KR100218228B1 - 치주질환병원체 세균의 단백질 분해 활성을 측정하기 위한 시스템 - Google Patents

Abstract

비색법 검정은, 예를 들면, 하치육 플라그(subgingival plaque)의 표본 내에서 치주질환병원체 세균에 의해 생산된 트립신-같은 효소에 의해 가수분해되어 발색단을 방출하는 색소생성 테스트 물질을 사용하여, 상기 표본내 단백질분해 활성의 존재를 검출한다. 발색단의 방출은 가시적 색변화와 관련되고 치주질환의 존재를 지시한다. 단백질분해 활성에 대한 색소생성 검정의 결과는 적어도 최소수의 미생물, 1,000,000-10,000,000 정도가 표본내에 존재한다면 신뢰할만하다. 본 발명의 비색법 검정은 불충분한 표본 크기의 결과로서 그릇된 음성 결과를 불러 일으키지 않도록 표본이 필요한 수의 미생물을 포함하는지의 여부를 지시한다. 표본내에 미생물의 효소 활성의 비특이적 마커, 예를 들어 포스파타아제 또는 펩티다아제 효소는 비특이적 효소 활성에 대한 감응으로 비특이적 색소생성 테스트 물질로부터 발색단을 방출시킴으로써, 표본 크기 충족을 지시한다.

Description

[발명의 명칭]

치주질환병원체 세균의 단백질 분해 활성을 측정하기 위한 시스템

[발명의 배경]

본 발명은 일반적으로 포유류에 있어 구강질환 존재를 결정하기 위한 시스템에 관한 것이며, 더욱 특별히, 사람 또는 동물에 있어 치주질환(periodontal disease) 활성 측정에 유용한 비색법 테스트에 관한 것이다.

치주 질환은 사람 치열의 주요한 고통이다. 오늘날, 카리에스 (충치)보다는 치주질환의 영향으로 더욱 많은 치아가 상실된다. 치주질환은 치아를 받쳐주는 치조골 및 치육(잇몸)에 해를 미치는 상태의 군이다. 치주 질환의 일차적 원인은 조직의 실제적인 손상을 결과시킬 수 있는 잇몸의 염증을 야기시키는 세균성 플라그(bacterial plague)이다. 몇몇 경우에서, 치조골의 손상은 치아가 치조골에 붙어있지 않은 곳에서 발생한다.

치주질환에선, 잇몸선(gum line) 위(상치육(supragingival)) 및 아래(하치육(subgingival)) 모두, 치아에 붙어있는 플라그내에 세균이 보통 다량으로 축적된다. 상기 플라그는 깊숙히 석회화되어 치석이라고 공지된 것을 형성할 수 있다. 상기 플라그 및 관련 치석은 치주질환의 특성인 치아와 치육 사이에 치은낭을 야기할 수 있다. 현재, 치주질환은 치은낭의 존재 및 깊이, 치조골에 대한 치아의 부착 손실, 및 잇몸의 치간유듀 출혈과 같은 임상관찰 척도에 의해 진단된다. 그러나 임상 관찰은 항상 신용할 수 있는 척도는 아니다. 예를 들면, 깊은 곳에 있는 치은낭은 반드시, 염증성 조직 손상을 야기시킬 수 있는 세균(치주질환병원체 세균(periodontopathic bacteria))에 의해 감염되는 것은 아니다. 불행하게도, 치은낭이 치주질환병원체 세균으로 감염되는지의 여부를 결정하기 위한 신용할 수 있고, 저렴하며 객관적인 수단이 지금은 없다.

진단 테스트의 부족은, 특히 치주 질환을 치료하기 의해 조치되어지길 전형적으로 요구되는 교정 측정의 엄격성 면에서 중대한 문제점이 되었다. 그러한 측정은 환부근을 노출시키고 회사조직을 제거하며 치근낭을 제거하기 위해 병든 잇몸 조직의 절개를 포함할 수 있다. 최근에, 더욱 조심성있는 외과처치가 개발되었으며, 이는 전형적으로 치아로부터 잇몸의 피부판을 떼내고, 새로 노출된 치아 표면에서 모든 치석 및 플라그를 세척한 다음, 세척된 표면 위에 치육을 다시 봉합하는 것을 포함한다. 상기 두 외과적 해결책은 환자들이 전문적인 지속 치료를 계속 받는 동안은 동등하게 작용한다.

전통적으로 치주질환은 숙주 조직이 세균 및/또는 세균의 산물에 감응하고 있다는 것을 의미하는, 잇몸의 염증으로서 정의되었으며, 치주질환은 의학적 견지에서 세균 감염처럼 치료되지 않았다. 예를 들면, 치주질환은 치아상의 플라그의 성장이 필연적이라고 생각되기 때문에 당분야에서 살균 약제로 치료되지 않았고, 플라그가 신체의 외부에 있기 때문에 전신 투여 약제에 의해 치료될 수 있는 것 같지 않았다. 더욱이, 치주질환이 한가지, 또는 몇몇의, 특히 해로운 세균에 특이적이라고는 믿어지지 않았다. 실제로, 약 200종의 미생물이 각종 플라그 샘플로부터 단리되었다. 따라서, 비특이적으로 치아의 세균성 침착물 축적을 제거하기 위한 장치를 요하는 기계적치료가 치주질환 치료에 적합한 수단이라고 생각되었다.

치주질환은 치주치은낭이 많은 그램 음성 혐기성 세균에 의해 군락화될 때 일어나는 치아지지 조직의 진행성 손실을 특징으로 한다고 보고되었다.(예를 들면, Loesche, 일동, "치주질환에 있어서 스피로페타균의 역활(Role of Spirochetes in Periodontal Disease), 치주질환에서 숙주-기생충 상호 작용(Host-Parasite Interaction in Periodontal Disease), Genco 및 Mergengagen, eds., 미국 미생물학 학회, 워싱톤, D.C., 1982, 62-75페이지 및 Slots, 사람의 치주질환에서 흑색 박테로이드속(black pigmented bacteroides)의 중요성(Importance of Black Pigmented Bacteroides in Human Periodontal Disease)," Ibid., 27-45 페이지 참조).

스피로헤타균 및 흑색 박테로이드속(BPB)은 검사시 치은낭이 출혈할 때 및 질병 진행의 임상적 증거가 있을 때 특별히 눈에 띈다. 따라서, 이들 혐기성 유기체에 대해 정해진 약물 치료의 가능성이 증가된다. 실제로, 혐기균에 대항하여 효과적인 살균제, 메트로니다졸(metronidazole)의 사용으로 유리한 결과가 관찰되었다. 메트로니다졸은 일리노이주 60680 시카고시, G.D. Searle & Co. 로부터 상표명 FLAGYL하에 및 뉴우저어지주 람세이시 Zenith Laboratories, Inc.로부터 일반형으로 구입가능하다. 치주질환의 치료시, 약물의 사용은 치은낭과 같은 임의의 임상적 증상이 약물-치료환자에게서 여전히 관찰될 수 있지만, 반드시 감염되었다고는 볼수 없기 때문에, 혐기성 치주 감염의 존재를 검출하는 객관적인 수단에 대한 필요를 강조하였다. 따라서, 당분야에서는 약물요법의 효능을 모니터하기 위한 간단하고 믿을 만한 테스트를 요구한다.

배양법에 의한 증가된 수의 스피로헤타균 및 BPB의 세균학적 진단이 현재 연구 실험실에서 행해질 수 있을 뿐이다. 그러나, 현재 기술로는 스피로헤타균의 특정 유형을 배양액내애서 성장시킬 수 없다.

스피로헤타균의 존재는 위상차 또는 암시야 집광경(集光鏡)을 사용하는 현미경 실험에 의해 결정될 수 있다. 치주질환의 존재를 결정하기 위해 사용된 선행기술은 운동성 형태, 주로 스피로헤타균의 존재를 측정하기 위해 플라그의 현미경 실험을 포함하고, 이로써 점증 또는 종결 요법에 대한 요구를 평가한다. Keyes, 일동. "Diagnosis of Creviculoradicular Infections," Ibid., 395-403페이지 및 Listgarten 일동, J,Clin.Periodontal, 8권 1222-138 페이지 (1981)참조. 그러나, BPB의 확인을 위한 어떤 유사한 현미경 절차도 존재하지 않는다. 따라서, 현재 치과의사/임상의학자는 치주질환과 상호 관계가 있는 세균학적 변수의 존재 또는 부재에 대한 필요한 검정 및 측정을 하기 위해 이용가능한 정교한 연구 실험실 설비를 갖추고/갖추거나 고가의 현미경 및 관련 비디오 장비의 구입에 의지해야만 한다.

당 분야의 현 상황을 고려하여, 혐기성세균으로 인한 치주질환 활성의 존재를 활인하기 위한 믿을만하고 저렴한 테스트 시스템에 대한 많은 요구가 있다. 부가적으로 치과의사/임상의학자에 의해 편리하게 실행될 수 있는 테스트 시스템에 대한 요구가 있다. 그러한 테스트 시스템은 환자의 상태를 알리고, 치료 효율성을 모니터하는데 상당한 가치가 있을 것이다.

치주질환의 존재를 측정할 수 있게 하는 간단하고 저렴한 테스트는 의심스러운 치주질환병원체 세균의 표본의 단백질분해 활성을 측정한다. 더욱 명확하게, 상기 검정 방법은 예를 들어 하치육 플라그의 표본에서, 트립신-같은 활성의 존재를 검출하도록 작용한다. 한 실시양태에서, 색소생성 테스트 물질은 표본내 트립신-같은 효소에 의해 가수분해되어 발색단을 방출할 수 있는, 발색단과 결합된 아미노산 또는 펩티드 기질을 포함한다. 상기 방출로 인한 색 변화의 검출은 상기 트립신-같은 활성이 존재하는지의 여부, 및 그 결과 치주질환을 야기할 수 있는 미생물이 존재하는지의 여부를 지시한다.

언급된 기술에서의 문제점은 테스트의 결과가 치주질환 병원체의 존재를 믿을 만하게 지시하기 위해선 최소한의 미생물이 표본내에 조재하여야 한다는 것이다. 따라서, 표본 자체가 작고, 결과적으로 최소수 미만의 미생물을 함유한다면, 테스트 절차는 치주질환-발생 미생물이 표본내에 조재할 지라도 그릇된 음성 결과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 치주질환의 존재를 결정하기 위한 개선된 테스트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 치주질환을 확인할 수 있고, 임상적 관찰을 요구하지 않아도, 아직은 임상학적으로 관찰되지 않는 초기에 그 질환이 검출될 수 있는 테스트 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 부가 목적은 트립신-같은 효소 활성을 소유하는 구상 표본내에 인터 알라(inter alla), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 박테로이드속 긴기발리스(Bacteroides gingivalis), 박테로이드속 포르시서스(forsythus), 카프노사이토파가 긴기발리스(Capnocytophaga gingivalis) 및 그밖의 유기체의 존재를 검출하기 위한 테스트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 치과의사/임상의학자의 진료소에서 비숙련 직원에 의해 실행될 수 있고, 고가의 또는 특수 장비를 요구하지 않는, 치주질환 테스트를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 치주질환에 대한 믿을만한 테스트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 개개의 환자에 대한 테스트 결과의 신빙성을 지적할 수 있게 하는 치주질환 테스트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감염력을 모니터하기 위해 사용될 수 있는 구강질환 테스트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 부가 목적은 유행병 조사, 선별 검진, 예컨대 군인 선별, 및 치주질한 환자에 대한 치료 효능 모니터를 위해, 환자의 장기 신체검사의 일부로서 쉽게 실행될 수 있는 치주질환 테스트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 호기적 조건 하에서 혐기균을 검출할 수 있는 치주질환 테스트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 표본의 배양을 요구하지 않고, 플라그의 샘플 또는 그 밖의 상기 표본을 직접 테스트할 치주질환 테스트를 제공하는 것이다.

부가적으로 본 발명의 목적은 치주질환 존재의 결정에 유용할 수 있는 편리한 검정 키트를 제공하는 것이다.

부가적으로 본 발명의 추가 목적은 치주질환의 존재가 색상 변화로 결정되는 비색법 시스템을 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

선술한 및 그밖의 목적, 특징, 및 잇점은 치주질환병원체 세균의 단백질분해 활성을 측정하는 개선된 테스트를 제공하는 본 발명에 의해 성취된다. 본 발명에 따라서, 포유류, 예를 들어 사람의 구강으로부터 세균상을 샘플링하고, 그다음 샘플의 단백질분해 활성을 색소생성 테스트 물질로 측정하는 단계들이 제공된다.

특히, 트립신-같은 활성은 타이. 덴티콜라(T.denticola), 비이, 긴기발리스(B. gingivalis), 비이. 포르시서스(B.forsythus), 및 씨이. 긴기발리스(C.gingivalis)와 같은 치주질환병원체가 상기 활성을 특징으로하기 때문에 측정된다. 의심스러운 치주질환 병원체에 의해 생산된 단백질분해 효소는, 트립신 저해제에 의해 저해되지 않고, 칼슘을 요구하지 않고, EDTA 에 의해 저해되지 않으며, 산성 pH에서 활성이기 때문에 트립신이 아니다. 그러나, 상기 효소는 트립신을 특정하기 위해 보통 사용되는 펩티드 기질(예, BANA)와 반응하므로, "트립신-같은(trypsin-like)"이라고 불리어졌다.

본 발명에 따라서, 표본은 믿을 만하 테스트 결과를 산출하기에 충분한 예정된 최소수의 미생물을 상기 표본이 함유하는지의 여부를 지시하는 비특이적 효소 마커에 대해 부가적으로 검정된다.

광범위한 테스트 결과의 분석은 표본내 세균 대략 백만 내지 천만 개가 단백질분해 효소 테스트에서 믿을 만한 결과를 산출하기에 충분하다는 것을 알렸다. 그러나, 표본 자체가 작고, 예를 들어 세균 백만개 미만 정도의 세균집단을 갖는다면, 테스트 절차는 전적으로 표본내에 너무 적은 수의 세균이 있기 때문에 음성 결과를 산출할 수 있다.

구강 상(oral flora)의 원은, 전부는 아니지만, 대부분이 몇몇 효소들을 소유하는 것 같다. 상기 흔한 비특이적 효소의 활성 측정은 미생물 자체의 존재, 및 그 결과, 표본 크기 충족의 척도로서 사용될 수 있다. 본 발명은 적어도 예정된 수의 미생물이 샘플내에 존재할 때 비특이적 마커 효소에 의해 효소적으로 분해되어 발색단을 발출하므로써 색변화를 관찰할 수 있는 제2의 발색단-함유 색소생성 테스트 물질을 제공한다. 한 예증적 실시양태에서, 비특이적 효소 마커는 구강의 상에서 발견된, 모두는 아니지만 대부분의 세균에 존재하는 포스파타아제이다. 포스파타아제 효소가 제2의 색소생성 테스트 물질과 반응하여 양성 결과를 얻는다면, 샘플내에는 트립신-같은 효소 테스트에 대한 정확하고 믿을만한 테스트 결과를 얻기에 충분한 유기체가 있다. 반면에, 포스파타아제 테스트가 음성이라면, 음성 트립신-같은 효소 테스트가 예상될 것이다. 이로써 임상의학자는 샘플이 너무 작으므로 환자를 다시 샘플링해야 한다는 것을 즉시 경고받게 된다.

포스파타아제 효소에 의해 효소적으로 분해될 수 있는 제2의 색소생성 테스트 물질의 특정한 실례는, 알칼리성 포스파타아제와 함께 양호한 결과를 제공하는 파라- 및 오르토-니트로페놀 포스페이트, 및 산성 포스파타아제와 함께 양호한 결과를 제공하는 0-카르복시페놀 포스페이트를 포함한다.

또 하나의 예증적 실시양태에서, 비특이적 효소 마커는 펩티다아제, 및 더욱 명확하게 아미노펩티다이제이다. 아미노펩티다아제에 의해 효소적으로 분해될 수 있는 전형적인 제2의 색소생성 테스트 물질은 L- 프롤린--나프틸아미드이다.

제2의 색소생성 테스트 물질은 트립신-같은 활성을 위해 색소생성 테스트 물질과 결합될 수 있다. 의심스러운 치주질환병원체 세균의 트립신-같은 활성을 측정하기 위한 특정에는 N-벤조일-DL-아르기닌-2-나프틸아미드(BANA) 및 벤조일-DL-아르기닌- P-니트로아닐리드(BAPNA)이다.

색소생성 테스트 물질들의 결합을 선택하기 위한 유일한 기준은 각 발색단의 방출에 의해 생산된 생산된 색상변화가 서로 구별될 수 있어야 한다는 것이다. 따라서, 하기에 더욱 완벽하게 서술되겠지만, BANA가 트립신-같은 활성을 측정하기 위해 사용된다면, 포스파타아제에 의해 가수분해되어 발색단을 방출하는 기질은 색상 적합성이고 유리하게 제2의 테스트 물질로서 사용될 수 있다. BAPNA가 트립신-같은 활성을 측정하기 위해 사용된다면, 아미노펩티다아제에 의해 가수분해될 수 있는 L-프롤린--나프틸아미드는 유리하게 제2의 테스트 물질로서 사용될 수 있다. 임의 실시양태에선, 효소 활성에 감응성인 색상 변화를 생산하기 위해 색상 전개제가 첨가된다.

본 발명의 키트 양상에서, 치주질환의 존재의 지시를 제공하기 위해 비색법 검정 키트가 제공된다. (1) 포유류의 구강으로부터 세균상내 의심 스러운 치주질환 병원체 세균에의해 생산된 단백질 분해 효소에 특이적인 제1의 색소생성 테스트 물질 ; 및 (2) 세균상에 의해 생산된 효소에 비특이적이며, 비생물의 양에 감응하여 효소적 분해를 받는 제2의 색소생성 테스트 물질을 갖는 키트가 제공된다.

제1의 색소생성 테스트 물질은 트립신-같은 효소적 활성에 특이적이고, BANA, BAPNA, 및 2-아르기닌-7-아미노-4-트리플루오로메틸 쿠마린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 제2의 색소생성 테스트 물질은 효소 포스파타아제에 특이적이고, P-니트로페놀 포스페이트, 0-니트로페놀 포스페이트, 및 0-카르복실 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 검정 키트 양상의 부가 실시양태에서, 제2의 색소생성 테스트 물질은 효소 펩티다아제에 특이적이고, L-프롤린--나프틸아미드, L-류우신--나프틸아미드, 및 L-페닐알라닌--나프틸아미드로 구성된 군으로부터 선택된다.

임의 실시양태에서, 색상 전개제를 갖는, 본 발명의 비색법 검정 키트가 제공된다.

색상 전개제는 패스트 가넷(fast garnet), 패스트 블루(fastblue), 및 p-디메틸아미노신남알데히드의 산성화 용액으로 구성된 군으로부터 선택된다.

[발명의 상세한 설명]

치주질환의 특징인 높은 수준의 유기체를 함유하는지가 의심되는 구강 표본은 의심스러운 치주질환-생산 유기채에 의해 생산된 효소에 특이적인 발색단-함유 기질에 적용된다. 티이, 덴티콜라, 비이, 긴기발리스, 비이, 포르시서스, 및 스피로헤타균은 기질을 가수분해하여, 그로써 발색단을 반응생성물로서 방출할 수 있는 펩티다아제 및/또는 단백질분해 효소를 생산한다. 그다음 상기 방출된 발색단은 비색법으로 관찰될 수 있다. 임의 실시양태에서, 다른 색소생성제, 또는 색상 전개제의 첨가가 요구된다.

효소적 조건에 감응하여 색상의 존재 또는 부재는 활성 치주질환과 관련된 세균조건 증가와 서로 관련된다. 치주질환과 관련된다고 공지된 세균 종중에는, 티이, 덴티콜라, 스피로헤타균; 비이. 긴기발리스, BPB 중 가장 악성임; 비이. 포르시서스, 진행성 손상 부위로부터 종종 단리된 유기체; 및 씨이. 긴기발리스, 당뇨병 환자의 치주질환과 관련된 유기체가 있으며; 상기 모두는 트립신 기질 N-벤조일-DL-아르기닌-2-나프틸아미드(BANA)의 가수분해에 의해 측정될 수 있는 트립신-같은 효소를 소유한다. 로에쉐(Loesche), J. Oral Microbiol. Immunol., Vol.1, 65-70페이지, (1986) 참조. 적어도 40종의 그밖의 플라그는 BANA 기질을 가수분해할 수 없지만, 상기 종은 치주질환 발생에 제일 중요한 것이라고 고려되지 않는다. 따라서, BNAN를 가수분해시키는 플라그의 능력은 플라그내 하나 이상의 상기 세균 종의 존재 및/또는 비례적 증가를 반영할 수 있고 그러므로 치주 플라그내 혐기균 감염의 측정을 제공한다.

특정한 예증적 실시양태에서, 펩티즈 기질 BANA는 무색이다. 표본내 세균과 함께 배양시, 발색단,-나프틸아미드는 아르기닌의 카르복실기와의 결합으로부터 방출된다. 패스트 가넷과 같은 색상 전개제의 후속 첨가는, 높은 수준의 효소 활성이 표본내에 있다면 밝은 오렌지색-적색의 형성을 결과시킨다. 황색의 발색은 음성 결과로서 해석된다. 대안적인 유리한 실싱양태에서, 펩티드 기질은 가수분해됨에 따라 색을 형성하는 벤조일-DL-아르기닌-P-니트로아닐리드(BAPNA)이며, 이로써 부가의 색상 전개제의 도움 없이 표본의 효소 활성을 증명한다.

물론, 효소 활성의 변동 정도로서, 및 치과의사/임상의학자에 의해 모니터되어야 하는 상태의 지시로서 해석될 수 있는 양성과 음성 테스트 사이에는 색상의 변화가 있다. 경험은 비색법테스트 시스템에서 색상발색 정도의 해석은 효소 활성의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 비교목적을 위해 표준 색표의 발색으로 쉽게 수정될 수 있다.

선술된 바와 같이, 발명의 간소성 및 경제성에 공헌하는 미합중국 출원 제740,097호의 발명의 특징 중 하나는, 표본 크기 또는 함량이 독립적으로 정량화되고 측정될 필요가 없다는 것이다. 그러나, 테스트 결과는 색상 발색을 위한 미생물의 임의 최소 수준에 따라 결정된다. 광범위한 테스팅은 표본내에 약 1,000,000-10,000,000 세균이 믿을 만한 결과를 얻은 것이라는 것을 제시하였다. 플라그의 표본은, 예를 들 면, 활성 치주질환이 존재한다면, 본 원에 서술된 기술에서 양성 효소 반응을 산출할 필수량의 유기체를 함유할 수 있다.

본 발명의 시스템의 바람직한 실시양태에서, 표본내 미생물의 양이 예정된 수를 초과하고, 그러므로, 단백질분해 효소 테스트에서 믿을 만한 결과를 산출하기에 충분하다는 것을 증명하기 위해 제2의 색소생성 테스트 물질이 제공된다. 유리하게, 제2의 색소생성 기질은 구상상내 발견되는, 모두는 아니지만, 대부분의 세균에 존재하는 효소에 의해 가수분해될 수 있으므로, 표본내에 존재하는 미생물의 양의 척도로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제2의 발색단-함유 기질의 효소적 분해는 샘플내에 약 1,000,000 이상 또는 단백지분해 효소 및/또는 펩티다아제 효소 테스트에서 정확하고 믿을 만한 결과를 얻기 위해 필요한 상기 그밖의 예정된 수의 미생물이 있다면 관찰가능 색상 변화를 생산한다. 물론, 예정된 최소수는 효소적 분해에 대한 색소생성 텍스트 물질의 감수성에 따라 결정된다.

프로테아제는 구강상에서 우세한 효소이다. 테스트 용액의 pH에 따라 결정되는, 알칼리성 및 산성 포스파타아제는 효소 작용의 비특이적 마커로서 사용될 수 있다. 포스파타아제는 인산 에스테르의 가수분해 및 합성 및 인산으로부터 포스페이트 기의 다른 화합물로의 이동을 촉매하는 효소이다. 그러므로, 포스파타아제의 작용에 의해 가수분해되어 발색단 니트로페놀을 방출할 수 있는 O-니트로페놀 포스페이트와 같은 포스페이트 기-함유 기질은 제2의 색소생성 테스트 물질로서 적합하다. 그밖의 예증적 예는 p-니트로페놀 포스페이트 및 0-카르복시 페놀 포스페이트이다. 물론, 구강의 세균상에서 흔히 발견되는 다른 효소들의 활성은 포스파타아제 활성 대신에 사용될 수 있다. 예증적 예는 프롤린, 류우신, 및 페닐알라니에 대한 아미노 펩티다아제이다. 그러나, 펩티다아제에 특이적이라고 선택된 제2의 색소생성 물질은 의심스러운 치주질환병원체 세균의 트립신-같은 활성을 지시하는 색변화를 관찰하는 임상학자의 능력을 방해할 색을 생산할 발색단을 방출하지 않아야 한다. 이것은 예를 들면, BAPNA에서 발견되는 니트로아닐리드 발색단이 사용되고 프롤린의-나프틸아미드 유도체가 제2의 색소생성 테스트 물질로서 사용된다면 성취될수 있다. 이러한 경우 BAPAN 가수분해에 대한 음성 반응은 무색인 반면, 프롤린 가수분해에 대한 양성 반응은 반응 혼합물에 페스트 가넷의 첨가 후 적색-오렌지색이다. 물론,-나프틸아비드 발색단을 함유하는 그밖의 기질이 색소생성 기질로서 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백한다.

특정한 예증적 실시양태에서, 플라그의 샘플을 멸균 큐렛을 사용하여 꺼내고 예비살균된 마개달린 작은 병내 격렬한 교반에 의해 수용액 내에 현탁시킨다. 디메틸 설폭시드(DMSO) 1㎖ 내에 BANA (미주리주 세인트 루이스시, 시그마 케미컬 컴퍼니 (Sigma Chemical Company)) 44㎎을 용해시킴으로써 BANA의 원액을 제조한다. 사용 전에, BANA 원액을 pH8.5의 0.1 M Tris(히드록시메틸) 아미노메탄 히드로클로라이드 완충액의 혼합물과 1:100의 부피비로 희석시킨다. 완충된 BANA 용액을 플라그 샘플에 첨가하고 밤새 항온 처리시킨다. 패스트 가넷 한 방울의 첨가는 약 5분 이내에, 발색시켰다.

실험실 결과는 BANA-샘플 용액의 pH가 약 5.0과 8.5 사이에서 변동 할 수 있다고 지시한다. 그밖의 완충액, 예컨대 소렌손(Sorenson)포스페이트 완충액 또는 EDTA를 가진 포스페이트 완충액을 사용할 수 있다. 상기 결과는 순수한 증류수내 비완충 용액 및 완충 용액이 작용한다는 것을 제시한다. 항온처리는 일반적으로 약 1시간 미만 (즉, 약 1-5분 정도) 내지 약 24시간 범위의 시간을 요구한다. 더욱이, 항온처리 온도는 약 25-60범위, 및 바람직하게 대략 37와 55사이여야 한다.

본 발명의 특정한 예증적 실시양태에서, 제2의 색소생성 테스트 물질, p-니트로페놀 포스페이트(pNPP)를 상기 서술된 바와 같이 제조된, 시약 BANA를 함유하는 수성, 알칼리성 완충 용액에 첨가한다. 대안적 실시양태에서, BANA를 pNPP 시약 후에 첨가할 수 있다. 그 다음 표본을 시약을 함유하는 용액에 첨가하고 용액을 약 37에서 항온처리시킨다. 상기 두 시약 모두 처음엔 무색이다. 그러나, 표본내 미생물로부터의 알칼리성 포스파타아제의 작용은 발색단 p-니트로페놀을 유리시킬 것이다. 충분한 양의 미생물이 샘플내에 존재한다면, 용액은 관찰할 수 있게 황색으로 변할 것이다. 황색의 발색시 테스트를 수행하는 임상의학자에게 표본 크기가 적절하고, 색상 전개제, 예컨대, 패스트 가넷이 첨가되어-나프틸아미드 발색단이 트립신-같은 효소를 생산하는 세균에 의해 BANA로부터 방출되었는지의 여부를 지시한다는 것을 확신시킨다.

그렇다면, 오렌지색-적색이 발색되어 표본 내에 치주질환 병원체의 존재를 지시할 것이다. 색이 황색인 채로 있다면, 치주질환 병원체의 존재가 금기(禁忌)된다. 그러므로 임상의학자에게 표본 크기가 너무 작기 때문이 아니라 치주질환 병원체의 부족으로 인해 황색이 결과된다는 것을 확신시킨다. 따라서, 불충분한 샘플 크기로 인한 그릇된 음성결과 가능성에 관해서 당분야에 존재하는 의혹은 방지된다.

BANA의 양성 가수분해에 의해, 스피로헤타균 및/또는 비이.긴기발리스, 씨이. 긴기발리스, 티이.덴티콜라, 및 비이. 포르시서스로 인한 혐기적 치주 감염의 결정은 또한 0-니트로페놀 포스페이트(ONP)의 혼입에 의해 개선된다. 상기는 ONP가 반응 혼합물의 pH에 따라 결정되는, 알칼리성 또는 산성 포스파타아제에 의해 가수분해될 수 있고, 플라그 샘플내에 존재할 것인 광범위한 플라그 세균 및 숙주 세포가 ONP를 소유한다는 사실에 기인한다. ONP의 가수분해는 약 1,000,000 세균이 샘플내에 존재할 때 양성 결과를 산출한다. 상기 세균 수는 플라그 샘플 대략 10㎍(습윤 중량)에 상응한다. 플라그 10㎍을 함유하는 모든 플라그 샘플은 양성 ONP 테스트 결과를 보일 것이다. 임상의학자가 육안으로 거의 볼 수 없을 정도로 작은 플라그 샘플을 꺼내어, BANA-ONP 반응 혼합물에 첨가한다면, 하기 순서의 색상 전개가 일어난다 :

음성 ONP 반응은 임상의학자에게 플라그 샘플이 너무 작아 믿을 만한결과를 낼 수 없다는 것을 알릴 것이다. 그러면 임상의학자는 환자로부터 샘플을 다시 취하거나, 치육 조직의 임상적 외관에 따라 결정하여 다음 번에 재샘플링할 것이다. 반면에, 양성 ONP 반응은 임상의학자에게 패스트 가넷 시약의 첨가로 진행하기에 충분한 플라그가 샘플내에 있다는 것을 지시한다. 패스트 가넷의 첨가 후 색 변화가 없다면, 임상의학자는 혐기성 유기체의 존재에 비해 프라그가 병들지 않았음을 결정하였다.

결합 BANA-ONP 혼합물을 사용하여 얻을 수 있는 발견의 예는 하기와 같다 : 치과 진료소에서 48면의 환자로부터 프라그 표본을 취하였고 상술된 결합 BANA-ONP 혼합물내에서 밤새 항온처리하였다.

색상 반응의 결과를 치간 유두 출혈, 치은낭 깊이, 및 치아의 치조골에 대한 부착의 손실과 같은 임상적 증후의 진찰로부터 임상적 발견 및 현미경 사용으로 스피로헤타균의 발견과 비교하였다. 결과를 하기 표 1에 제시한다. 환자를 진단하였던 임상의학자는 효소 테스트 결과의 어떠한 지식도 없이 그렇게 행하였다.

현미경 검사에 관해서, 완충액내에 분산된 샘플 10㎍를 2030㎜ 커버슬립 (cover slip)하에 유리 슬라이드 상에 놓고 봉하였다.

현미경 검사용 표본을 짜이스(Zeiss) 암시야 현미경에 의한 검사 이전에 무기 챔버내에 두었다는 것을 주목해야 한다. 어느쪽이 먼저 오더라도, 200 세균 또는 100오일 침지 대물 렌즈의 20시야를 계수하였다. 그다음 고출력시야 (hpf) 당 스피로헤타균의 수를 계산하였다. 1 고출력시야의 부피는 대략 1.8610^-6m1 이다.

상기 결과들은 결합 효소 검정이 임상적 상황을 믿을 만하게 반영 한다는 것을 명백히 지시한다. 감염이 진행될 때 효소 시약에 의해 결정된 모든 22 플라그는 치주질환의 입상적 진단과 일치하였다. BANA 효소 반응이 음성이었던 21 플라그(항목 3-5)에서, 상기 환자 21면 중 19명을 치주질환 치료 요구없이 임상적으로 진단하였다. 2개의 BANA 효소 음성 샘플(항목 5)은 o-니트로페놀 포스페이트 테스트와 부합하여 분석하기에는 너무 작으므로 비려졌고 임상의사에게 보다 큰 표본을 사용하여 다시 테스트하여야 한다는 것을 지시하였다.

대안적인 실시양태에서, 트립신-같은 효소 기질은 BAPNA로 구성되고 제2의 색소생성 테스트 물질은 L-프롤린 아미노 펩티다아제로 대한 나프틸아미드 유도체, N-L-프롤린--나프틸아미드(PNA)이다.

언급한 예에서, BAPNA 기질은 BANA에 대해 서술된 바와 같이 제조 되고 거기에 PNA를 첨가했다. 표본을 혼합물과 함께 밤새 항온처리 한다. 황색의 발색은 혐기균 감염을 지시한다. 발색의 실패는 표본이 너무 작다든가 혐기균 감염이 없다는 것을 지시한다는 점에서 불확실한 결과이다. 패스트 가넷과 같은 색상 전개제의 첨가는 상기 딜레마를 해결한다. PNA의 가수분해로 인한 오랜지색 내지 적색의 발색은 샘플내에 충분한 플라그가 존재했다는 것을 지시한다. 황색이 발색한다면, 플라그 샘플은 너무 작았다. 상기는 하기 다이아그램으로 도해된다.

물론, 비특이적 효소 반응에 의해 전개된 색상이 특이적 트립신-같은 효소 반응의 결과로서 전개된 색을 방해하지 않는 한, 그밖의 색소생성 테스트 물질은 본원에 서술된 것들 대신 대체될 수 있다. 부가의 특정예는 L-류우신 및 L-페닐알라닌의-나프틸아미드 유도체 및 산포스파타아제에 대한 기질인 o-카르복시페놀 포스페이트이다.

그러나, 그밖의 발색단-함유 기질도 본 발명의 실행에 사용될 수 있다는 것은 이해될 것이다. 트립신이 아르기닌 또는 리신의 단백질을 공격하므로, 상기 염기성 아미노산을 포함하는 그밖의 펩티드/발색단 배합물이 BANA 또는 BAPNA 대신 치환될 수 있다는 것은 분명하다. 예증적 예는 상술된 BANA 및 BAPNA 화합물이 입체이성질 동족체, 예컨대 L-BANA 및 L-BAPNA이다. 티이.덴티콜라 및 몇몇 비이. 긴기발리스 균주는 L-피롤리도닐--나프틸아미드에 대항하여 시험관내 활성이므로, 상기 비-펩티드 발색단은 혐기균 치주질환 감염의 존재 결정시 유용할 수 있다. 본원에 언급된, 모든 펩티드 발색단은 미합중국 미주리주 세인트 루이스의 시그마 케미컬즈와 같은 화학제품 공급업체로부터 구입될 수 있다.

색상 전개제에 관하여, 발색단의 방출을 비색법적으로 증명할 임의의 전개제가 본 발명의 실행에 사용될 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 예증적 예는 화학 명칭이 o-아미노-아조톨투엔-디아조늄 염인 패스트 가넷-gbc 염(시그마 케미컬즈, 미합중국 미주리주 세인트루이스시); 패스트 블루; 및 p-디메틸-아미노신남 알데히드의 산성화 용액을 포함한다.

대안적 실시양테에서, 2-아르기닌-7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 유도체와 같은 형광 발생 테스트 물질을 사용하여 단백질분해 활성을 측정할 수 있다. 그러므로 UV 광원으로 검출될 수 있는 형광으로서, 형광단의 방출에 의해 단백질분해 활성을 증병할 수 있다.

그러므로, 본 원에서 사용된 바 용어 "발색단(chromophore)"은 가시선 또는 자외선을 흡수하거나 형광하는 물질을 포함하는 것으로 널리 해석되어야 한다. 펩티드 기질과 형광단의 결합은 형광단이 발출될 때 UV 선 하에 관찰될 수 있는 색 변화의 생산을 결과시킬 것이다.

예를 들면 형광성 청색에서 녹색으로 스토크스 이동(Stokes shift)이 관찰될 것이다.

본 발명의 상기-서술된 특정한 실시양태의 이행시, 샘플링 기술은 하치육 플라그의 제거를 포함하였다. 원칙적으로, 본 발명의 목적에 효과적이라고 고찰되는 샘플링 기술은 당분야에 공지되는 임의의 방법일수 있고 병에 걸렸다고 의심되는 임의의 조직, 유체, 또는 그밖의 표본의 샘플링에 적용될 수 있으며 예로써, 하치육 플라그, 치육구 유체, 상치육 플라그, 경구 조직, 타액 또는 구강 행굼 거담제, 등을 포함한다는 것이 인지되어야 한다. 물론 타액 또는 구강 행굼 거담제는 임의공지 방법으로 사용하기 전에 농축될 수 있었다. 바람직하게, 임의의 분명한 치주질환 없이 환자의 각 제1구치의 근심 볼 인접 부위(mesial buccal approximal site)로부터 또는 사분원 (quadrant) 당 최고의 치주질환 관련 부위로부터 의심스러운 치주질환 표본을 제거할 것이다. 바람직하게, 샘플 부위에서 상치육 플라그를 제거하고 버릴 것이다. 여과지, 등을 치육구의 구멍에 넣어 모세혈관 작용에 의한 치육구액을 수집할 수 있다. 그다음 여과지로부터 단백질을 용리시키고 색소생성 테스트 물질에 적용 시킨다.

선술한 예증적 예는 구강 표본의 단백질분해 활성이 색소생성 테스트 물질(들) 및 표본을 함유하는 액체 용액내에서 측정되었던 실시양태에 관한 것이었지만, 표본의 효소 활성은 본 발명의 원칙에 따라 수많은 대안적 실시양태에 의해 측정될 수 있었다. 이행된 실시양태에서, 구강 표본 및/또는 색소생성 테스트 물질, 및 몇몇 실시양태에선, 색상 전개제를 흡수하거나 수용하기 위해 적어도 하나의 다공성 표면 부분에 실질적인 강성 담체가 제공된다. 다공성 물질은 여과지와 같은, 흡수성 섬유의 직조된 또는 직조되지 않은 물질일 수 있다.

본 발명에 따른 치주질화 테스트의 사용과 관련된 잇점 및 이득은 매우 많고 상업적으로 중요한 것으로 고려된다. 상기 방법은 치주질환 치료 뿐만 아니라 혐기균 감염의 존재 또는 부재의 초기 결정에 유용하다.

본 발명의 통례의 치근막염, 즉 만성 파괴적 치근막염을 확인하는데 특히 유용함은 물론이며, 이때 환자는 스피로헤타균, 티이. 덴티콜라, 비이. 긴기발리스, 비이. 포르시서스, 및 씨이. 긴기발리스가 상당히 증가됨을 보인다.

또한 본 발명의 테스트는 질병의 여러 가지 치료시기의 양적 평가에 도움이 되고 치료가 적합했는지 및 부가의 치료 양상이 정당화되는지의 여부를 결정하는데 도움이 될 수 있다. 상기 방법은 특히 재치료가 필요한지를 결정하기 위해 정기 검진시 사용하기 적합한다.

본 발명의 목적에 비추어, 본 테스트는 사람의 치주질환에 한정되지 않으며, 일반적으로 질병-원인 미생물이 포유류에 존재하는지의 여부 결정에 동등하게 적용될 수 있다는 것은 부가적으로 이해되어야 한다. 그러한 것으로서, 본 발명의 방법은 수의학에서의 적용을 발견할 것이다.

본 발명이 특정한 실시양태, 및 적용의 견지에서 서술되었지만 당업자 들은, 상기 언지에 비추어, 청구된 발명의 정신을 벗어나지 않거나 범위를 초과하지 않으면서 부가적인 실시양태를 초래할 수 있다. 따라서, 본 명세서내 설명은 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제의 되며 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (8)

1. 하기 단계들로 구성된 벙법 : (a) 포유류의 구강으로부터 다양한 미생물을 함유하는 세균상(細菌相; beacterial flora)의 샘플을 얻는 단계; (b) 적어도 예정된 수의 상기 미생물이 상기 세균상의 샘플내에 존재 한다면, 발색단이 방출되고 관찰될 수 있도록 상기 샘플내 미생물의 효소 활성에 의해 기수분해될 수 있는 비특이성 색소 생성 테스트 물질에 상기 샘플을 적용시킴으로써 상기 다양한 미생물에 있어서 미생물의 총수가 예정된 수를 초과 하는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (c) 상기 세균상내 의심스르운 치주질환병원체 세균에 의해 생산된 단백질 분해 효소에 특이적인 색소생성 테스트 물질을 사용하여, 상기 결정 단계에서 관찰가능한 발색단의 방출에 반응하여, 상기 세균상의 단백질 분해 활성을 측정하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 비특이성 색소생성 테스트 물질이 포스파타아제 또는 펩티다아제에 의해 가수분해될 수 있는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 색소생성 테스트 물질은 의심스러운 치주질환 병원체 미생물의 트립신-같은 효소 활성에 특이적인 단백질 분해효소에 특이적인 방법.
4. 하기 단계들로 구성된 방법 : 포유류의 구강으로부터 치주질환 병원체 세균을 함유 하는지가 의심 되는 세균 표본을 샘플링하는 단계; 상기 샘플링된 세균 표본을 액체 배지내에 분산시키는 단계; 상기 세균 표본내 치주질환 병원체 세균으로 인해 유발된 단백질 효소 분해에 영향받기 쉬운 발색단-함유 기질을 상기 액체 배지에 첨가하는 단계; 적어도 예정된 수의 미생물이 상기 세균 표본내에 존재한다면 발색단이 방출되고 관찰될 수 있도록 상기 세균 표본내 미생물의 효소 활성에 영향 받기 쉬운 비특이성 발색단-함유 기질을 상기 액체 배치에 더 첨가하는 단계; 상기 예정된 수의 미생물이 상기세균 표본내에 존재한다는 것을 나타내는 양성의 색상 변화에 대해 상기 액체 배지를 관찰하는 단계; 및 상기 관찰단계에서 양성의 색상 변화에 대해 반응하여, 고 비율 농도로의 상기 치주질환 병원체 세균의 존재를 지시하는 색상 변화에 대해 상기 액체 배지를 부가로 관찰하는 단계.
5. 하기로 구성된 비색법 검정 키트 : (1) 포유류의 구강으로부터의 세균상내 의심스러운 치주질환병원체 세균에 의해 생성된 단백질분해 효소에 특이성인 제1색소생성 테스트 물질; 및 (2) 상기 세균상에 의해 생성된 효소에 비특이성이며, 미생물의 양에 반응하여 효소적 분해에 적용되는 제2색소생성 테스트 물질.
6. 제5항에 있어서, 상기 제1색소생성 테스트 물질이 트립신-같은 효소활성에 특이성인 비색법 검정 키트.
7. 제5항에 있어서, 상기 제2색소생성 테스트 물질이 효소 포스파타아제 또는 펩티다아제에 특리성인 비색법 검정 키트.
8. 제5항에 있어서, 색상 전개제를 더 포함하는 비색법 검정 키트.