JP4284131B2 - 口腔内微生物の分析方法 - Google Patents
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すなわち、本発明の課題は、特定の施設や特定の技術を必要としない簡便かつ迅速な、口腔内微生物の分析方法、及び口腔内の汚染度合いの判定方法を提供するものである。
細菌は、グラム鑑別により大きく2つ(グラム陰性菌とグラム陽性菌)に大別されるため、グラム陰性菌全般が有する酵素活性と、グラム陽性菌の中で口腔内常在菌として多く存在することが知られている溶連菌全般が有する酵素活性とを分析することで、口腔内の多くの細菌を分析するものである。
また、本発明は、口腔内微生物の分析において、分析対象の口腔内微生物に特有の酵素活性に対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、口腔内微生物を含む可能性のある試料とを直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を分析することを特徴とする、口腔内の汚染度合いの判定方法に関する。
本発明方法の別の好ましい態様によれば、口腔内微生物が口腔内グラム陰性菌であり、前記口腔内グラム陰性菌に特有の酵素がアラニンアミノペプチダーゼである。
本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、口腔内微生物が口腔内溶連菌であり、前記口腔内溶連菌に特有の酵素がロイシンアミノペプチダーゼである。
本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、口腔内微生物に特有の酵素がアラニンアミノペプチダーゼ及びロイシンアミノペプチダーゼであり、分析対象の口腔内微生物が口腔内グラム陰性菌及び口腔内溶連菌である。
本発明の分析用キットの好ましい態様によれば、アラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、及びホスファターゼに対する各発色酵素基質又は発光酵素基質をそれぞれ別々に含ませた各吸水性担体を、支持基板上に担持する。
例えば、グラム陰性菌[例えば、バクテロイデス属(但し、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・フラジリスを除く)、プレボテータ属、ベイロネーラ属(但し、ベイロネーラ・パルブルを除く)、フソバクテリウム属、ナイセリア属、ブランハメーラ属、アシネトバクター属、キンゲラ属、モラキセラ属、ブルセラ属、ボルデテーラ属、アルカリゲネス属、シワネーラ属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、フラボバクテリウム属、アクチノバシルス属、パスツレラ属、アエロモナス属、カルディオバクテリウム属、プレシオモナス属、ビブリオ属、ヘモフィルス属、ガードネレーラ属、ブチアキセラ属、セデシア属、サイトロバクター属、エドワードジェラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、エッシエリヒア属、ハフニア属、クレブジェラ属、クルイベーラ属、モルガネーラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、タツメーラ属、又はエルシニア属に属する各微生物]を分析する場合には、グラム陰性菌全般に特有の酵素として、例えば、アラニンアミノペプチダーゼを利用することができる(CARLONE,G.M., M.J.VALADEZ, M.J.PICKETT. 1983. Methods for Distinguishing Gram-positive from Gram-negative Bacteria. J.Clin.Microbiol. 16, 1157-1159;CERNY,G. 1976. Method for the Distinction of Gram-negative from Gram-positive Bacteria. J.App.Microbiol. 3, 213-225;及びCERNY,G. 1978. Studies on the Aminopeptidase-Test for the Distinction of Gram-negative from Gram-positive Bactria. Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol. 5, 113-122)。
これらの酵素基質を発色物質又は発光物質と結合するには、公知の手段、例えば、共有結合(例えば、ペプチド結合、エステル結合、又はグリコシド結合等)により結合することができる。あるいは、市販の合成酵素基質を用いることもできる。
具体的には、例えば、発色酵素基質又は発光酵素基質の0.01〜10%の溶解液10μL〜300μLを染み込ませ、自然乾燥、送風乾燥、減圧真空乾燥、又は凍結乾燥により乾燥させて用いることができる。
以下、各菌種ごとに具体的な分析方法について説明する。
L−アラニン β−ナフチルアミドを含ませた吸水性担体は、例えば、L−アラニン β−ナフチルアミドをエタノールに溶解し、終濃度として前記酵素基質が0.05%〜0.5%になるように調整した液を、濾紙に10〜300μL染み込ませた後、乾燥することにより調製することができる。
L−ロイシン β−ナフチルアミドを含ませた吸水性担体は、例えば、L−ロイシン β−ナフチルアミドをエタノールに溶解し、終濃度として前記酵素基質が0.05%〜0.5%になるように調整した液を、濾紙に10〜300μL染み込ませた後、乾燥することにより調製することができる。
本発明の分析用キットでは、前記基質を含ませた吸水性担体をそのまま含むこともできるが、異なる基質をそれぞれ含ませた異なる複数の吸水性担体を、支持基板(例えば、防水性紙、ガラス、プラスチック、木材、又は金属等)上に担持させた状態で含むことが好ましい。例えば、アラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、及びホスファターゼに対する各発色酵素基質又は発光酵素基質をそれぞれ別々に含ませた各吸水性担体を、支持基板上に担持させた簡易検出試験紙を含む本発明の分析用キットを用いると、口腔内に存在するほとんどの微生物を一度に分析することができる。
本調製実施例では、本発明方法に用いる試薬及び担体を作製した。
(A)アラニンアミノペプチダーゼテスト(AAPテスト)用
簡易検出試験紙として、1cm×12cmのプラスチック板に、ペーパーディスク(φ8mm,厚手:アドバンテック社)を3個貼り付けたものを用意した。
L−アラニン β−ナフチルアミド(入手先:シグマ社)をエタノールに溶解し、終濃度として前記酵素基質が0.15%になるように調整した液を、前記簡易検出試験紙のディスク1個に60μL染み込ませ、25℃で18時間、乾燥後、乾燥剤入りの遮光容器にいれて保存した。
また、発色試薬として、1mol/L塩酸にp−ジメチルアミノシンナムアルデヒド(入手先:シグマ社)を1%に溶解したものを遮光瓶にいれて保存した。
L−ロイシン β−ナフチルアミド(入手先:シグマ社)をエタノールに溶解し、終濃度として前記酵素基質が0.15%になるように調整した液を、前述のディップスティックのディスク1個に60μL染み込ませ、25℃で18時間、乾燥後、乾燥剤入りの遮光容器にいれて保存した。
また、発色試薬として、1mol/L塩酸にp−ジメチルアミノシンナムアルデヒド(入手先:シグマ社)を1%に溶解したものを遮光瓶にいれて保存した。
4−メチルウンベリフェリル ホスフェ−ト(入手先:シグマ社)を0.067mol/Lリン酸緩衝液(pH8.0)に溶解し、終濃度として前記酵素基質が0.08%になるように調整した液を、前記簡易検出試験紙のディスク1個に60μL染み込ませ、25℃で18時間、乾燥後、乾燥剤入りの遮光容器にいれて保存した。
(A)健常者口腔内殺菌前後試料の採取
健常者5人による以下の口腔内殺菌前後試料を用いた。
1.口腔内殺菌前試料の採取
食後2時間を経過した状態で、滅菌綿棒により歯の表裏、歯茎、及び舌の上下部分を5往復ずつ強く拭き取り、滅菌生理食塩水2mL中に綿棒を入れ、洗い出し、試験管の壁で綿棒に残った液を絞り、この液を口腔内殺菌前試料とした。
2.口腔内殺菌後試料の採取
前記口腔内殺菌前試料を採取後、丁寧に歯磨きを実施し、イソジン溶液を口腔内に含み、1分間殺菌後、イソジン溶液を吐き出した。このイソジン溶液による殺菌を5回実行後、水道水で口腔内を漱ぎ、滅菌綿棒にて前述と同様に口腔内拭き取り液を得た。この液を口腔内殺菌後試料とした。
口腔内殺菌前後試料液中に、調製実施例1で作製した簡易検出試験紙(1cm×12cmのプラスチック板にディスクを貼り付け、AAPテスト用試薬、LAP用試薬、及びMPHOS用試薬をそれぞれ染み込ませ、乾燥させたもの)を数秒間浸した後、取り出し、ティッシュペーパーにディスク面を押し付け、過剰液を取り除いた。角シャーレに簡易検出試験紙を並べ、蓋をして36℃で30分間反応後、MPHOSテストは366nmUVランプを照射し、ディスクの蛍光(陽性の場合:青色蛍光、陰性の場合:無蛍光)の有無を肉眼で判定した。AAPテスト及びLAPテストは発色液を1滴滴下し、ディスクの色調変化(陽性の場合:赤色、陰性の場合:無変化)を肉眼で判定した。
簡易検出試験紙法の対照として口腔内殺菌前後試料中の菌数を測定した。この際、従来の菌数測定法ではグラム陰性菌とグラム陽性菌を区別して測定することができる方法は存在しないため、AAPテストは総菌数を対照とした。
1.菌数の測定
口腔内殺菌前後試料液を滅菌生理食塩水にて10倍段階希釈し、その希釈液の各々をGAM寒天培地(日水製薬)上に100μL塗抹し、36℃で48時間嫌気培養を行ない、培地上の集落数をすべて数えた。
2.溶連菌数の測定方法
前述した10倍段階希釈口腔内殺菌前後試料液を血液寒天培地(ベクトンデッキンソン)上に100μL塗抹し、36℃で48時間炭酸ガス培養を行ない、培地上のα溶血性溶連菌、β溶血性溶連菌、及びγ溶血性溶連菌の集落のみをすべて数えた。
健常者口腔内殺菌前後試料の簡易検出試験紙法と菌数測定結果を表2に示す。表中の各記号−、±、+、++、+++は、ディスクの発色又は蛍光の強さを表す。
表2に示すように、健常者口腔内殺菌前の総菌数は1mL中107個〜108個で、口腔内殺菌後は1/10〜1/100に減少していることが判明した。口腔内殺菌後の減少率が1/10〜1/100であったことは、口腔内微生物は、腸内細菌同様、常在細菌として、他の病原細菌の侵入及び増殖を抑制する働きがあるため、健常者及び患者において極端な細菌数の低下は危険である。従って、口腔内殺菌後であっても総菌数が104個以下になることは、あり得ないと考えられる。更に、簡易検出試験紙法による検出感度は、この境界値と非常によく一致し、口腔内殺菌後はほとんど陰性結果となっている。しかも、AAPテスト及びMPHOSテストは、総菌数ときわめて良く相関しており、更に、LAPテストと溶連菌も高い相関性があることが判明した。
(A)入院高齢者口腔ケア前後試料の採取
実施例1に示した方法で入院高齢者10名の口腔ケア前後の口腔内試料を採取した。但し、入院高齢者のほとんど歯がない状態であったので、口腔内全体を綿棒で拭き取った。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様に実施した。
入院高齢者口腔ケア前後試料の簡易検出試験紙法と菌数測定結果を表3に示す。
表3に示すように、入院高齢者の口腔ケア前の総菌数は、実施例1に示した健常者に比較し、1mL当たり108個から1010個ときわめて多い結果であった。口腔ケア後は1/10から1/1000まで総菌数が減少し、ケア効果を確認することができた。また、この菌数測定結果と簡易検出試験紙法の判定結果間にはきわめて高い相関性が認められ、本発明方法は、口腔ケア効果の判断として、簡便かつ迅速な方法であることが、確かめられた。更に、本発明によれば、+判定以下であれば、口腔内微生物数が少ないことから、誤嚥による肺炎を引き起こすリスクは低いと判定することができ、+判定以下になるような口腔ケアの必要性及び患者の個人差を認識することができる。従って、口腔ケア従事者がケア効果を即座に知ることができるため、個々の患者への適切な対応とケアの充実が図れる。更に、本発明は、特定の設備や技術を必要としないため、ベッドサイドでの検査が可能である。
Claims (7)
- 口腔内微生物の分析において、アラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、又はホスファターゼに対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、口腔内微生物を含む可能性のある口腔内全体の拭い液試料とを直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を分析することを特徴とする、口腔内微生物の分析方法。
- 口腔内微生物の分析において、アラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、又はホスファターゼに対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、口腔内微生物を含む可能性のある口腔内全体の拭い液試料とを直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を分析することを特徴とする、口腔内の汚染度合いの判定方法。
- 口腔内微生物の分析において、アラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、又はホスファターゼに対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体と、口腔内微生物を含む可能性のある口腔内全体の拭い液試料とを直接接触させた後、前記担体の発色又は発光を分析することを特徴とする、誤嚥性肺炎のリスク判定方法。
- 吸水性担体が濾紙である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- アラニンアミノペプチダーゼ及びロイシンアミノペプチダーゼに対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体を用いる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、分析対象である口腔内微生物のアラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、又はホスファターゼに対する発色酵素基質又は発光酵素基質を含ませた吸水性担体、及び口腔内の拭き取り手段を含むことを特徴とする、口腔内微生物の分析用キット。
- アラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、及びホスファターゼに対する各発色酵素基質又は発光酵素基質をそれぞれ別々に含ませた各吸水性担体を、支持基板上に担持する、請求項6に記載のキット。
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