CN107607638B - 芳香族化合物的检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种芳香族化合物的检测方法，包括：提供重氮盐；使用所述重氮盐对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理，得到重氮衍生化产物；以及将所述重氮衍生化产物进行液相色谱‑质谱检测。本发明还提供一种试剂盒，用于通过液相色谱‑质谱检测芳香族化合物，包括重氮衍生化试剂，所述重氮衍生化试剂包括用于对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理的重氮盐或者所述重氮盐的制备原料中的至少一种。

Description

芳香族化合物的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别是涉及芳香族化合物的检测方法及试剂盒。
背景技术
具备结构分辨能力的液相色谱-质谱(LC-MS)检测方法已逐渐成为生物活性物质定量测试的主要方法之一。LC-MS检测方法在临床检测领域的应用也日趋广泛，尤其是对于小分子化合物的定量测试。在临床检测实际应用中，当被测物质浓度低时，对于检测方法的灵敏度要求就会提高。当血液样本量有限，例如样本是微量血样本(1μl～10μl血液量)或者干血样本(DBS)，检测方法的灵敏度将会限制定量测试的可行性。
芳香族化合物为带有苯环或者其他芳香环结构的化合物。很多生物活性物质都属于芳香族化合物，例如雌二醇、雌三醇、雌酮、胆红素、胆绿素、苯二氮
Figure GDA0002101358530000011
类药物、维生素B1、维生素B2等。芳香族化合物作为生物活性物质中的一个重要类别，其LC-MS检测方法时常在灵敏度方面遇到挑战。以雌二醇的LC-MS检测方法为例，有报道使用酰氯对雌二醇进行衍生化，但是这种衍生化方法只是针对具有羟基的芳香族化合物有效。而目前尚未报道有能够提高LC-MS检测灵敏度的芳香族化合物的普适性衍生化方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种兼具普适性和较高灵敏度的芳香族化合物的检测方法及试剂盒。
一种芳香族化合物的检测方法，包括：
提供重氮盐；
使用所述重氮盐对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理，得到重氮衍生化产物；以及
将所述重氮衍生化产物进行液相色谱-质谱检测。
在其中一个实施例中，所述重氮盐具有芳香环基团。
在其中一个实施例中，所述重氮盐具有苯基。
在其中一个实施例中，所述重氮衍生化处理包括使所述重氮盐与所述芳香族化合物进行重氮偶联反应。
在其中一个实施例中，所述待测样本为含水样本，所述重氮衍生化处理的步骤为使用所述重氮盐直接对所述含水样本进行所述重氮衍生化处理。
在其中一个实施例中，所述重氮盐具有在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种。通过所述重氮衍生化处理，使得到的重氮衍生化产物具有所述在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种。所述能够带负电荷的基团为本身带负电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团，所述能够带正电荷的基团为本身带正电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团。
在其中一个实施例中，所述本身带负电荷的基团包括磺酸盐基(SO3 -)及羧酸盐基(COO-)中的至少一种，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团包括磺酸基(SO3H)及羧酸基(COOH)中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述本身带正电荷的基团包括季铵基，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团包括氨基及巯基中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述重氮衍生化处理之后，进一步包括使用淬灭剂对所述未反应的重氮盐进行淬灭的步骤，所述淬灭剂能够与所述未反应的重氮盐的带正电荷的重氮根基团(-N2 +)反应，去除所述重氮根基团。
在其中一个实施例中，所述淬灭剂包括芳香族化合物。
在其中一个实施例中，使用的所述芳香族化合物包括苯酚、苯酚衍生物、萘酚、萘酚衍生物及苯胺衍生物中的一种或多种。
在其中一个实施例中，使用的所述芳香族化合物具有供电子基团。
一种试剂盒，用于通过液相色谱-质谱检测芳香族化合物，包括重氮衍生化试剂，所述重氮衍生化试剂包括用于对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理的重氮盐或者所述重氮盐的制备原料中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述重氮盐具有芳香环基团。
在其中一个实施例中，所述重氮盐具有苯基。
在其中一个实施例中，所述重氮盐具有在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种，所述能够带负电荷的基团为本身带负电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团，所述能够带正电荷的基团为本身带正电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团。
在其中一个实施例中，所述本身带负电荷的基团包括磺酸盐基(SO3 -)及羧酸盐基(COO-)中的至少一种，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团包括磺酸基(SO3H)及羧酸基(COOH)中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述本身带正电荷的基团包括季铵基，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团包括氨基及巯基中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述重氮盐的所述制备原料包括氨基化合物与亚硝酸或者亚硝酸的制备原料，所述亚硝酸的制备原料包括亚硝酸盐及酸。
在其中一个实施例中，还包括样本复溶液、样本稀释液、洗脱液、内标液、校准品溶液及对未反应的重氮盐进行淬灭的淬灭剂中的至少一种。
本发明提供的检测方法，采用重氮盐与芳香族化合物进行重氮衍生化反应，从而将重氮基引入芳香族化合物的分子结构中，得到重氮衍生化产物。在将待测样本中的芳香族化合物进行衍生化反应之后，分子结构中增加了容易带电荷的基团，改变了分析物的性质，可以提高分析物的极性使其利于离子化，从而可以提高离子化效率。重氮基团带有两个氮原子，可以使得衍生化之后的芳香族化合物易于质子化带正电荷，提高正离子模式离子化效率。芳香族化合物带有苯环或者其他芳香环结构，芳香环结构具有共性，可以发生亲电取代等反应。该方法不仅可以提高液相色谱-质谱对芳香族化合物的检测灵敏度，而且可以应用于所有的芳香族化合物，是一种利用液相色谱-质谱检测芳香族化合物的普适性的方法。应用范围广，可推广使用。
该方法中的重氮衍生化反应可以为水相反应，当待测样本为含水样本时，可以直接对该样本使用，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液等临床样本。其他液相色谱-质谱检测方法中将样本风干之后才能进行有机相的衍生化反应，相比之下，本方法操作更加简单便捷，节约时间的同时还可以避免过多的操作流程带来的待测样本损失。
优选的，当重氮盐具有能够带负电荷的基团时，使得衍生化之后的芳香族化合物能够电离带负电荷，可以提高质谱负离子模式检测时的离子化效率。液相色谱-质谱检测方法在负离子模式下排除杂质干扰能力更强，从而在检测血液样本这类成分复杂样本时可以加强被测物的检测灵敏度。
优选的，当重氮盐具有能够带正电荷的基团时，可以进一步提高质谱正离子模式检测时的离子化效率。
本发明提供的试剂盒在对芳香族化合物的液相质谱-色谱检测方法中具有本发明提供的检测方法的优点，同时还可以使对芳香族化合物的液相色谱-质谱的检测方法更加方便快捷。
附图说明
图1为本发明实施例衍生化测定芳香族化合物的方法示意图；
图2为本发明实施例衍生化的雌二醇的全扫描质谱图；
图3为本发明实施例未衍生化的雌二醇的全扫描质谱图；
图4为本发明实施例衍生化的雌二醇的单离子监测离子色谱图；
图5为本发明实施例未衍生化的雌二醇的单离子监测离子色谱图；
图6为本发明实施例衍生化的雌三醇的全扫描质谱图；
图7为本发明实施例未衍生化的雌三醇的全扫描质谱图；
图8为本发明实施例衍生化的雌三醇的单离子监测离子色谱图；
图9为本发明实施例未衍生化的雌三醇的单离子监测离子色谱图；
图10为本发明实施例苯酚淬灭苯磺酸重氮盐反应产物的全扫描质谱图；
图11为本发明实施例苯酚淬灭苯磺酸重氮盐反应产物的单离子监测离子色谱图；
图12为本发明实施例雌二醇的标准曲线图；
图13为本发明实施例雌三醇的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及技术效果更加清楚明白，以下结合附图对本发明的具体实施例进行描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明实施例提供一种芳香族化合物的检测方法，包括：
S100，提供重氮盐；
S200，使用提供的重氮盐对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理，得到重氮衍生化产物；以及
S300，将重氮衍生化产物进行液相色谱-质谱检测。
采用重氮盐与芳香族化合物进行重氮衍生化反应，从而将重氮基引入芳香族化合物的分子结构中，得到重氮衍生化产物。在将待测样本中的芳香族化合物进行衍生化反应之后，分子结构中增加了容易带电荷的基团，改变了分析物的性质，可以提高分析物的极性使其利于离子化，从而可以提高离子化效率。重氮基团带有两个氮原子，可以使得衍生化之后的芳香族化合物易于质子化带正电荷，提高正离子模式离子化效率。芳香族化合物是具有芳香环结构的化合物，优选是具有芳基的化合物。芳基可以为任何从简单芳香环衍生出的官能团或取代基，例如苯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基或哒嗪基等从六元芳香环衍生出的官能团，或者呋喃基、吡咯基、噻吩基、咪唑基或噻唑基等从五元芳香环衍生出的官能团，其中芳香环具有共性，可以发生亲电取代等反应。该方法不仅可以提高液相色谱-质谱对芳香族化合物的检测灵敏度，而且可以应用于所有的芳香族化合物，是一种利用液相色谱-质谱检测芳香族化合物的普适性的方法。应用范围广，可推广使用。
该方法中的重氮衍生化反应可以为水相反应，当待测样本为含水样本时，可以直接对该样本使用，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液等临床样本。其他液相色谱-质谱检测方法中将样本风干之后才能进行有机相的衍生化反应，相比之下，本方法操作更加简单便捷，节约时间的同时还可以避免过多的操作流程带来的待测样本损失。
在步骤S100中，提供的重氮盐优选具有芳香环基团。更优选的，重氮盐具有苯基。但是不局限于苯基。
优选的，重氮盐具有在进行液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团，通过所述重氮衍生化处理，使得到的重氮衍生化产物具有所述在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团。使得重氮衍生化产物可以在质谱负离子模式下进行检测。能够带负电荷的基团为本身带负电荷的基团或者在进行液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团，可以使衍生化之后的重氮化合物易于带负电荷，提高质谱负离子模式检测时的离子化效率。液相色谱-质谱检测方法在负离子模式下抗杂质干扰的能力更强，在检测复杂样本，例如血液样本的时候有利于提高被测物的检测灵敏度。
本身带负电荷的基团可以包括磺酸盐基(SO3 -)及羧酸盐基(COO-)等固有带电荷基团中的至少一种。在进行液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团包括磺酸基(SO3H)及羧酸基(COOH)中的至少一种。磺酸基(SO3H)及羧酸基(COOH)等能够在溶液中解离释放出氢离子，从而带有负电荷。
优选的，重氮盐具有在进行液相色谱-质谱检测过程中能够带正电荷的基团，通过所述重氮衍生化处理，使得到的重氮衍生化产物具有所述在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带正电荷的基团，进一步提高重氮衍生化产物在质谱正离子模式下检测的灵敏度。能够带正电荷的基团可以为本身带正电荷的基团或者在进行液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团，可以使衍生化之后的重氮化合物易于带正电荷，提高质谱正离子模式检测时的离子化效率，从而进一步提高使用其衍生化之后的重氮化合物的液相色谱-质谱检测方法的灵敏度。
本身带正电荷的基团包括季铵基等固有带电荷基团。在进行液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团包括氨基及巯基中的至少一种。氨基及巯基等能够在溶液中结合氢离子。季铵基(NR3 +)中N所连接的R为烃基，可以相同或不同。氨基可以包括NH2、NHR及NR2中的一种或多种，R为烃基，连接至同一氮原子的R可以相同或不同。巯基可以包括SH及SR。其中，R代表烃基。
重氮盐还可以包括其他基团，例如烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、羰基及磷酸基中的一种或多种。
上述基团可以通过任何形式任何数量化学键与芳香环基团连接，优选为σ单键。
应当理解，在步骤S100中，可以直接提供重氮盐；或者步骤S100可以包括：提供重氮盐的制备原料；以及利用重氮盐的制备原料制备重氮盐。
在一实施例中，重氮盐通过氨基化合物与亚硝酸之间的反应制取，提供的重氮盐的制备原料可以包括氨基化合物、反应所需要的溶剂及亚硝酸或者制备亚硝酸的原料。
优选的，氨基化合物为芳香胺类化合物，如苯胺、邻/对氨基苯磺酸、邻/对硝基苯胺或二氯苯胺等。
亚硝酸通常不稳定，因此步骤S100还可以包括：提供制备亚硝酸的反应原料；通过亚硝酸的反应原料反应制备亚硝酸；以及将制成的亚硝酸与氨基化合物进行反应制备重氮盐。制备亚硝酸的反应原料包括亚硝酸盐及酸。可选的，酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸及磷酸中的一种或多种。亚硝酸盐为亚硝酸钠或亚硝酸钾等。
可选的，反应所需要的溶剂包括水、氢氧化钠溶液或者碳酸钠溶液。可以用于溶解氨基磺酸以及氨基羧酸类的化合物，防止出现氨基磺酸以及氨基羧酸类的化合物在酸性介质中形成内盐沉淀，而无法进行后续反应的情况。
可选的，亚硝酸盐固体和氨基化合物固体可以事先混合，加入酸溶液进行“一锅化”反应制取重氮盐。
在步骤S200中，重氮衍生化处理可以包括重氮盐与芳香族化合物进行的重氮偶联反应。在其中一个实施例中，芳香族化合物与重氮盐之间的偶联反应可以表示为下述反应方程式：
Figure GDA0002101358530000081
优选的，表示为下述反应方程式：
Figure GDA0002101358530000082
在步骤S200中，待测样本可以为含水样本。重氮衍生化处理的步骤为使用重氮盐直接对含水样本进行重氮衍生化处理，也就是进行重氮衍生化反应。该实施例中重氮衍生化反应为水相反应，可以直接对临床样本使用，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液等，相比于其他液相色谱-质谱检测方法中将含水样本风干之后才能进行衍生化反应的有机相反应，操作更加简单便捷，节约时间的同时还可以避免过多的操作流程带来的待测样本损失。待测的含水样本可以是经过简单处理之后的含水样本，也可以是未经任何处理的含水样本。对待测含水样本的简单处理可以包括沉淀、离心、过滤、浓缩等。
优选的，在步骤S200后进一步包括：
S400，使用淬灭剂对未反应的重氮盐进行淬灭。重氮衍生化反应结束之后，可以使用淬灭剂与反应混合物中未反应的重氮盐进行淬灭。淬灭剂能够与重氮盐的带正电荷的重氮根基团(-N2 +)反应，通过消耗重氮根基团(-N2 +)，去除重氮根基团(-N2 +)，实现对重氮盐的淬灭效果。对未反应的重氮盐进行淬灭可以防止具有重氮盐干扰后续的检测。
优选的，淬灭剂包括芳香族化合物。
优选的，使用的芳香族化合物具有供电子基团。供电子基团可以是氨基、羟基、烷氧基及烷基中的一种或多种。供电子基团可以影响芳香环的电子云密度，使芳香环的部分位置的电子云密度增加，提高发生亲电取代反应的活性。供电子基团的邻位和对位电子云密度更容易增加，从而更加容易发生亲电取代反应。使用具有供电子基团的芳香族化合物对未反应的重氮盐进行淬灭，反应过程更加容易，在一定程度上保证对未反应的重氮盐淬灭的彻底性。当然，也可以通过添加过量的芳香族化合物对未反应的重氮盐进行淬灭来保证淬灭的彻底性。用于淬灭重氮盐的芳香族化合物可以包括苯酚、苯酚衍生物(如水杨酸)、萘酚、萘酚衍生物、苯胺衍生物(如N,N-二甲基苯胺)等化合物中的一种或多种。
淬灭剂并不局限于芳香族化合物，只要是可以消耗重氮盐中的重氮根基团(-N2 +)即可。优选的，淬灭剂淬灭重氮盐之后可以生成稳定的化合物，且生成的稳定化合物应该与待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理后得到的重氮衍生化产物不同，能够在液相色谱-质谱检测中被区分。可选的，淬灭剂还可以包括抗坏血酸、卤化物及具有活泼亚甲基的脂肪族化合物中的一种或多种。
重氮衍生化产物的定量分析可以采用内标法，并使用灵敏度比单离子检测更高的多反应检测扫描来进行定量测试。在一致的实验条件下，获取测试信号与初始被测物样品浓度的线性关系。测试信号可以是衍生化被测物的离子色谱峰面积与内标物的离子色谱峰面积的比值。初始被测物样品的浓度即为衍生化之前的被测样品的浓度。若测试信号与初始被测物样品浓度之间具有良好的线性关系，则可以推断该方法可以用于定量分析。
本发明实施例还提供一种试剂盒，用于通过液相色谱-质谱检测芳香族化合物，包括重氮衍生化试剂。重氮衍生化试剂可以用于对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理。重氮衍生化试剂可以包括重氮盐，从而使用重氮盐对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理；或者可以包括制备重氮盐所需要的原料，在使用过程中先由原料制备重氮盐，再使用制备的重氮盐对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理。
本发明实施例提供的试剂盒在对芳香族化合物的液相质谱-色谱检测方法中具有本发明提供的芳香族化合物检测方法的优点，同时还可以使对芳香族化合物的液相色谱-质谱的检测方法更加方便快捷。
本发明实施例提供的试剂盒还可以包括样本复溶液、样本稀释液、洗脱液、内标液、校准品溶液及对未反应的重氮盐进行淬灭的淬灭剂中的至少一种。
样本复溶液可以用来对干性的样本复溶，例如取得的干血点样本。样本稀释液可以用来对样本进行适当的稀释，以便进行检测前的样本处理。洗脱液用在液相色谱-质谱对样本的检测分析中。洗脱液可以包括蒸馏水、缓冲液、甲醇、乙腈等。内标液和校准品溶液用于对样本进行定量分析。校准品溶液用于在使用过程中对质谱质量轴进行校准。淬灭剂与步骤S400中描述的相同。
实施例1重氮盐的制备
称量31.5mg对氨基苯磺酸，完全溶于15mL质量分数为1％的NaOH溶液中，加入12mgNaNO2，再加入3mL 1M的HCl溶液，反应生成苯磺酸重氮盐。
实施例2雌二醇(Estradiol)与苯磺酸重氮盐的衍生化
S100，提供苯磺酸重氮盐。
S200，使用提供的苯磺酸重氮盐对芳香族化合物雌二醇进行衍生化处理，雌二醇的浓度为5μg/ml。反应方程式如下：
Figure GDA0002101358530000101
S300，将反应生成的雌二醇衍生物以及未衍生化的雌二醇使用LC-MS检测方法进行测试。请参阅图2、图3、图4及图5，负离子模式下利用全扫描质谱图检测待测样本中是否有衍生化及未衍生化的雌二醇，然后使用单离子监测离子色谱图进行定量测试。重氮衍生化方法将雌二醇单离子检测扫描定量测试信号显著提高。
实施例3雌三醇(Estriol)与苯磺酸重氮盐的重氮衍生化
S100，提供苯磺酸重氮盐。
S200，使用提供的苯磺酸重氮盐对芳香族化合物雌三醇进行衍生化处理，雌三醇的浓度为5μg/ml。反应方程式如下：
Figure GDA0002101358530000102
S300，将反应生成的雌三醇衍生物以及未衍生化的雌三醇使用LC-MS检测方法进行测试。请参阅图6、图7、图8及图9，负离子模式下利用全扫描质谱图检测待测样本中是否有衍生化及未衍生化的雌三醇，然后使用单离子监测离子色谱图进行定量测试。重氮衍生化方法将雌三醇单离子检测扫描定量测试信号显著提高。
实施例4衍生化与未衍生化定量测试信号比较
对雌二醇的衍生化步骤与实施例2相似。对雌三醇的衍生化步骤与实施例3相似。不同之处在于本实施例中雌二醇和雌三醇的浓度分别为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml三个梯度。表1为雌二醇及雌三醇的衍生化与未衍生化两者的定量测试信号比较。
表1为雌二醇及雌三醇的衍生化与未衍生化样本的定量测试信号比较。
Figure GDA0002101358530000111
可以看出，衍生化的雌二醇的色谱峰面积是未衍生化的雌二醇色谱峰面积的数倍至数十倍。而衍生化的雌三醇的色谱峰面积是未衍生化的雌三醇色谱峰面积的数十倍至数百倍。在检测条件基本一致的情况下，灵敏度可以用质谱图的响应值，即离子色谱图上的峰面积进行比较。雌二醇的LC-MS检测灵敏度提高了1个数量级，雌三醇的LC-MS检测灵敏度提高了2个数量级。当被测物的浓度较低时，峰面积的比值优势更明显。可见LC-MS对衍生化的雌二醇及衍生化的雌三醇具有更高的检测灵敏度。有理由推断，该重氮衍生化方法可以将待测样本中芳香族化合物的LC-MS检测灵敏度提高更高的数量级。
实施例5未反应的重氮盐的淬灭
S400，雌二醇与苯磺酸重氮盐进行重氮衍生化反应之后使用苯酚淬灭过量的苯磺酸重氮盐。请参阅图10和图11，雌二醇与苯磺酸重氮盐衍生化之后有剩余的苯磺酸重氮盐。使用苯酚对剩余的苯磺酸重氮盐进行了淬灭。可以观察到明显的重氮盐淬灭产物的质谱峰(见图10全扫描质谱图)和色谱峰(见图11离子色谱图)，其中两个色谱峰分别为来自苯酚邻位和对位重氮化得到的同分异构体。在样本测试中，可以利用LC出峰时间差异将重氮盐淬灭产物导入旁支液路，消除其对于LC-MS测试的影响。
实施例6重氮衍生化方法进行定量测试的线性分析
使用灵敏度比LC-MS单离子检测扫描更高的LC-MS多反应检测扫描来进行定量测试，分别以衍生化Estradiol-13C3,Estriol-13C3作为内标校准样本前处理损失及LC-MS离子化效率变化。制备1mg/L的雌二醇与雌三醇混标，2倍稀释12个梯度水平，浓度范围为0.49ng/mL～1000ng/mL(外加空白对照组，不含雌二醇和雌三醇，改用甲醇代替)。以测试信号为Y轴，对应的初始被测物样品浓度为X轴，进行权重为1/X的加权线性拟合得到标准曲线方程。请参阅图12及图13，初始被测物雌二醇及雌三醇的浓度范围均为0.49ng/ml～1000ng/mL，在此范围内线性关系优良，R2>0.99。其中，拟合得到的
雌二醇的相关线性关系为：Y＝0.000661+0.00399*X，R2＝0.993；
雌三醇的相关线性关系为：Y＝0.0232+0.0628*X，R2＝0.992。
有理由推断，这种具备普适性的对于芳香族化合物的衍生化方法可以用于微量血样本(1μl～10μl血液量)，或者唾液样本的定量测试。为了防止样本基质中可能存在的芳香族化合物消耗重氮盐衍生化试剂，可以加入过量的重氮盐衍生化试剂来消除这种影响。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (18)

1.一种芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，包括：
提供重氮盐，所述重氮盐具有芳香环基团；
使用所述重氮盐对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理，得到具有重氮基的重氮衍生化产物，所述重氮衍生化产物具有在进行液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种，所述芳香族化合物为苯酚、苯酚衍生物、萘酚、萘酚衍生物及苯胺衍生物中的一种或多种；以及
将所述重氮衍生化产物进行液相色谱-质谱检测。
2.根据权利要求1所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述重氮盐具有苯基。
3.根据权利要求1所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述重氮衍生化处理包括使所述重氮盐与所述芳香族化合物进行重氮偶联反应。
4.根据权利要求1所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述待测样本为含水样本，所述重氮衍生化处理的步骤为使用所述重氮盐直接对所述含水样本进行所述重氮衍生化处理。
5.根据权利要求1所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述重氮盐具有在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述能够带负电荷的基团为本身带负电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团，所述本身带负电荷的基团包括磺酸盐基(SO3 -)及羧酸盐基(COO-)中的至少一种，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团包括磺酸基(SO3H)及羧酸基(COOH)中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述能够带正电荷的基团为本身带正电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团，所述本身带正电荷的基团包括季铵基，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团包括氨基及巯基中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述重氮衍生化处理之后，进一步包括使用淬灭剂对所述未反应的重氮盐进行淬灭的步骤，所述淬灭剂能够与所述重氮盐的带正电荷的重氮根基团(-N2 +)反应，去除所述重氮根基团。
9.根据权利要求8所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述淬灭剂包括芳香族化合物。
10.根据权利要求9所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，使用的所述芳香族化合物包括苯酚、苯酚衍生物、萘酚、萘酚衍生物及苯胺衍生物中的一种或多种。
11.根据权利要求9所述的芳香族化合物的液相色谱-质谱检测方法，其特征在于，使用的所述芳香族化合物具有供电子基团。
12.一种试剂盒，用于通过液相色谱-质谱检测芳香族化合物，其特征在于，包括重氮衍生化试剂，所述重氮衍生化试剂包括用于对待测样本中的芳香族化合物进行重氮衍生化处理，得到具有重氮基的重氮衍生化产物的重氮盐或者所述重氮盐的制备原料中的至少一种，所述重氮衍生化产物具有在进行液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种，所述重氮盐具有芳香环基团，所述芳香族化合物为苯酚、苯酚衍生物、萘酚、萘酚衍生物及苯胺衍生物中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述重氮盐具有苯基。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述重氮盐具有在进行所述液相色谱-质谱检测过程中能够带负电荷的基团和能够带正电荷的基团中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述能够带负电荷的基团为本身带负电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团，所述本身带负电荷的基团包括磺酸盐基(SO3 -)及羧酸盐基(COO-)中的至少一种，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过电离产生负电荷的基团包括磺酸基(SO3H)及羧酸基(COOH)中的至少一种。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述能够带正电荷的基团为本身带正电荷的基团或者在进行所述液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团，所述本身带正电荷的基团包括季铵基，所述在进行液相色谱-质谱检测过程中通过质子化产生正电荷的基团包括氨基及巯基中的至少一种。
17.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述重氮盐的所述制备原料包括氨基化合物与亚硝酸或者亚硝酸的制备原料，所述亚硝酸的制备原料包括亚硝酸盐及酸。
18.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还包括样本复溶液、样本稀释液、洗脱液、内标液、校准品溶液及对未反应的重氮盐进行淬灭的淬灭剂中的至少一种。
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