JP2002514306A - インビトロアレルギー診断のためのストリップテスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、インビトロでアレルギーを診断するためのストリップテストに関し、そして全血及び血清中の特異的IgEを同定する方法に関する。本発明は、吸入アレルゲン、食品アレルゲン、交差反応性アレルゲン及び地中海性アレルゲンを同定するための該ストリップテストの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 インビトロアレルギー診断のためのストリップテスト 本発明は、アレルギー患者の血清及び全血中の特異的免疫グロブリンE(IgE)の 評価のためのインビトロアレルギー診断のためのストリップテスト(striptest) に関する。 インビボ及びインビトロアレルギー診断の種々の方法が知られている。皮膚、 穿刺、皮内及び刺激(provocation)テストを含む、インビボアレルギー診断に加 え、インビトロアレルギー診断が、益々重要になってきている。これは、アレル ゲンスペクトルが常に増加し続けており、そして多くの場合にインビボテストは 、患者に副作用を引き起こす結果、行うことができないことによる。 さらに多くの新規なアレルゲンについては、しばしば、入手可能な市販のテス ト溶液が存在しないので、従って稀なアレルゲンに関しては、抽出物の調製ひい ては、テスト溶液の調製のコストが、しばしば患者の数とつり合わないからであ る。ここでとりわけ、しばしば少数の人々にのみしか影響しない、例えば樹木、 生コーヒー、例えばラテックスグローブ等のような衛生のために使用される物品 、において生じるような職業上のアレルゲンに留意すべきである。高度なアレル ギー患者の場合には、新規で、まだ適切に特徴付けられていないアレルゲン溶液 で行われるインビボテストによって、治癒に悪影響を及ぼす予期せぬ副作用を引 き起こしてしまう。他方、インビトロ診断は、患者の血清でのテストは体外で行 われるので、患者の完璧に安全であるという有利点がある。 患者の血清中の特異的IgEと全IgEのインビトロ同定の点では、特異的IgEが非 常に重要な役割を果たしている。IgE(免疫グロブリンE)はタンパクであり、血清 学的観点がら、主にアレルギー症候群の原因となる。 現在までのところ、Johansson，Wide及びBennickによって開発され、そしてLa ncet 2，1105-1107(1967)に記載されている、アレルゲンディスクテストによる アレルギーのインビトロ同定は、周知である。この方法は、今日、最も頻繁に 使用されているテストである。同時に、アレルギー患者の血清中の特異的IgEを 測定するための最初のテスト系である。同様のテスト系は、例えばEP 203 238に 記載されている。 これら公知のテストの全ては、全血から調製された血清を使用してのみ行うこ とができ、相対的に鈍感である。すなわち、有意な診断のためのテストあたり、 血清1-2mlが必要である。 さらに、正確かつ信頼できる診断を行うために、インビトロテストが、例えば ラテックスのような稀なアレルゲンをも含む多様なアレルゲンをカバーすること が、多くの患者にとって重要である。現在までに周知のテストのさらなる不都合 は、これらのテストがカバーする不適切なアレルゲンスペクトルに加えて、実行 が困難かつ冗長で、誰もが単純に行うことができ、そして特に評価することがで きるようなものではないことである。さらにヒト医学の領域及び獣医学の両方に おける診断のためのテストに使用すること、及びそれにより結果を誤ることなし に血清及び全血で同様に行うことを可能にすべきである。 従って、本発明の課題は、血清及び全血の両方で行うことができ、そして十分 に多くのアレルゲンを包含する、インビトロアレルギー診断のための取り扱いが 簡単なストリップテストを提供することにある。 本発明は、全血及び血清の両方で行うことが可能であることを特徴とする、特 異的なIgEを評価するためのインビトロ診断のためのストリップテストに関する 。 さらに本発明は、それぞれのスティックが、ポジティブコントロール、ネガテ ィブコントロール及び少なくとも９つの異なるアレルゲンで、それぞれの場合コ ートされていることを特徴とする、血清及び／又は全血中の特異的IgEの検査の ためのインビトロ診断のためのストリップテストに関する。 ストリップテストは、アレルギー患者の全血又は血清中の特異的IgEの検査の ために使用され、そしてヒト領域に加えて、獣医領域でも同様に使用することが できる。その評価は、カラーチャートとの比較により、好ましくは視覚的に行わ れる。このプロセスでは、結果として得られるそれぞれのテストストリップ上の アレルゲンパッドの彩色をカラースケールと比較する。この場合の色彩強度は、 アレルギー診断の結果の指標である。 典型的なストリップテストは、好ましくは９アレルゲン、ネガティブコントロ ール及びポジティブコントロールを含む。完全なテストは、好ましくは異なる領 域の異なるアレルギーテストストリップを含む。これらは、例えばグラス／穀物 ／ハーブ(G/C/H)、動物／羽毛／ダニ(A/F/M)、樹木(T)、菌類(F)、食品(FS)、ス クリーニング(S)[Phadiatop]を含む。 典型的なアレルゲンスペクトルを以下の表に示す。これらの標準的なアレルゲ ンは、例えば焙煎コーヒー、特定の樹木、ラテックス等で生じるような特別なタ イプのアレルゲンをさらに含む。 本発明の商業的に入手可能なテストは、例えば - 吸入アレルゲンテストストリップ - 食品アレルゲンテストストリップ - 交差反応性アレルゲンテストストリップ及び - 地中海性(Mediterranean)アレルゲンテストストリップ を含む。 本発明によるテストストリップは、Allergodip^TMと呼ばれる。テストされるア レルゲンに関するAllergodipテストシステムの前述の典型的な組成物は、以下の ように示すことができる： コードナンバーは、1993年10月のアレルゲンディスクカタログから採用された ： ^* この場合局方薬^** ショートブタクサ(ragweed)か、又はジャイアントブタクサであるか等は、 さらにM-Aにより正確に同定しなければならない。 テストシステムの他の典型的な構成物は、さらに患者カラーチャート、ラベル されている試験管、試験管スタンド、結合剤、基質、使い捨てピペット、テスト を実行及び評価するための手引きである。結合剤は好ましくはAP-抗-IgEであり 、基質は好ましくはAP-パープルIgE又はBM-パープルIgEである。 テストは、好ましくは室温で行われる。 テストは、1-day及び2-dayテストの形態でさらに行うことができる。両方のテ ストは、主に結合剤及び基質とのインキュベーションの時間の長さにおいて異な る。さらに、テストは全血又は全血から調製される血清で行うことができる。 個々のテストストリップは、好ましくはアレルゲンディスクテストでも周知の ような、臭化シアン活性化により製造される。 Allergodipの製造のためには、BrCN活性化ペーパーシートが使用される。ペー パーシートの活性は、好ましくはアレルゲンディスク活性工程の後に行われ、量 及び体積を顕著に減らして行われる。 セルロースペーパーは、BrCNで活性化される。アレルゲンは活性化されたペー パーに共有結合させる。一枚のBrCN活性化ペーパーシート(DIN(ドイツ工業規格) A4)あたり、１つのアレルゲンが結合される。4mm幅ストリップを切断し、プラス ティックストリップ(DIN A4)に接着する。例えば９つの異なるアレルゲン、ポジ ティブコントロール及びネガティブコントロールを、次々に、そのプラスティッ クストリップ上に接着する。DIN A4プラスティックストリップを、4mm幅で約7cm 長であるプラスティックストリップ(Allergodips)に切断する。 アレルゲンテストストリップの製造は、好ましくは4mm幅ストリップがアレル ゲン結合シートから切断されるように行われる。これらのストリップは、両面テ ープにより約30cm長及び8cm幅のポリスチレンシートに結合される。異なるアレ ルゲンストリップを結合させ、しっかりと圧着させる。従って本願のアレルゲン ストリップで被覆されたポリスチレンシートは、次いで特別に開発したプレス( ト ルクキーの使用)により室温で終夜、圧縮される。圧縮の後、4mm幅のAllergodip (ストリップ)を、切断機器によりアレルゲン被覆ポリスチレンシートから切り出 す。ストリップを、乾燥ストッパーつきのチューブに、１チューブあたり10スト リップで貯蔵し、ラベルをして、-20℃で保存する。これらはこの条件下で、少 なくとも２年間は安定である。 どのストリップが、例えば樹木に相当するものであるかをラベルすることにつ いては、ポリスチレンシートの上部を色でラベルすればよい。それぞれのAllerg odipは、異なる色にする。 さらに本発明は、少なくとも以下のステップ： 1. 試験管に血清又は全血をピペッティングする； 2. テストストリップ(Allergodip^TM)とのインキュベーション； 3. 流水下で洗浄する； 4. ４時間の乾燥； 5. Allergodip^TMの結合剤とのインキュベーション； 6. 洗浄； 7. 短時間の乾燥； 8. Allergodip^TMと基質とのインキュベーション； 9. 吸収紙を用いた短時間の乾燥； 10. 発色したテストストリップの取り出し； 11. カラーチャートとの照合、又は照合して、患者/カラーチャートの組み合わ せによる記録； を逐次行うことを特徴とする、全血又は血清における特異的IgEの同定のための 方法に関する。 テストは、1-day又は2-dayテストの形態で行うことができる：1-day テスト - Allergodipを6.5mm×7cm試験管内で血清と共に室温で30分間、インキュベー トする。 - 次いでストリップを超音波槽で２分間洗浄する。 - ストリップをAP-抗-IgEと室温で２時間インキュベートする。 - 次いでストリップを超音波槽で２分間洗浄する。 - ストリップを基質と室温で1.5時間インキュベートする。 - ストリップを濾紙を用いて乾燥し、そして呈色反応をカラーチャートに対し て評価する(光度計を用いてもよい)。2-day テスト - Allergodipを6.5mm×7cm試験管内で血清と共に室温で３時間、インキュベー トする。 - 1-dayテストと同様に洗浄する。 - AllergodipをAP-抗-IgEと室温で終夜インキュベートする。 - 1-dayテストと同様に洗浄する。 - ストリップを基質と室温で1.5時間インキュベートする。 - ストリップを濾紙を用いて乾燥し、そして呈色反応をカラーチャートに対し て評価する(光度計を用いてもよい)。 アレルゲンパッドの青い色彩により、患者の血清中の特異的IgEレベルの高さ が、カラーチャートとの比較により決定される。1-dayテストでは３つのアレル ゲンクラスに、そして終夜テストでは４つのクラスに分割が行われる。 テストストリップに加えて、以下のさらに補助的な試薬が必要である。 結合剤 使用される結合剤は、好ましくはAP-抗-IgE結合剤である。 基質 使用される基質は、好ましくはAP-パープルである。代わりに、例えばBM-パー プルも使用することができる。 洗浄溶液 使用される洗浄溶液は、好ましくは0.9％NaCl溶液＋1％TWEEN 20＋0.05％NaN₃ である。洗浄溶液は、好ましくはおよそ1：15に希釈する。 研究は、洗浄に関して、水道水を超音波槽で使用することができることを示し ている。洗浄は、蛇口の下(1分間)で行うこともできる。 Allergodipの実行については、例えば超音波槽、目盛り付き試験管、Allergod ipホルダー、試験管スタンド、使い捨てピペット及びカラーチャートのような種 々 の器具が必要である。洗浄は、超音波槽の代わりに、蛇口の下で行うこともでき る。 ピペッティングした血清と試薬の量を特定するためには、目盛り付きの試験管 (1.5ml)が好適に用いられる。 試験管は、好ましくはプラスティック又はプレクシガラススタンドに置くべき である。 Allergodipは、洗浄溶液で満たした超音波槽で洗浄することができる。しかし ながら、研究は、蛇口の下での洗浄も可能であることも示している。 洗浄溶液を満たした超音波槽内にアレルギーテストストリップを吊すために、 ホルダークランプの溝が内側にギザギザに刻まれるプレクシガラス板からなる、 特別なホルダーが必要である。ストリップホルダーは、蛇口の下で洗浄を行うた めにも使用されるべきである。 試験の終了後、アレルギーテストストラップを、それらを読みとることができ るようにするために、吸収紙で短時間で軽くたたいて乾燥しなければならない。 Allergodipは、1-又は2-dayテストに対応する色彩に調製したカラーチャート により行われる。カラーチャートは、クラス0-4にクラス分けすることを可能に する。 Arergodipは、1-又は2-dayテストとして提供される。 結果の記録については、患者チャートが好ましくは使用される。このチャート は、とりわけ、アレルゲンの組み合わせを示し、それぞれのテストストリップに ついて個々に彩色される。 さらに本発明は、ヒト及び獣医薬領域でのインビトロアレルギー診断のための テストストリップの使用に関する。特にストリップテストは、吸入アレルゲン、 食品アレルゲン、交差反応性アレルゲン又は地中海性アレルゲンの同定のため及 びそれらに関連するアレルゲンの診断のために使用することができる。 使用することができる試験用紙は、そのようなテストについての使用に慣用の 全ての吸収マトリクスである。最も広く普及しているのは、濾紙の使用であるが 、他の吸収セルロース又はプラスティック製品を使用することもできる。吸収性 支持体、好ましくは濾紙は、塩素の同定に必要な試薬を含む含浸溶液に公知の方 法 で浸される。含浸し、乾燥した紙は、公知の方法で、例えばプラスティックフィ ルム、紙又は金属ストリップのような支持フィルム上に固定又はシールすること ができる四角形又は長方形の区分に切断することができる。接着表面は、例えば 10から20％のテスト紙表面の小部分に制限される。試験紙は、含浸前にストリッ プ形態でプラスティックテープに取り付けることもでき、そして含浸後にストリ ップ方向に対して垂直に、扱いやすいストリップに切断することができる。 以下の例は、より詳細に本発明を説明するために示すものであり、本発明を制 限するものではない。例1 テストストリップ(Allergodip)の製造のための、BrCN活性化濾紙へのアレルゲン の結合 全てのデータは、サイズ16×26cm=416cm²のBrCN濾紙へのアレルゲンの結合及 び10μg/mlのアレルゲン希釈溶液の処方されたタンパク量に関する。 便宜上、１個の金属ディッシュで１枚のBrCN濾紙シートのみをインキュベート することとする。 アレルゲンの結合については、１回の操作で６枚のアレルゲンシートの調製が 実施できることが証明されている。 タンパク含有溶液での泡の形成は、タンパクの制御不能な変性を導く。従って 、激しい振盪又は撹拌による泡の形成は避けるべきである。BrCN活性化濾紙シー トとのアレルゲン溶液のインキュベーションにより(調製については、PA 6.02.0 3を参照されたい)、アレルゲンは共有結合の形成により固着される。 それぞれのアレルゲンの結合については、アレルゲン結合溶液115mlが、イン キュベーションディッシュに添加される。ディッシュは、シートがアレルゲン結 合溶液で完全に覆われるようにして、振盪される。 インキュベーション：IKAシェーカー、スピード:45rpm、4℃、オーバーナイト 。 次いで、以下の洗浄を行う： タンパク同定のためのアレルゲン溶液5-10mlを除去する。 できるだけ完全にアレルゲン溶液をデカンテーション又は吸引する。 洗浄溶液NO.1： 1×120ml、4℃で10分間、IKAシェーカーで振盪する。 1×120ml、4℃で３時間、IKAシェーカーで振盪する。 洗浄溶液NO.2： 3×120ml、それぞれ4℃で10分間、IKAシェーカーで振盪する。 洗浄溶液NO.3： 2×120ml、それぞれ4℃で10分間、IKAシェーカーで振盪する。 再切断するまでインキュベーションバッファーで紙のシートを保存する。 この工程で泡を形成してはならない。 保存については、テストシート又はストリップを凍結乾燥する。 アレルゲン結合後に、直接的に凍結乾燥することが不可能な場合には、アレル ゲンシートを、フィルムチューブ内に気密状態及びバッファーなしで、個々に密 封し、速やかに-20℃に保存する。シート又はストリップを、バッファーなしで 、個々にGTディッシュ内で凍結乾燥する。１回の操作で８枚のアレルゲンシート を乾燥することができる。オーバーナイトでの凍結乾燥で十分である。 凍結乾燥後、アレルゲンシートを個々に、速やかに密封し、そしてラベルをし なければならない。-20℃で保存する。例2 患者の血清で1-dayテストを行う。 試薬及びAllergodipをテストで使用する前に、これらを室温にしなければなら ない。使用前に、数回注意深く叩くことにより基質を混合する。検査前に、基質 インキュベーションのために37℃の実行温度を得るため、インキュベーターのス イッチを入れる。 患者の血清を、リングマーカーまで試験管中にピペッティングする。Allergod ip、テストストリップを血清中に入れる。全てのアレルゲンパッドが液体中にな ければならない。 インキュベーションを、室温で30分間行う。使用される基質は、AP-パープル である。 Allergodipを血清から取り出し、そして洗浄バッファーで満たした超音波槽内 にホルダーにより吊す。 - 全てのアレルゲンパッドが洗浄バッファーで覆われていなければならない。 - ５分間、超音波槽で洗浄する。 - スティックを取り出し、そして濾紙で簡単に軽く叩いて乾燥する。 結合剤をリングマーカーまで第二の試験管にピペッティングする。使用される 結合剤は、AP-抗-IgE結合剤である。Allergodipを結合剤中に入れ、そして室温 で２時間インキュベートする。 洗浄を、前出と同一の洗浄バッファーを使用して超音波槽で５分間行う。 Allergodipを取り出し、そして濾紙で簡単に軽く叩いて乾燥する。次に基質を第 三の試験管中にリングマーカーまでピペッティングし、そしてAllergodipを基質 中に入れる。インキュベーションを、インキュベーターで37℃で３時間行う。そ してテストストリップAllergodipをチューブから取り出し、濾紙で叩いて乾燥し 、そして呈色反応を読みとる。 結果をカラーチャート(1-dayテストークラス0-4)で比較することにより評価す る。 Allergodipを書類に貼りつけることができる。テストストリップの呈色複合体 は、室温で少なくとも１年間は安定である。例3 患者の血清で2-dayテストを行う。 試薬及びAllergodipをテストで使用する前に、これらを室温にしなければなら ない。使用前に、数回注意深く叩くことにより基質を混合する。 患者の血清を、リングマーカーまで試験管中にピペッティングする。Allergod ipを血清中に入れる。全てのアレルゲンパッドが液体中になければならない。 インキュベーションを、室温で３時間行う。Allergodipを血清から取り出し、 そして洗浄バッファーで満たした超音波槽内に固定クランプを使用するか、ホル ダーにより吊す。全てのアレルゲンパッドが洗浄バッファーで覆われていなけれ ばならない。そして２分間、超音波槽で洗浄する。スティックを取り出し、そし て濾紙で簡単に軽く叩いて乾燥する。 次いで、結合剤AP-抗-IgEをリングマーカーまで第二の試験管にピペッティン グする。テストストリップを結合剤中に入れる。インキュベーションを室温で18 時間行う。 そしてテストストリップを取り出し、洗浄バッファー(0.9％ NaCl、1％ Tween 20、0.5％ NaN₃、水)にて超音波槽内で２分間洗浄する。 次いでテストストリップを取り出し、濾紙で叩いて乾燥する。基質AP-パープ ルIgEをさらなる試験管にピペッティングし、そしてテストストリップを室温で9 0分間インキュベートする。 最後に、Allergodipテストストリップを取り出し、濾紙で軽く叩いて乾燥し、 そして呈色反応を読みとり、評価する。 結果をAllergodipカラーチャートで比較することにより評価する。 Allergodipを患者チャートの書類に貼りつける。例4 全血でのテスト テストは、1-dayテストのテスト方法と同様に行う。全ての時間隔は保持され る。血清テストに対するいかなる差異も観察することはできなかった。呈色反応 は、はっきりしていて明確であり、血清テストのものに対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィービヒ，ヘルムート ドイツ連邦共和国 デー―21493 シュヴ ァルツェンベック、ベッケルヴェーク 10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 特異的IgEのインビトロアレルギー診断のためのストリップテストであって 、テストが、全血及び血清の両方で行うことができることを特徴とする、前記テ スト。 2. それぞれのスティックが、ポジティブコントロール、ネガティブコントロー ル及び少なくとも９つのアレルゲンで、コートされていることを特徴とする、請 求項１に記載のストリップテスト。 3. 吸入アレルゲン、食品アレルゲン、交差反応性アレルゲン及び地中海性(Med iterranean)アレルゲンの検出のための完結したテストであることを特徴とする 、請求項１に記載のストリップテスト。 4. テストシステム(キット)の形態であることを特徴とする、請求項1〜3のいず れかに記載のストリップテスト。 5. 10アレルゲン塗布スティック、結合剤、基質、視覚的評価のためのカラーコ ードを有する患者カラーチャート及び実行のための説明書を含む、請求項４に記 載のストリップテストシステム。 6. 全血又は血清中の特異的IgEの検出のための方法であって、少なくとも以下 の工程； 1. 試験管への血清又は全血のピペッティング； 2. テストストリップ(Allergodip^TM)とのインキュベーション； 3. 流水下での洗浄； 4. 短時間の乾燥； 5. 結合剤とのAllergodip^TMのインキュベーション； 6. 洗浄； 7. 短時間の乾燥； 8. 基質とのAllergodip^TMのインキュベーション； 9. 吸収紙での短時間の乾燥； 10. 発色したストリップテストの取り出し； 11. カラーチャートとの照合、又は照合及び患者/カラーチャートの組み合わ せによる記録； を逐次行うことを特徴とする、前記方法。 7. ヒト医学及び獣医学領域でのインビトロアレルギー診断のための、ストリッ プテストの使用。 8. 吸入アレルゲン、食品アレルゲン、交差反応性アレルゲン又は地中海性アレ ルゲンの検出のためのインビトロアレルギー診断のための、ストリップテストの 使用。