JPH0231349B2

JPH0231349B2 - Hitomatahaushurainosuupaaokishido*desumutaazenosokuteiho

Info

Publication number: JPH0231349B2
Application number: JP18093880A
Authority: JP
Inventors: Minoru Sakakibara; Masatoshi Tsujino; Nobuaki Nakagawa
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1980-12-19
Filing date: 1980-12-19
Publication date: 1990-07-12
Anticipated expiration: 2000-12-19
Also published as: GB2089980A; GB2089980B; FR2496692B1; FR2496692A1; JPS57102195A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はスーパーオキシド・デスムターゼ
（Superoxid dismutase：以下SODと略す）の測
定法に関する。 SCDはスーパーオキシド・ラジカル（Ｏ₂・）
の不均化反応を触媒する作用を有する酵素で、最
近その測定が臨床的に注目されている。特に動脈
硬化においては、動脈硬化と過酸化脂質との関係
が明らかになりつつあり、年齢の増加とともに過
酸化脂質が増加すると言われている。この様な状況の中で、肝臓や肺臓などにおける
SODの微量測定が望まれている。またSDOは
種々の治療薬としても用いられる様になり、ヒト
組織中のSODの分別定量や濃度測定が望まれて
いた。しかしながら従来のSODの測定に関しては、
Mc Cordらの方法〔J.Biol.Chem.、244、6049〜
6055（1969）〕で定量されているが、操作が煩雑
で、また測定感度も充分なものではなく、特に近
年ヒト由来のSODやウシ由来のSODを測定する
ことが必要とつたが、例えばウシ由来のSODを
医薬として投与した場合ウシ由来のSODを測定
する必要があるが、本来ヒト由来のSODも存在
し、両者の酵素活性は同一であり、良好に区別し
て測定し難いものであつた。本発明者らは、ヒトおよびウシ由来のSODか
らなる群より選ばれた１種のSODの簡便かつ良
好な測定法について誠意研究した結果、ヒトまた
はウシ由来のSODと特異的結合性を有する抗体
の該SODに対する特異的結合性において、ヒト
由来のSODに対する抗体がウシ由来、ブタ由来、
ウサギ由来、ラツト由来およびウマ由来のSOD
に対してヒト由来のSODに対する免疫学的交叉
性に比較して少なくとも1000分の１以下の極めて
交叉性の少ないものが得られ、かつウシ由来の
SODに対する抗体がヒト由来、ブタ由来、ウサ
ギ由来、ラツト由来およびウマ由来のSODに対
してウシ由来のSODに対する免疫学的交叉性に
比較して少なくとも1000分１以下の極めて交叉性
の少ないものが得られ、ヒトまたはウシ由来の
SODに対する抗体として、当該由来のSODに対
する交叉性に較して少なくとも異種動物由来
SODに対する交叉性が100分の１以下の特性を有
する抗体を用い、かつ該SODと標識酸素とを結
合して得られるSOD−酵素結合体を用いること
によりSODの良好な測定法を完成した。本発明
は上記の知見に基づいてなされたもので、水性媒
体下、ヒトおよびウシ由来のSODからなる群よ
り選ばれた１種のSOD−酵素結合体、少なくと
も該当するSODを含有する被検液と、該SODに
対する交叉性に比較して少なくとも異種動物由来
SODに対する交叉性が1000分の１以下の特性を
有する特異的結合性を有する抗体を反応せしめた
後、その固相と液相を分離し、次いでその固相ま
たは液相の酵素活性を測定することを特徴とする
ヒトおよびウシ由来のSODからなる群より選ば
れた１種のSODの定量的測定法である。まず本発明に用いられるヒトまたはウシ由来の
SODとしては、スーパーオキシド・ラジカルの
不均化反応を触媒する作用を有するヒトまたはウ
シ由来のSODからなる群より選ばれた１種の
SODであればよく、例えばウシ由来のSOD、特
にウシ肝臓由来のSODであるオルゴテイン
（Orgotein）、ヒト由来のSODが挙げられ、適宜
公知手段にて単離、精製すればよい。次いでこの
ようなヒトおよびウシ由来のSODからなる群よ
り選ばれた１種のSOD（以下単に、SODというこ
ともある）に標識酸素を結合せしめるのである
が、使用される酵素としては、酸化還元酵素、加
水分解酵素、転位酵素、リアーゼ、イソメラー
ゼ、リガーゼが適宜使用されるもので、例示すれ
ばラクテートデヒドロゲナーゼ、マレイトデヒド
ロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マルト
ースデヒドロゲナーゼ、ラクテートオキシダー
ゼ、マレイトオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、
キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダー
ゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カタラーゼ、α−
アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチー
ム、リパーゼ、アルカリホスフアターゼ、アミノ
ペプチターゼ、トリプシン、パパイン、α−キモ
トリプシン、アミダーゼ、ヘキソキナーゼ、グリ
セロキナーゼなどが挙げられる。さらにこれらの
酵素は、あらかじめ任意のスペーサ導入を行なつ
てもよく、例えばグリタルアルデヒドなどのジア
ルデヒド、ω−アミノ酸クロライドなどの反応性
誘導体、ジアルデヒドやジカルボン酸クロライド
とヘキサメチレンジアミン、デカチメチレンジア
ミンなどのジアミン、Ｓ−アセチルメルカプトサ
クシニツク・アンハイドライド、ジアルデヒドと
２−アミノエタンチオールなどのスペーサー導入
試薬を用いて新たたにアルデヒド基、アミノ基、
チオール基を導入してもよい。また同様に、
SODにおいても、あらかじめ任意のスペーサ導
入を行なつてよいものである。さらにこのSODと標識酸素とを結合せしめて
SOD−酵素結合体を得るに当つては、SOD、標
識酸素の有するアミノ基、水酸基、チオール基、
カルボキシル基などや、さらに導入されたアルデ
ヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基
などの官能基に基いて結合せしめればよい。結合
に当つては、両者を直接または結合剤を用いて間
接的に結合せしめてもよく、例えば標識酸素のの
有するカルボキシル基またはアミノ基とSODの
有するアミノ基またはカルボキシル基とを不活性
媒体中にて水溶性カルボジイミドの如き縮合剤の
存在下にて反応せしめればよく、またアルデヒド
基とアミノ基との反応性に基づいて反応せしめて
結合せしめてもよい。さらに結合剤を用いて反応
せしめるに当つては公知の種々の多官能性化合
物、例えばヘキサメチレンジイソシアナート、
2.4−トルエンジイソシアナートなどのジイソシ
アナート化合物、ヘキサメチレンジイソチオシア
ナートなどのジイソチオシアナート、スクシンア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポアルデヒ
ドなどのジアルデヒド、N.N′−エチレンビスマ
レイミド、N.N′−０−フエニレンジマレイミド、
ビスジアゾベンジジン、N.N′−ポリメチレンビ
スヨードアセトアミド、ジエチルマロンイミデー
ト、ジメチルアジピンイミデート、３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）−プロピオン酸、３−
（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド−ジチオ）プロ
ピオン酸、６−Ｎ〔３−（2′−ベンゾチアゾリル−
ジチオ）プロピオニル〕カプロン酸などのスルフ
イドカルボン酸またはそのスクシンイミドエステ
ル、Ｐ−ニトロフエニルエステル、酸クロライ
ド、イミデートなどの反応性誘導体（特願昭53−
85900号参照）、マレイミド安息香酸、マレイミド
フエニル酢酸、マレイミドフエニルプロピオン酸
などのマレイミドカルボン酸またはその反応性誘
導体などを用いて反応せしめてSOD−酵素結合
体を得ればよい。またこの結合体を得るに当つて
は、通常PH６〜８の緩衝液中メタノール、エタノ
ール、アセトン、ジオキサン、ジメチルスルホキ
サイド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフ
ランなどの有機溶媒の存在下、またはこれらの有
機溶媒中、０〜40℃にて反応せしめればよい。反
応終了後、必要に応じて、吸着クロマトグラフイ
ーやゲル過手段を用いて精製すればよい。またSODと特異的結合性を有する抗体として
は、通常そのSODを抗原として異種動物に感作
せしめて得られた抗体、またはその抗体を含有す
る抗血清が用いられる。例えばウシ由来のオルゴ
テインのフロイント・コンプリート・アジユバン
トの乳化物をウサギやモルモツトなどの異種動物
に一定期間にて数回注射して免疫感作せしめ、次
いでその血液を採血し、これを遠心などの常法に
より抗血清を得る。さらに塩析、等電点沈澱、透
析、クロマトグラフイー、ゲル過手段などの常
法によりその抗体を得てもよく、この抗体として
は、ヒトおよびウシ由来のSODからなる群より
選ばれた１種のSODに対する交叉性に比較して
少なくとも異種動物由来SODに対する交叉性が
1000分の１以下の特性を有する特異的結合性を有
する抗体であればよい。また得られた抗体は、必要に応じて不溶性担
体、例えばアルブミンやゼラチンなどの不溶性蛋
白質系担体、アガロース、セルロースやデキスト
リンなどのエピクロルヒドリン処理や臭化シアン
処理、さらにこれらのアミノ化試薬処理してなる
不溶性半合成高分子系担体、アクリロニトリル、
アクリル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル
酸、ムチルメタアクリル酸、ビニルアルコール、
酢酸ビニル、アミノスチレン、アクリルアミド、
エチレン、無水マレイン酸などのポリマーまたは
コポリマーなどの不溶性合成高分子系担体を用い
て、前述の如くの多官能性化合物にて結合せしめ
た不溶化担体として用いてもよい。次いでSOD−酵素結合体を用いて本発明を実
施するに当つて、まず一定量のSOD−酵素結合
体含有液、SODと特異的結合性を有する抗体の
含有液、およびSOD値を定量すべき被検液を加
えて、一般に４℃にて一夜反応せしめる。反応に
おいて、水性媒体、好ましくは0.25％BSA（牛血
清アルブミン）、0.1％NaN₃、0.15MNaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）などの緩衝液が用
いられ、またこの水性媒体は、上記各試料の希釈
媒体として使用してもよい。次いで反応後固相お
よび液層を分離するのであるが、好ましくは、用
いたSODと特異的結合性を有する受容体の産生
動物種の免疫グロブリン、およびその動物種のグ
ロブリンに対する抗体またはそれを含有する抗血
清を加えて、４℃、一夜反応せしめればよい。反
応終了後、その固相と液層とを分離するに当つ
て、遠心分離などの分離手段を用い、次いでその
固相（Ｂ成分）または液層（Ｆ成分）中の酵素活
性を測定すればよい。さらにこの際酵素活性を測
定するに当つては、使用する酵素反応に従つて対
応する基質を用いて消費される成分または生成さ
れる成分をもつてその定量を行なえばよく、例え
ば酸化酵素の場合にはその基質が酵素反応により
酸化される際に消費される酵素や生成される過酸
水素を測定し、これによりその酵素活性を求め、
さらにこの値よりＢ成分中のSODの定量、また
はＦ成分中の未反応のSOD−酵素結合体の定量
を行ない反応によつて消費されたSOD−酵素結
合体の量を求めてSODの定量を行なえばよく、
また還元酵素の場合はその酵素反応により消費さ
れる補酵素を測定することが好ましく、さらに加
水分解酵素の場合はその酵素反応により生成した
加水分解物を測定すればよく、またこれらの測定
に当つては例えば酸素電極、過酸化水素電極、比
色計にて直接測定するか、過酸化水素呈色試薬を
用いてその反応による呈色を測定してなる公知の
種々の方法が使用し得るもので、使用する酵素に
基いて適宜選択してその手段を採用すればよい。以上の如くして本発明を実施することにより、
被検液中のヒトおよびウシ由来のSODからなる
群より選ばれた１種のSODは極めて良好に定量
し得るもので、また使用する各種試薬も安全、か
つ安定であり、好適なSODの測定法であつた。次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれによつて何んら限定されるもの
ではない。実施例 (1) SOD 牛由来のSOD（オルゴテイン）：ダイアグ
ノステイツク・デイタ・インコーポレイテツ
ドより入手した。ヒト由来のSOD（ヒトSOD）：J.Blol.
chem.、234、46（1959）に記載の方法にて、
ヒト赤血球より、分離、精製した。その他の動物のSOD：ヒトSODの分離、
精製の方法に準じた方法にて分離、精製し
た。 (2) SODと特異的結合性を有する受容体５mg／mlのオルゴテインを等量のフロイン
ト・コンプリート・アジユバントと混和混合
して乳化物を作成し、この0.5mlづつを家兎
背部皮下に注射した。これを２週間毎に３回
行なつた後３週間おいて、さらに２週間毎に
３回免疫感作せしめた。次いでその抗体価
を、補体結合反応にて測定しつつ、800Uに
なつたとき、全採血し常法によりオルゴテイ
ンに対する抗血清を得た。５mg／mlのヒトSODを、上記のオルゴ
テインの代りに用いて、以下同様に家兎に免
疫せしめ、採血後、ヒトSODに対する抗血
清を得た。得られた各抗血清と異種動物由来のSOD
との交叉性について調べた結果、第１表に示
す通り、得られた抗血清の異種動物由来の
SODとの交叉性は1/1000以下であつた。

【表】

【表】 (3) SOD−酵素結合体 30mgのオルゴテイン、１ｍMEDATAを含
有する50ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）と100μ
ｇの３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ−
プロピオン酸スクシンイミドエステル含有
360μジメチルホルムアミドとを氷冷下１
時間撹拌反応せしめた。次いでその反応液
20μを分取し、100ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）２mlに加え、さらにβ−ガラクトシダ
ーゼ５mg加えて、氷冷下30時間撹拌反応し
た。反応終了後、反応液をセフアデツクスＧ
−150のカラム（２×70cm）にチヤージし、
100ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）にて溶出、ゲ
ル過して、β−ガラクトシダーゼ活性を有
する68〜77mlの分画を回収し、凍結乾燥して
オルゴテイン−β−ガラクトシダーゼ結合体
（β−ガラクトシダーゼの活性収率96％）を
得た。なおβ−ガラクトシダーゼ活性は、０−ニ
トロフエニル−β−ガラクトシドを基質とし
て、420nｍにおける吸光度により測定した。 30mgのヒトSODを50ｍリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlに溶解し、J.Biochem.、79、233〜
236（1976）の記載の方法に準じて、５mgのメ
タマレイミドベンゾイツクアシツドスクシン
イミドエステルを含むテトラヒドロフラン１
mlを加えて30分間室温で反応せしめ、セフア
デイツクスＧ−25のカラム（１×70cm）にチ
ヤージし、50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）の
溶媒でゲル過し、その16〜22mlの分画を回
収した（SODとして22mgを含有）。この分画
を凍結乾燥した後、0.7mgを分取し、0.2mlの
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）を加えて溶解
し、さらに0.3mlの50ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）を加えた後0.5mgのβ−ガラクトシダー
ゼを加えて、室温で２時間反応せしめた。反
応終了後、反応液をゲル過し、凍結乾燥し
てヒトSOD−β−ガラクトシダーゼ結合体
（β−ガラクトシダーゼの活性収率78％）を
得た。 (4) 抗ウサギγ−グロブリン抗体ウサギγ−グロブリン抗体10mg／mlと等量の
フロイント・コンプリート・アジユバントを混
和混合して乳化物を作成し、これをヤギ背部に
0.5mlづつ４ケ所に皮下注射した。２週間毎に
６回免疫し、最終免疫後２週間目に全採血し
て、常法によりその抗ウサギγ−グロブリンヤ
ギ血清を得た。 (5) オルゴテインに対する抗血清、ヒトSODに
対する抗血清の抗体価の測定オルゴテインに対する抗血清の測定オルゴテイン−β−ガラクトシダーゼ結合
体含有液100μ、オルゴテインに対する抗
血清の希釈液100μ、オルゴテイン含有液
100μを４℃で一夜反応した後、さらにこ
れに50μｇ／mlのウサギIgG含有液100μお
よび抗ウサギγ−グロブリンヤギ血清（８倍
希釈）100μを加えて４℃、一夜反応せし
めた（溶媒としては全て、0.25％牛血清アル
ブミン、0.1％NaN₃、0.15MNaCl含有10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）を用いた）。反応後
これに生理食塩水４mlを加え、次いで
3000rpm、15分間遠心分離し、その沈澱物た
る固相物を回収した。次いでこの固相物に、
４mg／mlの０−ニトロフエニル−β−ガラク
トシド、20ｍＭメルカプトエタノール、10％
メタノールを含む0.03Mリン酸緩衝液（PH
7.0）0.2mlを加えて37℃で１時間反応後、グ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（PH11.5）
2.3mlを加え、その呈色を420nｍの波長によ
り吸光度測定した。その結果、オルゴテインに対する抗血清の
抗体価は、第１図に示す通りであつた。ヒトSODに対する抗血清の抗体価の測定ヒトSOD−β−ガラクトシダーゼ結合体
含有液100μ、ヒトSODに対する抗血清の
希釈液100μ、ヒトSOD含有液100μを用
いて、以下、上記のオルゴテインに対する抗
体価の測定法と同様に行なつて、その抗血清
の抗体価を測定した。その結果、第２図に示す通りであつた。 (6) SODの測定オルゴテインの測定（検量線について）オルゴテインに対する抗血清の抗体価の測
定法と同様に、オルゴテイン−β−ガラクト
シダーゼ結合体含有液100μ（オルゴテイ
ンとして1.22nｇ／ml）、オルゴテインに対す
る抗血清100μ（512000倍希釈液）、および
被検液（オルゴテイン含有量０〜100nｇ／
ml）100μを加えて４℃、一夜反応せしめ、
次いでこれに50μｇ／mlのウサギIgG含有液
100μおよび抗ウサギγ−グロブリンヤギ
血清（８倍希釈液）100μを加えて４℃、
一夜反応せしめた。反応後これに、生理食塩
水４mlを加え、3000rpm、15分間遠心分離
し、その沈澱物を回収した。次いでこの沈澱
物に、４mg／ml０−ニトロフエニル−β−ガ
ラクトシド、20ｍＭメルカプトエタノール、
10％エタノール含有0.03Mリン酸緩衝液（PH
7.0）0.2mlを加え、37℃、１時間反応せし
め、反応液23mlのグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（PH11.5）を加えて、その呈色を波
長420nｍにて吸光度測定した。その結果、第３図に示す通りで、極めて良
好なオルゴテインの検量線が得られた。ヒトSODの測定（検量線について）ヒトSOD−β−ガラクトシダーゼ結合体
含有液100μ（ヒト由来SODとして1.14n
ｇ／ml）、ヒトSODに対する抗血清100μ
（640000倍希釈液）および被検液（ヒトSOD
含有量０〜100nｇ／ml）を用いて、以下、
上記オルゴテインの測定法と同様に行なつ
て、被検液中のヒトSODについて測定した。その結果、第４図に示す通りで、良好な検
量線が得られた。オルゴテインの測定被検液として、ウマの膝関節部にオルゴテ
インを投与（投与量は第２表の通り）し、そ
の血清を用いて、前記オルゴテインの測定法
（検量線）と同様に行なつて、オルゴテイン
投与後のウマ血清中のオルゴテイン含有量を
測定し、検量線に基いて算出した。その結果、第２表に示す通りであつた。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図はオルゴテインに対する抗血清の抗体価
を示す曲線、第２図はヒトSODに対する抗血清
の抗体価を示す曲線、第３図はオルゴテインの検
量線、第４図はヒトSODの検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１水性媒体下、ヒトおよびウシ由来のスーパー
オキシド・デスムターゼからなる群より選ばれた
１種のスーパーオキシド・デスムターゼ−酵素結
合体、少なくとも該当するスーパーオキシド・デ
スムターゼを含有する被検液と、該スーパーオキ
シド・デスムターゼに対する交叉性に比較して少
なくとも異種動物由来スーパーオキシド・デスム
ターゼに対する交叉性が1000分の１以下の特性を
有する特異的結合性を有する抗体を反応せしめた
後、その固相と液相を分離し、次いでその固相ま
たは液相の酵素活性を測定することを特徴とする
ヒトおよびウシ由来のスーパーオキシド・デスム
ターゼからなる群より選ばれた１種のスーパーオ
キシド・デスムターゼの定量的測定法。