JPS6217707B2

JPS6217707B2 -

Info

Publication number: JPS6217707B2
Application number: JP54129252A
Authority: JP
Inventors: Nobuaki Nakagawa; Kunio Ooyama
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-10-05
Filing date: 1979-10-05
Publication date: 1987-04-18
Also published as: JPS5653465A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は酵素免疫測定における改良法に関する
もので、詳しくは酵素免疫測定において、その免
疫反応系に還元剤を添加してなる酵素免疫測定に
おける改良法に関する。従来より生体内の微量成分、例えばハプテン、
抗原、抗体、その他レセプター、アイソザイムの
免疫成分の測定において、免疫的手法が用いられ
その標識物質としてラジオアイソトープ、酵素、
螢光物質などの種々の標識物質が使用されてい
た。ところがこれらの免疫的手法の内、酵素を標識
物質としてなる酵素標識免疫成分を用いてなる酵
素免疫測定においては、その免疫反応に際して測
定誤差を生じるものであつた。即ち、推定すれば、酵素免疫測定における試料
たる被検液、例えば血清、血漿中には免疫反応に
関与しない種々の蛋白質が含有されており、この
蛋白質が、酵素標識免疫成分の酵素と非特異的に
吸着反応を生じ、そのために測定すべき免疫成分
とその酵素標識免疫成分とによる特異的吸着反応
とを区別し得ず、これらによる反応生成物を全て
測定することとなり、著しい測定誤差を生ずるも
のであつた。特に、被検液が長期間保存されたものについて
はより著しい誤差を生じた。本発明者らは、上記の如くの酵素免疫測定にお
ける欠点を改良するに当つて種々研究した結果、
この免疫反応系にチオ硫酸ナトリウム、アスコル
ビン酸またはピロガロールなどの還元剤を添加せ
しめることにより、その酵素免疫測定値が著しく
安定化されることを知つた。本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、酵素免疫測定において、その免疫反応系に還
元剤を添加することを特徴とする酵素免疫測定の
改良法である。まず本発明における酵素免疫測定としては、酵
素を標識物質としてなる種々の公知の手法が使用
されるもので、例えばハプテン、抗原、抗体など
の測定すべき免疫成分と、β−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスフアターゼ、ホスホリパーゼＤ
などの加水分解酵素やその他の酵素とを架橋剤、
例えばグルタルアルデヒド、アジポアルデヒド、
ヘキサメチレンジイソシアナート、エチレンビス
マレイミド、ジエチルマロンイミデート、３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン
酸、３−（2′−ピリジール−Ｎ−オキサイド−ジ
チオ）プロピオン酸の反応性誘導体（特願昭53−
85900号参照）、マレイミド安息香酸スクシンイミ
ドエステルなどにて結合せしめてなる酵素標識免
疫成分、測定すべき免疫成分を含有する試料、例
えば血清、血漿などの生体体液、さらにこれらの
免疫成分と免疫反応を生ずる特異的免疫成分、例
えば測定すべき免疫成分がハプテンや抗原の場合
にはその抗体が特異的免疫成分として使用され、
また試料等の希釈液を兼用した免疫反応媒体、例
えば0.15MNaCl、0.1％NaN₃、0.25％BSA、
5mMEDTA含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）、さ
らに必要に応じて第二抗体、また例えばβ−ガラ
クトシダーゼやアルカリホスフアターゼをその標
識物質とする際にはその酵素作用によつて反応後
呈色する酵素基質を含有する酵素活性測定試薬か
らなる各成分を使用すればよい。次いで酵素免疫測定を実施するに当つては、例
えば免疫反応媒体中に、試料、酵素標識免疫成
分、およびこれらの免疫成分と免疫反応を生ずる
特異的免疫成分を加えてインキユベートせしめ
る。通常２〜24時間、室温〜37℃にてインキユベ
ートせしめればよく、またその反応後さらに第二
抗体を加えて２〜16時間程度インキユベートし、
これを遠心分離して免疫反応による沈澱生成物と
その液層とを分離し、次いでこの沈澱生成物また
は液層に酵素活性測定試薬を加えて、約37℃、10
〜60分間酵素反応せしめ、反応後その試薬に応じ
て酵素活性を求め、これにより試料中の免疫成分
の測定を行なうものである。上記の酵素免疫測定において、本発明ではその
免疫反応系に還元剤を添加するものであつて、そ
の添加時期としては少なくとも免疫反応の際にそ
の系内に存在すればよく、好ましくはあらかじめ
免疫反応媒体に添加してもよく、また試料、酵素
標識免疫成分、特異的免疫成分を加えた免疫反応
媒体液中に添加してもよい。またその還元剤としては、例えばチオ硫酸ナト
リウム、アスコルビン酸またはピロガロールが挙
られ、その添加量としては、最終濃度0.02％以上
であればよく、また多量に使用する際には目的と
する免疫反応の際の非特異的吸着に対しては効果
を奏するものの、酵素標識免疫成分の酵素活性を
阻害するために少なくともその酵素活性を阻害し
ない濃度であればよく、還元剤の種類により多少
異なるが、0.3％程度までであり、好ましくは
0.05〜0.15％である。このように酵素免疫測定における免疫反応系に
還元剤を添加せしめることにより、極めて正確に
試料中の免疫成分の測定をなし得るもので、また
特に保存された試料に対して著しく有効に効果を
奏するものである。次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれにより何んら限定されるもので
はない。実施例１インスリン80μＵ／mlを含有する試料100μ
（新鮮な血清、血漿およびその６ケ月凍結保存
物）、β−ガラクトシダーゼ標識インスリン100μ
（インスリンとして0.03mg含有）、抗インスリ
ン血清（50000倍希釈）100μを、0.15MNaCl、
0.1％、NaN₃、0.25％BSA、5mMEDTA含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）からなる免疫反応
媒体に加え、室温で３時間インキユベイトした。
この際、チオ硫酸ナトリウムを最終濃度として
0.1％添加した（＋）と無添加区（−）について
比較した（チオ硫酸ナトリウムはあらかじめ免疫
反応媒体中に添加した）。反応後これに、モルモツトIgGおよび抗モルモ
ツトIgGを４γづつ加え、室温で２時間インキユ
ベイトした後生理食塩水４mlを加えて3000rpm、
10分間遠心分離して、その沈澱物を得た。次い
で、この沈澱物にβ−ガラクトクダーゼ酵素活性
測定試薬（５mg／mlの０−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトシド、1mMMgCl₂、0.1％NaN₃、0.1
％BSA含有0.02Mリン酸緩衝液（PH6.7））0.3mlを
加えて37℃、60分間反応せしめた後、420nmにお
ける吸光度を測定（OD₄₂₀値）した。また対照と
して上記試料の代りにインスリン80μＵ／mlの免
疫反応媒体からなる試料を用いて同様に行なつ
た。なお、β−ガラクトシダーゼ標識インスリンは
次の如くして得たものである。３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピ
オン酸スクシンイミドエステル（特願昭53−
85900号参照）0.5mgおよびインスリン7.2mgを、
20％ジメチルホルムアミド含有0.1Mリン酸緩衝
液（PH8.0）1.8mlに加え、５℃で60分間反応せし
めた後そのPHを5.0に調整し、沈澱した３−（2′−
ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニルインス
リンを得た。次いでこの沈澱物0.025mgとβ−ガ
ラクトシダーゼ２mgとを0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に加えて室温で30分間撹拌反応せしめ、反
応後これをセフアデツクスＧ−200のカラムにチ
ヤージしてゲル過せしめ、その素通り区分（β
−ガラクトシダーゼ活性区分）を回収して、β−
ガラクトシダーゼ標識インスリンを含有する分画
を得た。以上の通りして得られた試料中のインスリン測
定の結果は第１表の通りである。なお相対活性は
対照におけるチオ硫酸ナトリウム添加区を100％
とした。

【表】その結果、第１表に示す通り、チオ硫酸ナトリ
ウム無添加区は全般に、対照に比べ、高い酵素活
性値を示し、特に６ケ月保存した試料においては
著しく高い酵素活性値を示したものであるに対
し、チオ硫酸ナトリウムを添加した区は全般に対
照と異なることなく、良好な酵素活性値を示した
もので、多分チオ硫酸ナトリウムの添加が、目的
とする免疫反応以外のβ−ガラクトシダーゼ標識
インスリンのβ−ガラクトシダーゼと、血清や血
漿中の他の蛋白質とによる非特異的吸着反応を防
止したものと推定される。実施例２上記実施例１のチオ硫酸ナトリウムの代りに、
種々の濃度のチオ硫酸ナトリウム、アスコルビン
酸およびピロガロールの還元剤を同様に用い、以
下実施例１の条件にてそれらの作用効果を測定
し、その相対活性値を各々求めた。その結果、第２表に示す通りで、一般に還元剤
0.02％ではその結果は弱く、0.05％〜0.15％が好
ましく、0.2〜0.3％まで酵素に阻害作用が現われ
ると推定された。なお相対活性は、対照の還元剤
無添加を100％とした。

【表】実施例３人の新鮮血清およびその６ケ月保存血清100μ
に、アルカリホスフアターゼ標識家兎IgG（ア
ルカリホスフアターゼ、家兎IgG、グルタルアル
デヒドを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）にて反応せ
しめ、セフアデツクスＧ−50にてその酵素活性分
画を回収）（IgGとして10mg／ml）、モルモツト
IgG4γ、抗モルモツトIgG4γを用いて、またチ
オ硫酸ナトリウム最終濃度0.1％にて、実施例１
に準じて、チオ硫酸ナトリウムの効果を測定し
た。また酵素活性測定は、トリス塩酸緩衝液（PH
8.2）で、ｐ−ニトロフエニルリン酸エステルを
酵素基準として、37℃で15分間反応後400nmの吸
光度（OD₄₀₀）を測定した。その結果、第３表に示す通りである。

【表】その結果、酵素免疫反応において、人の保存血
清の添加においても著しい高い酵素活性を示し、
チオ硫酸ナトリウムの添加はこれを改善し、良好
な値を示したものである。実施例４試料（新鮮および６ケ月保存の血清、血漿の
各々）100μに、６−アミノペニシラン酸（６
−APA）0.1ng、β−ガラクトシダーゼ標識６−
APA（３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プ
ロピオン酸スクシンイミドエステル、β−ガラク
トシダーゼおよび６−APAを用いて実施例１に
準じて調製した）（６−APAとして0.5ng／ml）
100μ、抗６−APAモルモツト血清（グルタル
アルデヒドを用いてBSAに10分子の６−APAを
結合せしめたものをモルモツトに６回感作して調
製した、40000倍希釈）を用い、実施例１に準じ
て、同様に行ない、チオ硫酸ナトリウム（最終濃
度0.1％）の添加の効果を測定した。その結果、
第４表に示す通りであつた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１酵素免疫測定において、その免疫反応系に還
元剤を添加することを特徴とする酵素免疫測定に
おける改良法。２酵素免疫測定における標識酵素が、加水分解
酵素である特許請求の範囲第１項記載の改良法。３還元剤が、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビ
ン酸またはピロガロールである特許請求の範囲第
１項記載の改良法。４還元剤が、最終濃度0.02％以上ないし酵素免
疫測定における標識酵素の活性を阻害しない濃度
である特許請求の範囲第１項または第３項記載の
改良法。