細菌、その内 毒素、及びその他の炎症作因が歯肉炎及びその他の歯周病を引き起こす。適切な 医学的及び歯学的処置を直ちに開始するために、歯周ポケット内の内毒素の存在 、及び可能な場合は内毒素の濃度を確かめることが重要である。

被験者の歯周ポケット内の内毒素のモニタリングは、歯周病及び治療計画の効果 を診断するために用いてもよい。

細菌内毒素はカブトガニのアメーバ様細胞溶解産物中に生じる血液凝固酵素を活 性化する、ということはずっと以前から公知であった。この特性は、多くの出版 物、例えばＪ、Ｌｅｖｉｎ　ａｎｄＦ、　Ｂ、　Ｂａｎｇｓ、１９６Ｂ、　Ｔｈ ｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍｏｎｔｈ、　１９　：　１８６　、並びにＳ 、Ｎａｋａｍｕｒａ、１９７６、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　？２　：　 ９０２に記載されている。これらの研究は、Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解 産物（ＬＡＬ）の凝固には二価陽イオン存在下での内毒素による前凝血酵素の活 性化を必要とすることを立証した。このように形成された活性酵素は、グリシン サブユニットとアルギニンサブユニットとの間のＣ−カルボキシル末端で凝固原 を開裂する。開裂凝固原分子は重合され、したがって凝固を引き起こす。最初の 内毒素試験はこのようにして形成されたゲルの観察に基づくものであった。その 実施にはかなりの時間を要すること、内毒素濃度を正確に測定できないとと、標 準化が難しいこと、並びにその実施には経験を積んだ高度熟練者を必要とするこ とから、ゲル化反応試験法は歯周病の監視に用いるには不完全である。

多数の酵素、例えばトリプシン、トロンビン、トロンボピアスチン、セリンプロ テアーゼ、プラスミン、及びプラスミノーゲンの検定には、蛍光原又は色素産生 基質が用いられてきた。

蛍光原又は色素原はＬＡＬ−基質として用い得ることも判明している。例えば、 １ｖａｎ＠ｇａ等、１９７８　；　Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｓ、ユニ１８３、並び に米国特許第４．１８８．２６５号、米国特許第４．４（１６，８３２号、及び 米国特許第４．５１０．２４１号の各明細書を参照されたい。色素原基質の使用 は、ヒトの複雑な凝固工程において種々の酵素及び阻害剤の研究及び臨床的な監 視のための一手段となっている。

酵素特異性基質の広範な一覧表は、トリプシン、トロンビン、トロンボプラスチ ン、プラスミン、プラスミンカリクレイン、ウロキナーゼ、及びプラスミノーゲ ンのような酵素の測定用に市販されている。ｌｖａｎａｇａ等［Ｈｅｍｏｓｊａ ｓｉｓ　７：１Ｂ３〜１８８　（１９７Ｂ）コは１日本産カブトガニ（Ｔａｃｈ ７ｐｌｅｕｓ　＋ｒｉｄｅｎｊａｊｕｓ）とアメリカ産カブトガ＝　（Ｌｉｍｕ ｉｕｓ　ｐｏｌｙｐｂｅｍｕｓ）との血液から調製されるＬＡＬ中の前凝固酵素 を活性化する内毒素のレベルを測定するのに合成基質を使用し得ることを示して いる。

ＬｉｍυＩｕｓアメーバ様細胞溶解産物を用いた細菌内毒素を検定するための色 素産生基質法はまた、ｊＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ　 ｔｈｅ　Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　ＣｒａｂＪ　（１９７９；　ｐ、　２０９〜２２ ０．　Ａ１１ｅｎ　Ｒ，Ｌｉｓ。

Ｉｎｃ、）　、及び米国特許第４．３０１．２４５号明細書に記載されている。

しかしながら、これらの記載内容は、内毒素を含有する可能性のある血液の試験 、あるいは内毒素汚染に対する食物試験に向けられている。

歯周ポケット中の細菌を監視するには、通常３つの方法を用いる： １゜暗視野又は位相差顕微鏡； ２、培養微生物学的評価；及び ３、蛍光抗体同定。

第一の方法は不正確で、時間がかかり、且つ専門的知識を要する。第二の方法は 経費がかかるし、歯科医が診察室で試みるには煩雑すぎる。第三の方法も歯科医 には困難であるし、各々の個別歯周ポケット部位で実施するには経費がかかり過 ぎる。

本方法を用いれば、専門家も高価な設備も必要とせずに、歯科診察室内で短時間 に所望の内毒素試験を行うことができる。

本発明の方法に要する時間は、細菌内毒素に関する従来の試験方法に要する時間 よりはるかに短い。さらに、本方法は、歯周ポケットにおけるグラム陰性細菌感 染を示すための内毒素濃度を簡単且つ正確に測定する。

発明の要約 本発明は、被験者の歯周ポケット内に存在する細菌内毒素の量の定量的測定方法 に関する。その方法は：ａ）被験者の歯周ポケットから試料を採取し；ｂ）アル ギニル基と窒素含有基との間の結合を開裂することができる酵素を活性化するよ うな条件下で試料をアメーバ様細胞（ａｍｅｂｏｅｙｔｅ）溶解産物と接触させ ；Ｃ）その活性化酵素を、アルギニル基及びアルギニル基と結合する好適な窒素 含有基を含む基質と接触させてアミンを形成し； ｄ）その結果生じたアミンを処理して検出可能物質を生成し；ｅ）生成された物 質の量を定量的に測定し、それによって歯周ポケット中に存在する細菌内毒素量 を定量的に測定する 各段階から成る。

好ましい実施例においては、その方法は、アメーバ様細胞溶解産物−内毒素の相 互作用を妨げると思われる試料中に存在する酵素を不活性化するようにアメーバ 様細胞溶解産物と接触させる前に試料を処理することを包含する。

本発明はまた、本発明の方法により被験者の歯周ポケット内に存在する細菌内毒 素の量を定量的に測定し、並びにそのようにして測定された量を歯周病の起因と なる公知の内毒素量と相互に関連させることを包含する歯周病診断方法を提供す る。本発明は、該方法を実施するためのキットをも提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、種々の内毒素濃度の反応混合液で測定されたｐ　−ニトロアニリンの 最終濃度の光学密度を示す。

第２図は、ｐ−ニトロアニリンそれだけ、並びにＨ−酸及びＮ−ｎａを伴うその アゾ染料に関する光学密度の相対値を示す。

第３図は、Ｈ−酸とカップリングしたｐ−ニトロアニリンに関する内毒素標準曲 線を示す。

第４図は、Ｈ−酸とカップリングしたｐ−ニトロアニリンの種々の希釈液で歯周 ストリップから溶出される内毒素の光学密度を示す。

第５図は、反応混合液中の内毒素の種々の濃度でのＮ−ｎａとカップリングした ｐ−ニトロアニリンの光学密度を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、被験者の歯周ポケット内に存在する細菌内毒素の量の定量的測定方法 に関する。その方法は：ａ）被験者の歯周ポケットから試料を採取し；ｂ）アル ギニル基と窒素含有基との間の結合を開裂することができる酵素を活性化するよ うな条件下で試料をアメーバ様細胞溶解産物と接触させ； Ｃ）その活性化酵素を、アルギニル基及びアルギニル基と結合する好適な窒素含 有基より成る基質と接触させてアミンを形成し； ｄ）その結果生じるアミンを処理して検出可能物質を生成し；ｅ）生成された物 質の量を定量的に測定し、それによって歯周ポケット中に存在する細菌内毒素の 量を定量的に測定する 各段階から成る。

好ましい実施態様においては、その方法は、トリプシン又はトリプシン様酵素の ようなアメーバ様細胞溶解産物−内毒素相互作用を妨げる試料中の酵素を不活性 化するように、アメーバ様溶解産物と接触させる前に試料を処理することを包含 する。

アメーバ様細胞溶解産物−内毒素相互作用に及ぼすグラム陽性細菌の効力を減じ るために、試料を希釈してもよい。平均して、グラム陰性細菌は、任意のグラム 陽性細菌よりも、カブトガニ検定では約Ｉ×１０６倍活性が高い。したがって、 グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の区別は、試料中のプラーク生物の希釈によっ て容易に確認できるし、増強され得る。この方法では、グラム陽性細菌の活性を 惹起するカブトガニはすべて、希釈によって効力を最小にされ得るし、それによ りグラム陰性細菌のみが明白なカブトガニ反応を惹起することができる。歯周病 原体ではないかと考えられるものの９８％以上がグラム陰性であるため、試料中 のプラーク生物の希釈は、ポケット部位におけるグラム陰性細菌のレベルを測定 するための臨床的道具としての本方法の有効性を増大し、それによって歯周病を 診断する際の方法の有効性を増大する。

試料は、濾紙の小片を被験者の歯周ポケット内に入れ、紙片上に試料を集めるこ とによって採取してもよい。好ましい実施例では、アメーバ様細胞溶解産物−内 毒素相互作用を妨げる可能性がある試料中に存在する内因性酵素を不活性化する ために、その紙片を次に、例えば高温にセットしたヘアドライヤーからの熱風に １分間当てて加熱する。

本発明の実施に際しては、試料は、カブトガニのアメーバ様細胞溶解産物、好ま しくはＬｉｍｕｌｕｓのアメーバ様細胞溶解産物と混合する。しかしながら、日 本産のカブトガニであるＴａｃｂｙｐｌｅｕｉ　＋ｒｉｄｅｎｌａｊｕｓのよう な他の型のカブトガニから得られる溶解産物を用いることもできる。その溶解産 物は、慣用手法に従って調製できる。］ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ 　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ。

ｖｏｌｌＩｍｅ　５１．　ＪＵｌｙ　１９７２．　Ｂｏｌｌｅ４ｉｎ　ｏｆ　Ｊ ｏｈｎｓ　Ｉ（ｏｐｋｉｎｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ。

ｖｏｌｕｍｅ　１１５、ｐａｇｅｓ　２６５〜２７４　（１９６４）、及びＰｒ ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔａｌ　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌｕｍｅｌさ表子 ３−５００３６９　（５） １３７、ｐａｇｅｓ　３３４〜３４２に示されているような手法は、溶解産物を 回収するのに使用可能である。手短かにいえば、慣用手法は、通常、滅菌針を用 いてカニの心臓からカニ血液を抜き取り、その血液を血液細胞の凝集及びその細 胞の早発性溶解を防止する混合液中に入れ、遠心分離によってアメーバ様細胞を 残りの血液成分と分離し、機械的破壊、凍結−解氷により、又は水対細胞が約３ 〜６：１の容積比の発熱物質無含有蒸留水中での浸透圧性溶解等によって、アメ ーバ様細胞を溶解することを包含する。このようにして得られた溶解産物は、遠 心分離して破壊細胞を除去し、通常、凍結乾燥して保存される。使用に際しては 、溶解産物粉末を、約５０容積の滅菌発熱物質無含有蒸留水で希釈して、固形物 濃度が１ｍｌ当たり約０．０２ｇとなるようにする。

本方法においては、使用する溶解産物は新たに調製したものでもあるいは通常は 凍結乾燥粉末形態で保存されていたものでも、再形成されたものでもよく、もし くは反応混合液調製中に粉末として液体混合液に直接加えられるものであっても よい。何れの場合も、溶解産物は反応混合液中に約１．５０〜２．５０　ｇ　／ １００ｍ１の固形物濃度で存在する。

本発明に用いる基質は、試料中の内毒素による前酵素（ｐｒｏｅｎｘｙｍｅ）の 変換によって生成される溶解産物酵素による基質から分離され得る選択された比 色定量的指示薬を含有する。このような目的のためには、一般に、例えば米国特 許第４、０２８．３１８号明細書に記載された種類の任意の適当な基質を用い得 る。しかしながら、このような基質の中でもある種のものが他のものよりも有益 であることが判明している。これに関しては、一般式Ｒ１−Ｉ　！ｅ−Ｇｉｎ− Ｇｉ７−Ａｔｇ−ｐＮＡで表わされる基質が好ましい。

上記一般式のＲ１ブロック基は、Ｎ−ｔｅｒ４ブトキシカルボニル、炭素数１〜 １２のアルカノイル、シクロへキシルカルボニル、並びに１つ又はそれ以上のハ ロゲン、低級アルキル、例えばメチル及びエチル、アミノ又はフェニル基で置換 されたＮ−ベンゾイル、アセチル及びベンゾイルであってもよく、あるいはペプ チド構造のＮ末端Ｌ−アミノ酸がＮ−末端Ｄ−アミノ酸で置換される場合はＨで あってもよい。適当な色素原又は蛍光原基としては、ニトロフェニル、メチルニ トロフェニル、ジニトロフェニル、ナフチル、ニトロナフチル、メトキシナフチ ル、インドキシル、メチルインドキシル、（４−メチル−）ウンベリフェリル及 びレゾルフィンが挙げられる。

最も好ましい基質は、ベンゾイル（又はアセチル）−イソロイシン−グルタミン 酸−グリシン−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド　ベンゾイルアルギニン−β− ナフチルアミド、ベンゾイルアルギニン−ｐ−ニトロアニリドを包含する。さら に適した基質は、わずかの実験的試験により容易に確定できる。このような基質 は、例えば色指示薬としての２−ナフチル−アミド又はｐ−ニトロアニリドを含 有してもよい。

さらに、本発明が意図するものは、上記ペプチド型化合物の酸付加塩である。適 当な酸塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸から得 られるもの、又はギ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、及びベン ゼンスルホン酸のような有機酸から得られるものが挙げられる。

本方法によれば、試料、アメーバ様細胞溶解産物、及び選択された基質を適当な 相対濃度で一緒に混合することにより、所望の試験反応を実施する。本方法の実 施に際しては、試料を、例えば、滅菌試験管のような反応域に加え、次いで約５ 〜１０容積の発熱物質非含有滅菌水で希釈し、その後粉末Ｌｉｍｕｌｕｓアメー バ様細胞溶解産物又はその他のカブトガニのアメーバ様細胞溶解産物を適当濃度 で、このような各試験管に加えることができる。各試験管の温度は、好ましくは 好適範囲内、例えば３５〜４０℃、最も好ましくは約３７℃に保持する。この混 合液を完全に混合し、約７〜１２分間、好ましくは約１０分間インキュベートす る。

次いで基質を各試験管に加え、その結果生じる混合液を混ぜ、前に示した約３７ ℃の所望温度で約２〜４分、好ましくは約３分間インキュベートし、総反応時間 （最初のインキュベーション＋最終インキュベーション）を約１０〜１２分、好 ましくは約１１分とし、そこで例えばＩＮの酢酸を、継続中の反応を停止させる に十分な容量で、即ち通常１００成を各試験管に加える。次いでその混合液を各 試験管内に放置して、４０５　ｎｍで比色計を読む。

標準となる内毒素の公知の希釈液から予め作成された標準曲線からその内毒素の 濃度を算出する。本方法は、次に示す実験の詳細の項に記載されているのと同様 の試薬シートを用いて実施してもよい。

それに代わる方法としては、試料をアメーバ様細胞溶解産物と接触させることと 、トリプシン様酵素を基質と接触させることとを同時に実施してもよい。一実施 例においては、試料を濾紙細片上に収集し、アメーバ様溶解産物及び基質を含有 する試薬シートと接触させる。好ましくは、シートはトリスのような緩衝液をも 含有する。泪紙片上の試料を、アメーバ様細胞溶解産物及び基質を含有する溶液 に浸漬してもよく、あるいはそれを上記試薬シートとともに、緩衝液及び／又は 発熱物質無含有水を含む溶液中に浸漬してもよ、い。

防御可能物質を生成するための酵素の処理としては、好ましくはアミンをジアゾ 化してジアゾニウム塩を生成し、そのジアゾニウム塩を適当なカップリング剤と 反応させて検出可能物質を生成することが挙げられる。好適なカップリング剤は 当業者には十分公知であって、ヒスチジン、８−アミノ−１−ヒドロキシナフタ レン−３，６−ジスルホン酸、又はＮ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン　 ジヒドロクロリド、あるいはその塩がある。

本発明はさらに、本発明の方法により被験者の歯周ポケット中に存在する細菌内 毒素の量を定量的に検８し、そのようにして検出した量と歯周病の起因となる公 知の内毒素量とを相互に関連づける段階から成る歯周病診断方法を提供する。好 ましい実施例においては、歯周病は歯肉炎又は重症歯周炎である。

最後に、本発明は患者の歯周病を診断するための診断キットを提供する。

本発明を、以下の実験の詳細の項及び実施例によりさらに説明する。これらの各 項は本発明の理解を助けるためのものであって、以下の請求の範囲に示す通り、 いかなる点においても本発明を限定するものではないし、そのように解釈さるべ きものではない。

実験の詳細 本発明者の実験室で実施した実験は、歯肉炎の段階とカブトガニＩｔｍｕｌｕａ の溶解産物検定により測定した場合の内毒素レベルとの間に、正の強い相関を立 証した。このような実験においては、一つの、わずかに炎症を起こした歯肉ポケ ット中に濾紙小片を入れることによって採取された内毒素を定量的に評価するこ とが可能であった。その細片から溶出した物質をカブトガニアメーバ様細胞溶解 産物検定により定量し、１つのポケット部位の内容物から得られた試料中の内毒 素のナノグラム数として記録した。歯肉炎レベルとカブトガニｌｉｍｕｌｕｓア メーバ様細胞溶解産物活性レベルとの間に、ｒ＝０．９５という相関値を観察し た。これらの初期実験で得られた結果に基づいて、歯科医の業務限度内で便利に 応用できるようにするためのカブトガニアメーバ様細胞溶解産物検定の簡単な応 用に関する研究を実施した。このために色素原基質を用いて、内毒素−カブトガ ニアメーバ様細胞溶解産物相互作用後に色を発色させた。

本発明は、歯周ポケット内のグラム陰性細菌の微量（ピコグラム、１０−１２グ ラム）の特異的生化学成分を測定するために非常に高感度の比色定量検定又は蛍 光定量検定を使用する。その方法には、濾紙小片を用いた標準化法により歯科医 が患者の歯周ポケット内容物の試料を採取することが必要である。紙片は、ポケ ット内に含まれる細菌及びそれらの遊離生化学成分を収集するための芯となる。

その紙片は、「乾燥検定」法又は「湿潤検定」法に従って処理することができる 。前者の乾燥検定法の場合、紙片を、緩衝液成分及びカブトガニアメーバ様細胞 溶解産物成分を含む「試薬シート」上に置く。「試薬シート」上に置いた紙片部 位を発熱物質無含有水で湿らせ、内毒素−カブトガニ溶解産物相互作用後、発現 した色を色図表の色強度と比較する。基質が蛍光原性である場合、発現した蛍光 は、暗室内で反応スポットを照射して同様に評価する。色又は蛍光図表は、標準 条件下で必要とされる内毒素の量に基づいて作成する。

一方、「湿潤検定」法においては、試料紙片及び「試薬シート」を相互作用のた めに０．５ｍｌの発熱物質無含有水に浸漬し、比色計又は蛍光測定系を用いて色 又は蛍光の発現を測定する。得られた値は、色又は蛍光対内毒素量の標準曲線を 用いて調べる。

適当な発色団としての発色又は発蛍光反応の結果は、カブトガニアメーバ様細胞 溶解産物中に存在する酵素原（ｘｙｍｏｇｅｎ）　形態から生じるトリプシン様 酵素の作用に影響されない。酵素原の活性化は、酵素原−内毒素相互反応の結果 である。色又は蛍光の強度は、歯周ポケット中に存在する任意の炎症性物質−大 半はグラム陰性細菌に起因する細菌性内毒素の直接測定値である。

この方法で、歯科医は患者の歯周ポケット内に含まれるグラム陰性細菌及び／又 は炎症物質を監視することができ、したがって適用した療法の首尾を追跡調査す るための定量的判定基準を有することができる。

実施例 典型的カブトガニＬｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解産物（Ｌ　Ａ　Ｌ）試験： 　ＷｈｉＮａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐ＋ｏｄｕｃｆｓ　ｌ：：よルキッ）　 ＱＣＬ−１００００に従って色素原基質を使用。

材料： １．４ｃｃの発熱物質無含有水に溶解させる凍結乾燥ＬＡＬ０１、Ｑｃｃの発熱 物質無含有水に溶解させるＥ、　ｃｏｌｉ内毒素標準（約２０内毒素単位（ＥＵ ））。

５、（ｌｅｃの発熱物質無含有水に溶解させるアセチル−自ｅ−ＧＩＩ＋−Ｇ　 ！ｙ　−ＡＲＧ　−ｐ−ニトロアニリド基質（２，２ＷＭ溶液）。

Ｃａ＋＋及びＭｇ”イオンの存在下でＮａＣｊ！を用いてイオン強度０．２に調 節した０、　０５Ｍ、　ｐＨ９，０）リス緩衝液。

発熱物質無含有水。

５０成　ＬＡＬ ５０ρ　緩衝液　１０分、３７゜ ５０成　標準又は未知 の内毒素 ５０成　基質　３分、３７゜ 全容積：０．３ｃｃ。

４０５　ｎｍでのｐ−ニトロアニリンの測定０．Ｄ。

色素原性カブトガニアメーバ様細胞産物（ＬＡＬ）の変法試験：歯科診療室での 歯周病評価用に特に開発された。

色素原性ＬＡＬ変法試験の主な特徴は：１、ＯＪから０．５ｃｃへの反応混合液 容積の増量。容積増加は、典型的ＬＡＬ試験で用いられる特別の高価な分光光度 計の代わりに廉価な比色計を用Ｃ）るために必要である。

２、ｐ−ニトロアニリンによるかなり弱い黄色変色に代わる強力な赤色変色の視 覚的比較の可能性。赤色変色はｐ−ニトロアニリンをＨ−酸（チェリーレッド） 又はＮ−ｎａ（紫赤）とカップリングすることにより得られる。

３、歯科診療室職員によって行われる手順での過誤の可能性が極めて小さい。

材料： 材料はすべて市販されている。

Ｗｂｉｔｊａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ＋ｓによるＱＣＬ−１０００ キツトとして提供されるＬＡＬ、内毒素標準、色素原性基質、緩衝液及び発熱物 質無含有水。

ｐ−ニトロアニリン−Ｈ−酸カツブリング用：１％亜硝酸ナトリウム ３％尿素 ６％重炭酸ナトリウム ０．７５％Ｈ−酸（８−アミノ−１−ヒドロキシナフタレン−３，６−ジスルホ ン酸、Ｎａ塩。１．５ＨＯＨ）０．０５Ｎ　ＨＣＮ ｐ−ニトロアニリン−Ｎ−ｎｘカップリング用：１％亜硝酸ナトリウム ３％尿素 ０．７５％Ｎ−ｎ１（Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン。

２ＨＣＩり ０．３５Ｎ　ＨＣｆｉ Ｈ−酸及びＮ−ｎａはＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から得られる 。

方法： 典型的ＬＡＬ試験の性質及び条件の評価を用いて開始する段階で、変法試験を開 発した。Ｑ、３ｃｃの反応混合物容積の不利益と典型的ＬＡＬ試験での視覚的比 較のための最適判定基準ではない黄色変法とに加えて、本試験においては２つの 望ましくない条件が認められる： １、酵素原−酵素変換のための１０分間インキュベーションとその後の３分間の 酵素−基質相互作用の実施には、特にいくつかの試料を−続きｐ取り扱う場合に は、試験実施の一部にストレス及びエラーを引き起こす恐れのある綿密な時間調 整が必要である。基質は開始時から存在してはいけない理由はなく、酵素が生成 されている場合に作用を受ける。したがって、ＬＡＬ。

内毒素・基質及び緩衝液の全混合物を３７℃で１５分間保持することにした。

全体的相互作用を１５分間の一段階にするという変法は、第一段階で１０分間イ ンキュベーションを行い、その後第二段階で３分間酵素反応をさせるという特徴 を有する典型的ＬＡＬ試験よりも、時間調整のエラーに関してはかなり安全であ る。さらに、総相互作用時間を１５分にすると、生成されるｐ−ニトロアニリン の濃度が高くなる。

２、典型的ＬＡＬ試験で２５％酢酸を用いることには特別の利点はない。したが って、変法ＬＡＬ試験では、二つの目的でＨｃＪｌの溶液を使用することにした ：先ず第一は酵素−基質相互作用を終結するため、そして第二は生成されたｐ− ニトロアニリンをそのジアゾニウム塩に変換して、適当な薬剤とカップリングさ せるためである。ｐ−ニトロアニリン−Ｈ−酸カツブリングは、アルカリ性条件 下で実施した。したがって、０．０５ＮＨαは酵素活性を終結し、亜硝酸を遊離 させてｐ−ニトロアニリンと相互作用させるに十分であった。ｐ−ニトロアニリ ン−Ｎ−ｎａカップリング法に関しては、１３５Ｎ　ＨＣｆｉを用いて酵素活性 を終結し、ｐ−ニトロアニリンのジアゾニウム塩を形成し、カップリングに必要 な酸性度を提供した。

実験作業は、ＬＡＬ、内毒素、基質及び緩衝液の混合物を３７℃で１５分間保持 し、０．５ｃｃのＯ，［１５Ｎ（又は（［１，３５Ｎ）ＨＣＩｌを用いて酵素活 性を終結させることにより開始した：５０成　ＬＡＬ ５０／１１１　緩衝液 ５０　Ｊｌｌ　標準又は未知の内毒素 ５０成　基質 １５分・３７°　全体で１段階１５分 その結果束じたｆｉ、７ｃｃという最終容積により、普通の分光光度計及びｌｃ ｃキュベツトを用いて、４［１５ｎｍでｐ−ニトロアニリンＯ，Ｄ、測定を行う ことが可能になった。

その後の作業においては、１．０　ｃｃ　ａ／酸を加えて最終容積を１．２ｃｃ とした。１．．２ｃｃという容積は、ｐ−ニトロアニリン　ジアゾニウム塩を生 成し、その後カップリングしてアゾ染色を生成するのに適当であった。Ｈ−酸又 はＮ−ｎａとのカップリング後は、反応混合液を５．０ｃｃに希釈してその０． Ｄ、を５４Ｏｎ＋ｎで測定することも、標準変色を視覚的に比較することもしな かった。

Ｈ−酸とカップリングさせたｐ−ニトロアニリンの変法ＬＡＬ試験： ０ｍＬＡＬ ５０ＩＪｉ　緩衝液 ５０成　標準又は未知の内毒素、対照 ５０成発熱物質無含有水 ５０Ｉｌｉ　基質 １、０　ｃｃ　０．０５Ｎ　ＨＣｆ １００ｊＪｆ１１％亜硝酸ナトリウム １００成　３％尿素 ５００成　６％重炭酸ナトリウム １００μ　０．７５％　Ｈ−酸 水で全体を５．Ｏｃｃとする（３．１　ｃｃ）　０．　Ｄ、は５４０　ｎｍで測 定コメント： 酸性媒質に亜硝酸ナトリウムを加えることにより、順次ｐ−ニトロアニリンと反 応してそのジアゾニウム塩を生成する亜硝酸が遊離する。

尿素は、任意の過剰亜硝酸を除去し、したがってこの酸とＨ−酸のアミノ基との 反応を防止するために加える。

重炭酸ナトリウムは、Ｈ−酸カツブリングのためにアルカリ性を提供する。

生じたチェリーレッド色は数週間安定していた。

構　造　式 Ｈ−酸（遊離型）Ｎ−ｎａ（遊離型） ｐ−ニトロアニリン Ｎ−ｎｕとカップリングされたｐ−ニトロアニリンの変法ＬＡＬ試験□５０成　 ＬＡＬ ５０μｓ　緩衝液 ５０　ｇ　標準又は未知の内毒素、対照発熱物質無含有水５０成 ５０成　基質 １、０　ｃｃ　０．３５Ｎ　ＨＣｊ！ １００ＪＪｉ１％亜硝酸ナトリウム １００成　３％尿素 １００１１１Ｏ，７５％　Ｈ−ｎａ 水で全体を５．０ｃｃとする（３．５ｃｃ）　Ｏ，Ｄ、は５４０　ｎｍで測定コ メント： Ｎ−ｎａを加える前の酸性及び１．４ｃｃ容積という条件下では、このカプラー を導入すると紫系色が即時に形成される。この色は実際に２４時間変わらないが 、しかし新鮮な反応混合液と古い反応混合液との比較で視覚的に観察される程度 まで約２週間で退色する。

Ｎ−ｎａカップリング化反応混合液のＯ，Ｄ、　は、Ｈ−酸カツブリングと関連 したＯ、　Ｄ、よりも約１．４倍高く、カップリングを施されていないｐ−ニト ロアニリンのＯｏＤ、よリモ約６倍高い。

歯周ポケット液から得られた内毒素に対する変法ＬＡＬ試験：歯周ポケット液を 、専門的に用いられる紙片を３０秒間挿入することにより採取した。１．Ｏｃｃ の緩衝液を紙片に加え、その混合液を静かに加温して、１分間掻き回した。内毒 素のこの親溶液を発熱物質無含有水で５０．１００．５００及び１０００倍に希 釈した。

内毒素の親溶液はＬＡＬ材料を過飽和している濃度を示したので、希釈溶液のみ を用いて変法ＬＡＬ試験を実施した。一定量のＬＡＬ材料は、内毒素に応じた量 の酵素に変換される一定量の酵素原を含有する。存在する全酵素原について要求 されるものを超過して供給される内毒素は無益であって、それ以上の酵素は生成 され得ない。したがって、過剰の内毒素は遊離されたｐ−ニトロアニリンに対し てプラトー効果を示す。

実施例 歯周ポケットの内毒素測定： 紙片を重症歯周炎患者の６間両周ポケット内に３０秒間挿入した。その紙片を１ ．０ｃｃの緩衝液中で溶出して、内毒素の親溶液を生成した。Ｈ−酸カツブリン グによる変法ＬＡＬ試験を、内毒素親溶液の５０倍希釈液１００成を用いて実施 した。５４Ｑ　ｎｍで０、２３４のＯ，Ｄ、を測定した。

同一条件下で作成した標準内毒素曲線（直線関数）によれば、５４０　ｎｍでの ０．２３４という０．　Ｄ、は０．９３Ｅυ／ｃｃ　（内毒素単位／ｃｃ）の内 毒素濃度に相応する。

したがって、内毒素の５０倍希釈液はＱ、　９３　ＥＵ／ｃｃＱ内毒素濃度を有 した。かくして、１．Ｑｃｃの紙片溶出物（親溶液）中の内毒素濃度は４６．５ 　ＥＵ／ｃｃ　（０，９３Ｘ　５０）の内毒素含量を示した。

内毒素標準曲線二 典型的ＬＡＬ試験に関する材料の項に記載の通り、標準Ｅ。

ｃｏｌｉ内毒素は、Ｘ内毒素単位／バイアル（ＥＵ／バイアル）の内訳で供給さ れる。１．０ｃｃの発熱物質無含有水を加えると、ＸＥＵ／ｃｃの標準内毒素溶 液が生じる。１内毒素単位は０．２ナノグラムのＬＰＳ　（リポ多糖類）を表わ す。

Ｘ　ＥＵ／ｃｃのオリジナル標準内毒素溶液をＸ倍に希釈して、その一部をさら に希釈することが可能な（例えば２．　４．　５及び１０倍）　１．０　ＥＵ／ ｃｃの標準内毒素溶液を得るのが便利である。

１、　［Ｉ　ＥＵ／ｃｃ溶液及びそれをさらに希釈した希釈液を用いてＬＡＬ試 験を実施し、測定されたＯ、　Ｄ、対使用した内毒素溶液のＥＵ／ｃｃをプロッ トする。

変法色素原ＬＡＬ試験に関する全般的考察ニジアゾ化−カップリングの手法に基 づいたアニリン及び多数のその誘導体の分光測光的測定は、Ｇｅｏｒｇｅ　Ｎｏ ｒｗｉｔｘ及び？ｊｅｒとＫｅｌｌｂｅｒは、アニリン及びその誘導体上のジア ゾ化−カップリングのためのＨ−酸及びＮ−ｎａを選択し、分光測光法において 信頼でき且つ有用なアゾ染料を生産するための反応条件を研究した。

しかしながら、本研究では、ｈ＋ｖｉｔｘ及びＫｅｌｌｈｅｒの条件のある種の ものは、実際上の目的のために修正した。例えば、カップリング剤をｐ−ニトロ アニリンのジアゾニウム塩を含有するかなり少量の溶液に加えて、濃度をより高 くし、反応性をより速くした。さらに、スルファミン酸アンモニウムよりも低コ スト物質である尿素を、過剰亜硝酸を除去するために用いた。

Ｈ−酸及びＮ−ｎｘは、すべての芳香族炭化水素及びその誘導体と同様、注意し て取り扱わねばならない物質である。安全性の理由から、またＨ−酸（再結晶化 物質でない）溶液は露光されない場合でも放置しておくと黒ずんでくるために、 カップリング剤溶液の使用に代わるものを探す必要があった。厚いグラスファイ バー濾過円板（Ｗｈａｔｍａｎ）から切り出した細片をカップリング剤溶液で湿 らせて、乾燥させた。このようなカップリング試薬細片は、カップリング剤の添 加用に上首尾に使用できた。

新鮮なカップリング試薬液を付加した場合と同じ光学密度の赤色が直ちに発現し た。

変法ＬＡＬ試験はさらに、厚いグラスファイバー？Ｆｉ過円板上での「スポット テスト」として実施した。しかしながら、上記した方法が、光に当たる状態に置 かれた溶液における変色の視覚的比較により適している。

対照実験（内毒素溶液の代わりに発熱物質無含有水を加える）で観察された低値 の光学密度は、３７℃でｐｎ　９に晒された基質の自然発生的加水分解によるも のである。このために、基質溶液は発熱物質無含有水を用いて調製し、ｐ−ニト ロアニリンを有意に遊離させずに６力月間冷蔵保存可能である。基質は、ＬＡＬ 試験実施中のみ、緩衝液に晒される。

今日までに、以下の９つの口内単離体のＬｉｍｕｌｕｓ活性が分析されている： 　（１）　Ｓ、　ｍｕｔａｎｓ、　Ｓ、　ｓａｎｇｕｉｓ、　Ａ、　１ｓｒａｅ ｌｉｉ、　Ａ、　ｖｉｓｃｏａｕｓ。

Ａ、　ｎｅｌｓｌｕｎｄｉを含むグラム（ト）細菌；　（２）　Ｃ４ｉｎｇｉｖ Ｃ４１ｎ、　Ｃ，ｏｃｈｒａｃｅａ、　Ａ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｃｊｅｍｃｏｍ ｉｔａｎｓ及びＶ、　ａｌｃａｌｅｓｃｅｎｓを含むグラム（ハ）細菌。

平均して、グラム（へ）細菌は、凝固及び試験管希釈検定を用いて試験したいず れのグラム（ト）細菌よりもカブトガニＬｉｍｕｌｕｓ検定においては約１×１ ０６倍も活性が高い。全細胞懸濁液を同様の全細胞懸濁液から得た音波破砕抽出 物と比較した場合の差異は無視できるものであった。したがって、全細胞又は同 −細胞源由来の細胞断片のいずれもが同一の容易さでカブトガニ１１ｍｎ１ｕｓ 活性を引き起こし得ると考えられる。

これらの結果は、グラム（ハ）細菌とグラム（イ）細菌との間の区別が容易に確 認可能であり、プラーク生物の希釈によって増強されることを示唆する。このよ うに、グラム（ト）細菌の全カブトガニ−誘発活性は、希釈作用によって消去さ れ得、したがってグラム（ト）細菌のみが陽性のカブトガニ反応を誘発すること ができる。歯周病原体の疑いがあるものの９８％以上がグラム（ハ）であるため 、これはポケット部位のグラム（へ）細菌のレベルを測定するための有益な臨床 用具になり得るものと思われる。

特定のポケット領域の内毒素レベルを測定するための努力に際して歯科医がチェ アサイドで使用可能な収集手順を開発しできた（以下の実施例参照）。

カブトガニ収集のためのプロトコル （１）　綿棒で該当領域を隔離する。

（２）乾燥面撒糸（ガーゼ）で該領域を拭く。

（３）＃３滅菌吸収性歯自治療紙先端を１０秒間、問題のポケット中に入れる。

（４）　高温にセットしたヘアドライヤーから１分間送風しながらプライヤーの 乾燥先端で紙の先端をつまむ。

（５）紙の先端を滅菌試験管中に入れ、試験管をラベルして、冷凍庫内に入れる 。

（６）１名の患者当たり２箇所の疾病部位と一箇所の「正常」部位からの収集を 試みる。

（７）　紙片先端でＬＡＬ試験又は変法ＬＡＬ試験を実施し、比色表で比較して 内毒素濃度を確定する。

４０５ｎｒｎ＋＝お１する○、Ｄ。

！０５＃ｒ＝＋；ｔ５４０　ｎｒｎ　＋＝お１するＯ、　Ｃ）。

０．０．ｓ＋ｏｎｒｎ ０、Ｄ、Ｓ＋Ｏｎｎｚ ５４０　ｎｍ　ＩＲ’＋＋７るＯ、Ｃ）。

国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．被験者の歯周ポケット中に存在する細菌内毒素の量の定量的測定方法であっ て： ａ）被験者の歯周ポケットから試料を採取し；ｂ）アルギニル基と窒素含有基と の間の結合を開裂することができる酵素を活性化するような条件下で該試料をア メーバ様細胞溶解産物と接触させ； ｃ）その活性化酵素を、アルギニル基及び該アルギニル基と結合する好適な窒素 含有基を含む基質と接触させてアミンを形成し； ｄ）その結果生じるアミンを処理して検出可能物質を生成し；ｅ）生成された物 質の量を定量的に測定し、それによって歯周ポケット中に存在する細菌内毒素を 定量的に測定する各段階から成る方法。
2. ２．アメーバ様細胞溶解産物−内毒素相互作用を妨害すると思われる試料中に存 在する内因的酵素を不活性化するために、アメーバ様細胞溶解産物と接触させる 前に該試料を処理することをさらに包含する請求項１記載の方法。
3. ３．該試料の処理が該試料の加熱を包含することを特徴とする請求項２記載の方 法。
4. ４．アメーバ様細胞溶解産物と接触させる前に該試料を希釈することをさらに包 含する請求項１記載の方法。
5. ５．アメーバ様細胞溶解産物がカブトガニＬｉｍｕｌｕｓのアメーバ様細胞溶解 産物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. ６．濾紙片を被験者の歯周ポケット内に入れ、該紙片上に試料を収集することに より該試料を採取することを特徴とする請求項１記載の方法。
7. ７．濾紙片上に採取された試料をアメーバ様細胞溶解産物と接触させる前に加熱 することを特徴とする請求項６記載の方法。
8. ８．緩衝液存在下で試料とアメーバ様細胞溶解産物との接触を実施することを特 徴とする請求項１記載の方法。
9. ９．試料とアメーバ様細胞溶解産物との接触、及び該活性化酵素と基質との接触 を同時に実施することを特徴とする請求項１記載の方法。
10. １０．試料とアメーバ様細胞溶解産物との接触、及び活性化酵素と基質との接触 を、濾紙片上に試料を採取し、該紙片をアメーバ様細胞溶解産物及び基質を含有 する試薬シートと接触させることにより実行することを特徴とする請求項９記載 の方法。
11. １１．試料とアメーバ様細胞溶解産物との接触、及び酵素と基質との接触を、濾 紙片上に試料を採取し、その紙片をアメーバ様細胞溶解産物及び基質を含有する 溶液中に浸漬することにより成し遂げることを特徴とする請求項９記載の方法。
12. １２．活性化酵素がトリプシン又はトリプシン様酵素であることを特徴とする請 求項１記載の方法。
13. １３．窒素含有基がナフチルアミド又はｐ−ニトロアニリドであって、形成され るアミンがナフチルアミア又はｐ−ニトロアニリンであることを特徴とする請求 項１記載の方法。
14. １４．基質がベンゾイルアルギニン−Ｂ−ナフチルアミド、ベンゾイルアルギニ ン−ｐ−二トロアニリド、又はアセチルーＩｌｅｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− （ｐ−ニトロアニリド）であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
15. １５．基質がアセチルーＩｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（ｐ−ニトロアニ リド）であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. １６．アミンの処理が、ジアゾニウム塩を生成するためのアミンのジアゾ化、及 び検出可能物質を生成するための該ジアゾニウム塩と適当なカップリング剤との 反応を包含することを特徴とする請求項１記載の方法。
17. １７．カップリング剤がヒスチジン、８−アミノ−１−ヒドロキシナフタレン− ３，６−ジスルホン酸、又はＮ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンジヒドロ クロリド又はその塩であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
18. １８．検出可能物質が着色物質であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
19. １９．形成された物質の定量的測定を、検出可能物質と公知の内毒素濃度の標準 と比較することにより行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
20. ２０．着色物質の定量的測定を、該着色物質と色対内毒素濃度の標準曲線とを比 較することにより行うことを特徴とする請求項１８記載の方法。
21. ２１．着色物質の定量的測定を、着色物質の光学密度と公知の内毒素濃度の溶液 の光学密度とを比較することによって行うことを特徴とする請求項２０記載の方 法。
22. ２２．被験者の歯周ポケット内に存在する細菌内毒素又は他の炎症性物質の量を 定量的に測定する方法であって：ａ）濾紙片上に被験者の歯周ポケットから採取 した試料を収集し； ｂ）カブトガニのアメーバ様細胞溶解産物−内毒素相互作用を妨害すると思われ る内因的酵素を不活性化するように、該試料を含有する紙片を処理し； ｃ）該処理紙片を、カブトガニのアメーバ様細胞溶解産物、並びにアルギニル基 及び該アルギニル基と結合するナフチルアミド又はｐ−ニトロアニリド基を包含 する基質と接触させて芳香族アミンを形成し； ｄ）該芳香族アミンを処理してジアゾニウム塩を形成し；ｅ）該ジアゾニウム塩 を適当なカップリング剤と反応させて着色物質を生成し； ｆ）暮色物質の着色強度と公知の内毒素濃度の標準とを比較することにより生成 された着色物質の量を定量的に測定し、それによって歯周ポケット内に存在する 細菌内毒素の量を定量的に測定する 各段階から成る方法。
23. ２３．試料を含む紙片の処理を該紙片を加熱することによって行うことを特徴と する請求項２２記載の方法。
24. ２４．請求項１記載の方法により被験者の歯周ポケット内に存在する内毒素量を 定量的に測定し、そのようにして測定された量を公知の歯周病誘発内毒素量と相 互に関連させることを包含する歯周病診断方法。
25. ２５．歯周病が歯肉炎又は重症歯周炎であることを特徴とする請求項２４記載の 方法。
26. ２６．試験試料を置く支持手段、凍結乾燥されたカブトガニアメーバ様細胞溶解 産物の容器、約２０内毒素単位のＥ．ｃｏｌｉ内毒素標準の容器、アルギニル基 並びに該アルギニル基と結合する適当な窒素含有基とを含む基質の容器、緩衝液 の容器、発熱物質無含有水の容器、並びに酢酸の容器を包含する歯周病診断キッ ト。
27. ２７．基質がアセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド であること特徴とする請求項２６記載のキット。
28. ２８．緩衝液が、Ｃａ及びＭｇイオン存在下でＮａＣ４を用いてイオン強度０． ２に調整された１．０５Ｍ、ｐＨ９．０トリス緩衝液であることを特徴とする請 求項２６記載のキット。
29. ２９．亜硝酸ナトリウム、尿素、重炭酸ナトリウム、８−アミノ−１−ヒドロキ シナフタレン−３，６−ジスルホン酸のナトリウム塩、及びＨＣｌの容器をさら に包含する請求項２６記載のキット。
30. ３０．亜硝酸ナトリウム、尿素、Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン、及 びＨＣｌの容器をさらに包含する請求項２６記載のキット。