EP1019730A1 - STREIFENTEST ZUR $i(IN-VITRO)-ALLERGIEDIAGNOSTIK - Google Patents

STREIFENTEST ZUR $i(IN-VITRO)-ALLERGIEDIAGNOSTIK

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Publication number
EP1019730A1
EP1019730A1 EP98928264A EP98928264A EP1019730A1 EP 1019730 A1 EP1019730 A1 EP 1019730A1 EP 98928264 A EP98928264 A EP 98928264A EP 98928264 A EP98928264 A EP 98928264A EP 1019730 A1 EP1019730 A1 EP 1019730A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
test
allergens
strip
allergodip
allergen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP98928264A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rüdiger WAHL
Oliver Cromwell
Helmut Fiebig
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1019730A1 publication Critical patent/EP1019730A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the invention relates to a strip test for in vitro allergy diagnostics
  • IgE immunoglobulin E
  • In-vitro allergy diagnostics are becoming increasingly important in addition to in-vivo allergy diagnostics, which include, for example, skin, prick, intracutaneous and provocation tests, since the allergen spectrum is constantly increasing and in-vivo testing in many cases due to side effects is not feasible for the patient.
  • IgE immunoglobulin E
  • IgE immunoglobulin E
  • the invention relates to a strip test for in-vitro diagnosis for the assessment of specific IgE, characterized in that the test can be carried out both with whole blood and with serum.
  • the invention further relates to a strip test for in-vitro diagnosis for the assessment of specific IgE in sera and / or whole blood, characterized in that each stick is coated with a positive, a negative control and at least nine different allergens.
  • the strip test is used to assess specific IgE in whole blood or sera from allergy sufferers and can also be used in the veterinary area in addition to the human area.
  • the evaluation is preferably carried out visually by comparison with a color card.
  • the coloring of the allergen pads on the respective test strips is compared with a given color scale.
  • the color intensity is the indicator for the findings of the allergy diagnosis.
  • a typical strip test preferably includes 9 allergens, a negative and a positive control.
  • a complete test preferably contains different allergy test strips from different areas. These include, for example, grasses / cereals / herbs (G / G / K), animals / feathers / mites (T / F / M), trees (B), mushrooms (P), food (NM), screening (S) [Phadiatop ].
  • allergen spectrum is listed in the table below.
  • allergens of a special kind such as those found in roasted coffee, certain woods, latex etc.
  • Tree pollen grasses / cereals / herbs (G / G / K)
  • a commercial test of the present invention includes, for example
  • Inhalation allergen test strips Food allergen test strips Cross-reactivity allergen test strips and Mediterranean allergen test strips.
  • Allergodip TM The test strips according to the invention are referred to as Allergodip TM.
  • the above-mentioned exemplary composition of such an Allergodip test system in relation to the allergens to be tested can look as follows:
  • test system Other typical components of the test system are also patient color cards, test glass tubes with markings, test stands, conjugate, substrate, disposable pipettes and a regulation for performing and evaluating the test.
  • the conjugate is preferably AP-anti-IgE
  • the substrate is preferably AP-purple IgE or BM-purple IgE.
  • the test is preferably carried out at room temperature.
  • the test can also be carried out in the form of a 1-day and a 2-day test.
  • the main difference between the two tests is the duration of incubation with conjugate and substrate.
  • the test can also be performed with whole blood or with serum made from whole blood.
  • the individual test strips are preferably produced by bromine cyan activation, as is also known from allergen pane testing.
  • BrCN-activated sheets of paper are used to make the Allergodip.
  • the BrCN activation of the paper sheets was based on the allergen disk activation, whereby quantities and volumes were significantly reduced.
  • Cellulose paper is activated with BrCN.
  • the allergens are covalently coupled to the activated papers.
  • One allergen is coupled for each BrCN activated paper sheet (A4).
  • 4 mm wide strips are cut and glued onto a plastic strip (A4).
  • the plastic strips are e.g. 9 different allergens, a positive and a negative control glued.
  • the A4 plastic strip is cut into 4 mm wide plastic strips (Allergodips) that are approx. 7 cm long.
  • the allergen test strips are preferably produced in such a way that strips 4 mm wide are cut from the allergen-linked sheets. These strips are glued to each other on a polystyrene plate, approx. 30 cm long and 8 cm wide, using an adhesive tape on both sides. The different allergen strips are glued on top of each other and pressed on firmly. The polystyrene plates so glued with allergen strips are now added overnight using a specially developed press (using a torque wrench)
  • Allergodip strips
  • the strips are stored in tubes with 10-piece drying plugs, labeled and stored at -20 ° C. They are stable for at least 2 years under these conditions.
  • the polystyrene plate is also color-coded at the top to indicate which stripes are involved, e.g. trees. Every Allergodip has a different color.
  • Another object of the invention is a method for the detection of specific IgE in whole blood or sera, which is characterized in that at least the following steps are carried out in succession:
  • test can be carried out in the form of a 1-day or 2-day test:
  • the Allergodip is incubated in a 6.5 mm x 7 cm test tube with the serum for 30 minutes at room temperature. The strip is then washed in an ultrasonic bath for 2 minutes.
  • the strip is incubated with AP-Anti-IgE for 2 hours at room temperature.
  • the strip is then washed in an ultrasonic bath for 2 minutes.
  • the strip is incubated with substrate for 1.5 hours at room temperature.
  • the strip is dried with filter paper and the color reaction is assessed against a color card (possibly a densitometer).
  • the Allergodip is placed in a test tube containing the serum for 3 hours
  • the Allergodip is incubated with AP-Anti-IgE overnight at room temperature.
  • the strip is incubated with substrate for 1.5 hours at room temperature.
  • the strip is dried with filter paper and the color reaction is assessed against a color card (possibly a densitometer).
  • the 1-day test is divided into 3 allergen classes and the overnight test is divided into 4 classes.
  • Conjugate AP-Anti-IgE conjugate is used as conjugate.
  • AP-purple is used as the substrate.
  • BM purple can be used. Washing solution
  • a 0.9% NaCl solution is preferably used as the washing solution + 1% TWEEN 20 + 0.05% NaN 3 .
  • the washing solution is preferably diluted accordingly as a 1:15 concentrate.
  • Allergodip e.g. an ultrasonic bath, calibrated test tube, holder for Allergodip, stand for the test tube, disposable pipettes and a color card.
  • Ultrasonic bath washing can be replaced by washing under the tap.
  • Calibrated test tube tubes (1.5 ml) are preferably used to specify how much serum + reagents have to be pipetted.
  • the tubes should be placed in plastic or plexiglass stands.
  • the Allergodip can be washed in an ultrasonic bath, which is filled with the washing solution.
  • studies have shown that washing under the tap is also possible.
  • a special holder consisting of a plexiglass pane into which grooves for the holder clamps are milled.
  • a holder for the strips should also be used for washing under the tap.
  • the Allergodip is evaluated using a color card that is adapted to the colors that correspond to the 1 or 2-day test.
  • the color card enables a classification from class 0 - 4.
  • the Allergodip is offered as a 1 and 2 day test.
  • a patient card is preferably used to document the results.
  • the card gives the allergen composition again and is color coded individually for each test strip.
  • the invention furthermore relates to the use of the strip test for in vitro allergy diagnosis in the human and veterinary field.
  • the strip test can be used to detect inhalation allergens, food allergens, cross-reactivity allergens or Mediterranean allergens and to diagnose the associated allergies.
  • absorbent matrices that are usually used for such tests can be used as reagent papers.
  • the use of filter paper is the most common, but other absorbent cellulose or plastic products can also be used.
  • the absorbent carriers, preferably filter paper, are impregnated in a manner known per se with impregnation solutions which contain the reagents necessary for the determination of chlorine.
  • the soaked and dried papers can be processed into square or rectangular zones, which in turn are applied in a known manner to the carrier film, e.g. Plastic films, paper or metal strips can be glued or sealed.
  • the adhesive area is limited to a fraction of the reagent paper area, e.g. to 10 to 20%.
  • the reagent papers can also be coated in strips before being impregnated
  • Foam formation in protein-containing solutions leads to uncontrollable denaturation of proteins. Foaming by vigorous shaking or stirring should therefore be avoided.
  • allergens are immobilized by forming a covalent bond.
  • allergen coupling solution 115 ml of allergen coupling solution are placed in an incubation dish. The bowl is moved so that the sheet is completely covered with allergen coupling solution.
  • test sheets or strips are freeze-dried for storage.
  • the allergen sheets are sealed individually, airtight and without buffer in a film tube and stored temporarily at -20 ° C.
  • the sheets or strips are freeze-dried without a buffer, individually in GT trays. 8 sheets of allergen can be dried in one pass. Freeze drying overnight is sufficient.
  • Patient serum is pipetted into the test glass tube up to the ring marker. Allergodip, the test strip, is placed in the serum. All allergen pads must be under liquid.
  • the conjugate is pipetted into a second test tube up to the ring marker.
  • the Allergodip is placed in the conjugate and added for 2 hours
  • the wash is carried out with the same wash buffer as before in an ultrasonic bath for 5 minutes.
  • the Allergodip is removed and dabbed briefly with filter paper, then the substrate is pipetted up to the ring marker in a third test tube and the Allergodip is placed in the substrate. Incubation takes place for 3 hours at 37 ° C in the incubator.
  • the Allergodip test strip is then removed from the tube, blotted with filter paper and the color reaction is read. The results are assessed by comparison with a color chart (1-day test - class 0 - 4).
  • Allergodip can be stuck on for documentation.
  • the color complex of the test strip is stable for at least one year at room temperature.
  • the patient serum is pipetted into the test glass tube up to the ring maker. Allergodip is placed in the serum. All allergen pads must be under liquid. The incubation is carried out for 3 hours at room temperature.
  • the Allergodip test strip is removed from the serum and hung in an ultrasonic bath filled with washing buffer using the fastening clip or a holder. All allergen pads must be covered with the wash buffer and washed in an ultrasonic bath for 2 minutes. Then the sticks are removed and dabbed briefly with filter paper.
  • the conjugate AP-A-IgE to ring marker is then pipetted into a second test tube and the test strip is placed in the conjugate. The incubation takes place over a period of 18 hours at room temperature.
  • test strip is removed and with a washing buffer
  • test strip (0.9% NaCl, 1% Tween 20, 0.5% NaN 3 , water) washed in an ultrasonic bath for 2 minutes. The test strip is then removed and blotted with filter paper. The AP-purple IgE substrate is then pipetted into another test tube and the test strip is incubated for 90 minutes at room temperature.
  • Allergodip test strip is removed, dried with filter paper and the color reaction is read and evaluated. The results are assessed by comparison with the Allergodip color chart. The Allergodip is stuck in the patient card for documentation.
  • the test is carried out in the same way as the 1-day test. All time intervals are retained. There were no differences in the serum test. The color reaction was clear and distinct and corresponded to that of the serum test.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Streifentest zur in-vitro Allergiediagnose und ein Verfahren zum Nachweis von spezifischem IgE in Vollblut oder Seren sowie die Verwendung des Streifentests zum Nachweis von Inhalations-, Nahrungsmittel-, Kreuzreaktivitäts- und Mediterranallergenen.

Description

Streifentest zur in-vitro-Allergiediagnostik
Die Erfindung betrifft einen Streifentest zur in-vitro-Allergiediagnostik zur
Beurteilung von spezifischem Immunglobulin E (IgE) in Seren und Vollblut von Allergikern.
Man kennt verschiedene Methoden der in-vivo und in-vitro Allergiediag- nostik. Der in-vitro Allergiediagnostik kommt neben der in-vivo Allergiediagnostik, die beispielsweise Haut-, Prick-, Intracutan und Provokationstests umfaßt, eine immer größere Bedeutung zu, da das Allergenspektrum sich stets vergrößert und eine in-vivo Testung in vielen Fällen aufgrund von Nebenwirkungen für den Patienten nicht durchführbar ist.
Für zahlreiche neue Allergene stehen zudem vielfach keine kommerziellen Testlösungen zur Verfügung, da der Aufwand für die Extraktherstellung und somit auch für die Testlösungsherstellung häufig nicht im Verhältnis zur Patientenzahl steht, wenn es sich um seltene Allergien handelt. Zu nennen wären hier u.a. die Berufs-Allergene, wie sie z.B. in Hölzern,
Rohkaffee, Hygienegebrauchsartikeln wie z.B. Latexhandschuhen etc., vorkommen, die oft nur kleine Gruppen betreffen. Bei hochgradigen Allergikern kann es bei in-vivo Testungen mit neuen, noch nicht ausreichend charakterisierten Allergenlösungen zu unzumutbaren Nebenwir- kungen kommen, die das Wohlbefinden erheblich beeinträchtigen. Die in- vitro Diagnostik dagegen hat den Vorteil, daß sie für den Patienten völlig ungefährlich ist, da die Testung mit dem Serum des Patienten außerhalb des Organismus durchgeführt wird.
Im Rahmen der in-vitro Bestimmung von spezifischem IgE und Gesamt- IgE in Seren von Patienten spielt das spezifische IgE die entscheidende Rolle. IgE (Immunglobulin E) ist ein Eiweißstoff und aus serologischer Sicht hauptverantwortlich für das Krankheitsbild einer Allergie. Bekannt ist bisher die in-vitro Bestimmung von Allergien durch den Allergenscheiben-Test, der von Johansson, Wide und Bennick entwickelt wurde und in Lancet 2, 1105-1107 (1967) beschrieben ist. Dieses Verfahren stellt den heute am häufigsten benutzten Test dar. Es ist gleich- zeitig das erste Testsystem, um spezifisches IgE in Seren von Allergikern zu messen. Ähnliche Testsystem sind z.B. in EP 203 238 beschrieben.
Alle diese bekannten Tests können nur mit aus Vollblut hergestellten Seren durchgeführt werden und sind relativ unempfindlich, d.h. es sind 1-2 ml Serum zur aussagekräftigen Diagnose pro Test notwendig.
Ferner ist es für viele Patienten wichtig, daß eine in-vitro-Testung eine Vielzahl von Allergenen, wozu auch seltene Allergene, wie z.B. Latex gehören, abdeckt, um so eine genaue und zuverlässige Diagnose zuzulassen. Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Tests ist neben einem unzureichenden Allergenspektrum, welches diese Teste abdecken, eine aufwendige und langwierige Durchführung, die nicht von jedermann auf einfache Weise ausgeführt und insbesondere auch nicht ausgewertet werden kann. Zudem sollte ein solcher Test sowohl im human-medizini- sehen Bereich, als auch in der Veterinärmedizin zur Diagnose eingesetzt werden können und gleichermaßen mit Serum und Vollblut durchgeführt werden können, ohne daß hierbei das Ergebnis verfälscht wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen auf einfache Weise zu handhabenden Streifentest zur in-vitro-Allergiediagnostik zu entwickeln, der sowohl mit Serum als auch mit Vollblut durchgeführt werden kann und eine ausreichende Anzahl von Allergenen einschließt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Streifentest für die in-vitro Diagnose zur Beurteilung von spezifischem IgE dadurch gekennzeichnet, daß der Test sowohl mit Vollblut als auch mit Serum durchgeführt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Streifentest für die in-vitro Diagnose zur Beurteilung von spezifischem IgE in Seren und/oder Vollblut, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Stick mit jeweils einer Positiv-, einer Negativkontrolle und mindestens neun verschiedenen Allergenen beschichtet ist.
Der Streifentest dient zur Beurteilung von spezifischem IgE in Vollblut oder Seren von Allergikern und kann neben dem Humanbereich gleichermaßen auch im Veterinärbereich eingesetzt werden. Die Auswertung erfolgt vorzugsweise visuell durch Vergleich mit einer Farbkarte. Dabei werden die entstehenden Färbungen der Allergenpads auf dem jeweiligen Teststreifen mit einer vorgegebenen Farbskala verglichen. Die Farbintensität ist dabei der Indikator für den Befund der Allergiediagnose.
Ein typischer Streifentest umfaßt vorzugsweise 9 Allergene, eine Negativ- und eine Positivkontrolle. Ein Komplettest beinhaltet vorzugsweise unterschiedliche Allergieteststreifen aus verschiedenen Bereichen. Hierzu gehören beispielsweise Gräser/Getreide/Kräuter (G/G/K), Tiere/Federn/ Milben (T/F/M), Bäume (B), Pilze (P), Nahrungsmittel (NM), Screening (S) [Phadiatop].
Ein typisches Allergenspektrum ist in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet. Hinzu kommen zu diesen Standardallergenen noch Allergene spezieller Art, wie sie beispielsweise in Röstkaffee, bestimmten Hölzern, Latex etc. vorkommen.
Baumpollen (B) Gräser / Getreide / Kräuter (G/G/K)
Birke Beifuß
Eiche Gerste
Erle Glaskraut
Hasel 6-Gräser
Pappel Hafer
Platane Ragweed
Rotbuche Roggen
Ulme Wegerich
Weide Weizen
Neg. Kontrolle Neg. Kontrolle
Pos. Kontrolle Pos. Kontrolle
Ein handelsüblicher Test der vorliegenden Erfindung enthält beispielsweise
Inhalationsallergen-Teststreifen Nahrungsmittelallergen-Teststreifen Kreuzreaktivitätsallergen-Teststreifen sowie Mediterran-Allergenteststreifen.
Die erfindungsgemäßen Teststreifen werden als Allergodip™ bezeichnet. Die zuvor genannte beispielhafte Zusammensetzung eines solchen Allergodip-Testsystems in bezug auf die zu testenden Allergene kann folgendermaßen aussehen:
Die Code-Nummern wurden dem Allergenscheibenkatalog Stand Oktober 1993 entnommen:
* hier officinales
** muß noch von M-A genau festgelegt werden, ob Short, Gigant Ragweed etc.
Weitere typische Komponenten des Testsystems sind ferner Patienten- Farbkarten, Testglasröhrchen mit Markierung, Testständer, Konjugat, Substrat, Einmalpipetten und eine Vorschrift zur Durchführung und Auswertung des Tests. Das Konjugat ist vorzugsweise AP-Anti-lgE, das Substrat bevorzugt AP-purple IgE oder BM-purple IgE.
Der Test wird vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
Der Test kann ferner in Form eines 1 -Tages- und eines 2-Tagestests ausgeführt werden. Beide Tests unterscheiden sich hauptsächlich in der Zeitdauer der Inkubation mit Konjugat und Substrat. Ferner kann der Test mit Vollblut oder mit aus Vollblut hergestelltem Serum durchgeführt werden. Die einzelnen Teststreifen werden vorzugsweise durch Bromcyan- Aktivierung, wie sie auch von der Allergenscheibentestung her bekannt ist, hergestellt.
Zur Herstellung des Allergodip werden BrCN-aktivierte Papierbögen verwendet. Die BrCN-Aktivierung der Papierbögen erfolgte in Anlehnung an die Allergenscheibenaktivierung, wobei Mengen und Volumina deutlich reduziert wurden.
Cellulosepapier wird mit BrCN aktiviert. An die aktivierten Papiere werden die Allergene kovalent gekoppelt. Pro BrCN aktivierten Papierbogen (DIN A4) wird ein Allergen gekoppelt. 4 mm breite Streifen werden geschnitten und auf einen Plastikstreifen (DIN A4) geklebt. Auf den Plastikstreifen werden übereinander z.B. 9 unterschiedlichen Allergene, eine Positiv- und eine Negativkontrolle geklebt. Der DIN A4 Plastikstreifen wird in 4 mm breite Plastikstreifen (Allergodips), die ca. 7 cm lang sind, geschnitten.
Die Herstellung der Allergenteststreifen erfolgt vorzugsweise derart, daß aus den allergengekoppelten Bögen 4 mm breite Streifen geschnitten werden. Diese Streifen werden auf eine Polystyrolplatte, ca. 30 cm lang und 8 cm breit, mittels eines beidseitigen Klebebands übereinander geklebt. Die unterschiedlichen Allergenstreifen werden übereinander- geklebt und fest angedrückt. Die so vorliegenden mit Allergenstreifen beklebten Polystyrolplatten werden jetzt über Nacht mittels einer speziell entwickelten Presse (Verwendung eines Drehmomentschlüssels) bei
Raumtemperatur gepreßt. Nach der Pressung werden aus der Allergen- beklebten Polystyrolplatte mittels einer Schneidemaschine 4 mm breite Allergodip (Streifen) geschnitten. Die Streifen werden in Röhrchen mit Trockenstopfen ä 10 Stück gelagert, etikettiert und bei -20 °C gelagert. Sie sind unter diesen Bedingungen mindestens 2 Jahre stabil.
Zur Markierung, um welchen Streifen es sich handelt, z.B. Bäume, wird die Polystyrolplatte ebenfalls oben farblich markiert. Jeder Allergodip hat eine andere Farbe. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von spezifischem IgE in Vollblut oder Seren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens die folgenden Schritte nacheinander ausgeführt werden:
1. Pipettierung des Serums oder Vollblutes in ein Teströhrchen;
2. Inkubation mit dem Teststreifen (Allergodip™);
3. Waschen unter fließendem Wasser;
4. Kurzes Trocknen;
5. Allergodip™-lnkubation mit dem Konjugat;
6. Waschen;
7. Kurzes Trocknen;
8. Allergodip™-lnkubation mit dem Substrat;
9. Kurzes Trocknen mit Fließpapier;
10. Entnahme des entwickelten Teststreifens;
11. Abgleich gegen die Farbkarte oder Abgleich und Dokumentation mittels der kombinierten Patienten/Farbkarte.
Der Test kann in Form eines 1 -Tages- oder 2-Tages-Tests durchgeführt werden:
1 -Tages-Test
Der Allergodip wird in einem Teströhrchen 6,5 mm x 7 cm mit dem Serum 30 Min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Streifen wird dann 2 Min. im Ultraschallbad gewaschen.
Der Streifen wird mit AP-Anti-lgE 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Streifen wird dann 2 Min. im Ultraschallbad gewaschen.
Der Streifen wird mit Substrat 1 ,5 Std. bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Streifen wird mit Filterpapier getrocknet, und die Farbreaktion wird gegen eine Farbkarte (eventuell Densitometer) beurteilt.
-Tages-Test
Der Allergodip wird in ein Teströhrchen mit dem Serum 3 Std. bei
Raumtemperatur inkubiert.
Waschung analog dem 1 -Tages-Test.
Der Allergodip wird mit AP-Anti-lgE über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Waschung analog dem 1 -Tages-Test.
Der Streifen wird mit Substrat 1 ,5 Std. bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Streifen wird mit Filterpapier getrocknet, und die Farbreaktion wird gegen eine Farbkarte (eventuell Densitometer) beurteilt.
Über die Blaufärbung der Allergenpads wird durch Vergleich zu einer Farbkarte die Höhe des spez. IgE-Spiegels in dem Serum des Patienten bestimmt. Bei dem 1 -Tages-Test erfolgt eine Einteilung in 3 Allergen- klassen und bei dem Über-Nacht-Test in 4-Klassen.
Man benötigt neben den Teststreifen die folgenden weiteren Hilfsreagenzien:
Konjugat Als Konjugat wird AP-Anti-lgE-Konjugat verwendet.
Substrat
Als Substrat wird AP-purple eingesetzt. Alternativ kann beispielsweise BM- purple verwendet werden. Waschlösung
Als Waschlösung wird vorzugsweise eine 0,9%ige NaCI-Lösung eingesetzt + 1 % TWEEN 20 + 0,05 % NaN3. Die Waschlösung wird bevorzugt als 1 :15 Konzentrat entsprechend verdünnt.
Untersuchungen haben gezeigt, daß zur Waschung Leitungswasser im Ultraschallbad verwendet werden kann, auch kann eine Waschung unter dem Wasserhahn (1 Minute) erfolgen.
Zur Durchführung des Allergodip werden unterschiedliche Gerätschaften benötigt, wie z.B. ein Ultraschallbad, kalibrierte Reagenzglasröhrchen, Halterung für Allergodip, Ständer für die Reagenzglasröhrchen, Einmalpipetten und eine Farbkarte. Die Ultraschallbadwaschung kann durch Waschung unter dem Wasserhahn ersetzt werden.
Um vorzugeben, wieviel Serum + Reagenzien pipettiert werden müssen, werden vorzugsweise kalibrierte Reagenzglasröhrchen (1 ,5 ml) benutzt.
Die Röhrchen sollen zweckmäßigerweise in Kunststoff- oder Plexiglas- Ständer gestellt werden.
Die Waschung der Allergodip kann im Ultraschallbad erfolgen, das mit der Waschlösung befüllt wird. Untersuchungen ergaben jedoch, daß eine Waschung unter dem Wasserhahn ebenfalls möglich ist.
Um die Allergieteststreifen in das mit Waschlösung befüllte Ultraschallbad zu hängen, wird eine spezielle Halterung benötigt, bestehend aus einer Plexiglasscheibe, in die Nuten für die Halterungsklammem eingefräßt sind. Auch sollte eine Halterung der Streifen für das Waschen unter dem Wasserhahn benutzt werden.
Nach Testende müssen die Allergieteststreifen kurz mit Fließpapier abgetupft werden, um dann abgelesen werden zu können. Die Auswertung der Allergodip erfolgt über eine Farbkarte, die den Färbungen angepaßt ist, die dem 1- bzw. 2-Tages-Test entsprechen. Die Farbkarte ermöglicht eine Klassifizierung von Klasse 0 - 4.
Der Allergodip wird als 1- und 2-Tages-Test angeboten.
Zur Dokumentation der Ergebnisse wird vorzugsweise eine Patientenkarte verwendet. Die Karte gibt u.a. die Allergenzusammenstellung wieder und ist für jeden Teststreifen individuell farblich kodiert.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung des Streifentests zur in-vitro-Allegiediagnose im human- und veterinärmedizinischen Bereich. Insbesondere kann der Streifentest zum Nachweis von Inhalations- allergenen, Nahrungsmittelallergenen, Kreuzreaktivitätsallergenen oder Mediterranallergenen und zur Diagnose der damit verbundenen Allergien eingesetzt werden.
Als Reagenzpapiere können alle saugfähigen Matrizes verwendet werden, die üblicherweise für solche Tests im Gebrauch sind. Am weitesten ver- breitet ist die Verwendung von Filterpapier, jedoch können auch andere saugfähige Cellulose- oder Kunststoffprodukte eingesetzt werden. Die saugfähigen Träger, vorzugsweise Filterpapier, werden in an sich bekannter Weise mit Tränklösungen imprägniert, die die zur Bestimmung von Chlor notwendigen Reagenzien enthalten. Die getränkten und getrock- neten Papiere können zu quadratischen bzw. Rechteckigen Zonen verarbeitet werden die ihrerseits in bekannter Weise auf die Trägerfolie, z.B. Kunststoffolien, Papier- oder Metallstreifen aufgeklebt bzw. aufgesiegelt werden können. Die Klebefläche ist auf einen Bruchteil der Reagenzpapierfläche beschränkt, z.B. auf 10 bis 20 %. Die Reagenz- papiere können auch vor dem Imprägnieren in Streifenfom auf ein
Kunststoffband aufgebracht, und nach dem Imprägnieren senkrecht zur Streifenrichtung in handliche Stäbchen geschnitten werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung näher zu erläutern, diese aber keinesfalls zu beschränken. Beispiel 1
Allergenkopplung an BrCN-aktivierte Filterpapiere zur Herstellung der Teststreifen (Allergodip)
Alle Angaben beziehen sich auf eine Allergenkopplung an einen BrCN- Filterpapierbogen von der Große 16 x 26cm = 416 cm2 und einer Proteinvorgabe von 10 μg/ml Allergenverdünnungslösung.
In einer Metallschale kann nur ein BrCN-Filterpapierbogen inkubiert werden.
Für die Allergenkopplung hat sich die Herstellung von 6 Allergenblättern in einem Arbeitsgang als praktikabel erwiesen.
Eine Schaumbildung führt bei proteinhaltigen Lösungen zu unkontrollierbaren Denaturierungen von Proteinen. Schaumbildung durch heftiges Schütteln oder Rühren ist daher zu vermeiden.
Durch Inkubation einer Allergenlösung mit Bromcyan-aktivierten Filterpapierbogen (Herstellung siehe PA 6.02.03) werden Allergene durch Ausbildung einer kovalenten Bindung immobilisiert.
Zur Kopplung des jeweiligen Allergens werden 115 ml Allergenkopp- lungslösung in eine Inkubationsschale gegeben. Die Schale wird so bewegt, daß der Bogen vollständig mit Allergenkopplungslösung bedeckt ist.
Inkubation: IKA-Schüttler, Geschwindigkeit: 45Rot/min, 4 °C, über Nacht.
Nachfolgend werden folgende Waschungen durchgeführt:
5 - 10 ml Allergenlösung für die Proteinbestimmung entnehmen. Allergenlösung möglichst vollständig dekantieren bzw. absaugen. Waschlösung Nr. 1 :
1 x 120 ml, 10 Min. bei 4 °C auf dem IKA-Schüttler bewegen. 1 x 120 ml, 3 h bei 4 °C auf dem IKA-Schüttler bewegen.
Waschlösung Nr.2:
3 x 120 ml, je 10 Min. bei 4 °C auf dem IKA-Schüttler bewegen.
Waschlösung Nr. 3:
2 x 120 ml, je 10 Min. bei 4 °C auf dem IKA-Schüttler bewegen. Papierbögen bis zur Weiterverarbeitung unter Inkubationspuffer aufbewahren.
Es darf dabei kein Schaum entstehen.
Zur Aufbewahrung werden die Testbögen oder -streifen gefriergetrocknet.
Ist die Gefriertrocknung nicht direkt nach der Allergenkoppplung möglich, werden die Allergenbögen einzeln, luftdicht und ohne Puffer in Folienschlauch eingeschweißt und bei -20 °C zwischengelagert.
Gefriergetrocknet werden die Bögen oder Streifen ohne Puffer, einzeln in GT-Schalen. Es können 8 Allergenbögen in einem Durchgang getrocknet werden. Eine Gefriertrocknung über Nacht ist ausreichend.
Nach dem Gefrietrocknen müssen die Allergenbögen sofort einzeln eingeschweißt und etikettiert werden. Lagerung bei -20 °C. Beispiel 2
Durchführung des 1 -Tagestests mit Patientenserum.
Bevor die Reagenzien und Allergodip in dem Test eingesetzt werden, müssen diese auf Raumtemperatur gebracht werden.
Vor Gebrauch Substrat durch vorsichtiges mehrmaliges Kippen mischen. Vor dem Arbeiten Inkubator einschalten, um für die Substratinkubation die Arbeitstemperatur von 37 °C zu erreichen.
Patientenserum wird bis zum Ringmarker in die Testglasröhrchen pipettiert. Allergodip, der Teststreifen, wird in das Serum gestellt. Alle Allergenpads müssen unter Flüssigkeit stehen.
Die Inkubation erfolgt 30 Min. bei Raumtemperatur. Der Allergodip wird aus dem Serum entnommen und über die Halterung in ein mit Waschpuffer gefülltes Ultraschallbad gehängt.
- Alle Allergenpads müssen mit dem Waschpuffer bedeckt sein. 5 Min. im Ultraschallbad waschen. Sticks entnehmen und kurz mit Filterpapier abtupfen.
Das Konjugat wird bis zum Ringmarker in ein zweites Teströhrchen pipettiert. Der Allergodip wird in das Konjugat gestellt und 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert.
Die Waschung erfolgt mit dem gleichen Waschpuffer wie zuvor über 5 Min. ins Ultraschallbad. Der Allergodip wird entnommen und kurz mit Filterpapier abgetupft, anschließend wird das Substrat bis zum Ringmarker in ein drittes Teströhrchen pipettiert und der Allergodip in das Substrat gestellt. Die Inkubation erfolgt 3 Stunden bei 37 °C im Inkubator. Danach wird der Teststreifen Allergodip aus dem Röhrchen entnommen, mit Filterpapier abgetupft und die Farbreaktion abgelesen. Die Beurteilung der Ergebnisse erfolgt durch Vergleich mit Farbkarte (1 -Tagestest - Klasse 0 - 4).
Allergodip kann zur Dokumentation aufgeklebt werden. Der Farbkomplex des Teststreifens ist bei Raumtemperatur mindestens ein Jahr stabil.
Beispiel 3
Durchführung des 2-Tagestest mit Patientenserum
Bevor die Reagenzien und Allergodip in dem Test eingesetzt werden, müssen diese auf Raumtemperatur gebracht werden. Vor Gebrauch Substrat durch vorsichtiges mehrmaliges Kippen mischen.
Das Patientenserum wird bis zum Ringmaker in die Testglasröhrchen pipettiert. Allergodip wird in das Serum gestellt. Alle Allergenpads müssen unter Flüssigkeit stehen. Die Inkubation erfolgt 3 Std. bei Raumtemperatur. Der Teststreifen Allergodip wird aus dem Serum entnommen und mit der Befestigungsklammer bzw. über eine Halterung in ein mit Waschpuffer gefülltes Ultraschallbad gehängt. Alle Allergenpads müssen mit dem Waschpuffer bedeckt sein und werden 2 Min. im Ultraschallbad gewaschen. Anschließend werden die Sticks entnommen und kurz mit Filterpapier abgetupft.
Anschließend wird das Konjugat AP-A-lgE bis Ringmarker in ein zweites Teströhrchen pipettiert und der Teststreifen in das Konjugat gestellt. Die Inkubation erfolgt über eine Zeitdauer von 18 Stunden bei Raumtemperatur.
Danach wird der Teststreifen entnommen und mit einem Waschpuffer
(0,9 % NaCI, 1 % Tween 20, 0,5 % NaN3, Wasser) 2 Minuten im Ultraschallbad gewaschen. Der Teststreifen wird danach entnommen und mit Filterpapier abgetupft. Anschließend wird das Substrat AP-purple IgE in ein weiteres Teströhrchen pipettiert und der Teststreifen für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Schließlich wird der Allergodip-Teststreifen entnommen, Mit Filterpapier abgetrocknet und die Farbreaktion abgelesen und ausgewertet. Die Beurteilung der Ergebnisse erfolgt durch Vergleich gegen die Allergodip- Farbkarte. Der Allergodip wird zu Dokumentation in die Patientenkarte geklebt.
Beispiel 4
Testung mit Vollblut
Die Testung wird analog zu der Testdurchführung des 1 -Tages-Tests durchgeführt. Sämtliche Zeitintervalle werden beibehalten. Es konnten keine Unterschiede in bezug auf den Serumtest festgestellt werden. Die Farbreaktion war klar und deutlich und entsprach der des Serumtests.

Claims

- 17 -Patentansprüche
1. Streifentest für die in-vitro-Allergiediagnose von spezifischem IgE, dadurch gekennzeichnet, daß der Test sowohl mit Vollblut als auch mit Serum durchgeführt werden kann.
2. Streifentest nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß jeder Stick mit jeweils einer Positiv-, einer Negativkontrolle und mindestens 9 Allergenen beschichtet ist.
3. Streifentest nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß er jeweils ein Komplettest zum Nachweis von Inhalationsaliergenen, Nahrungsmittelallergenen, Kreuzreaktivitätsallergenen und Mediterranallergenen darstellt.
4. Streifentest nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form eines Testsystems (Kit) vorliegt.
5. Streifentest-System nach Anspruch 4 enthaltend 10 Allergen-
Dipsticks, Konjugat, Substrat, Patienten-Farbkarten mit Farbcode zur visuellen Auswertung und einer Durchführungsvorschrift.
6. Verfahren zum Nachweis von spezifischem IgE in Vollblut oder Seren, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens die folgenden
Schritte nacheinander ausgeführt werden:
1. Pipettierung des Serums oder Vollblutes in ein Teströhrchen;
2. Inkubation mit dem Teststreifen (AllergodipTm); 3. Waschen unter fließendem Wasser;
4. Kurzes Trocknen;
5. Allergodip™-lnkubation mit dem Konjugat;
6. Waschen;
7. Kurzes Trocknen;
8. Allergodip™-lnkubation mit dem Substrat;
9. Kurzes Trocken mit Fließpapier;
10. Entnahme des entwickelten Teststreifens;
11. Abgleich gegen die Farbkarte oder Abgleich und Dokumentation mittels der kombinierten Patienten/Farbkarte.
7. Verwendung des Streifentests zur in-vitro Allergiediagnose im human- und veterinärmedizinischen Bereich.
8. Verwendung des Streifentests zur in-vitro Allergiediagnose zum Nachweis von Inhalationsaliergenen, Nahrungsmittelallergenen, Kreuzreaktivitätsallergenen oder Mediterranallergenen.
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