WO1990007712A1 - Antigen, assoziiert mit degenerativen erscheinungen des zentralen nervensystems (zns), dagegen gerichtete antikörper sowie verfahren zur diagnose von dysfunktionen des zns - Google Patents

Antigen, assoziiert mit degenerativen erscheinungen des zentralen nervensystems (zns), dagegen gerichtete antikörper sowie verfahren zur diagnose von dysfunktionen des zns Download PDF

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WO1990007712A1
WO1990007712A1 PCT/EP1989/001585 EP8901585W WO9007712A1 WO 1990007712 A1 WO1990007712 A1 WO 1990007712A1 EP 8901585 W EP8901585 W EP 8901585W WO 9007712 A1 WO9007712 A1 WO 9007712A1
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WO
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antibody
heparan sulfate
antigen
sulfate proteoglycan
cns
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PCT/EP1989/001585
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Herbert Stadler
Ulrich Fritsche
Original Assignee
Bissendorf Peptide Gmbh
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to an anti-gene which is associated with degenerative phenomena of the central nervous system (CNS) and belongs to the class of heparan sulfate proteoglycans and comes from brain nerve endings, antibodies directed against it and a method for diagnosing dysfunction. of the CNS.
  • CNS central nervous system
  • the causes of degenerative diseases of the central nervous system are not known, so that the causal development of a diagnostic agent is not possible.
  • the morphological symptoms associated with the progression of the degeneration of the CNS are mostly well known (Alzheimer's disease, Trisomy 21, Jakob-Kreuzfeld syndrome and others).
  • the object on which the invention is based is to provide a diagnostic method with the aid of which it is possible to diagnose degenerative diseases early. diagnose early and safely. Another object is to provide a simple, optionally automatable method for carrying out series tests using conventional analysis methods, in particular immunological methods. For this it is necessary to find an antigen which is clearly correlated with the respective disease. Furthermore, an antibody directed against this antigen must be produced, which indicates the anti-gene correlated with the disease.
  • David Schubert et al. describe in Science 241, pp. 223 to 226 a heparan sulfate proteoglycan core protein from cells of the nerve cell line PC12 with a molecular weight of approximately 200,000 daltons. The authors also describe a striking sequence analogy of this proteoglycan with the human amyloid beta protein precursor molecule.
  • the heparan sulfate proteoglycan according to the invention originates from cranial nerve endings and has a molecular weight of 400,000 to 1,000,000.
  • Proteolytic Fragments of the heparan sulfate proteoglycan according to the invention have a molecular weight of 50,000 to 200,000.
  • the invention is Heparansulfatpro- teoglycan membrane-bound, while the correspond • sponding fragments especially in the physiological 'milieu of the body fluid may be soluble.
  • Another feature of the heparan sulfate proteoglycan according to the invention is its immunological reaction with antibodies of the mAb-SG antibody cell line (ECACC 88 122 108).
  • the heparan sulfate protoglycan according to the invention can be obtained by obtaining vesicles from cranial nerve ends which have previously been enriched from brain substance and are separated by gel chromatography at fractions, such fractions with a molecular weight of more than 300,000 being collected. Pig brain was homogenized to isolate the heparan sulfate proteoglycan.
  • the homogenate was centrifuged at low speed, preferably 3,000 rpm for a few minutes, preferably 10 minutes.
  • the supernatant was collected and subjected to centrifugation at a higher speed, preferably 12,000 rpm for a longer time than in the previous step, preferably 1 hour.
  • the sediment from this centrifugation step was collected and subjected to density gradient centrifugation.
  • a discontinuous density gradient was preferably used.
  • a discontinuous density gradient from three zones with 0.32 M sucrose followed by 0.8 M sucrose and 1.2 M sucrose is particularly preferred.
  • the mixture is centrifuged at a higher speed, preferably 21,000 rpm for a few hours, preferably 2 hours, the zones are collected between 0.8 and 1.2 M sucrose, diluted, in a suitable buffer, preferably 0.16 M sodium chloride, and centrifuged preferably again at 12,000 RPM for an hour.
  • the sediment is subjected to an otic shock by rehomogenization in the water. Repeated centrifugation, preferably at 12,000 rpm for a period of one hour, provides a supernatant which, after separation from the sediment, is centrifuged again preferably at 35,000 rpm for at least 8 hours.
  • the sediment obtained afterwards contains the required vesicle fraction in sufficient purity.
  • FIG. 1 shows a processing scheme for the extraction of the vesicles.
  • the synaptic vesicles from porcine brain obtained as described above were dissolved in sodium dodecyl sulfate and chromatographed with the aid of gel filtration, preferably on acrylamide / agarose as a separation matrix.
  • the fraction eluting in the exclusion volume of the column, containing glycosaminoglycan, was collected and continued to be used.
  • the glycosaminoglycan was determined according to Barthold et al. (Anal.
  • Figure 2a shows a typical chromatogram of the glycosaminoglycan distribution.
  • Figure 2b shows that the protein-containing main fraction does not elute in the exclusion volume V.
  • the fraction purified in this way is used to obtain antibodies according to the Köhler and Milstein method.
  • the cells generated in mouse are preferably fused with the mouse myeloma cell PAI (see
  • heparan sulfate proteoglycan there are also other clones which are directed against epitopes of the heparan sulfate proteoglycan according to the invention.
  • Particularly preferred antibody populations show no cross-reaction with glycosaminoglycan side chains of the heparan sulfate proteoglycan or heparan sulfate and / or purified heparan sulfate proteoglycans from Engelbert-Holm-Swarm Sarcoma cells.
  • the antibodies of the mAb-SG cell line were classified as belonging to the IgM class.
  • an antigen can be detected in the rat brain, which is referred to as "synaptoglycan" (see Figures 3 and 4).
  • This antigen is water-soluble.
  • the anti-gene (SG) reacting with the antibody can also be detected in membrane-bound form in the rat brain. It is very likely that the membrane-bound form originates from synaptic vesicle membranes.
  • Figure 5 illustrates how the antigen can appear on the outside of the nerve membrane.
  • the antigen is bound to the inner membrane. If the axonal nerve cell membrane fuses with the vesicles at the synaptic end of the cell, the inside of the vesicle forms part of the outside of the membrane after fusion.
  • the antigen was also detected in the brain homogenates of primates, mammals, such as rats and pigs, and other vertebrates, such as chicken, using immunoblotting technology. As a control, liver and kidney cell homogenates of the rat were examined for an immunological reaction with the antibody according to the invention. There was no positive reaction.
  • An immunological reaction of the antibody according to the invention could also be found in cell cultures of PC12 (pheochromocytoma cells) and neuronal cell cultures of the optical tectus of the chicken (see Figure 6).
  • the suitability of the antibody according to the invention for use in the method according to the invention for diagnosing dysfunctions of the central nervous system, caused by degenerative states of the central nervous system results from the surprising finding that the antibody according to the invention contains antigens from body fluid, how cerebrospinal fluid and serum react immunologically in patients with corresponding symptoms of CNS disorders.
  • the antibody-antigen complex was identified in thin sections of the brain of an Alzheimer's patient taken from po ⁇ t mortem by staining the extracellular plaques, especially in the periphery of the deposits.
  • the antigen can be detected in dilute CSF.
  • the result is a characteristic band pattern of usually 4 bands from 200,000 daltons to 50,000 daltons.
  • the band pattern varies in intensity and composition very strong depending on the patient ( Figure 7).
  • These bands are degeneration products of the native antigen. Deviations in intensity and pattern were obtained in particular in the case of disorders of the blood brain barrier, brain tumors, senile dementia, in particular of the Alzheimer type and in Parkinsonism.
  • the age of the patient tends to increase the CSF antigen in older people.
  • the antigen SG is also present in human serum, but in a considerably lower concentration than in the cerebrospinal fluid.
  • the diagnostic test can preferably be carried out in quantitative form by means of a “dot assay”.
  • material containing antigen is spotted on nitrocellulose filter.
  • the nitrocellulose can be saturated with concentrated protein-containing solution, preferably fetal 10% calf serum, 0.5% albumin, 0.05% milk powder.
  • radioactively labeled antibodies Bolton and Hunter method. After the unbound radioactive labeled antibody has been washed out, the radioactivity bound to nitrocellulose is counted in the gamma counter. Calibration curves show a linearity of the test of antigen in the nanogram range up to 10 ⁇ m antigen. The quantitative evaluation of samples is used in these measuring ranges.
  • the diagnostic method according to the invention is suitable for the detection of degenerative symptoms of the CNS.
  • degenerative symptoms of the CNS In particular, Alzheimer's dementia, brain tumors, blood-brain barrier disorders, trisomy 21, Jakob-Creutzfeld syndrome and others can be diagnosed.
  • an enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
  • the antibody according to the invention is thus outstandingly suitable as a diagnostic agent for performing the method for diagnosing dysfunctions of the CNS.
  • Pig brain was homogenized.
  • the homogenate was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes.
  • the supernatant was collected and subjected to centrifugation at 12,000 rpm for 1 h.
  • the sediment of this centrifugation step was collected and subjected to a density gradient centrifugation in a discontinuous density gradient.
  • the discontinuous density gradient consisted of three zones, 0.32 M sucrose followed by 0.8 M sucrose and 1.2 M sucrose.
  • the mixture was centrifuged at 21,000 rpm for 2 h, the zones were collected between 0.8 and 1.2 M sucrose, diluted in 0.16 M sodium chloride and centrifuged again at 12,000 rpm for 1 h.
  • the sediment was subjected to osmotic shock by rehomogenization in water. Another centrifugation at 12,000 rpm for a period of 1 h provided a supernatant which was centrifuged again at 35,000 rpm overnight after separation from the sediment. The sediment obtained afterwards contained the required vesicle fraction in sufficient purity.
  • the synaptic vesicles obtained in this way were dissolved in sodium dodec sulfate and chromatographed on acrylamide / agarose on an AcA-34 column. The fraction eluting in the exclusion volume of the column was collected and processed further.
  • the glycosaminoglycan determination was carried out according to Barthold et al. Anal. Biochem. 150, 320-324 (1985). The results of these chromatographic purification steps are shown in Figure 2 a, b.
  • the clones obtained after the fusion with the hybridoma technology were tested by means of dot blot, immunoblot and immunocytochemistry on thin sections of rat brain.
  • the material used for the immunization was used as the antigen.
  • the fusion produced 300 clones, about 100 of which were positive in the dot blot and these were checked by immunocytochemistry on the rat spinal cord and on the cholinergic electrical organ of Torpedo marmorata and 10 clones were selected as suitable. The further screening was carried out by Im unblotting. Finally, a clone was selected and subcloned twice by singulation. Dilutions 1: 5 and 1:10 were used.
  • the resulting clone showed the results originally obtained after the second subcloning.
  • the antibody class was determined as IgM (Biorad dot blot assay to determine the immunoglobulin class).
  • This onoclonal antibody is referred to below as mAb-SG, the underlying antigen as Synapoglycan (SG).
  • Buffer homogenized. After centrifugation for 2 hours at 100,000 g, a supernatant is obtained which is mixed 1: 1 with saturated ammonium sulfate solution. After one hour at centrifugation at 20,000 g (4 ⁇ C) for one hour and the precipitate dissolved in PBS and chromatographed on Sephacryl S-300 (Pharmacia, column dimensions 100 x 1.5 cm) in PBS (chromatogram see Figure 3). Peak I (absorption 280 nm) is collected and further purified on an ion exchange column (DEAE-Sephacryl, Pharmacia, 20 x 1 cm).
  • the material After the material has been applied to the column, it is washed with 10 column volumes of PBS and eluted with a gradient of PBS and PBS in 1.2 M sodium chloride.
  • the antigen elutes at about 0.5 M sodium chloride and is detected using mAb-SG according to the immunoblot technique.
  • the fractions containing SG are over 90% pure.
  • SG is treated with nitrous acid. This technique is specific to heparan sulfate-type proteoglycans.
  • SG is a heparan sulfate proteoglycan, broken down with nitrous acid. ( ⁇ 6 N hydrochloric acid for 24 hours at 105 C) in the hydrolyzate of gerei ⁇ nigtem SG Glucosa is detected in. Likewise, glucuronic acid type sugars are detected in SG. These are sugars characteristic of HSPG (heparan sulfate proteoglycan). SG is not digested by glycosidases that attack O-glycosidically bound sugars.
  • the apparent molar mass of SG results from SDS polyacrylamide gel electrophoresis and from gel chromatography at approximately 300,000 to 1,000,000 Daltons.
  • SG fulfills the characteristics of a heparan sulfate proteoglycan.
  • the epitope of the anti-SG antibody (mAb-SG) • is at least partially associated with the carbohydrate portion.
  • SG is found in human, rat, pig and chicken brain homogenates.
  • the antigen is not directly detectable in liver and kidney homogenates, so it either does not exist or is present in comparatively small concentrations.
  • SG can be detected in supernatants and in cells from pheochromocytoma cells (PC 12) and in neuron cultures from the optical tectum of the chicken.
  • a dot assay was carried out for the quantitative determination of SG in the serum and in the cerebrospinal fluid and other tissue fluids and tissues.
  • Material containing antigen is spotted on nitrocellulose paper, the nitrocellulose is then saturated with concentrated protein-containing solution (10% fetal calf serum, 0.5% albumin, 0.05% milk powder) and then with
  • the antibody mAb-SG shows staining of the extracellular plaques, especially in the periphery of the deposits, in thin sections of post-mortem brains from Alzheimer's patients.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Diagnose von Dysfunktionen des zentralen Nervensystems mittels eines Antigenantikörperkomplexes beschrieben. Das Diagnoseverfahren benutzt als Diagnostikum einen Antikörper gegen ein Heparansulfatproteoglycan aus Hirnnervenenden mit einem Molekulargewicht von 400.000 bis 1.000.000 und dessen proteolytische Fragmente, vorzugsweise Antikörper aus der Zellinie mAb-SG, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, England unter der Nummer 88 122 108. Die zur Untersuchung zu verwendende Probe stammt dabei aus Liquor oder Serum. Das diagnostische Verfahren eignet sich zur Diagnose von Alzheimer's Demenz, Gehirntumoren, allgemeinen Bluthirnschrankenstörungen, Trisomie 21 sowie Jakob-Creutzfeld-Syndrom und anderen degenerativen Erscheinungen des zentralen Nervensystems.

Description

Antigen, assoziiert mit degenerativen Erscheinungen des zentralen Nervensystems (ZNS) . dagegen gerichtete Antikörper sowie Verfahren zur Diagnose von Dvsfunk- tionen des ZNS
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Anti¬ gen, das mit degenerativen Erscheinungen des zentra¬ len Nervensystems (ZNS) assoziiert ist und zur Klasse der Heparansulfatproteoglycane gehört und aus Hirn- nervenendungen stammt, dagegen gerichteten Antikör¬ pern sowie ein Verfahren zur Diagnose von Dysfunktio- nen des ZNS.
In den letzten Jahren ist im zunehmenden Maße deut¬ lich geworden, daß viele neurologische Degenerations- erscheinungnen, die früher als altersbedingt hinge¬ nommen worden sind, tatsächlich als Erkrankungen aufzufassen sind. So wurde beispielsweise noch Anfang des 19. Jahrhundert die Anschauung vertreten, daß hohes Alter geradezu zwangsläufig zur Demenz führen würde. M.Allard, J.L. Signoret und D.Stalleicken beschreiben so zum Beispiel in der Monographie "Alz¬ heimer Demenz", Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, daß sich die Einstel¬ lung zu der Altersdemenz allmählich änderte, nachdem anatomisch-pathologische Untersuchungen zeigten, daß das Gehirngewebe älterer Menschen mit DemenzSymptomen ebenfalls die charakteristischen Zeichen der Alzhei¬ mer Krankheit aufwiesen und daß sogar bei asymptoma¬ tischen älteren Patienten diese histologischen Verän¬ derungen nachweisbar sind. Diese histologischen Ver¬ änderungen, beispielsweise neuritische Plagues (seni¬ le Drusen) sowie Alzheimer-Fibrillenveränderungen korrelieren mit dem Ausmaß der Demenz. Trotz aller Fortschritte in der Neurologie beruht die Diagnose dieses auf degenerativen Erscheinungen des zentralen Nervensystem beruhenden Krankheitsbildes, lediglich ' -
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auf einer Ausschlußdiagnose (siehe Seite 4 der oben genannten Monographie) . Die Autoren fordern eine ge¬ naue und frühzeitige Diagnose, hier im speziellen der Alzheimer'sehen Demenz, insbesondere da diese Erkrankung aufgrund der sich positiv verändernden Lebenserwartung in Zukunft sich noch stärker in den Brennpunkt des klinischen Interesses schieben wird (siehe Seite 61 der oben angegebenen Monographie) .
Die Ursachen degenerativer Erkrankungen des zentralen Nervensystems sind nicht bekannt, so daß die kausale Entwicklung eines Diagnostikums nicht möglich ist. Die morphologischen Erscheinungen im Zuge der Progre- dienz der Degeneration des ZNS sind hingegen meist gut bekannt (Morbus Alzheimer, Trisomie 21, Jakob- Kreuzfeld-Syndrom und andere) .
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es, ein Diagnoseverfahren bereitzustellen, mit dessen Hil¬ fe es möglich wird, degenerative Erkrankungen früh- . zeitig und sicher zu diagnostizieren. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines einfachen, gege¬ benenfalls automatisierbaren Verfahrens zur Durch- führung von Reihenversuchen unter Anwendung konventi¬ oneller Analysenmethoden, insbesondere immunologischer Methoden. Dazu ist es erforderlich ein Antigen zu finden, welches mit der jeweiligen Erkrankung ein¬ deutig korreliert ist. Desweiteren muß ein gegen dieses Antigen gerichteter Antikörper hergestellt werden, der das mit der Erkrankung korrelierte Anti¬ gen anzeigt.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß ein Heparan- sulfatproteoglycan aus Hirnnervenenden mit einem Molekulargewicht von 400.000 bis 1.000.000 (400 bis 1.000 KD) und dessen proteolytische Fragmente indi- kativ für degenerative Zustände des ZNS sind. David Schubert et al. beschreiben in Science 241, pp. 223 bis 226 ein Heparansulfatproteoglycankernprotein aus Zellen der Nervenzellinie PC12 mit einem Molekularge¬ wicht von etwa 200.000 Dalton. Die Autoren beschrei¬ ben weiterhin eine auffällige Sequenzanalogie dieses Proteoglycans mit dem menschlichen Amyloid Betapro¬ teinvorläufermolekül.
Selkoe et al. beschreiben in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85; PP 7341 bis 7345, 1988 ein Betaamyloidvor- läuferprotein der Alzheimer'sehen Krankheit mit einem Molekulargewicht von 110.000 bis 135.000 Dalton als Membran assoziiertes Protein in Nerven und Nichtner- vengeweben. Die Identifizierung dieses Vorlauferpro¬ teins geschah immunologisch durch Reaktion mit Anti¬ körpern, die gegen synthetische Peptide aus der Se¬ quenz des Betaamyloid precursor protein, dessen Ami- noεäuresequenz bekannt war, gerichtet war.
Paulεson, Mats et al. beschreiben in J. Mol. Biol. 1987, 297-313, ein Heparansulfatproteoglycan mit einem Molekulargewicht von ungefähr 500.000. Aller¬ dings stammt dieses Heparansulfatproteoglycan auε Basismembranen von Mäusetumoren. Es werden dort eben- falls strukturelle Merkmale dieses Heparansulfat- proteoglycans beschrieben. Aufgrund vergleichender Untersuchungen mit anderen Formen von Basismembran- Heparansulfatproteoglycanen folgern die Autoren, daß Heparansulfatproteoglycane aus Basismembranen auf- grund ihrer genetischen Unterschiedlichkeit nicht von gemeinsamen Vorläufern abstammen.
Das erfindungsgemäße Heparansulfatproteoglycan stammt jedoch aus Hirnnervenendungen und hat ein Molekular¬ gewicht von 400.000 bis 1.000.000. Proteolytische Fragmente des erfindungsgemäßen Heparansulfatproteo- glycans weisen ein Molekulargewicht von 50.000 bis 200.000 auf. Das erfindungsgemäße Heparansulfatpro- teoglycan ist membranständig, während die entspre- • chenden Fragmente insbesondere im physiologischen' Milieu der Körperflüssigkeit löslich sein können. Ein weiteres Merkmal des Heparansulfatproteoglycans gemäß der Erfindung ist seine immunologische Reaktion mit Antikörpern der Antikörperzellinie mAb-SG (ECACC 88 122 108) . Das erfindungsgemäße Heparansulfatpro¬ teoglycan ist erhältlich durch Gewinnung von Vesikeln aus Hirnnervenenden, die zuvor aus Hirnsubstanz an¬ gereichert worden sind und gelchro atographisch in Fraktionen getrennt werden, wobei solche Fraktionen mit einem Molekulargewicht über 300.000 gesammelt werden. Zur Isolierung des Heparansulfatproteoglycans wurde Schweinehirn homogenisiert.
Das Homogenat wurde bei niedriger Drehzahl, vorzugs¬ weise 3.000 UPM für einige Minuten, vorzugsweise 10 Minuten, zentrifugiert. Der überstand wurde gesammelt und einer Zentrifugation bei höherer Drehzahl, vor¬ zugsweise 12.000 UPM für längere Zeit als im vorher- gehenden Schritt, vorzugsweise 1 Stunde, unterworfen. Das Sediment dieses Zentrifugationsschrittes wurde gesammelt und einer Dichtegradienten-Zentrifugation unterworfen. Vorzugsweise wurde ein diskontinuierli¬ cher Dichtegradient verwendet. Besonders bevorzugt ist ein diskontinuierlicher Dichtegradient aus drei Zonen mit 0,32 M Saccharose gefolgt von 0,8 M Saccha¬ rose und 1,2 M Saccharose. Man zentrifugiert bei hö¬ herer Drehzahl, vorzugsweise 21.000 UPM für einige Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, sammelt die Zonen zwischen 0,8 und 1,2 M Saccharose, verdünnt, in geeig¬ netem Puffer, vorzugsweise 0,16 M Natriumchlorid und zentrifugiert ein weiteres Mal vorzugsweise bei 12.000 UPM für eine Stunde. Das Sediment wird einem os otischen Schock ausgesetzt durch Rehomogenisierung im Wasser. Erneute Zentrifugation, vorzugsweise bei 12.000 UPM für die Dauer von eine Stunde liefert einen überstand, welcher nach Trennung vom Sediment nochmals vorzugsweise bei 35.000 UPM mindestens 8 Stunden lang zentrifugiert wird. Das danach erhaltene Sediment enthält in hinreichender Reinheit die benö- tigte Vesikelfraktion. Die Figur 1 zeigt ein Aufar¬ beitungsschema zur Gewinnung der Vesikel.
Die wie oben beschrieben gewonnenen synaptischen Ve¬ sikel aus Schweinehirn wurden in Natriu -Dodecylsul- fat gelöst und mit Hilfe der Gelfiltration, vorzugs¬ weise an Acrylamid/Agarose als Trennmatrix chromato- graphiert. Die im Ausschlußvolumen der Säule eluieren- de Fraktion, enthaltend Glycosaminoglycan, wurde ge¬ sammelt und weiterhin verwendet. Die Glycosaminogly- canbestimmung erfolgte nach Barthold et al. (Anal.
Biochem. 150, 320 - 324 (1985). Ein typisches Chroma- togramm der Glycosaminoglycanverteilung zeigt die Abbildung 2a. Abbildung 2b zeigt, daß die proteinhal- tige Hauptfraktion nicht im Ausschlußvolumen V. elu- iert.
Die so gereinigte Fraktion wird zur Gewinnung von An¬ tikörpern gemäß der Methode von Köhler und Milstein verwendet. Vorzugsweise werden die in Maus erzeugten Zellen mit der Mausmyelomazelle PAI fusioniert (siehe
Research Disclosure, Mai 1982, pp 155 bis 157, Referat 21713). Zum Screening geeigneter Klone kann in vorteilhafter Weise die Immunocytochemie am Rücken¬ mark der Ratte oder am elektrischen Organ des Zitter¬ rochens (Torpedo armorata) eingesetzt werden. Die Klonierung und Subklonierung führt dann zu einem be¬ sonders bevorzugten Klon, der als Hybridomazellinie unter der Bezeichnung mAb-SG unter der Nummer 88 122 108 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) , Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP 4 OJG, England hinterlegt worden ist. Die monoklonaren Antikörper des hinterlegten Klones mAb-SG sind gegen ein zuckerhaltiges Epitop ge- richtet. Neben diesem Klon sind auch andere Klone vorhanden, die gegen Epitope des erfindungsgemäßen Heparansulfatproteoglycans gerichtet sind. Besonders bevorzugte Antikörperpopulationen zeigen keine Kreuz- reaktion mit Glycosaminoglycanseitenketten des Hepa- ransulfatproteoglycans bzw. Heparansulfat und/oder gereinigten Heparansulfatproteoglycanen aus Engel- beth-Holm-Swarm Sarcomazellen. Die Antikörper der Zellinie mAb-SG wurden als zur IgM-Klasse zugehörig klassifiziert. Mit dem so gewonnenen erfindungsge- mäßen Antikörper läßt sich ein Antigen im Rattenhirn nachweisen, das als "Synaptoglycan" bezeichnet wird (siehe Abbildungen 3 und 4) . Dieses Antigen ist was¬ serlöslich. Das mit dem Antikörper reagierende Anti¬ gen (SG) läßt sich im Rattenhirn auch in membran- gebundener Form nachweisen. Es iεt sehr wahrschein¬ lich, daß die membrangebundene Form aus synaptischen Vesikelmembranen stammt.
Die Abbildung 5 veranschaulicht wie das Antigen an der Außenseite der Nervenmembran erscheinen kann. In den Vesikeln ist das Antigen an der inneren Membran gebunden. Verschmilzt nun die axonale Nervenzellmem¬ bran am synaptischen Ende der Zelle mit den Vesikeln, bildet die Vesikelinnenseite nach Verschmelzung einen Teil der Membranaußenseite. Das Antigen wurde mittels Immunoblotting-Technik auch im Gehirnhomogenaten von Primaten, Säugetieren, wie Ratte und Schwein, sowie anderen Wirbeltieren, wie Huhn, nachgewiesen. Zur Kontrolle wurden Leber¬ und Nierenzellenhomogenate der Ratte auf immunolo¬ gische Reaktion mit dem Antikörper gemäß der Erfin¬ dung untersucht. Dabei zeigte sich keine positive Reaktion.
Auch in Zellkulturen von PC12 (Phäöchromozytoma-Zel- len) sowie neuronalen Zellkulturen des optischen Tectu s des Huhns konnte eine immunologische Reaktion des erfindungsgemäßen Antikörpers gefunden werden (siehe Abbildung 6) .
Die Eignung des erfindungsgemäßen Antikörpers zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose von Dysfunktionen des zentralen Nervensystems, be- dingt durch degenerative Zustände des zentralen Ner¬ vensystems, ergibt sich aus dem überraschenden Be¬ fund, daß der erfindungsgemäße Antikörper mit Anti- genen aus Körperflüssigkeit, wie Liquor und Serum bei Patienten mit entsprechenden Symptomen der Er- krankungen des ZNS immunologisch reagiert. Außerdem wurde der Antikorper-Antigenkomplex bei Dünnschnitten von poεt mortem entnommenen Gehirnen eines Alzheimer's Patienten durch Einfärbung der extra¬ zellulären Plaques, insbesondere in der Peripherie der Ablagerungen, identifiziert.
Mit der Immunblot-Technik kann das Antigen in verdünn¬ tem Liquor nachgewiesen-werden. Es ergibt sich ein charakteristisches Bandenmuster von meist 4 Banden von 200.000 Dalton bis 50.000 Dalton. Das Bandenmu¬ ster variiert in der Intensität und Zusammensetzung je nach Patient sehr stark (Abbildung 7) . Diese Ban¬ den sind Degenerationsprodukte des nativen Antigens. Abweichungen in Intensität und Muster wurden insbe- sondere erhalten bei Bluthirnschrankenstörungen, Ge¬ hirntumoren, senilen Dementien, insbesondere des Alzheimer Typs und bei Parkinsonismus. Ebenso besteht hier nach Alter der Patienten die Tendenz zur Zunahme des Antigens im Liquor bei höherem Alter. Das Antigen SG ist auch in humanem Serum präsent, jedoch in erheb¬ lich geringerer Konzentration als im Liquor.
In bevorzugter Weise kann man den diagnostischen Test in quantitativer Form durchführen mittels "Dot assay". Dazu wird antigenhaltiges Material auf Nitro- cellulosefilter getüpfelt. Die Nitrocellulose kann mit konzentrierter proteinhaltiger Lösung, vorzugs¬ weise fötalem 10 % Kälberserum, 0,5 % Albumin, 0,05 % Milchpulver gesättigt werden. Danach inkubiert man mit radioaktiv markierten Antikörpern (Methode nach Bolton und Hunter) . Nach Auswaschen des nichtgebun¬ denen radioaktiv markierten Antikörpers, wird die an Nitrocellulose gebundene Radioaktivität im Gamma- Zähler ausgezählt. Aus Eichkurven ergibt sich eine Linearität des Tests von Antigen im Nanogramm-Bereich bis 10 μm Antigen. In diesen Meßbereichen wird bei der quantitativen Auswertung von Proben gearbeitet. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren ist zur Erken¬ nung degenerativer Erscheinungen des ZNS geeignet. Insbesondere lassen sich Alzheimer's Demenz, Gehirn¬ tumoren, Bluthirnschrankenstörungen, Trisomie 21, Jakob-Creutzfeld-Syndrom u. a. diagnostizieren. Als Nachweisverfahren läßt sich neben dem oben beschrie¬ benen Immunoblotting und Radioimmunoassay auch ein Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) durch¬ führen. Der erfindungsgemäße Antikörper ist also in hervorra¬ genderweise geeignet als Diagnostikum zur Durchfüh¬ rung des Verfahrens zur Diagnose von Dysfunktionen des ZNS zu dienen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1
Isolierung des Heparansulfatproteoglycan aus antigen- haltigen Vesikeln aus Schweinehirnnervenenden
Schweinehirn wurde homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 3.000 UPM 10 Minuten zentrifugiert. Der überstand wurde gesammelt und einer Zentrifugation bei 12.000 UPM für 1 h unterworfen. Das Sediment dieses Zentrifu- gationεschrittes wurde gesammelt und einer Dichte- gradienten-Zentrifugation in einem diskontinuierli¬ chen Dichtegradienten unterworfen. Der diskontinuier¬ liche Dichtegradient bestand aus drei Zonen, 0,32 M Saccharose gefolgt von 0,8 M Saccharose und 1,2 M Saccharose. Man zentrifugierte bei 21.000 UPM für 2 h, sammelte die Zonen zwischen 0,8 und 1,2 M Saccha¬ rose, verdünnte in 0,16 M Natriumchlorid und zentri¬ fugierte ein weiteres Mal bei 12.000 UPM für 1 h. Das Sediment wurde durch Rehomogenisierung in Wasser einem osmotischen Schock ausgesetzt. Erneute Zentri¬ fugation bei 12.000 UPM für die Dauer von 1 h liefer¬ te einen überstand, welcher nach Trennung vom Sedi¬ ment nochmals bei 35.000 UPM über Nacht zentrifugiert wurde. Das danach erhaltene Sediment enthielt in hinreichender Reinheit die benötigte Vesikelfraktion. Die so gewonnenen synaptischen Vesikel wurden in Na- trium-Dodec lsulfat gelöst und an Acrylamid/Agarose an einer AcA-34-Säule chro atographiert. Die im Aus--, schlußvolumen der Säule eluierende Fraktion wurde gesammelt und weiter bearbeitet. Die Glycosamino- glycanbestimmung erfolgte nach Barthold et al. Anal. Biochem. 150, 320 - 324 (1985) . Die Ergebnisse dieser chromatographischen Reinigungsschritte sind in Abbil- düng 2 a, b wiedergegeben.
Beispiel 2
Gewinnung monoklonaler Antikörper und Screening von Klonen
Die nach der Fusion mit der Hybridomatechnik erhalte¬ nen Klone wurden mittels Dot-Blot, Immunblot und Im¬ munocytochemie an Dünnschnitten von Rattenhirn gete- stet. Bei den immunochemischen Versuchen wurde als An¬ tigen das zum Immunisieren verwendete Material ein¬ gesetzt. Bei der Fusion entstanden 300 Klone, etwa 100 davon waren im Dotblot positiv und dieεe wurden durch Immunocytochemie am Rückenmark der Ratte und am cholinergen elektrischen Organ von Torpedo marmorata überprüft und 10 Klone als geeignet ausge¬ wählt. Das weitere Screening erfolgte durch Im un- blotting. Schließlich wurde ein Klon ausgewählt und durch Vereinzelung zwei Mal subkloniert. Es wurden Verdünnungen 1 : 5 und 1 : 10 verwendet. Der resul¬ tierende Klon zeigte nach der zweiten Subklonierung die ursprünglich erhaltenen Resultate. Die Antikörper¬ klasse wurde als IgM bestimmt (Biorad Dot-Blot Assay zur Bestimmung der Immunglobulinklasse) . Dieser ono- klonale Antikörper wird im weiteren als mAb-SG be¬ zeichnet, das zugrunde liegende Antigen als Synapto- glycan (SG) . Beispiel 3
Charakterisierung von Svnaptoglvcan, Isolierung aus Rattenhirn
6 Rattenhirne (frisch) werden in 20 Volumina 0,15 M
Natriumchlorid, 10 M Natriumphosphat pH 7,4 (PBS-
Puffer) homogenisiert. Daraus wird nach Zentrifuga- tion für 2 Stunden bei 100.000 g ein überstand erhal- ten, der mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung 1 : 1 gemischt wird. Nach einer Stunde bei wird bei 20.000 g (4βC) für eine Stunde zentrifugiert und der Niederschlag in PBS gelöst und auf Sephacryl S-300 (Pharmacia, Säulendimension 100 x 1,5 cm) in PBS chromatographiert (Chromatogramm siehe Abbildung 3) . Peak I (Absorption 280 nm) wird gesammelt und weiter auf einer Ionenaustauschersäule (DEAE-Sephacryl, Pharmacia, 20 x 1 cm) gereinigt. Nach Auftragung des Materials auf die Säule wird mit 10 Säulenvolumina PBS gewaschen und mit einem Gradienten aus PBS und PBS in 1,2 M Natriumchlorid eluiert. Das Antigen eluiert bei etwa 0,5 M Natriumchlorid und wird gemäß Immunoblot-Technik mit mAb-SG detektiert. Die SG-ent- haltenden Fraktionen besitzen über 90 % Reinheit.
Chemische, enzymatische und physikalische Charakteri¬ sierung
SG wird mit salpetriger Säure behandelt. Diese Tech- nik ist spezifisch für Proteoglycane des Heparansul- fattyps. SG ist ein Heparansulfatproteoglycan, gemäß Abbau mit salpetriger Säure. Im Hydrolysat von gerei¬ nigtem SG (6 N Salzsäure 24 Stunden bei 105βC) wird Glucosa in nachgewiesen. Ebenso werden in SG Zucker vom Glucuronsäuretyp nachgewiesen. Diese Zucker sind charakteristisch für HSPG (Heparansulfatproteo¬ glycan) . SG wird von Glykosidasen, die O-glykosidisch gebundene Zucker angreifen, nicht verdaut. Die schein¬ bare molare Masse von SG ergibt sich aus der SDS Polyacrylamidgelelektrophorese und aus Gelchromato¬ graphie zu ungefähr 300.000 bis 1.000.000 Dalton. SG erfüllt die Charakteristika eines Heparansulfatproteo¬ glycans. Das Epitop des Anti-SG Antikörpers (mAb-SG) • ist mit dem Carbohydratanteil, zumindest teilweise, assoziiert.
Beispiel 4
Präsenz von SG in verschiedenen Geweben und Gewebs- flύssigkeiten
Immunblot-Technik mit mAb-SG
SG findet sich in Gehirnhomogenaten von Mensch, Ratte, Schwein und Huhn. In Leber- und Nierenhomogenaten ist das Antigen direkt nicht nachweisbar, iεt daher entweder nicht oder in vergleichsweise kleinen Kon¬ zentrationen vorhanden. SG ist in überständen sowie in Zellen von Phäochromozytomazellen (PC 12) sowie in Neuronen-Kulturen vom optischen Tektum des Huhns nachweisbar.
Immunocytochemie mit mAb-SG
Im Rattenhirn wird eine synapsenspezifische Färbung erhalten. Es werden jedoch nicht alle Synapsen ange¬ färbt. In Zellkulturen von PC 12-Zellen und Huhn op¬ tischen Tektum (Abbildung 6) werden Zellkörper und Neuriten angefärbt. Humanes Serum und Liquor:
Mit der Immunblot-Technik wird in 1 : 1 verdünntem Liquor deutliche Reaktion erhalten. Es ergibt sich ein charakteristisches Bandenmuster von 4 Banden von 200.000 bis 50.000 Dalton, das in Intensität und Zu¬ sammensetzung je nach Patient stark von einander ab¬ weicht (siehe Abbildung 7) . Diese Banden sind Dege¬ nerationsprodukte des nativen SG. Abweichungen in Intensität und Muster wurden insbesondere erhalten bei Blut-Hirnschrankenstörungen, Gehirntumoren, se¬ nilen Dementien insbesondere des Alzheimertyps und bei Parkinsonismus. Ebenso besteht je nach Lebens¬ alter der Patienten die Tendenz zur Zunahme des SG- Antigens im Liquor bei höherem Alter. SG ist auch in humanem Serum präsent, jedoch in erheblich geringerer Konzentration als im Liquor.
Beispiel 5
Quantitativer immunchemischer Test für SG mit mAb-SG
Zur quantitativen Bestimmung von SG im Serum und im Liquor und anderen Gewebsflüssigkeiten und Geweben wurde ein Dot-Assay durchgeführt. Antigenhaltiges Material wird auf Nitrocellulosepapier getüpfelt, die Nitrocellulose dann mit konzentrierter protein- haltiger Lösung (10 % fötales Kälberserum, 0,5 % Albumin, 0,05 % Milchpulver) gesättigt und dann mit
125J markiertem mAb-SG (Methode nach Bolton und
Hunter) inkubiert. Nach auswaschen des nicht gebunde¬ nen radioaktiven markierten mAb-SG wird die an Nitro¬ cellulose gebundene Radioaktivität im Gamma-Zähler ausgewertet. Aus Eichkurven ergibt sich eine Lineari- tät des Tests im Bereich von einem Nanogramm SG bis 10 μg des Antigens. Beispiel 6
Der Antikörper mAb-SG zeigt bei Dünnschnitten von post mortem Gehirnen von Alzheimer Patienten Anfär- bung der extrazellulären Plaques, insbesondere in der Peripherie der Ablagerungen.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Heparansulfatproteoglycan aus Hirnnervenendungen mit einem Molekulargewicht von 400.000 bis 1.000.000 (400 bis 1.000 KD) und dessen proteo- lytische Fragmente.
2. Heparansulfatproteoglycan nach Anspruch 1, da¬ durch gekennzeichnet, daß das proteolytische Fragment ein Molekulargewicht von 50.000 bis
200.000 (50 bis 200 KD) aufweist.
3. Heparansulfatproteoglycan nach Anspruch 1, da¬ durch gekennzeichnet, daß es membranständig ist.
4. Heparansulfatproteoglycanfragment nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es im physiologischen Milieu der Körperflüssigkeiten löslich iεt.
5. Heparansulfatproteoglycan nach Anspruch 1, da¬ durch gekennzeichnet, daß es immunologisch mit dem Antikörper aus der Antikörperzellinie C 98 unter Bildung eines Antigen/Antikörperkomplexes reagiert.
6. Heparansulfatproteoglycan gemäß einem der Ansprü¬ che 1 bis 5 erhältlich durch Gewinnung von Vesi¬ keln aus Hirnnervenenden, die zuvor aus Hirnsub- stanz angereichert worden sind und gelchromato- graphisch in Fraktionen getrennt werden, wobei solche Fraktionen mit einem Molekulargewicht über 300.000 (300 KD) gesammelt werden.
7. Antikörper gegen ein aus einer Hirnnervenenden¬ fraktion stammendem Antigen mit einem Molekular¬ gewicht von über 300.000 (300 KD) .
8. Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich¬ net, daß er gegen ein Heparansulfatproteoglycan aus einer Hirnnervenendung gemäß einem der An¬ sprüche 1 bis 6 gerichtet ist.
5
9. Antikörper nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein carbo- hydrathaltiges Epitop des Heparansulfatproteo¬ glycan nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gerich- 0 tet ist.
10. Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich¬ net, daß er nicht gegen die Glycosaminglycan- Seitenketten des Heparansulfatproteoglycan ge- 5 richtet ist und keine Kreuzreaktion mit Heparan- sulfat und/oder gereinigtem Heparansulfatproteo¬ glycan aus Engelbeth-Holm-Swarm Sarcomazellen zeigt.
o 1« Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich¬ net, daß er aus der Hybridoma-Zellinie mAb-SG (ECACC 88 122 108) stammt.
12. Antikörper nach einem der Ansprüche 7 bis 11 er- 5 hältlich durch Immunisierung eines geeigneten
Tieres mit Fraktionen aus Hirnnervenenden mit einem Molekulargewicht von über 300.000 (300
KD) .
0 13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich¬ net, daß das Tier mit einem Heparansulfatproteo¬ glycan nach einen der Ansprüche 1 bis 6 immuni¬ siert wird.
14. Antikörper nach einem der Ansprüche 7 biε 13, dadurch gekennzeichnet, daß er zur IgM Klasεe gehört.
15. Verfahren zur Diagnose von Dysfunktionen des ZNS mittels eines Antigen/Antikörperkomplexes, da- durch gekennzeichnet, daß
a) eine aus Liquor oder Serum stammende Probe mit
b) dem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 inkubiert und
c) der sich bildende Antigen/Antikörperkomplex durch ein an sich bekanntes Nachweisverfahren erfaßt wird, wodurch die Dysfunktion positiv diagnostiziert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15 zur Diagnose degenera¬ tiver Erscheinungen des ZNS.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16 zur Diagnose von Alzheimer's Disease, Gehirntumoren, Blut- Hirnschrankenstörungen, Trisomie 21 (Down Syn- drome) , Jakob-Creutzfeld-Syndrom.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Detektion des Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mittels Immunoblotting, Radio- immunoassay (RIA) , Enzyme Linked Immunosorbent- Assay (ELISA) durchgeführt wird.
19. Diagnostikum zur Durchführung des . Verfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 18, im wesentli¬ chen bestehend aus dem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14.
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