DD252615A1

DD252615A1 - Verfahren zur herstellung von superoxiddismutase

Info

Publication number: DD252615A1
Application number: DD29437986A
Authority: DD
Inventors: Marlis Grunow; Wulfdieter Schoepp; Waltraud Ruede
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1986-09-15
Filing date: 1986-09-15
Publication date: 1987-12-23

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Superoxiddismutase. Es ist das Ziel der Erfindung, das Enzym preiswert als Praeparat hoher Aktivitaet zur Verfuegung zu stellen. Die Aufgabe besteht darin, ein mikrobielles Herstellungsverfahren fuer Superoxiddismutase anzugeben, in dessen Verlauf das Enzym in hoher Aktivitaet entsteht und in technisch einfacher Weise weiter angereichert werden kann. Die Aufgabe wird geloest, indem der Produzentenstamm Pseudomonas putida ZIMET 10 947 eingesetzt wird, die Zuechtung mit n-Hexan als C-Quelle und (NH4)2SO4 als N-Quelle bei eingeschraenkter Sauerstoffversorgung erfolgt und das Enzym an 10-Carboxydecylsepharose durch hydrophobe Chromatographie angereichert wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Anreicherung von Superoxiddismutase.

Superoxiddismutase, die für Grundlagenuntersuchungen in verschiedenen Disziplinen von Interesse ist und deren Bedeutung für den menschlichen Organismus auf breiter Ebene untersucht wird, hat bereits eine praktische Anwendung als entzündungshemmendes Arzneimittel gefunden. Ihr Einsatz als Antioxidans und Polymerisationshemmstoff scheint möglich zu sein. Ein stark vereinfachtes und für Dismutasen unterschiedlichster Herkunft universell einsetzbares Präparationsverfahren würde sowohl für vergleichende enzymische als auch für kommerzielle Zwecke von Vorteil sein.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur Herstellung von Superoxiddismutase sind bereits bekannt. Die zahlreichen beschriebenen Präparationsverfahren bestehen in der Regel aus 8 Schritten:

1. Gewinnung eines zellfreien Rohextraktes durch Ultraschallbehandlung und nachfolgende Zentrifugation

(Zur Gewinnung der Superoxiddismutase aus Erythrocyten werden Hämoglobin und Lipide nach der Hämolyse durch eine Chloroform/Ethanol-Behandlung zu Beginn der Präparation entfernt [2]).

2. Hitzebehandlung (außer bei Erythrocyten-SOD); Streptomycinbehandlung (nur in einigen Fällen)

3. Ammoniumsulfatfraktionierung (mindestens in 2 Schritten)

4. Dialyse

5. lonenaustauschchromatographie (in der Regel mehrfach)

6. Konzentration des Enzyms

7. Gelfiltration

8. Konzentrierung und Ausfällung (Kristallisation) bzw. Lyophilisierung des Enzyms Zwischen allen Reinigungsschritten liegen kosten- und zeitaufwendige Zentrifugationsschritte.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, die wissenschaftlich, technisch und pharmakologisch interessante Superoxiddismutase preiswert als Präparat hoher Aktivität zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein mikrobielles Herstellungsverfahren für Superoxiddismutase anzugeben, in dessen Verlauf das Enzym mit vergleichsweise hoher Aktivität entsteht und in technisch einfacher Weise angereichert werden kann.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß als Mikroorganismus der Stamm Pseudomonas putida ZIMET10947 eingesetzt wird.

Die Kultivierung erfolgt in Submerskultur bei 3O⁰C wobei gasförmiges Hexan als C-Quelle und (NH₄J₂SOi als N-Quelle verwendet wird. Die Züchtung wird erfindungsgemäß unter Belüftungsbedingungen durchgeführt, die einer stark eingeschränkten Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen entsprechen.

Nach einer Wachstumszeit von 15-4Oh —je nach physiologischem Zustand und Menge des Impfmaterials — werden die Bakterien geerntet (z. B. durch Zentrifugation) und anschließend in Phosphatpuffer resuspendiert. Die Gewinnung des zellfreien Rohextraktes erfolgt vorzugsweise durch Einfrieren und Wiederauftauen der Suspension und anschließender Zentrifugation.

Aus dem zellfreien Proteinextrakt kann SOD durch fraktionierte Salzfällung bzw. Extraktion mit (NH₄I₂SO₄ auf das 3-5fache angereichert werden. Hierzu wird dem Proteinrohextrakt festes (NH₄I₂SO₄ bis zu einer Endkonzentration von 90% Sättigung zugesetzt, wobei die gesamte Aktivität in das Sediment gelangt. Zur weiteren Anreicherung der Superoxiddismutase wird das Sediment mit (NH₄)₂SO₄-Lösungen sinkender Konzentration, die 0,05mol/l Na₂HPO₄ enthalten, bei 0⁰C jeweils 5 Minuten gerührt. Die Hauptmenge an Superoxiddismutase löst sich in einem Konzentrationsbereich von 60-55% gesättigter (NH₄)₂S0₄-Lösung.

Die Anreicherung der Superoxiddismutase aus diesen Lösungen erfolgt durch hydrophobe Chromatographie an 10-Carboxydecylsepharose bis auf spezifische Aktivitäten von ca. 3000EE/mg.

Die technisch-ökonomischen Vorteile der vorgeschlagenen Verfahrensweise bestehen darin, daß der Stamm Pseudomonas putida ZIMET 10947 unter den erfindungsgemäßen Züchtungsbedingungen Superoxiddismutase in relativ hoher Aktivität produziert.

Weitere Vorteile im Vergleich zu den bekannten technischen Lösungen bringt das Aufschlußverfahren durch Einfrieren sowie die Anreicherung des Enzyms an 10-Carboxydecylsepharose.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Beispiel näher erläutert werden.

Beispiel

Die Kultivierung der Mikroorganismen erfolgt in einem Medium, das pro I folgende Bestandteile enthält: K₂HPO₄,7,46g; NaH₂PO₄,0,54g; MgSO₄ · 7H₂0,20mg; CaCI₂ · 2H₂0,20mg; Fe(NH₄I₂SO₄) · 6H₂0,10mg.

Als N-Quelle dient (NH₄J₂SO₄ (1 g/l). Als C-Quelle wird η-Hexan in gasförmigem Zustand eingesetzt. Die Kultivierung erfolgt bei 30°C in einem 101-Fermentationsgefäß bei einem Füllinhalt von 7 !Flüssigkeit (Fermentor Biofer VR Ungarn). Die Kultur wird mit einem konstanten Luft/Hexan-Gemisch (31 Luft/h, 0,015% Hexan enthaltend) bei einer Rührgeschwindigkeit von 800 · min"¹ versorgt. Nach 20 bis 30 Stunden hat die Kultur eine optische Dichte von Eeoo"¹ = 1/5-2,5. Die Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und anschließend in 0,05mol/l Phosphatpuffer pH 8 resuspendiert (Eeoo^m = 20). 100ml-Portionen dieser Suspension werden bei.-80°C eingefroren und 60min bei dieser Temperatur belassen. Anschließend werden die Proben für 4h bei 3O⁰C gehalten. Nach Zentrifugation bei lOOOOxg für 30 min befindet sich die Aktivität der Superoxiddismutase im zellfreien Überstand. Durch Zugabe von festen (NH₄)₂SO₄ bis zu 90% Sättigung wird das Gesamtprotein dieses Rohextraktes ausgefällt. Nach Zentrifugation bei 15000xg (45min) wird das Sediment mit einer (NH₄)₂SO₄-Lösung von 60% Sättigung behandelt. Der nach Zentrifugation (15000xg, 45 min) erhaltene klare Überstand enthält ca. 90% der SOD-Aktivität und wird auf eine Säule von Carboxydecylsepharose, die mit einer (NH₄)₂SO₄-Lösung gleicher Konzentrationen äquilibriert wurde, aufgetragen/Unter diesen Bedingungen wird die Superoxiddismutase quantitativ am Trägermaterial adsorbiert. Das Waschen mit einer (NH₄)₂SO₄-Lösung gleicher Konzentration erfolgt so lange, bis kein Protein im Eluat mehr nachweisbar ist. Mit schrittweiser Verringerung der (NH₄)₂SO₄-Konzentration wird die Superoxiddismutase eluiert, wobei der Hauptteil der Aktivität bei einer Konzentration von 43% erscheint. Nach Einengen des Eluats auf Vs des Ausgangsvolumens (ebenfalls an Carboxydecylsepharose) kann die Superoxiddismutase durch Dialyse gegen gesättigte (NH₄)₂SO₄-Lösung leicht in kristalliner Form gewonnen werden. Das so erhaltene Präparat hat eine Aktivität von 3000EE/mg (bestimmt nach McCord und Fridovich [2]) und ist stabil über einen Zeitraum von mindestens 6 Monaten bei einer Lagerungstemperatur von 4⁰C.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Superoxiddismutase, dadurch gekennzeichnet, daß als Produzentenstamm Pseudomonas putida ZIMET 10947 eingesetzt, die Züchtung bei eingeschränkter Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen durchgeführt und das produzierte Enzym durch ladungskontrollierte hydrophobe Chromatographie an 10-Carboxydecylsepharose angereichert wird.

2. Verfahen nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Pseudomonas putida ZIMET 10947 in einem Medium der Zusammensetzung K₂HPO₄ 7,46g, NaH₂PO₄ 0,54g, MgSO₄ · 7H₂O 20 mg, CaCI₂ · 2H₂O 20 mg, Fe(NH₄J₂SO₄ · 6H₂O 10 mg derart kultiviert wird, daß als C-Quelle gasförmiges η-Hexan, als N-Quelle (NH₄J₂SO₄ eingesetzt werden, die Kultur mit einem konstanten Luft-Hexan-Gemisch unter Rühren versorgt wird, nach 15 bis 40 Stunden die Bakterien geerntet werden, in Phosphatpuffer resuspendiert werden, nach Einfrieren und Auftauen zentrifugiert werden, wobei die Superoxiddismutaseaktivität im zellfreien Überstand verbleibt, diese durch Ammoniumsulfatfällung separiert wird und das Enzym durch hydrophobe Chromatographie an 10-Carboxydecylsepharose angereichert wird.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Belüftung der Kultur mit 31 Luft, die 0,015% η-Hexan enthält, pro Stunde erfolgt.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei ca. 3O⁰C kultiviert wird.