JP3413199B2 - 歯周病病原性細菌のタンパク質加水分解活性の測定系 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、一般に、哺乳類における口腔疾患の存在を
判定するための系に関し、特にヒト又は動物における歯
周病活性を測定するために有用な比色試験に関する。

技術背景 歯周病は、ヒト生歯の主な疾患である。今日では、よ
り多くの歯がカリエス（虫歯）よりも歯周病の影響で失
われている。歯周病は、歯肉（gum）及び歯を支持する
骨類に影響を及ぼす一群の状態である。歯周病の根本的
原因は、組織の実際の破壊を結果的にもたらすかも知れ
ない歯肉（gum）の炎症の原因となる細菌性プラーク
（歯垢）である。症例によっては、骨の破壊がその点
（プラーク）で起こり、そこで歯の骨に対する結合が失
われることもある。

歯周病では、通常、歯肉線の上（歯肉上）及び下（歯
肉下）の両方において、歯に付着したプラーク中におけ
る細菌の大きな集合がある。このプラークは、その深部
において石灰化されることがあり、歯石（calculs）と
して知られているものを形成する。このプラーク及びこ
れに関連する歯石は、歯と歯肉の間にポケットを形成し
するが、このポケットは本疾患に特徴的なものである。
現在、歯周病は、ポケットの存在及び深度、歯の骨への
結合の喪失、及び歯肉の乳頭出血のような指標類の臨床
観察によって診断される。しかし、臨床観察は、必ずし
も信頼性ある指標であるとは限らない。例えば深部のポ
ケットに、炎症組織破壊の原因となる可能性のある細菌
類（歯周病原性の細菌類）が必ずしも感染しているとは
限らない。現在のところ、残念なことに、前記ポケット
が歯周病細菌類によって感染されているかどうかを調べ
るための信頼性があり、安価でかつ客観的な手段がな
い。

特に歯周病治療のために取られる必要のある典型的な
矯正措置の辛さに鑑みれば、診断試験がないことが深刻
な問題となってきた。このような措置として、罹患歯根
を露出させかつポケットを除去するために罹患歯肉組織
を切除することを挙げることができる。最近になって、
より保存性の良い外科的治療が開発され、通常、歯肉片
を歯から遊離させ、露出したばかりの歯のすべての歯石
及びプラークの表面を洗浄し、その後、この洗浄表面上
に前記歯肉を縫合して戻すことが行われている。患者が
専門的なメンテナンス治療を受け続ける限りにおいて、
両方の外科的手法は、等しく良好に作用する。

歯周病は、旧来から、宿主組織が細菌及び／又は細菌
産生物に応答していることを意味する歯肉の炎症として
定義されてきたが、歯周病は医学的意味における細菌感
染のようには治療されてこなかった。その例として、歯
周病は、歯上でのプラークの成長が避けられないもので
あること更にはプラークが身体の外部にあるので全身投
与薬物類によって治療できるようには思われないことか
ら、当該技術分野では抗生物質によって治療されていな
い。更に、歯周病が１種又は数種の特に破壊力の強い細
菌類に特異的であるとは考えられてこなかった。実際
に、約200種の微生物類が種々のプラーク標本から単離
されている。従って、歯を機器で加工して集積した細菌
性堆積物を非特異的に除去することを必要とする物理的
治療が歯周病治療のための適切な手段であると考えられ
てきた。

歯周病は、グラム陰性嫌気性細菌類の増殖によりコロ
ニーが形成されるとき起こるような歯を支える組織の進
行的損失を特徴とする（例えばLoescheら、“Role of
Spirochetes in Periodontal Disease"、Host−Pa
rasite Interaction in Periodontal Disease,Genc
o and Mergengagen編著、American Society of Mi
crobiology、Washington DC、1982,62−65頁及びSiot
s、“Importance of Black Pigmented Bacteroides
in Human Periodontal Disease"、同上、27−45頁
参照）。

スピロヘータ類及び黒色色素化バクテロイデス（BP
B）は、特に、ポケットが深針使用（probing）によって
出血した場合及び疾患進行の臨床的証拠がある場合に、
特に顕著になる。従って、これらの嫌気性生物類を目的
とした薬物療法の可能性が生じる。実際に、嫌気性細菌
に対して有効な抗生物質であるメトロニダゾールの使用
によって、有益な結果が観察されている。メトロニダゾ
ール（metronidazole）は、商標FLAGYLの下に、G.D.Sea
rle＆Co.,Chicago,IL60680から入手可能であり、また、
Zenith Laboratories社、Ramsey,NJから一般的形態で
入手可能である。しかしポケットのような臨床症状の一
部が薬物治療患者において観察されるであろうが必ずし
も感染されていないかも知れないので、歯周病治療にお
ける薬物類の使用によって、嫌気性歯周感染の存在を検
出する客観的手段の必要性が高まってきた。従って、当
該技術分野においては、薬物治療の奏功性をモニター
（monitor）するための簡易で、信頼性ある検査が必要
とされている。

スピロヘータ類及びBPBのレベル上昇を培養法により
細菌学的に診断することは、現時点では研究施設で実施
できるのみである。しかし、ある種のスピロヘータ類
は、既存の技術では培養によって増殖できない。

スピロヘータの存在は、相コントラスト（phase con
trast）又は暗視野コンデンサー類（dark field cond
ensers）のいずれかの下に顕微鏡検査によって判定でき
る。歯周病存在を判定するための一つの先行技術は、ほ
とんどがスピロヘータである運動形態（motile form
s）の存在を判定するためにプラークの顕微鏡検査を必
要としており、それによって、治療を増強するか又は終
結させる必要性を評価する。Keyesら、"Diagnosis of
Creviculoradicular Infections"、同上、395−403
頁及びListgartenら、J.Clin.Periodontal.,第８巻、12
2−138頁（1981）参照。しかし、BPBの同定のための同
様の顕微鏡手技は全く存在していない。従って、現在の
ところ、歯科医／臨床医は、歯周病に相関する細菌性パ
ラメータ群についての必要なアッセイ及び測定を行うた
めに、高価な顕微鏡及び関連ビデオ装置の購入に依存し
なければならず、及び／又は、利用可能な高度技術の研
究施設設備を有していなければならない。

当該技術分野の現況を鑑みるに、嫌気性細菌による歯
周病活性の存在を確認するために信頼性ありかつ安価な
検査系（test system）の必要性が大いにある。更に、
歯科医／臨床医が便利に実施できる検査系が求められて
いる。このような検査系は、患者に対してその状態につ
いてアドバイスする際及び治療の有効性をモニタリング
する際に重要な価値を有するであろう。

歯周病存在の判定を可能にする簡易かつ安価な検査で
は、疑いのある歯周病病原性細菌の試料のタンパク質分
解活性を測定する。更に具体的に述べると、このアッセ
イ法は、例えば歯肉下プラークの標本中におけるトリプ
シン様活性（trypsin−like activity）の存在を検出
するように実施する。１態様において、色素生産性試験
物質は、標本中のトリプシン様酵素類（trypsin−like
enzymes）によって加水分解されると発色団若しくは
色素（chromophore）を放出するような発色団と組み合
わせた一種類のアミノ酸又はペプチド基質からなる。前
記の放出による色の変化を検出することで、上記トリプ
シン様活性が存在しているかどうか、従って、歯周病の
原因となる微生物類が存在するかどうかが示される。

上記の技術の一つの問題は、前記検査の結果が歯周病
病原性の微生物類の存在を高い信頼性で表示にするため
には、ある最小数の微生物類が前記標本中に存在しなけ
ればならないことにある。従って、もし前記標本自体が
小さく、かつその結果、最小数未満の上記微生物類しか
含有されていないならば、その際には、歯周病産生性の
微生物類が前記標本中にたとえ存在していても、前記検
査手法は誤りの陰性の結果をもたらすかも知れない。

従って、本発明の目的は、歯周病の存在を判定するた
めの改良された結果を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、歯周病を同定できかつ臨
床観察を必要としない検査系を提供することであり、そ
の結果、臨床的にはまだ観察できないような初期におい
て歯周病を検出できる。

更に本発明の目的は、特に、トリプシン様活性を有す
るTreponema denticola,Bacteroides gingivalis,Bac
teroides forsythus,Capnocytophaga gingivalis及び
その他の微生物類の存在を口腔試料中において検出する
ための検査法を提供することである。

また、本発明の目的は、熟練していない者でも歯科医
／臨床医の職場内で実施できかつ高価な又は特殊な機器
を要さない歯周病の検査法を提供することである。

更に本発明の目的は、信頼性ある歯周病の検査法を提
供することである。

更に本発明の目的は、ある特定の患者の検査結果の信
頼性を表示する歯周病検査法を提供することである。

また本発明の目的は、菌の感染力をモニターするため
に使用できる歯周病検査法を提供することである。

更に本発明のもう一つの目的は、疫学調査のため、軍
人スクリーニング検査のようなスクリーニング検査のた
め、及び歯周病患者の治療奏功性をモニタリングするた
め、患者の定期検診の一部として容易に実施可能な歯周
病検査法を提供することである。

更にもう一つの本発明の目的は、好気性条件下で嫌気
性細菌類を検出可能な歯周病検査法を提供することであ
る。

また本発明の別の目的は、細菌試料の培養を必要とせ
ずなかつプラーク又はその他の標本試料を直接検査する
歯周病検査法を提供することである。

更に、本発明の目的は、歯周病の存在を判定する際に
有用である便利なアッセイキット（assay kit）を提供
することである。

また本発明の目的は、比色系（colorimetric syste
m）を提供することであり、それによって歯周病の存在
が色の変化によって判定できる。

発明の開示 上記の及びその他の目的、特徴及び利点等は、歯周病
病原性細菌類のタンパク質加水分解活性（proteolytic
activity）を測定する改良検査を提供する本発明によ
って達成される。本発明によれば、哺乳類、例えばヒト
の口腔から細菌菌叢（bacterial flom）の試料を採取
する、次に色素原性試験物質（achromogenic test su
bstance）前記試料のタンパク質加水分解活性を測定す
る段階が提供される。

特に、トリプシン様活性は、T.denticola,B.gingival
is,B.forsythus,C.gingivalisのような歯周病病原性の
生物類が前記活性を特徴としているので、測定される。
歯周病病原性の疑いのある生物類によって産生されたタ
ンパク質加水分解酵素は、それがトリプシン阻害剤によ
って阻害されないこと、それがカルシウムを必要としな
いこと、それがEDTAによって阻害されないこと、及びそ
れが酸性pHにおいて活性であることからみて、トリプシ
ンではない。しかし、それは、トリプシン測定に通常使
用されるペプチド物質（例:BANA）と実際に反応し、従
って、前記酵素は“トリプシン様（trypsin−like）”
と称されてきた。

本発明によれば、前記標本が信頼できる検査結果をも
たらすために十分な所定の最小数の微生物類を含有する
かどうかを指示するために、前記標本を非特異的酵素マ
ーカーに対して更にアッセイする。

広範囲にわたる結果の分析によって、標本中約100万
乃至1,000万の細菌群が、タンパク質加水分解酵素検査
による信頼できる結果をもたらすために十分であること
が判明した。しかし、もし前記標本自体が少なく例えば
百万未満の桁数（オーダー）の細菌群を有しているとす
ると、その際には、前記検査手法は、前記標本中の細菌
が余りに少ないという理由だけで、陰性の結果を生ずる
ことになるかも知れない。

数種類の酵素類は、全部とはいわないまでもほとんど
の口腔菌叢の構成員が有しているようである。これらの
共通の非特異的酵素類の活性測定は、微生物類などの存
在の指標として及びそれゆえ標本の大きさが十分である
ことの指標として使用できる。本発明は、発色団（chro
mophore）を放出するために前記非特異的マーカー酵素
によって酵素的に分解可能であり、それによって、試料
中に少なくとも所定の数の微生物類が存在する場合に観
察可能な色の変化をもたらす第２の発色団含有色素原産
性試験物質（ａ second chromophore−containing c
hromogenic test substance）を提供する。一つの例
示的態様では、前記非特異的酵素マーカーは、口腔菌叢
に見られる全部とはいわないまでもほとんどの細菌類中
に存在するホスファターゼである。もし前記ホスファタ
ーゼ酵素が第２の色素原性物質と反応して陽性の結果を
生ずると、その際には、試料中に十分な生物類があり、
トリプシン様酵素検査について、真の信頼できる検査結
果が得られる。一方、もし前記ホスファターゼ試験が陰
性であれば、陰性のトリプシン様酵素検査が予測される
であろう。臨床医は、そのことから、前記試料が余りに
少なすぎること及びその臨床医が前記患者から再度試料
を採取すべきであることにすぐに気がつくであろう。

ホスファターゼ酵素類によって酵素的に分解可能な第
２の色素原性試験物質類の具体的例としては、アルカリ
ホスファターゼによって良好な結果を生じるパラ−ニト
ロフェノールリン酸エステル及びオルト−ニトロフェノ
ールリン酸エステル類が、また酸ホスファターゼ酵素類
によって良好な結果を生じるｏ−カルボキシフェノール
リン酸エステル類が挙げられる。

もう一つの例示的態様において、前記非特異的酵素マ
ーカーは、ペプチダーゼであり、更に具体的には、アミ
ノペプチダーゼである。アミノペプチダーゼによって酵
素的に分解される例示的な第２の色素原性試験物質は、
Ｌ−プロリン−β−ナフチルアミドである。

これらの第２の色素原性試験物質類をトリプシン様活
性のための色素原性物質類と併用できる。歯周病病原性
の疑いのある細菌類のトリプシン様活性を測定するため
の具体的例は、Ｎ−ベンゾイル−DL−アルギニン−２−
ナフチルアミド（BANA）及びベンゾイル−DL−アルギニ
ン−ｐ−ニトロアニリド（BAPNA）である。

ある組み合わせの色素原性試験物質類を選択するため
の唯一の基準は、それぞれの発色団類の放出によっても
たらされた色変化が互いに識別可能でなければならない
ということにある。従って、下記でより十分に説明する
が、もしBANAを用いてトリプシン様活性を測定すれば、
ホスファターゼによって加水分解可能で発色団を放出す
る基質類は色の点で両立可能であり、第２の試験物質と
して利用でき有益であろう。Ｌ−プロリン−DL−ナフチ
ルアミドはアミノペプチダーゼ類によって加水分解可能
であり、前記第２の試験物質として利用でき有益であ
る。ある態様においては、酵素活性に応答して色の変化
を生じる発色剤（ａ color developer）を添加する。

本発明のキットの面において、比色アッセイキット
（ａ colorimetric assay kit）が、歯周病の存在を
示するために提供される。前記キットには、（１）哺乳
類の口腔由来の細菌菌叢中において歯周病病原性の疑い
のある細菌によって産生されるタンパク質加水分解酵素
に特異的な第１の色素原性物質、及び（２）前記細菌菌
叢によって産生される酵素類に対して非特異的な第２の
色素原性試験物質が付属されており、前記第２の色素原
性試験物質がある量の微生物に応答して酵素的分解を起
こす。

前記第１の色素生産性試験物質は、トリプシン様酵素
活性に特異的であり、BANA、BAPNA、及び２−アルギニ
ン−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリンから
なる群から選択される。前記第２の色素原性物質は、前
記酵素ホスファターゼに特異的であり、ｐ−ニトロフェ
ノールリン酸エステル、ｏ−ニトロフェノールリン酸エ
ステル、及びｏ−カルボキシルリン酸エステルからなる
群から選択される。

本発明のアッセイキットの面の更に１態様において
は、前記第２の色素原性試験物質は、前記酵素ペプチダ
ーゼに特異的であり、Ｌ−プロリン−β−ナフチルアミ
ド、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド、及びＬ−フェ
ニルアラニン−β−ナフチルアミドからなる群から選択
される。

本発明の比色アッセイキットは、ある態様において、
色剤（ａ color developer）を付属している。前記
は、ファーストガーネット（fast garnet）、ファース
トブルー（fast blue）、及びｐ−ジメチルアミノシン
ナムアルデヒドの酸性溶液（an acidified solution
of ｐ−dimethylaminocinnamaldehyde）からなる群
から選択される。

発明を実施するための最良の形態 歯周病に特徴的な微生物類を高レベル含有する疑いの
ある口腔標本を、歯周病をもたらす疑いのある生物類に
よって産生された酵素類に特異的な発色団含有基質に供
する。T.denticola,B.gingivalis,B.forsythus及びスピ
ロヘータ類は、基質を加水分解可能でそれによって反応
生成物として発色団を放出するようなタンパク質加水分
解酵素及び／又はペプチダーゼを産生する。この放出さ
れた発色団を次に比色法で観察できる。ある態様におい
ては、もう一つの色素生成剤（chromogenic agent）す
なわち発色剤（color developer）を添加する必要があ
る。酵素条件に応答して色がでるか又はでないかは、歯
周病に関連する増強された細菌条件に相関している。

歯周病に関連していることが既知の細菌種の中でも、
下記の種：スピロヘータであるT.denticola;BPBの内で
最も強力なB.gingivalis;進行性の破壊部位から頻繁に
単離される生物であるB.forsythus;及び糖尿病における
歯周病に関連している生物であるC.gingivalis;の全て
が、トリプシン基質であるＮ−ベンゾイル−DL−アルギ
ニン−２−ナフチルアミド（BANA）の加水分解によって
測定可能なトリプシン様酵素を有している。J.Oral.Mic
rol.Immuno.,Vol.1,65−70頁参照（1986）。少なくとも
40種のその他のプラーク種は、前記のBANA基質を加水分
解不可であるが、これらの種は、歯周病をもたらす点に
おいて特に重要であると考えられていない。従って、前
記プラークがBANAを加水分解する能力は、プラーク中に
おいて１種以上のこれらの細菌種が存在していること及
び／又は比例的に増加していることを反映でき、従っ
て、歯周病プラーク中における嫌気性感染の一つの測定
法を提供するものである。

具体的に例示される態様において、ペプチド基質BANA
は、無色である。標本中の細菌とインキュベーションさ
れると、発色団β−ナフチルアミドがアルギニンのカル
ボキシル基との間の結合から解かれ放出される。その後
ファーストガーネットのような発色剤を添加すると、高
レベルの酵素活性が前記標本中にあれば明るい橙々〜赤
色が形成されることになる。黄色の発色は、陰性の結果
として解釈される。別の有益な態様において、ペプチド
基質は、ベンゾイル−DL−アルギニン−ｐ−ニトロアニ
リド（BAPNA）であり、それが加水分解すると色を形成
し、それによって、標本の酵素活性を示すためのその他
の発色剤の必要性がなくなる。

当然ながら、陽性及び陰性の試験の間で色の変動があ
るが、それは、酵素活性の程度が種々であるとして解釈
され、また、歯科医／臨床医がモニターすべき状態を示
唆すると解釈される。経験から、比色検査系における発
色の程度の解釈は、酵素活性の存在又は不在を判定する
比較目的のための標準化されたカラーチャートの開発に
容易に影響されることが示唆されている。

先にも述べたように、その簡易性と経済性に寄与して
いる米国特許出願第740,097号の発明の特徴の一つは、
標本の大きさ又は含量は別個に定量したれ測定したりす
る必要が必ずしもないことにある。しかし、試験結果
は、発色についてある最低レベルの微生物類に依存して
いる。広範囲の試験の結果、約1,000,000乃至10,000,00
0の細菌が標本中にあることが信頼できる結果をもたら
すことが示された。プラーク標本は、例えばもし活動性
の歯周病が存在すれば、本文に記載の技術において陽性
酵素反応をもたらすために必須の量の生物類を含有可能
である。

本発明の系の好適な態様において、標本中の微生物の
量が所定量を越えていること及びそれゆえタンパク質加
水分解酵素試験によって信頼できる結果をもたらすに足
るを示すために第２の色素原性の試験物質が提供さる。
前記第２の色素原性の基質が口腔の菌叢中に見られる全
部とはいわないまでもほとんどの細菌類中に存在する酵
素によって加水分解可能であり、その結果、それが標本
中に存在する微生物類の量の測定値として使用できるこ
とは有益である。好適な態様において、前記第２の発色
団含有基質の酵素的分解は、試料中に約1,000,000を越
えるか又はタンパク質分解及び／又はペプチダーゼ酵素
試験によって真の信頼性ある結果を与えるために必要な
その他の予め定めた数の微生物類があれば、観察可能な
色の変化を生ずる。前記の最小の予め定めた定数は、当
然、酵素分解に対する色素生産性の試験物質の感度に依
存する。

ホスファターゼは、口腔菌叢中に多く存在する酵素で
ある。アルカリ性及び酸性ホスファターゼは、試験溶液
のpHに依存し、酵素作用の非特異的マーカーとして使用
できる。ホスファターゼは、リン酸エステル類の加水分
解及び合成及びリン酸からその他化合物へのリン酸基運
搬を触媒する酵素である。従って、ホスファターゼの作
用によって加水分解可能で発色団ニトロフェノールを放
出するｏ−ニトロフェノールリン酸エステルのようなリ
ン酸基含有基質類は、第２の色素原性試験物質類として
適切である。その他の例示的例はｐ−ニトロフェノール
リン酸エステル及びｏ−カルボキシフェノールリン酸エ
ステルである。

当然、口腔の細菌菌叢中に共通して見られるその他の
酵素類の活性を、ホスファターゼ活性の代わりに使用で
きる。具体例を挙げると、プロリン、ロイシン、及びフ
ェニルアラニンのためのアミノペプチダーゼ類である。
しかし、前記ペプチダーゼに特異的である選択された第
２の色素原性物質は、歯周病の疑いのある細菌類のトリ
プシン様活性を示唆する色変化を観察する臨床医の能力
を妨害するような色をもたらす発色団を放出してはなら
ない。このことは、例えばもしBAPNA中に見られる前記
ニトロアニリド発色団を用いてプロリンのβ−ナフチル
アミド誘導体を第２の色素原性試験物質として使用する
ならば、達成できる。この場合、BAPNA加水分解のため
の陰性反応は、無色であり、一方、プロリン加水分解の
陽性反応は、反応混合物に対してファーストガーネット
を添加した後は赤橙色である。β−ナフチルアミド発色
団を含有するその他の基質類を色素生産性基質として使
用できることが当業者に自明であることは当然である。

具体的な例示的態様において、プラーク試料を滅菌キ
ュベットで移し小型の栓付き滅菌済バイアル中で激しく
攪拌しながら水溶液中に懸濁する。BANAのストック溶液
を、BANA（Sigma Chemical 社 St.Louis、MO）44mg
を1mlのジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解させ、
調製する。使用前に、前記BANAストック溶液をpH8.5の
0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンハイドロ
クロらいド緩衝液で1:100容量混合物に希釈する。前記
緩衝BANA溶液を前記プラーク試料に添加し、一晩インキ
ュベーションした。１滴のファーストガーネットを添加
すると、約５分以内に色が生じた。

実験室結果は、BANA試料溶液のpHが約5.0乃至8.5の間
の範囲にあることが示唆される。ソレンセン（Sorense
n）リン酸緩衝液又はEDTA含有リン酸緩衝液のようなそ
の他の緩衝液も使用できる。この結果は、純粋な精製水
中の非緩衝溶液が緩衝溶液と同様に作用することを示し
ている。通常、インキュベーションは、約１時間未満
（すなわち、約１分から５分のオーダー）から約24時間
の範囲の時間を要している。更に、インキュベーション
温度は、約25℃乃至60℃の範囲にあるべきであり、好適
には、約37℃乃至55℃であるべきである。

本発明の具体的例示的態様において、第２の色素生産
性試験物質であるｐ−ニトロフェノールリン酸エステル
（pNPP）を、上記のようにして調製した反応試薬BANA含
有アルカリ性緩衝水溶液に添加する。別の態様では、BA
NAをpNPP反応試薬の後に添加できる。その後前記標本を
前記試薬類含有溶液に添加し、前記溶液を約37℃でイン
キュベーションする。両試薬類ともに、無色である。し
かし、標本中微生物由来アルカリ性ホスファターゼの作
用で、発色団ｐ−ニトロフェノールが放出される。もし
十分な量の微生物類が前記試料中に存在すれば、前記溶
液は黄色に変化し観察可能であろう。検査を実施してい
る臨床医は、黄色の出現により前記標本の大きさが適切
であることを確認し、更に、例えばファーストガーネッ
トのような発色剤を添加し、前記β−ナフチルアミド発
色団がトリプシン様酵素を産生する細菌類によってBANA
から放出されたかどうかが示唆される。もしそうであれ
ば、橙赤色が出現し、前記標本中に歯周病病原性の細菌
類が存在していることが示唆されるであろう。もし色が
黄色のままであったならば、その際には、歯周病病原性
の生物類の存在と矛盾する。臨床医は、従って、黄色が
歯周病病原性生物類がないことの結果であり、前記標本
の大きさが余りに少なかったことによるのではないこと
を確信する。従って、不適切な標本サイズによる誤陰性
結果の可能性に関して、当該技術に存在する疑いが排除
される。

スピロヘータ類及び／又はB.gingivalis、C.gingival
is、T.denticola及びB.forsythusにより生じる嫌気性歯
周病感染のBANA加水分解陽性による判定は、また、ｏ−
ニトロフェノールリン酸エステル（ONP）の取り込みに
よって改良される。このことは、反応混合物のpHに依存
性にONPがアルカリ性又は酸性ホスファターゼ類によっ
て加水分解できるという事実の結果であり、プラーク試
料中に存在するであろう種々のプラーク細菌類及び宿主
細胞類が有している。ONPの加水分解は、約1,000,000の
細菌類が試料中に存在するときに陽性の結果をもたら
す。この数の細菌類は、約10μｇ（正味重量）のプラー
ク試料に対応する。プラーク10μｇを含有する全プラー
ク試料は、陽性のONP試験結果をもたらすであろう。も
し臨床医が極めて少なく裸眼ではほとんど見えないプラ
ーク試料を取り出しそれをBANA−ONP反応混合物に添加
すれば、下記の発色シークエンスが出現する。

陰性のONP反応は、臨床医に対して、プラーク試料が
少なすぎ信頼性ある結果が得られないことを示唆するで
あろう。その後、前記臨床医は、患者から再度試料を採
るか又は歯肉組織の臨床的所見に応じて次回まで試料を
再度採らないかのいずれかを行うであろう。一方、陽性
のONP反応は、臨床医に対して、試料中に十分なプラー
クがあり、ファーストガーネット試薬の添加に進むよう
に示唆するであろう。もしファーストガーネットの添加
後に色変化が全くないならば、臨床医は、嫌気性生物類
の存在と関連する疾病プラークがないと判断する。

下記は、BANA−ONP併用混合物を用いて入手可能な所
見を例示したものである：プラーク標本は、歯科医のも
とで患者48例から採取し、上述のBANA−ONP併用混合物
中で一晩インキュベーションした。

色反応の結果を、乳頭出血、ポケット深度、及び歯の
骨への結合喪失のような臨床症状の検査による臨床所見
及びスピロヘータ類の顕微鏡所見と比較した。下記の第
Ｉ表に結果を示した。患者を診断した臨床医は、酵素検
査結果を全く知らないでそのように判断した。

顕微鏡検査に関して、緩衝液に分散させた試料10μｇ
を20×30mmカバースライド下のガラススライドにのせ密
封した。顕微鏡検査のための標本は、Zeiss 暗視野顕
微鏡による検査前に嫌気性チェンバー中に保存した。10
0x油浸対物レンズの20個の視野又は細菌200個のいずれ
か最初にきた方を計数した。高出力視野（hpf）当たり
のスピロヘータ類の数をその後計算した。１個の高出力
視野の容積はおよそ1.86×10−5mlである。

これらの結果は、前記併用酵素アッセイが臨床状況を
高い信頼性で反映していることを明白に示している。前
記酵素試薬類によって感染していると判定された全22の
プラークは、歯周病の臨床診断と一致していた。BANA酵
素反応が陰性であった21のプラーク（項目３−５）中に
おいて、これらの患者21例中の19例が歯周病治療を全く
必要としないと臨床的に診断された。これらのBANA酵素
陰性試料（項目５）の内２個がｏ−ニトロフェノールリ
ン酸エステル検査に関連して量が少な過ぎるとして廃棄
し、臨床医はより多い標本を用いて再検査すべきである
ということが示唆された。

別の態様において、トリプシン様酵素基質は、BAPNA
からなり、第２の色素原性試験物質は、Ｌ−プロリンア
ミノペプチダーゼのナフチルアミド誘導体であるＮ−Ｌ
−プロリン−β−ナフチルアミド（PNA）である。先の
例に関して述べると、前記BAPNA基質はBANAについて説
明したように調製し、PNAをそれに添加した。標本をこ
の混合物と一晩、インキュベーションした。黄色の出現
は、嫌気性感染を示していた。色が出現しないことは、
標本が余りに少なすぎたか又は嫌気性感染が全くないこ
とをそれが示唆している点において、あいまいな結果で
ある。ファーストガーネットのような発色剤の添加は、
前記ジレンマを解決する。PNA加水分解による橙々色か
ら赤色への出現は、十分なプラークが前記試料中に存在
することを示唆している。もし黄色が出現すれば、その
際には、プラーク試料が余りに少なすぎることになる。
このことは、下記の図で例示される。

当然、非特異的酵素反応で呈した色が特異的トリプシ
ン様酵素反応の結果として呈した色を妨害しない限りに
おいて、その他の色素原性試験物質類を本文で記載した
ものに代えることができる。更に具体的な例は、酸ファ
オスファターゼの基質であるｏ−カルボキシフェノール
リン酸エステルであり、また、Ｌ−ロイシン及びＬ−フ
ェニルアラニンのβ−ナフチルアミド誘導体類である。

しかし、その他の発色団含有基質類を本発明の実施に
使用することができることを理解されたい。トリプシン
はアルギニン又はリジンにおいてタンパク質類を攻撃す
るので、これらの塩基性アミノ酸類を伴ったその他のペ
プチド／発色団組み合わせ類がBANA又はBAPNAの代わり
となることができることが明らかである。例示的例は、
Ｌ−BANA及びＬ−BAPNAのような上述のBANA及びBAPNA化
合物類の立体異性類似体類（stereoisomeric analogue
s）である。T.denticola及び数種のB.gingivalis金株類
は、インビトロでＬ−ピロリドニル−β−ナフチルアミ
ドに対して活性であり、その結果、この非ペプチド発色
団は、嫌気性歯周病感染の存在を判定する際に価値があ
るであろう。本文で述べた全てのペプチド発色団類は、
Sigma Chemicals,St.Louis,MO,U.S.A.のような化学薬
品供給会社から購入できる。

発色剤に関して、発色団の放出を比色法で示すいかな
る発色剤も本発明の実施において利用できる。例示的例
は、化学的にはｏ−アミノ−アゾトルエン−ジアゾニウ
ム塩と称されるファーストガーネット−gbc塩（Sigma
Chemicals,St.Louis,MO,U.S.A.）；ファーストブルー；
及びｐ−ジメチル−アミノシンナムアルデヒドの酸性溶
液が挙げられる。

別の態様においては、タンパク質加水分解活性を、２
−アルギニン−７−アミノ−４−トリフルオロ−メチル
クマリン誘導体類のような蛍光原性試験物質によって測
定できる。タンパク質加水分解活性は、従って、蛍光団
（fluorophore）の放出によってUV光源で検出できる蛍
光（fluorescence）として示すことができる。従って、
本文で使用した用語“発色団（fluorophore）”は、広
い意味で、可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又
は蛍光を発する物質を含むと解釈される。ペプチド基質
と蛍光団との併用は、蛍光団が放出された時にUV光で観
察可能な色変化をもたらす結果となるであろう。例えば
蛍光ブルーから蛍光グリーンへのストークス（Stokes）
シフトが観察可能であろう。

本発明の上述の具体的態様の実施において、試料採取
技術には、歯肉下プラークの取り出し（removal）が含
まれていた。本発明の目的等に有効であると考えられて
いるサンプリング技術は、原則的に、当該技術で公知の
いかなるこのような方法であってもよく、いかなる組
織、体液、又はその他の疾病の疑いのある標本をサンプ
リングするためにも適用でき、従って、例示的に示す
と、歯肉下プラーク、歯肉間隙液体、歯肉上プラーク、
口腔組織、唾液又は口腔洗浄去痰薬等が含まれる。唾液
又は口腔洗浄去痰薬は、当然、使用に先立ち、いかなる
既知の方法によっても濃縮可能である。好適には、歯周
病の疑いのある標本を、外見上歯周病が全くない患者の
４分円（puadrant）当たり最も歯周病に侵されている部
位又は各第１臼歯の近心頬の隣接面部位のいずれかか
ら、取り出す。好適には、試料部位の歯肉上プラークは
取り出し捨てるのがよい。フィルターペーパー等を、歯
肉近心の開口部に配置し、毛細管の作用で歯肉近心液体
を採取する。その後、タンパク質を前記フィルターペー
パーから溶出させ、色素原性試験物質に供する。

先の例示的例は口腔標本のタンパク質加水分解活性を
標本及び色素原性試験物質（類）を含有する液体溶液中
で測定する態様に関しているが、標本の酵素活性は、本
発明の原則に従った多数の別の態様によっても測定でき
る。一つの考えられた態様においては、口腔標本及び／
又は色素原性試験物質を吸収するか又は受け取る少なく
とも１個の多孔性表面部分、及びいくつかの態様では更
に着色剤を、実質的に剛性である担体に付属させる。前
記多孔性材料は、フィルターペーパーのような、繊維質
吸収剤、織布又は不織布材料であることができる。

産業上の利用可能性 本発明による歯周病検査の用途に関連した利点及び利
益類は数多く、しかも、商業的に重要であると考えられ
ている。前記方法類は、嫌気性感染の存在又は不在を最
初に判定する際と同様に歯周病治療においても有用であ
る。本発明は、特に、一般的な歯周病、すなわち、患者
がスピロヘータ類、T.denticola,B.gingivalis,B.forsy
thus及びC.gingivalisの有意な増大を示す慢性破壊性歯
周病の同定に有用である。本発明の検査は、また、種々
の段階の前記疾患治療を定量的に評価するのに有用であ
り、治療が適切であったか否か及び治療手段に別の正当
な方法があるか否かを判定する際に役立つ。前記方法
は、メンテナンスのための定期的来院に際して再治療が
必要かどうかを調べる際の用途に特に適している。

更に、本発明の目的のために、本検査はヒト歯周病に
限定されておらず、疾病を引き起こす微生物類が哺乳類
に一般的に存在するかどうかを判定するのにも容易に適
用される。本発明の方法は、そのようにして、獣医学で
適用されるであろう。

本発明を具体的態様及び適用の観点から記載してきた
が、当業者は、この教示を参照して、本発明の請求の範
囲に記載された範囲又は精神から逸脱することなく追加
的に態様を生み出せるであろう。従って、本開示におけ
る説明は、本発明の理解を促進するために提供されてお
り、本発明の範囲自体を限定することを意図していな
い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/42 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）哺乳類口腔から採取した複数種の微
   生物類を含有する細菌菌叢の試料を用いて、前記複数種
   の微生物類中のいくつかの微生物類が所定の数を越える
   かどうかを判定する段階であって、 前記判定方法が、少なくとも所定数の前記微生物類が前
   記試料中に存在することを条件として発色団が放出され
   かつ観察可能であるように、前記試料中の微生物類の酵
   素活性によって加水分解可能な第２の色素原性試験物質
   に前記細菌菌叢試料を供することからなり、 前記第２の色素原性試験物質がホスファターゼによって
   加水分解可能であり、前記ホスファターゼがアルカリホ
   スファターゼ及び酸ホスファターゼからなる群から選択
   され、 前記第２の色素原性試験物質がｐ−ニトロフェノールリ
   ン酸エステル、ｏ−ニトロフェノールリン酸エステル及
   びｏ−カルボキシルフェノールリン酸エステルからなる
   群から選択される段階と、 （ｂ）前記判定段階に応答して、前記細菌菌叢のタンパ
   ク質加水分解活性を前記細菌菌叢中の歯周病病原性の疑
   いのある細菌によって産生されたタンパク質分解酵素に
   対し特異的な色素原性試験物質によって測定する段階で
   あって、 前記試料中に前記歯周病病原性の微生物類が存在するこ
   とを条件として発色団が放出されかつ観察可能であるよ
   うに、前記色素原性試験物質が前記試料中の歯周病病原
   性の疑いのある微生物類のトリプシン様活性に対し特異
   的であり、 前記色素原性試験物質が発色団と組み合わせたペプチド
   基質からなり、 発色団と組み合わされた前記ペプチド基質がBANA及びBA
   PNAからなる群から選択される段階と、 からなる哺乳類口腔から採取した細菌菌叢中の歯周病病
   原性の疑いのある細菌の検査方法。
2. 【請求項２】前記第２の色素原性試験物質がペプチダー
   ゼによって加水分解可能であり、 前記ペプチダーゼがアミノペプチダーゼであり、 前記第２の色素原性試験物質がＬ−プロリン−β−ナフ
   チルアミド、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド、及び
   Ｌ−フェニルアラニン−β−ナフチルアミドからなる群
   から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載
   の哺乳類口腔から採取した細菌菌叢中の歯周病病原性の
   疑いのある細菌の検査方法。
3. 【請求項３】哺乳類の口腔から採取した歯周病病原性細
   菌類を含有する疑いのある細菌標本を液体媒体中に分散
   させる段階； 歯周病病原性細菌類に起因する酵素的分解に対し感受性
   である発色団含有基質を前記液体媒体に添加する段階； 少なくとも所定数の前記微生物類が前記採取した細菌標
   本中に存在することを条件として発色団が放出されかつ
   観察可能であるように、前記細菌標本中の微生物類の酵
   素活性に対して感受性である第２の発色団含有基質を前
   記液体媒体に対して更に添加する段階であって、 ホスファターゼ活性による発色団の放出により生じる色
   が前記歯周病病原性細菌類の酵素活性に応答して生じる
   色と両立不可能でないことを条件として、前記第２の発
   色団含有基質が前記ホスファターゼ活性に対し特異的で
   あり、 前記液体媒体が5.0乃至8.5の間のpHを有し、 前記pHが約5.0乃至6.0の間にある場合、前記第２の発色
   団含有基質が酸ホスファターゼに対し特異的であり、前
   記第２の発色団含有基質がｏ−カルボキシフェノールリ
   ン酸エステルであり、 前記pHが約6.0乃至8.5の間にある場合、前記第２の発色
   団含有基質がアルカリホスファターゼに対し特異的であ
   り、 前記第２の発色団含有基質がｏ−ニトロフェノールリン
   酸エステル及びｐ−ニトロフェノールリン酸エステルか
   らなる群から選択される段階； 前記液体媒体を観察し、それによって、色の変化により
   前記細菌標本中における前記所定数の微生物類存在する
   かが示される段階；及び 前記観察に応答して、前記歯周病病原性細菌類の存在を
   示す色の変化について前記液体媒体を更に観察する段
   階； からなる哺乳類口腔から採取した細菌菌叢中の歯周病病
   原性の疑いのある細菌の検査方法。
4. 【請求項４】哺乳類の口腔から採取した歯周病病原性細
   菌類を含有する疑いのある細菌標本を液体媒体中に分散
   させる段階； 歯周病病原性細菌類に起因する酵素的分解に対し感受性
   である発色団含有基質を前記液体媒体に添加する段階； 少なくとも所定数の前記微生物類が前記採取した細菌標
   本中に存在することを条件として発色団が放出されかつ
   観察可能であるように、前記細菌標本中の微生物類の酵
   素活性に対して感受性である第２の発色団含有基質を前
   記液体媒体に対して更に添加する段階であって、 ペプチダーゼ活性による発色団の放出により生じる色が
   前記歯周病病原性細菌類の酵素活性に応答して生じる色
   と両立不可能でないことを条件として、前記第２の発色
   団含有基質が前記ペプチダーゼ活性に対し特異的であ
   り、 前記第２の発色団含有基質がＬ−プロリン−β−ナフチ
   ルアミド、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド、及びＬ
   −フェニルアラニン−β−ナフチルアミドからなる群か
   ら選択される段階； 前記液体媒体を観察し、それによって、色の変化により
   前記細菌標本中における前記所定数の微生物類存在する
   かが示される段階；及び 前記観察に応答して、前記歯周病病原性細菌類の存在を
   示す色の変化について前記液体媒体を更に観察する段
   階； からなる哺乳類口腔から採取した細菌菌叢中の歯周病病
   原性の疑いのある細菌の検査方法。
5. 【請求項５】（１）哺乳類の口腔由来の細菌菌叢中の歯
   周病病原性の疑いのある細菌類によって産生されたタン
   パク質加水分解酵素に対し特異的であって、トリプシン
   様酵素活性に対し特異的であるBANA、BAPNA、及び２−
   アルギニン−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマ
   リンからなる群から選択される第１の色素原性試験物
   質；及び （２）前記細菌菌叢によって産生された酵素類に対し非
   特異的であって、前記酵素ホスファターゼに対し特異的
   であるｐ−ニトロフェノールリン酸エステル、ｏ−ニト
   ロフェノールリン酸エステル、及びｏ−カルボキシルリ
   ン酸エステルからなる群から選択される第２の色素原性
   試験物質であって、微生物類の量に応答して酸素的分解
   を受ける第２の色素原性試験物質； からなる比色アッセイキット。
6. 【請求項６】前記第２の色素原性物質が酵素ペプチダー
   ゼに対し特異的であるＬ−プロリン−β−ナフチルアミ
   ド、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド、及びＬ−フェ
   ニルアラニン−β−ナフチルアミドからなる群から選択
   される請求の範囲第５項記載の比色アッセイキット。
7. 【請求項７】細菌菌叢の標本のタンパク質加水分解活性
   を測定する方法であって、前記方法が、前記タンパク質
   分解活性測定の信頼性を示すために、前記細菌菌叢の標
   本中に少なくとも所定数の微生物類が存在するかどうか
   を、ｐ−ニトロフェノールリン酸エステル、ｏ−ニトロ
   フェノールリン酸エステル、及びｏ−カルボキシルリン
   酸エステルからなる群から選択される第２の色素生産性
   試験物質によって、非特異的酵素活性であるホスファタ
   ーゼ活性を測定して示すことにより判定する段階からな
   る方法。
8. 【請求項８】前記非特異的酵素活性がペプチダーゼ活性
   であり、前記第２の色素生産性試験物質が、酵素ペプチ
   ダーゼに対し特異的であるＬ−プロリン−β−ナフチル
   アミド、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド、及びＬ−
   フェニルアラニン−β−ナフチルアミドからなる群から
   選択される請求の範囲第７項記載の細菌菌叢の標本のタ
   ンパク質加水分解活性を測定する方法。