FR2489839A1 - Dosage enzymatique de l'anticorps du recepteur de l'acetylcholine, et necessaire de dosage - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE DOSAGE DE L'ANTICORPS DU RECEPTEUR DE L'ACETYLCHOLINE DANS UN ECHANTILLON, QUI CONSISTE A FAIRE REAGIR LE RECEPTEUR DE L'ACETYLCHOLINE AVEC UN PRODUIT DE CONJUGAISON TOXINEB-GALACTOSIDASE, A AJOUTER LE SPECIMEN AU MELANGE REACTIONNEL POUR QU'IL REAGISSE AVEC LUI, A AJOUTER AU MELANGE UN ANTICORPS SE CONJUGUANT AVEC LE RECEPTEUR DE L'ACETYLCHOLINE, PUIS A SOUMETTRE LE MELANGE A UNE SEPARATION DES PHASES SOLIDE ET LIQUIDE ET A DETERMINER L'ACTIVITE DE B-GALACTOSIDASE DANS LE CONSTITUANT SOLIDE OU LIQUIDE. LE DOSAGE DU RECEPTEUR DE L'ACETYLCHOLINE EST UN PROCEDE DE DIAGNOSTIC DE LA MYASTHENIE CHEZ L'HOMME.

Description

24ft839

La présente invention concerne un procédé de dosage en-

zymatique de l'anticorps du récepteurde l'acétylcholine, et,

un nécessaire pour le dosage enzymatique. Le dosage du récep-

teur de l'acétylcholine, constituant l'objet de l'invention,

fait partie d'une méthode de diagnostic permettant de déter-

miner la myasthénie chez l'homme.

On a récemment trouvé que le récepteur de l'acétyl-

choline (appelé ci-après "Ach-R") est classé comme Ach-R

nicotinique et Ach-R muscalinique, et que le Ach-R nicoti-

nique se conjugue de façon irréversible avec 1' a -bungaro-

toxine qui est une toxine de Bungarus multicinctus dans la famille des serpents, et qu'un Ach-R nicotinique de pureté

élevée peut être obtenu en utilisant cette toxine, par chro-

matographie d'affinité ou filtration sur gel. I1 a également été prouvé que Ach-R est un constituant impliqué dans la

myasthénie chez l'homme.

En outre, actuellement, on est encore incertain de l'effet fonctionnel de Ach-R muscalinique, bien qu'il ait été isolé et purifié. I1 existe certaines différences entre Ach-R

de la synapse et celui des nerfs périphériques.

Par ailleurs, l'Ach-R nicotinique sus-mentionné se conjugue non seulement avec 1' a-bungarotoxine, mais avec d'autres neurotoxines de serpent, comme l'érabutoxine, la toxine provenant de Laticauda semifasciate; et avec les

toxines a et ', toxines provenant du cobra (Naja niqri-

collis et Naja naja (Indien)), et la transmission de l'exci-

tation par l'intermédiaire de l'Ach-R est bloquée par suite.

En outre, la myasthénie est considérée à l'heure actuelle comme une maladie auto-immunologique reliée au thymus, aux lymphocytes et à Ach-R, et on a trouvé qu'il existe un titre

élevé d'anticorps du récepteur de l'acétylcholine (appelé ci-

après "anticorps de Ach-R") dans le sérum sanguin de patients myasthéniques. Ainsi, on émince du muscle fémoral d'un humain décédé de sclérose latérale amyotrophique, on traite avec de la solution à 1 % de Triton X-100 pour solubiliser son Ach-R et on centrifuge à 105G pendant 60 minutes. On utilise comme échantillon de Ach-R le liquide surnageant, que l'on traite

préalablement avec de la [125I] - a -bungarotoxine, addi-

tionnée d'un spécimen (par exemple du sérum), laissée réagir

pendant une nuit à 41C et additionnée de sérum IgG anti-

humain de lapin comme anticorps anti-IgG, pour former un pré-

cipité d'anticorps de Ach-R conjugué à la [ 125Il -a -bunga- rotoxine dans le sérum. On dose ainsi l'anticorps de l'Ach-R

dans le sérum sanguin en déterminant la radioactivité du pré-

cipité séparé. La valeur de l'anticorps est représentée par

le nombre de moles d'l -bungarotoxine conjuguées à l'anti-

corps de Ach-R par litre de sérum. Les valeurs moyennes ont été considérées comme étant 105 nM dans un cas sérieux, 50 nM dans un cas moyen et 2,5 nM dans le type atteignant le muscle des yeux, avec des valeurs médianes de 75,9 nM dans le cas

sérieux, 53 nM dans les cas moyens, 15,5 nM dans les cas fai-

bles et 0,25 nM dans le type atteignant les muscles des yeux.

Cependant, le dosage utilisant un tel composé de mar-

quage radioactif n'est pas intéressant pour un certain nombre de raisons. En particulier, la manipulation de substances

radioactives présente de nombreux problèmes, et tout particu-

lièrement dès dangers. La valeur normale de la radioactivité du composé marqué par la substance radioactive varie au cours du temps. Un tel composé est coûteux. En outre, il est peu commode en ce que l'activité immunologique du composé marqué

tend elle-même à se détériorer en raison de sa radioactivité.

Même après la détermination, des dangers considérables sont impliqués en raison de la radioactivité. Ce mode opératoire

ne peut donc être effectué que dans des conditions de perfor-

mance et de sécurité élevées.

En tant que moyen histochimique, on connait un procédé

utilisant la peroxydase o on effectue la fixation morpholo-

gique sur tissu en utilisant un produit conjugué a.-bungaro-

toxine/peroxydase. Mais la méthode à la peroxydase n'est pas

satisfaisante en ce qui concerne son caractère de reproducti-

vité, vraisemblablement en raison de la détérioration des activités de 1' a-bungarotoxine et de la peroxydase au cours

de la formation du produit conjugué a-bungarotoxine/peroxy-

dase. On pense que les raisons détaillées de ce caractère de reproductibilité non satisfaisant sont les suivantes:

d'abord, Ach-R est soumis à un changement allostérique spéci-

f ique de sa structure quand il se conjugue avec une neuro-

toxine de serpent, comme 1' a -bungarotoxine. La substance radioactive de marquage classique ne nuit pas au changement de structure allostérique, car elle a un poids moléculaire

suffisamment faible par rapport à la neurotoxine de serpent.

En conséquence, un tel changement de structure au cours de la conjugaison de la neurotoxine de Ach-R permet une conjugaison

suffisamment facile de l'anticorps de Ach-R au produit conju-

gué substance radioactive de marquage/a-bungarotoxine/Ach-R.

L'utilisation d'une substance de marquage ayant un poids moléculaire supérieur, comme la peroxNdase, à la place de la

substance radioactive, nuit au changement de structure allo-

stérique spécifique qui est essentiel à la conjugaison. On

pense que ceci est la raison du caractère reproductible infé-

rieur. Il n'est donc pas évident de déterminer quel type de

substance de marquage doit être choisi, si le produit conju-

gué substance de marquage/a -bungarotoxine est réactif sur le plan immunologique à Ach-R, et si le produit conjugué est

réactif à l'anticorps de Ach-R.

Les présents inventeurs ont étudié de façon exhaustive le procédé et le nécessaire de dosage pour obtenir une bonne

sécurité et d'excellentes caractéristiques de reproductibi-

lité, en ce qui concerne le dosage de l'anticorps de Ach-R dans un échantillon comme du sérum sanguin, indépendamment des divers problèmes incertains. Ils ont trouvé au-delà de ce qu'ils attendaient qu'un produit conjugué,en tant quesubstance de marquage, obtenu à partir d'une neurotoxine de serpent et

d' 6-galactosidase qui a cependant un poids moléculaire net-

tement supérieur à celui de la substance radioactive classi-

que, de la structure protéinée par elle-même et de la struc-

ture allostérique particulière,en utilisant un agent de con-

jugaison bifonctionnel tel que représenté par la formule (II)

R1 - X - R2 (II)

(o R1 est un groupement fonctionnel ayant une réactivité vis-à-vis du groupement amino de la molécule de neurotoxine de serpent qui peut se conjuguer de façon spécifique avec Ach-R; R2 est un groupement fonctionnel ayant une réactivité

vis-à-vis du groupement thiol de la molécule de 5 -galactosi-

dase; et X est un groupement d'espacement), a une excellente aptitude de conjugaison vis-à-vis de Ach-R. Ils ont en outre trouvé que la e galactosidase macromoléculaire ne nuit pas au changement de structure allostérique spécifique qui est essentiel pour la conjugaison de Ach-R à l'anticorps de Ach-R, et de ce fait la conjugaison avec l'anticorps de Ach-R peut s'effectuer de façon satisfaisante. Ils ont en outre

établi que l'anticorps de Ach-R peut être dosé par voie enzy-

matique de façon satisfaisante, en conjugant l'anticorps de Ach-R au produit conjugué de Ach-R et d'un produit conjugué

neurotoxine de serpent/ e-galactosidase, en ajoutant au sys-

tème réactionnel un anticorps se conjugant à l'anticorps de

Ach-R, en séparant les phases solide et liquide pour obte-

nir les constituants solide et liquide, et en déterminant l'activité de 5galactosidase dans l'un ou l'autre ou dans

les deux. constituants.

La présente invention est basée sur les découvertes mentionnées précédemment, et le but de l'invention est de fournir un procédé de dosage de l'anticorps de Ach-R dans un échantillon, procédé qui consiste à faire réagir Ach-R avec un produit conjugué toxine/! -galactosidase représenté par la formule-générale (I), (Toxine-)-"B - X - B2 - - -Gal) (I) (o "Toxine" est le reste d'une molécule de neurotoxine de serpent qui peut se conjuguer de façon spécifique avec

Ach-R; "-Gal" est le reste de la molécule de 3 -galacto-

sidase; B1 et B2 sont des groupements de conjugaison identi-

ques ou différents; et X est un groupement d'espacement), dans un milieu aqueux, à ajouter l'échantillon au mélange réactionnel pour la réaction, puis à ajouter au mélange un anticorps pouvant se conjuguer à l'anticorps de Ach-R pour la réaction, puis à séparer les phases solide et liquidé et à déterminer la -galactosidase dans le constituant solide

ou liquide, et à fournir un nécessaire de dosage de l'anti-

corps de Ach-R comprenant au moins Ach-R, un produit de conjugaison toxine/3 -galactosidase de formule (I), (Toxine-- B1 - X - B2 -- 8 -Gal) (I)

(o Toxine, S-Gal, B1, B2 et X sont tels que définis précé-

demment), et un anticorps se conjugant à l'anticorps de

Ach-R.

L' Ach-R utilisé dans la présente invention peut être

du Ach-R nicotinique séparé d'un organisme vivant fonction-

nant à la choline, par exemple à partir d'un organe contenant de l'Ach-R, comme les muscles du squelette des rats, des

lapins, des chiens et des chats. En général, l'organe conte-

nant Ach-R peut être émincé dans un milieu aqueux, par exem-

ple dans une solution tampon, homogénéisé et centrifugé. Le précipité résultant peut être additionné d'une solution de

Triton X-100, de Tween 80, ou de sel de sodium d'acide déso-

xycholique ou d'acide cholique pour assurer la solubilisation de Ach-R en vue d'obtenir une fraction solubilisée contenant Ach-R. Si nécessaire, Ach-R peut être séparé et purifié de la

fraction solubilisée le contenant, en effectuant une chroma-

tographie d'affinité pour obtenir Ach-R, une centrifugation

avec gradient de densité au sucre de canne, ou une chromato-

graphie sur tamis moléculaire. En outre, dans la chromatogra-

phie par affinité, on peut utiliser un support d'affinité o une neurotoxine de serpent, comme l'érabutoxine de Lacticauda semifasciate, est conjuguée au gel constituant le substrat, comme le gel d'agarose. Ou bien, on peut utiliser un support d'affinité dans lequel un ligand ayant un groupement ammonium

quaternaire, comme un groupement p-triméthylammonium-

anilino, triméthylammonium-propylamino, p-triméthylammonium-

méthyl-anilino et p-triméthylammonium-benzoyle, est intro-

duit dans le gel constituant le substrat. Dans l'étape d'élution, une solution contenant de la carbamylcholine, de l'hexaméthonium, du décaméthonium, du benzaquinonium, ou autres, peut être utilisée pour obtenir les fractions actives. Dans le produit conjugué toxine/e galactosidase qui est utilisé dans la présente invention et est représenté par la formule générale (I), la toxine peut être une quelconque neurotoxine de serpent ayant une aptitude à la conjugaison

spécifique avec Ach-R, comme l'a -bungarotoxine, l'érabuto-

xine, la toxine a, la toxine B, etc. En particulier, l'a -

bungarotoxine est intéressante car elle présente une réacti-

vité irréversible forte dans la conjugaison avec Ach-R.

En outre, un quelconque groupement fonctionnel peut

être introduit au préalable sur ces toxines ou sur le e -

galactosidase. Par exemple, un groupement aldéhyde, amino ou

thiol peut être introduit en utilisant un réactif d'introduc-

tion de groupement fonctionnel, comme un dialdéhyde, par

exemple le glutaraldéhyde et l'adipaldéhyde, un dérivé réac-

tif, par exemple un chlorure d' -amino-acide, un dérivé

réactif d'un acide dicarboxylique avec une diamine, par exem-

ple l'hexaméthylènediamine et la décaméthylènediamine, l'an-

hydride S-acétylmercaptosuccinique, et le 2-aminoéthanethiol avec un dialdéhyde, dans un milieu inerte, par exemple le

méthanol, l'éthanol, l'acétone, le diméthylsulfoxide, le di-

méthylformamide, le dioxane, ou leurs solutions aqueuses ou une solution dans une solution tampon, sous refroidissement

ou à la température ambiante.

Pour préparer le produit de conjugaison toxine/e -

galactosidase représenté par la formule générale (I) par con-

jugaison d'une toxine et de e-galactosidase, on utilise un

agent de conjugaison qui est choisi selon les types des grou-

pements amino, hydroxy, carboxy ou thiol que possèdent les

molécules de toxine et de B-galactosidase, ou des groupe-

ments aldéhyde, amino ou thiol que l'on a introduits sur eux.

Comme agent de conjugaison, on peut citer à titre d'exemple divers composés multifonctionnels connus, par

exemple les diisocyanates comme le diisocyanate d'hexaméthy-

lène et le diisocyanate de 2,4-toluène; les diisothio-

cyanates comme le diisothiocyanate d'hexaméthylène; les dialdéhydes comme le succinaldéhyde, le glutaraldéhyde et

l'adipaldéhyde; le N,N'-éthylènebismaléimide; le N,N'-o-

phénylènedimaléimide; la bisdiazobenzidine; les N,N'-poly-

méthylènebisisodiacétamides; le malonimidate de diéthyle,

l'adipinimidate de diméthyle; les acides sulfure-carboxyli-

ques comme l'acide 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionique, l'acide 3-(2'pyridyl-N-oxyde-dithio)propionique, et l'acide 6-N- [3-(2'-benzothiazolyldithio)propionyll caprique; et leurs dérivés réactifs comme les esters de succinimide, les

esters p-nitrophényliques et les chlorures et imidates d'aci-

de (voir la demande de brevet japonais n 85900/1978); et

les acides maléimide-carboxyliques comme l'acide maléimide-

benzoique, l'acide maléimide-phénylacétique et l'acide malé-

imide-phénylpropionique; et leurs dérivés réactifs. On pré-

fère particulièrement les agents de conjugaison bifonction-

nels représentés par la formule générale (II),

R1 - X - R2 (II)

dans laquelle R1 est un groupement fonctionnel qui réa-

git avec le groupement amino de la molécule de toxine et est

de préférence un groupement carboxylique ou son dérivé réac-

tif; R2 est un groupement fonctionnel qui réagit avec le groupement thiol de la molécule de -galactosidase et est de

préférence un groupement fonctionnel comportant un groupe-

ment dithio, comme un groupement 2-benzothiazolyl-dithio, un groupement 2pyridyl-N-oxyde-dithio, etc., ou un groupement maléimide; et X est un groupement d'espacement qui n'est pas

utilisé dans la réaction, et qui est un reste de chaîne molé-

culaire auquel sont combinés les groupements fonctionnels

sus-mentionnés, et peut être constitué par les acides sul-

fure-carboxyliques, maléimide-carboxyliques sus-mentionnés

ou leurs dérivés réactifs.

Pour conjuguer la toxine et la e -galactosidase, on

peut effectuer la réaction normalement à une température re-

froidie ou à la température ambiante dans un milieu inerte, par exemple une solution tampon de pH 6-8, de l'acétone, du méthanol, de l'éthanol, du dioxanne, du diméthylsulfoxyde, du diméthylacétamide, du tétrahydrofuranne ou dans un milieu mélangé. Pour effectuer la réaction, on fait réagir la toxine

avec un agent de conjugaison, de préférence l'agent de conju-

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gaison bifonctionnel représenté par la formule générale (I).

Les quantités utilisées sont de 1 mole ou plus d'agent de conjugaison par rapport à la toxine, généralement avec un rapport molaire de 1,1-2. Après la réaction, le produit est

purifié si nécessaire puis on le fait réagir avec la R -

galactosidase, de préférence dans une solution tampon de pH

stable vis-à-vis de la -galactosidase. La quantité de R -

galactosidase utilisée peut être une quantité à peu près équimolaire par rapport à la quantité de toxine utilisée. La réaction peut être effectuée à la température ambiante ou à une température inférieure. Le produit conjugué résultant de

toxine et de e -galactosidase peut être purifié par chromato-

-graphie d'adsorption ou filtration sur gel, pour obtenir le produit conjugué représenté par la formule générale (I),

(Toxine -)- B1 - X - B2 ( -Gal) (M).

Dans la formule (I), "Toxine" représente le reste d'une molé-

cule de neurotoxine de serpent qui peut se conjuguer de façon spécifique avec Ach-R; " -Gal" représente le reste de la molécule de f galactosidase; B et B sont des groupements de conjugaison identiques ou différents entre la toxine, la ç5 -galactosidase et l'agent de conjugaison, de préférence B1

étant un groupement de liaison amide et B2 étant un groupe-

ment de liaison dithio ou thiosuccinimide; et X est un grou-

pement d'espacement de l'agent de conjugaison.

L'anticorps utilisé dans l'invention qui se conjugue à

l'anticorps de Ach-R peut commodément être un anticorps vis-

à-vis de l'espèce biologique de l'échantillon, ou un sérum en contenant. Par exemple, dans le cas o l'échantillon est un

sérum clinique, on peut citer comme exemple l'anticorps vis-

à-vis de IgG humain, ou le sérum le contenant, comme le sérum

IgG anti-humain de lapin ou le sérum IgG anti-humain de chè-

vre. L'anticorps se conjugant à l'anticorps de Ach-R peut être utilisé à l'état de sérum comme mentionné précédemment, ou peut être isolé ou purifié avant l'utilisation, selon les moyens connus de séparation et de purification, par exemple une combinaison de centrifugation, précipitation au point

isoélectrique, dialyse, chromatographie d'adsorption, fil-

tration sur gel, et autres moyens. Quand l'anticorps est sé-

paré et purifié, il peut être utilisé en tant que corps soli-

de combiné à un support insoluble par l'intermédiaire d'un

groupement fonctionnel, ledit support comprenant les sup-

ports protéines insolubles, comme l'albumine ou la gélatine

traitée par le glutaraldéhyde; les supports de poids molécu-

laire élevé insolubles semi-synthétiques, comme l'agarose, la cellulose et la dextrine traitée par l'épichlorhydrine ou le bromure de cyanogène puis avec un réactif d'amination;

les supports de poids moléculaire élevé synthétiques insolu-

bles, comme les polymères et copolymères d'acrylonitrile, d'acide acrylique, d'acrylates, d'acide méthacrylique, de méthacrylate de méthyle, d'alcool vinylique, d'acétate de vynile, de styrène, d'aminostyrène, de divynilbenzène,

d'acrylamide, d'éthylène, d'anhydride maléique, d'acide cro-

tonique, etc., ou ceux traités par un réactif d'amination; et les supports minéraux insolubles comme les dérivés de

silane traités par un réactif d'amination. Les moyens permet-

tant d'introduire un groupement amino sur le support insolu-

ble sont très nombreux. Par exemple, il peut s'agir de l'ami-

nation par réduction d'un groupement nitrile, de l'introduc-

tion d'un groupement aminoalkyle par réaction d'un groupement

hydroxy avec le y -aminopropyltriéthoxysilane, de l'intro-

duction d'un groupement amino par transformation d'un groupe-

ment hydroxyméthyle en groupement aldéhyde en utilisant

l'oxydation par le periodate suivie de la réaction du groupe-

ment aldéhyde avec une diamine, de la transformation du grou-

pement hydroxy d'un polysaccharide en un groupement imido-

carbonate par la réaction avec le bromure de cyanogène, et de la transformation d'un amide en groupement iminohalogénure

par la réaction avec un halogénure de phosphore. Ce groupe-

ment fonctionnel peut ensuite être-traité par un autre réac-

tif d'introduction de groupement fonctionnel pour introduire

de façon adéquate un nouveau groupement fonctionnel.

Dans la mise en oeuvre de la présente invention, on prend une quantité définie de Ach-R obtenu comme mentionné

précédemment, normalement une quantité qui n'est pas infé-

rieure à la teneur en anticorps de Ach-R dans le spécimen.

Par ailleurs, on prend une quantité définie de produit conju-

gué toxine/ -galactosidase représenté par la formule géné-

rale (I), qui est pratiquement la quantité égale à la quan- tité de Ach-R ci-dessus. On fait incuber les deux pour les faire réagir dans un milieu aqueux, par exemple dans une solution de tampon de phosphate 0,05 M contenant 0,15 M de NaCl et ayant- un pH de 6-8, ou dans une solution tampon de phosphate de 0,1 M contenant 1 mM de MgC12, 0,1 M de NaCl, 0,1 % de sérum-albumine de boeuf, 0,1 % de NaN3 et une petite quantité de méthanol. Dans ce cas, le Ach-R et le produit conjugué toxine/ galactosidase de formule générale (I) peuvent préalablement être chacun ajoutés séparément dans les

milieux aqueux à utiliser, avant la réaction des deux compo-

sants. La réaction peut être effectuée normalement à une tem-

pérature de 5oC'à la température ambiante pendant 3 heures ou

plus, de préférence à 50C pendant 5 heures ou plus.

Puis on ajoute au mélange réactionnel un spécimen, par exemple du sérum sanguin d'un patient myasthénique, et on

laisse incuber pour faire la réaction pendant une nuit norma-

lement à 5?C. Puis on y ajoute un anticorps se conjugant à

l'anticorps de Ach-R, et on laisse le mélange reposer normalement à 50C pen-

dant 5 heures ou plus pour que se fasse la réaction. L'anti-

corps peut être utilisé en quantité excessive vis-à-vis de l'anticorps de Ach-R. Le mélange réactionnel peut être soumis

à une séparation solide/liquide. Dans cette étape, si l'anti-

corps se conjugant à l'anticorps de Ach-R est soluble, par exemple dans le sérum, la substance coagulée résultante peut être séparée à partir de la phase liquide selon un moyen de

séparation solide/liquide, comme la centrifugation. Si l'an-

ticorps se trouve sur un support solide, combiné avec un sup-

port insoluble, le solide peut être séparé du constituant liquide selon un moyen de séparation solide/liquide, comme la

filtration. On peut ensuite déterminer l'activité de f -

galactosidase dans le constituant solide et/ou liquide. Pour déterminer l'activité de -galactosidase, on peut utiliser

normalement comme substrat de l'o-nitrophényl- -galacto-

side, et une solution tampon de phosphate 0,1 M (pH 7,2) con-

il tenant 10 % de méthanol et 10 mm de mercaptoéthanol comme milieu de réaction. On effectue la réaction à 30-401C, de préférence 370C, pendant 15-20 minutes. Une fois la réaction terminée, on détermine l'extinction de la couleur à la lon- gueur d'onde de 420 nm. D'après cette valeur active, on peut doser l'anticorps de Ach-R dans les constituants solides. Ou bien, on peut doser l'anticorps de Ach-R dans le spécimen en déterminant le produit conjugué toxine/a -galactosidase de formule (I) n'ayant pas réagi et en calculant la quantité de

produit conjugué toxine- a-galactosidase de formule (I) con-

sommé dans la réaction.

* Le nécessaire de dosage qui permet de mettre en oeuvre le dosage de l'invention comme mentionné précédemment doit

comporter au moins Ach-R, le produit conjugué toxine/ a -

galactosidase représenté par la formule générale (I) et l'an-

ticorps se conjugant à l'anticorps de Ach-R. Si nécessaire, il peut être combiné avec un milieu de réaction aqueux et un

réactif permettant de déterminer l'activité de la ( -galacto-

sidase. Les quantités de chaque composant dans ce nécessaire peuvent être préparées de façon adéquate, correspondant à la quantité d'anticorps de Ach-R dans le spécimen. Le spécimen

peut également être dilué de façon appropriée avant l'utili-

sation. Chaque composant peut être utilisé au moins en quan-

tité supérieure à la teneur en anticorps de Ach-R recherché dans le spécimen. Il est commode que le présent nécessaire soit préparé pour permettre d'effectuer 50 à 100 essais par nécessaire. Ainsi, l'anticorps de Ach-R dans le spécimen peut être dosé avec une précision élevée, des caractéristiques de reproduction élevées, une sécurité et une stabilité élevées,

en mettant en oeuvre l'invention comme décrit précédemment.

On va maintenant décrire l'invention plus concrètement en se rapportant aux exemples suivants qui ne doivent pas

cependant être considérés comme limitatifs.

Exemple 1

(1) Produit conjugué Toxine/ a-galactosidase 1) On ajoute 9 mg d'a bungarotoxine dans 1 ml d'une

solution tampon de phosphate de 0,1 M (pH 7,5).

On ajoute à cette solution 0,15 ml d'une solution de diméthylformamide contenant 5 mM d'EDTA disodique et 0,6 mg

de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionylsuccinimide.

On fait réagir le mélange à 0 C pendant 1 heure en agi- tant.

On sépare ensuite une portion de 6 p1 du mélange réac-

tionnel (contenant 0,05 mg d' a -bungarotoxine), et on y ajoute 500p1 d'une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH

7,2) contenant 0,15 M de NaCl, et 2,5 mg de -galactosidase.

Après réaction à 0 C pendant 30 minutes, on filtre sur gel le mélange réactionnel sur une colonne de Sephacryl S-300 (1 cm x 50 cm, en utilisant une solution tampon de phosphate 0,01 M de pH 7,2 et contenant 0,15 M de NaCl comme solvant), et l'on recueille les fractions d'effluent de 12 à 15 ml pour obtenir

un produit conjugué d' a -bungarotoxine et de e-galactosi-

dase (appelé ci-après "produit conjugué I-1"), avec une récu-

pération de 88 % de l'activité de B -galactosidase, une pure-

té de 96 % du produit conjugué et 100 % d'activité d'immuno-

conjugaison vis-à-vis de Ach-R et d'activité de B -galactosi-

dase résiduelle après conservation du produit conjugué à 5 C

pendant 3 mois.

2) On effectue la même réaction qu'en 1) ci-dessus, en

utilisant 6 mg d' a-bungarotoxine et 0,37 mg de 3-(2'-pyri-

dyl-N-oxyde-dithio)propionylsuccinimide, pour obtenir un produit conjugué d' a -bungarotoxine et d'5 -galactosidase

(appelé ci-après "produit conjugué I-2"), avec une récupéra-

tion de 89 % de l'activité de e-galactosidase, une pureté de

% du produit conjugué et 100 % d'activité d'immuno-conju-

gaison vis-à-vis de Ach-R et d'activité résiduelle de -

galactosidase après conservation du produit conjugué à 5 C

pendant 3 mois.

3) On dissout 9 mg d' a -bungarotoxine dans une solu-

tion tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0). On ajoute à cette solution 100 ml d'une solution de tétrahydrofuranne contenant mg d'ester d'hydroxysuccinimide de méta-maléimide-benzoy-

le. On fait réagir le mélange à la température ambiante pen-

dant 30 minutes. Puis on chasse les sels du mélange réaction-

nel en l'introduisant sur une colonne de Sephadex G-25 1 cm x 40 cm; en utilisant comme solvant une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,0) et on recueille des fractions de 13-16 ml (contenant 7,3 mg d' a-bungarotoxine). Puis on sépare une fraction de 0,3 ml et on lui ajoute 2, 5 mg de e-

galactosidase. Après réaction à la température ambiante pen-

dant 3 heures, on introduit le mélange sur une colonne de Sephacryl S-300 (1 cm x 50 cm). On recueille des fractions effluentes de 13-16 ml et l'on obtient un produit conjugué d' a -bungarotoxine et de -galactosidase (appelé ci-après "produit conjugué I-3"), avec une récupération de 76 % de l'activité de -galactosidase, une pureté de 57 % du produit

conjugué et 100 % d'activité d'immuno-conjugaison et d'acti-

vité résiduelle de e -galactosidase après conservation du

produit conjugué à 5 C pendant 3 mois.

(2) Ach-R: On découpe des nerfs sciatiques de rats Wister (3 mâles

pesant chacun environ 200 g) à la hauteur de l'aine des pat-

tes arrière. Après 14 jours d'élevage, on décapite les rats et on les saigne, puis on recueille les tissus musculaires de

leurs pattes arrière (5,8 - 7,2 g par rat; 18,5 g au total).

Au tissu musculaire, on ajoute 74 ml d'une solution tampon 50

mM Tris-HCl (pH 7,4) contenant 1 mM de fluorure de phényl-

méthylsulfonyle et 0,1 M de NaCl, et on homogénéise ce mélan-

ge dans un appareil d'homogénéisation puis on le centrifuge (2.000 tours/minute, 15 minutes et 1.300 G) pour recueillir

un précipité qu'on lave deux fois dans les mêmes conditions.

Au précipité, on ajoute 74 ml d'une solution tampon 50 mM Tris-HC1 (pH 7, 4) contenant 2 % de Triton X-100 et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle et 0,1 M de NaCl, et on agite Le mélange pendant une nuit à 5 C pour assurer l'extraction puis on le centrifuge (18.000 tours/minute, 15 minutes et 37.000 G) pour obtenir environ 73 ml d'un fluide surnageant contenant Ach-R

(8,2 x 1012 M de Ach-R par ml de fluide surnageant).

(3) Antigène se conjugant avec l'antigène de Ach-R: Selon le procédé classique, on sensibilise un lapin

avec IgG humain en utilisant l'adjuvant de Freund, pour obte-

nir du sérum IgG anti-humain de lapin (contenant environ

250 -!/ml d'anticorps IgG anti-humain).

(4) Spécimens: On utilise trois types de sérum sanguin provenant de

patients myasthéniques et un sérum sanguin normal. Les spéci-

mens A, B et C sont des sérums de conjugaison à la toxine con-

tenant 18,5 x 10-9 M, 4,1 x 10-9 M et 0,8 x 10-9 M respective-

ment de l'anticorps de Ach-R selon un dosage utilisant une substance radioactive. Le spécimen D est un sérum normal ne

contenant normalement pas plus de 10-9 M/ml de Ach-R.

(5) Nécessaire de dosage:

Pour un seul essai, on utilise les constituants sui-

vants: pl d'une solution tampon de phosphate 0,01 M

(pH 7,2) contenant 10-13 M de produit conjugué a -

bungarotoxine/ -galactosidase et 0,15 Mi de NaCl, p1 d'une solution contenant 8,2 x lf 12 M/ml de Ach-R,

p1 de sérum IgG anti-humain de lap.-

À 300 M 1 d'un réactif de dosage de l'activité de -

e-galactosidase [ solution tampon de phosphate

0,1 M à pH 7,2 contenant 5 mg/ml de o-nitrophényl-

-galactoside, 10 % de méthanol et 10 mM de mercap-

toéthanol],

À 2,2 F1 d'un fluide d'arrêt de la réaction [ solu-

tion tampon 0,1 M de glycine-NaOH (pH 11,5)].

(6) Méthode de dosage:

On fait incuber 100 pl1 d'une solution tampon de phos-

phate 0,01 M contenant 10-13 M d'un produit conjugué a. -

bungarotoxine/ e-galactosidase (comme indiqué par "produit conjugué I-1, I-2 et I-3)" et 0,15 M de NaCl, pour que se fasse la réaction avec 10 1l d'une solution contenant 8,2 x -12 M/ml de Ach-R, à 5 C pendant 6 heures. On ajoute 1 pl,

3 pl ou 5 p1 d'un spécimen (spécimens A, B, C et D) au mé-

lange réactionnel et on fait incuber pour que se fasse la réaction pendant une nuit à 5 C. Puis on ajoute au mélange du sérum humain normal (4 ul pour 1 l 1 de spécimen et 2 1 pour 3 p1 de spécimen) pour que chaque mélange ait le même

volume, puis on ajoute 50 V 1 de sérum de lapin IgG anti-

humain puis on laisse réagir en laissant reposer à 5 C pen-

dant 6 heures. On centrifuge ensuite le mélange à 3.000 tours

par minute (1.800 G) pendant 15 minutes, on recueille le pré-

cipité et on le lave deux fois avec, à chaque fois, 3 pl d'une solution tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,2) contenant 0,15 M de NaCl. On ajoute le précipité à 300 p 1 d'un réactif de dosage de l'activité de la fgalactosidase, composé d'une solution tampon de phosphate 0,1 M (pH 7,2) contenant 5 mg/ml de o-nitrophényl- 5 -galactoside, 10 % de méthanol et 10 mM de mercaptoéthanol, et on fait réagir ce mélange à 37 C pendant minutes. Puis on arrête la réaction en ajoutant 2,2 ml d'une solution tampon 0,1 M de glycine-NaOH (pH 11,5). On

détermine l'extinction à une longueur d'onde de 420 nm.

Les résultats sont donnés dans le Tableau 1 avec d'ex-

cellentes mesures quantitatives.

TABLEAU I

Produit conjugué d' a-bungarotoxine/8-galactosidase Spécimens (Teneur en anticorps I - 1 I - 2 I - 3 de Ach-R calculée) Valeur de! AnticorpsValeur Anticorps Valeur Anticorps (X 10-15 M) de de Ach-R de.la de Ach-R de la de Ach-R DO420 nm (X 10-15M)D420 nm (X 5M) D0420 nm (X 015;i) 1 pl (18 5) 0/728 18,3 0.740 18,4 0,696 17 2 Specimen 3 p (55)5) 1776 44 8 1,81 45 5 1,69 42 4 A17 l 81 45r 116 42 A p (92j5) 3,08 77,9 3,16 79,4 3,19 80 2 Sp! e 1 pZ ( 4 1) 0 180 4 5 0 179 4,5 00216 5 4 SpecBmen 3 vt (12 3) 01528 13,2 0,533 13,4 0,496 1215 iR(2015) 0860 21,0 0,871 21,8 0;778 19;6

(20,5) 0 8)08

jc e1 Ilz ( O8q) 0p043 1,0 0)033 0q8 0r066 146 Specinen 3 PZ C 2 4)01109 2,7 0,085 201 0 116 219 4]( 410) 0,192 4,8 0,177 4,4 0t203 511 1 pz ( < 1 0 040 0;9 0030 0,7 01053 112 Specimnen 3, 1) DSpecimen 3 p0 ( < 1)0044 10 00 4 0l9 04048 ll Dl < 1 0051 12 0038 61 14 ii9. ( < 1)0,051 1,2 0,038 09 01061!z4 01% N Co o Co %O Comme essai témoin, on effectue le même mode opératoire en utilisant un produit conjugué a-bungarotoxine/peroxydase (obtenu selon le procédé décrit dans Methods in Enzymology, 37, 133-136, 1975). On dissout ainsi 2 mg de peroxydase dans 1 ml d'une solution aqueuse 0,3 M d'hydrogénocarbonate de sodium. On ajoute au mélange 0,1 ml d'éthanol contenant 1 % de dinitrofluorobenzène, on laisse réagir à la température ambiante pendant 60 minutes, on ajoute 0,5 ml d'une solution

0,06 M d'acide periodique et on laisse réagir à la tempéra-

ture ambiante pendant 3 heures, puis on ajoute 0,5 ml d'une

solution 0,16 M d'éthylèneglycol pour arrêter la réaction.

Puis on dialyse le mélange réactionnel avec une solution tam-

-pon 0,01 M de carbonate (pH 9,5), on ajoute 1 mg de bungaro-

toxine et on fait réagir pendant une nuit à 5 C. On introduit le mélange dans une colonne de Sephadex G-75 (1 cm x 37 cm)

pour la filtration sur gel et on élue avec du sérum physiolo-

gique pour obtenir des fractions effluentes de 10 - 20 ml

sous forme d'un fluide contenant du conjugué a -bungaro-

toxine/peroxydase (avec une pureté de 78 %).

On effectue sur le spécimen A la même méthode de dosage

que celle utilisée précédemment, en utilisant le conjugué a -

bungarotoxine/peroxydase à la place du conjugué a-bungaro-

toxine/ -galactosidase. Comme réactif de dosage de l'acti-

vité de peroxydase, on utilise un mélange réactionnel de 0,1 ml de 4aminoantipyrine à 0,3 %, de 0,1 ml de phénol à 0,2 %, de 0,1 ml de peroxyde d'hydrogène à 0,1 % et de 0,2 ml d'une

solution tampon Tris-HCl 1 M (pH 8,0), à 37 C pendant 45 mi-

nutes, et on détermine l'extinction de couleur à une longueur

d'onde de 500 nm.

Comme résultats, on obtient des valeurs de la DO500nm de 0,036 sur 1 p 1 de spécimen A, de 0,040 sur 3 pl et de 0,052 sur 5 p 1, ce qui montre une sensibilité inférieure qui

ne convient pas au dosage.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Procédé de dosage de l'anticorps du récepteur de l'acé-

tylcholine dans un spécimen ou échantillon, qui consiste à faire réagir le récepteur de l'acétylcholine avec un produit conjugué toxine/e galactosidase représenté par la formule générale (I), (Toxine) - B1 -X- B2 _ ( -Gal) (I) (o "Toxine" désigne le reste d'une molécule de neurotoxine de serpent qui se conjugue spécifiquement avec le récepteur

de l'acétylcholine; " -Gal" est un reste de molécule de C -

galactosidase; B1 et B2 sont des groupements de conjugaison

identiques ou différents; et X est un groupement d'espace-

ment) dans un milieu aqueux; à ajouter le spécimen au mélan-

ge réactionnel pour effectuer la réaction; puis à ajouter au mélange un anticorps se conjugant avec le récepteur de

l'acétylcholine pour que se fasse la réaction; puis à sou-

mettre le mélange à une séparation de phase solide/liquide et

à déterminer l'activité de e-galactosidase dans le consti-

tuant de la phase solide ou liquide.

2. Procédé de dosage selon la revendication 1, caractérisé

en ce qu'on utilise comme produit conjugué toxine/e -galac-

tosidase représenté par la formule (I) le produit dans lequel la neurotoxine de serpent se conjugant de façon spécifique

au récepteur de l'acétylcholine est l'a-bungarotoxine.

3. Procédé de dosage selon la revendication 1, caractérisé

en ce qu'on utilise le produit conjugué toxine/e -galactosi-

dase représenté par la formule générale (I) que l'on obtient en utilisant un agent de conjugaison bifonctionnel représenté par la formule (II),

R1 - X - R2 (II)

(o R est un groupement fonctionnel réagissant avec le grou-

pement amino d'une molécule de neurotoxine de serpent se con-

jugant de façon spécifique au récepteur de l'acétylcholine;

R2 est un groupement fonctionnel réagissant avec le groupe-

ment thiol de la molécule de X -galactosidase; et X est un

groupement d'espacement).

4. Nécessaire de dosage de l'anticorps du récepteur de l'acétylcholine qui comprend au moins du récepteur de l'acé-

tylcholine, un produit de conjugaison toxine/ -galactosi-

dase représenté par la formule générale (I), (Toxine) - Bi - X - B2 - ( Gal) (I) (o "Toxine" est le reste d'une molécule de neurotoxine de

serpent qui peut se conjuguer de façon spécifique au récep-

teur de l'acétylcholine; "' -Gal" est un reste de molécule

de -galactosidase; Bi et B2 sont des groupements de conju-

gaison identiques ou différents; et X est un groupement d'espacement), et un anticorps se conjugant avec l'anticorps

du récepteur de l'acétylcholine.

5. Nécessaire de dosage selon la revendication 4, caracté-

risé en ce qu'on utilise le produit conjugué toxine/s -galac-

tosidase représenté par la formule générale (I) o la neuro-

toxine de serpent se conjugant de façon spécifique au récep-

teur de l'acétylcholine est l'a -bungarotoxine.

6. Nécessaire de dosage selon la revendication 4, caracté-

risé en ce qu'on utilise le produit conjugué toxine/e -galac-

tosidase représenté par la formule générale (I) que l'on obtient en utilisant un agent de conjugaison bifonctionnel représenté par la formule générale (II)

R - X R2 (II)

(o R1 est un groupement fonctionnel réagissant avec le grou-

pement amino d'une molécule de neurotoxine de serpent se con-

jugant de façon spécifique au récepteur de l'acétylcholine;

R2 est un groupement fonctionnel réagissant avec le groupe-

ment thiol de la molécule de C -galactosidase; et X est un

groupement d'espacement).