DE19526675A1 - Teststreifenanalyse zur Erfassung von autoallergen menschlichen Pathologien - Google Patents

Teststreifenanalyse zur Erfassung von autoallergen menschlichen Pathologien

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Description

Einleitung (Abkürzungen folgen den Empfehlungen von IUPAC-IUB-Kurzbezeichnungen für Ganglioside entsprechen den von Wiegandt vorgeschlagenen²⁰, die Svennerholm's sind hier in Klammern beigefügt. Gtet1 (GM1). II³-NeuAc-Gg₄Cer; Gtet2a (GD1a). IV³NeuAc-, II³NeuAc-Gg₄Cer. Gtet2b (GD1b), II³(NeuAc)₂-Gg₄Cer: Gtet4b (GQ1b). IV³(NeuAc)₂-,II³(NeuAc)₂-Gg₄Cer. MAG. mylein-assoziiertes Glykoprotein. POD. Peroxydase. SGPG. IV³(SO₃--GlcAβ)-nLn₄Cer.)
Forschungsergebnisse der letzten 10 bis 12 Jahre haben gezeigt, daß eine Reihe verschiedener auf menschlichen Nerven vorkommender Kohlenhydrat-Immunepitope als autoallergene Antigen-Kandidaten bei humanen peripheren Neuropathien involviert sind (für Übersicht, siehe ¹). Im Jahre 1980 beschrieb Latov & al. ¹⁰ einen Patienten mit schwerer demyelinisierender Neuropathie und hohem Titer an monoklonalem IgM kappa, das mit peripherem Nerv reagierte. Immunsuppressive Therapie war begleitet von klinischer Besserung. Es konnte später gezeigt werden, daß das betreffende IgM spezifisch an myelin-assoziiertes Protein (MAG) und an sulphatiertes Glukuronylparaglobosid (SGPG) band ¹¹. Dabei ist MAG und SGPG ein auf GlcAβ3Gal < befindliches Kohlenhydratepitop gemeinsam 4,13,16. Ein identisches Epitop kommt auf sauren Insekten-Glykosphingolipiden, Arthrosiden vor ¹⁹. Etwa die Hälfte aller mit monoklonaler IgM-Gammopathie einhergehender Neuropathien zeigen Antikörper, die an MAG oder SGPG binden (für Übersicht, siehe ⁵). In den folgenden Jahren haben dann eine Reihe von Untersuchungen an Motorneuropathien gezeigt, daß einige der Patienten - unter diesen Fälle mit den Anzeichen klassischer amyotropher Lateralsklerose²² - hohe mono- oder polyklonale Antikörpertiter aufwiesen, die gegen Ganglioside gerichtet waren (Gtet12.17; Gtet2a3,8,9,15,26; Gtet2b12,18; Gtet4b21,24). Bei einigen Motorneuronerkrankungen kommen hochtitrige Antikörper vor, die mehrere Ganglioside erkennen, nämlich solche, denen bestimmte Kohlenhydratepitope gemeinsam sind6,23,25,26. Die Tatsachen, daß gegen Ganglioside gerichtete Antikörper zum einen an Nervenzellen binden, zum anderen in vitro Zelltod hervorrufen14,22, und darüber hinaus eine immunsuppressive Therapie benefizient ist, macht ihren Zusammenhang mit der Aitiologie der in Frage stehenden Neuropathien deutlich.
Für die Diagnose der mit Gammopathien einhergehenden Neuropathien ist die Bestimmung der gegen die entsprechenden Epitope gerichteten Antikörper entscheidend. Dies geschieht im allgemeinen mittels ELISA. Eine Einschritt-Methode zur Charakterisierung IgM-reaktiver Immunglobuline benutzt hochauflösende Agarose-Elektrophorese für die Trennung der Immunglobuline. Transfer auf mit Glykolipiden beschichtete Nitrozellulose- Folien, und Sichtbarmachung mit enzymgekuppelten anti-Immunglobulin Antikörpern⁷. Da alle diese Verfahren vergleichsweise recht aufwendig sind, besteht ein dringender Bedarf für einen schnellen halbquantitativen Test, mit dem ohne weitere Hilfsmittel, am Schreibtisch, zusätzliche Information zur Diagnose in Frage kommender Krankheiten zu erhalten ist. Aus diesem Grund haben wir den hier zur Anmeldung für ein Patent vorgelegten Teststreifen- Ansatz entwickelt.
Verfahrensbeschreibung Der Test
Mit dem von uns erfundenen und ausgearbeiteten Verfahren (im folgenden kurz "PIG- stictest" [pathological immunoglubilin stick test] bezeichnet) ist es möglich ohne Anwendung weiteren Instrumentars, außer einer Routine-Pipette, innerhalb von zwei Stunden, die Gegenwart anomal erhöhter Antikörpertiter gegen die hier in Frage stehenden wesentlichen Oligosaccharid-Epitope nachzuweisen. Die verwendeten Trägersubstanzen der Antigen- Epitope sind SGPG (wahlwese Arthrosid oder MAG), Gtet1, Getet2a und Gtet2b (eventuell zusätzlich Gtet4b). Die Teststreifen bestehen aus mit Polyisobutylmethacrylat stabilisiertem Kieselgel beschichteter Plastikfolie, auf die an 5 Stellen Glykolipide (SGPG, 2×; Gtet1, 1×; Gtet2a; 1×; Gtet2b, 1×) punktförmig aufgetragen sind. Während die Ganglioside in jeweils nur einer Konzentration appliziert sind, ist SGPG zweimal, aber in verschiedener Menge aufgegeben. Da alle Menschen geringe Titer mit dem SGPG-Epitop reagierender Antikörper im Serum aufweisen, wurde hier einmal eine vergleichsweise größere Menge als "interne" Positivkontrolle, ein andermal eine nur mit pathologisch hohen Titern reagierende geringere, aufgetragen.
Der PIG-stictest wird zur Analyse von 10 Serumproben konfektioniert (siehe Abb. 1). Seine Haltbarkeit erstreckt sich auf mindestens ein halbes Jahr bei trockner Lagerung bei 4- 6°C. Ein dem Pig-stictest vergleichbarer Test ist uns nicht bekannt.
Analysendurchführung
Zur Durchführung des PIG-stictests werden die Streifen 10 Min. in Röhrchen 1 (Blockierungsmedium; siehe Abb. 1) vorinkubiert. Sodann werden im gleichen Röhrchen direkt 20 µl des zu analysierenden Serums zugegeben, und nach 30minütiger Inkubation der Teststreifen (siehe Abb. 1) dreimal mit 2 ml Lösung 5 je ca. 1 Min. in Röhrchen 2 gewaschen. Nach weiterer Inkubation in Röhrchen 3 (anti-human Ig Antikörper; siehe Abb. 1) werden die Teststreifen wiederum in Röhrchen 2 dreimal mit 2 ml Lösung 5 je 1 Min. gewaschen. Anschließend werden die Streifen in Röhrchen 2, das man mit 2.9 ml Chromogen- Lösung (2 ml Lösung 5, 80 µl Chromogen, 10 µl H₂O₂) für maximal 5 Min. angefärbt. Durch Eingeben der Streifen in Wasser kann die Farbreaktion stark angehalten werden.
Literaturangaben
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2. Baba. H., Daune, G. C., Ilyas, A. A., et al. Anti-G M1 ganglioside antibodies with differing fine specificities in patients with multifocal motor neuropathy. Journal of Neuroimmunology 25 (1989) 143-150.
3. Bollensen, E. Schipper, H. I. and Steck, A. J. Motor neurophathy with activity of monoclonal IgM antibody to GD1a ganglioside. J. Neurol. 236 (1989) 353-355.
4. Chou, D. K. H., Ilyas, A. A., Evans, J. E., Costello, C., Quarles, R. H. and Jungalwala, F. B. Structure of sulphated glucuronyl glycolipids in the nervous system reacting with HNK-1 antibody and some IgM paraproteins in neuropathy. J. Biol. Chem. 61 (1986) 11717-11725.
5. Gosselin. S., Kyle, R. A. and Dyck, P. J. Neuropathy associated with monoclonal gammopathies of undertermined significance. Ann. Neurol. 30 (1991) 54-61.
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17. Sadiq, S. A., Thomas, F. P., Kilidireas, K., et al. The spectrum of neurologic disease associated with anti-GM1 antibodies. Neurology 40 (1990) 1967-1972.
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24. Yuki, N., Sato. S., Tsuji, S., Hozumi, I. and Miyatake, T. An immunologic abnormality common to Bickerstaff's brain stem encephalitis and Fisher's syndrome. J. Neurol. Sci. 118 (1993) 83-87.
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Claims (3)

1. Herstellung und Anwendung von Teststreifen mit multiplem Auftrag von Oligosaccharidepitop- Trägern zur immunologischen Erfassung und Charakterisierung anomal hoher Antikörpertiter im Körperflüssigkeiten. Oligosaccharidepitopträger sind: SGPG (wahlweise MAG oder Arthrosid), Gtet1, Gtet2a, Gtet2b, Gtet4b.
2. Bei den unter 1. genannten Teststreifen, die Anwendung einer internen Positivkontrolle in Form einer vergleichsweise größeren Auftragsmenge von SGPG oder einem heterophilen Antigen, e. g. Arthropentaosylceramid oder Forssman-Glykolipid, welche mit allen menschlichen Seren unter den gegebenen Bedingungen Farbbildung erfolgen läßt.
3. Die Anbietung des Tests unter Anwendung gefriergetrockneter Reagentien:
Röhrchen 1, Rinderserumalbumin/Phosphatpuffer/Natriumchlorid;
Röhrchen 3, Rinderserumalbumin/Phosphatpuffer/Natriumchlorid/POD-markierte anti-human Immunglobulin Antikörper.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE19721151A1 (de) * 1997-05-21 1998-11-26 Merck Patent Gmbh Streifentest zur in-vitro-Allergiediagnostik
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