JPH01503439A - 結合アッセイ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ム　・・セイ幼 辻」 本発明は、酵素ラベル結合アッセイを実施するための装置に関する。

さらに詳しくは、この装置は吸収材料及び展開溶液を含んで成り、該吸収材料は 毛細管作用により該展開溶液を輸送することができ、そして酵素ラベルされた試 薬と基質との相互作用のみを許容して指示薬ゾーンに検出可能なシグナルを生じ させ、この指示薬ゾーンは測定結果に依存する量で、酵素ラベルされた試薬を直 接的又は間接的に固定化することができる。

土１図と１景 イムノアッセイのごとき結合アッセイは、生物学的流体中の物質の検出のため臨 床実験室において広く使用されている。

しかしながら、複雑な分析技法及び装置を必要としないで、例えば医師によりそ の診察室で、又は患者により家庭で行うことができるアッセイ法の開発への関心 が高まっている。この様なアッセイ法は便利であるのみならず、時間及び費用の 節約をも可能にする。便利で且つ簡単なアッセイ法及び試薬製剤がめられている 特定の用途は癌の検出及び月経循環における妊娠可能期の決定である。

多数の試薬ゾーンを有する材料のストリップを用いる結合アッセイが記載されて おり、この方法においては、展開溶液が溶剤フロントを形成し、これが毛細管作 用によってストリップにそって動き、そして試薬ゾーンに位置するアッセイ試薬 及びサンプルの間の反応を促進する（例えば、英国特許随１５８９２３４明細書 を参照のこと）。この様なストリップの特徴は、アッセイ法及びサンプル組成に より決定されるある条件下で、ラベルされた試薬が固定化され、そしてアッセイ 結果の指示を与える試験位置の存在である。初期のアッセイにおいては、ラベル された試薬は、放射性アイソトープによりラベルされた結合パートナ−又は測定 されるべき分析対象の類似体であった。このようなアッセイは、放射能ラベルの レベルを検出するための装置を必要とし、そして健康上の危険の問題を提供する 。これに対する解決策は、適切な基質と共に特徴的なシグナル（例えば色シグナ ル）を生成する酵素ラベルの使用であった。

この様ないわゆる「デツプスティック」酵素ラベル結合アッセイの設計における 重要な問題は、検出可能なシグナルを生成するための適切な酵素基質の使用であ る。このシグナルは、アッセイが完全に進行した後に試薬ストリップ上の適切な 位置に基質を添加することによって顕現される。あるいは、ストリップの適切な 部分が取り出され、そして化学的に分析される。これらのすべてが、そのアッセ イ法の家庭での使用にとって不可能ではないにしても少なくとも不便な段階を代 表する。

本発明者等のヨーロッパ特許明細書Ｎα２２５０５４において、本発明者等は、 最少の操作段階を用いた、家庭での該アッセイの使用を大きく促進する競争的及 び非競争的酵素ラベル結合アッセイに用いる装置を記載している。この装置は本 質的に、通常吸水性の紙から成る長いストリップ及び液槽を用いる。

このストリップにそって横断的に配置された、例えばサンプル受理ゾーン、使用 される特定のアッセイ法のために適当な酵素ラベルされたハプテン又は抗体が含 浸された試薬ゾーン、及び該酵素ラベルされた試薬を固定化することができる指 示薬ゾーンが存在する。破ることができるサックであることができる液槽はサン プル受理ゾーンに隣接するストリップの末端に位置し、そして酵素ラベル化試薬 のためには緩衝液、シグナル生成基質及び必要なコファクターを含んで成る展開 溶液を収容する。酵素及び基質は、接触に際してこれらが容易に測定することが できる発色のごときシグナルを生成するように選択される。他のアッセイ法のた めには、試薬ゾーン及び展開溶液の性質を変えることができ、そして追加の試薬 ゾーンを設けることができる。

例えば、競争的ハプテンアッセイのための装置が使用される場合、サンプルがサ ンプル受理ゾーンに通用され、液槽が破られ、こうしてすべての必要なコファク ターと共にシグナル生成基質を含有する展開溶液がストリップに入り、そしてそ れにそって動き、サンプル及び酵素ラベル化ハプテンをそれぞれのゾーンから取 り上げ、そしてそれら並びにシグナル生成基質及びコファクターを指示ゾーンに 輸送し、ここで酵素ラベルされたハプテンとサンプルからのハプテンとが固定化 された抗体上の結合部位に関して競争する。

この装置の特に有用な形態においては、シグナル発生基質又はすべての必要なコ ファクターが、これらがストリップにそって酵素ラベルされた試薬よりもゆっく りと移動するように選択される。この方法においては、シグナル生成基質及びコ ファクターがすべての結合した酵素ラベル化試薬に出合う時まで指示ゾーンにお いてシグナルが生成しない。この分別的移行が、基質及び酵素ラベルされたハプ テンがストリ、、ブにそって一緒に指示ゾーンに移動する場合に起こり得る、結 合した酵素ラベル化ハブテン及び非結合酵素ラベル化ハブテンから生ずるシグナ ルの不完全な分離に基くアッセイ中のすべての不明疎さを回避する。指示ゾーン におけるシグナルの強度はサンプル中のハプテンの濃度に逆比例する。

主発里二丘！ 本発明者等は今や酵素ラベル化結合アッセイを行うための新規な装置を見出した 。この装置においては、好ましい観点においてシグナル生成基質及び酵素でラベ ルされた試薬が同時に移行し、従って分別移行の利用がすべて回避され、しかし なお明瞭な結果が得られることを保証する。この装置は操作するのが便利であり 、最少の操作段階を用い、そして特に家庭で使用するのに適する。

ＡＩＮυ１肌 従って、本発明の１つの観点に従えば、本発明者等は酵素ラベル化結合アフセイ を行うための装置を提供し、この装置は吸収材料と基質を含有する展開溶液とを 有し、ここでこの吸収材料は指示薬ゾーンを含む複数の試薬ゾーンを備えており そして毛細管作用によりこれらの試薬ゾーンを通って前記展開溶液を輸送するこ とができ、そして前記指示薬ゾーンは測定結果に依存する量において酵素ラベル 化試薬を直接的又は間接的に固定化することができ、酵素ラベル化試薬が指示薬 ゾーンにおいて固定化される以外はシグナルの生成を防止する試薬を前記吸着材 料が含有することを特徴とする。

本発明の装置において、アッセイは、指示薬ゾーンで固定化された酵素ラベルの 量がアッセイの結果を示すような任意のタイプの酵素ラベル化結合アッセイであ ることができる。

固定化された酵素の作用により指示薬ゾーンで生成したシグナルは蛍光的又は化 学発光的でもよいが、好ましくは発色による。この装置は例えば臨床化学におい て及び微生物学において使用することができ、特に妊娠可能性及び核酸の決定に おいて並びに怒染性疾患の診断のために使用することができる。この装置は競争 的結合アッセイ及び非競争的結合アッセイを行うために適当であり、これらのア ッセイにおいてはサンプル中の分析対象が酵素でラベルされた試薬に結合するか 又は酵素でラベルされた分析対象類似体と競争して試薬に結合し、あるいはそれ 自体測定可能な特徴を有し、そして装置上に固定化された試薬に結合する。好ま しくはこのアッセイはイムノアッセイである。

このアッセイ法は例えば二部位免疫アッセイ又は二重競争アッセイ、例えば英国 特許２０２９０１１Ｂ及び２１１６３１８Ｂ明細書中に記載されているタイプの 二重分析対象アッセイであることができる。この分析対象は特異的結合パートナ −を有する任意の分析対象、例えば抗原又は抗体と結合することができる抗体又 は抗原、あるいは相補的核酸鎖と結合することができる単鎖核酸であることがで きる。

酵素でラベルされた試薬は、適切であればハプテン、抗体又は核酸と連結された 、適切な基質の存在下で測定可能なシグナルを生成することができる任意の酵素 （以後、シグナル生成酵素と称する）であることができる。あるいは、酵素ラベ ルされた試薬中の酵素は、シグナル生成酵素のだめの基質を生成することができ る酵素（以後、基質生成酵素と称する）であることができる。すなわち、−ｉに シグナル生成酵素は酸化還元酵素、例えばパーオキシダーゼ、例えば西洋ワサビ ・パーオキシダーゼ、オキシダーゼ、例えばクエン酸合成酵素、ユーリカーゼ、 又はモノアミンオキシダーゼ、あるいは脱水素酵素、例えばジアホラーゼ又はグ ルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ；あるいはヒドロラーゼ、例え ばホスファターゼ、例えばアルカリ性ホスファターゼ、グリコシダーゼ、例えば β−グルコシグーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ、又はコリンエステラーゼである ことができる。基質生成酵素は例えばオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダ ーゼ、又はホスファターゼ、例えばアルカリ性ホスファターゼであることができ る。

使用されるアッセイ法に依存して、シグナル生成酵素又は基質生成酵素は、標準 的カップリング法、例えばスルヒドリルマレイミドカップリング〔イシカワ、Ｅ 、　（１９８０）　＋　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｕｐｐ、上、１−１６；Ｄｕ ｎｃａｎ、　Ｒ−Ｊ−Ｓ　１等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、＋　１３２＋６ ８−７２〕、ジスルフィド−チオール交換（Ｃａｒｌｓｏｎ、Ｊ、等（１９７８ ）　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　１７３＋７２３−７３７）　、過ヨウ素酸酸化（Ｎａ ｋａｎｅ、Ｐ、Ｋ。

等（１９７４）、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、２２．１０８４ −１０９１）　、又はグルタルアルデヒドカップリング［Ａｖｒａｍａｓｓ、　 Ｓ、　（１９６９）　＋　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ。

６　＋４３−７２；Ａｖｒａｍｅａｓ、Ｓ、等（１９７１）　、　１ｍｍｕｎｏ ｃｈｅａ＋、　８　、１１７５−１１７９　）を用いて、例えばハプテン、抗体 又は核酸に共有結合せしめることができる。

あるいは、シグナル生成酵素又は基質生成酵素は酵素ラベル化試薬の部分を構成 せず、しかし抗体の固定化に関して後で検討するように物理的吸着又は化学的カ ップリングを用いて例えば指示薬ゾーンに固定化され得る。すなわち、例えばア ッセイ系がシグナル生成酵素及び基質生成酵素の両者を用いる場合、前者は指示 薬ゾーンに固定化されることができ、そして後者は抗体、ハプテン又は核酸に連 結されて酵素ラベル化試薬を構成することができる。

シグナル生成基質は一般に、シグナル生成酵素の直接的又は間接的作用により検 出可能なシグナルを生成する任意の化合物であることができる。すなわち、シグ ナル生成基質はそれ自体シグナル生成酵素の作用により（例えば、酸化、還元又 は加水分解により）変換されて検出可能な生成物（例えば、色度測定、蛍光測定 又は化学発光測定の手段により検出可能な）を生じさせてもよい。この様な基質 の例にはフェノール、例えばニトロフェノール類、インドール類、例えばインド ールエステル類、ベンジジン類、例えば子トラメチルベンジジン、及びクマリン 類例えばヒドロキシクマリンエステル類があり、これらは適切な酵素の作用によ り着色生成物に転換され得るものである。

あるいは、シグナル生成基質は、シグナル生成酵素により生成される他の化合物 との相互作用により検出可能な生成物に転換される化合物であることができる。

すなわち、例えば、電子供与体、例えばニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ チド（ＮＡＤ）又はコエンザイムＡ（ＣＯＡ）の存在下で反応して検出可能な生 成物を形成する電子受容体、例えばテトラゾリウム塩又はエルマン（Ｅ１１＋ｎ ａｎ）試薬〔５，５−ジチオビス−（２−ニトロベンゾエート）〕であることが できる。電子供与体は対応する電子受容体へのシグナル生成酵素の作用により生 成してもよく、例えば適当な酵素により還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）はＮＡＤに酸 化され、そしてアセチルＣｏＡはＣｏＡに酸化される。

一般に、シグナル生成基質から生成した生成物は水に対して相対的に不溶であり 、そして吸着材料に結合して、指示薬ゾーンにおいて又はその近傍でそれが生成 したところで検出可能なシグナルを提供する。

所望により、シグナル生成系の感度は、相互作用して増幅系を形成する試薬を選 択すること増強することができる。この様な試薬は、例えば、展開溶液中に含ま れるか又は吸着材料中に固定化される相互作用する一連の酵素（酵素カスケード ）であることができる。すなわち、例えば酵素ラベルされた試薬がカスケード中 の一次酵素を形成しそして不活性な前駆体化合物に作用してそれを活性体に転換 する（例えば、プロ酵素−酵素転換、例えばトリプシノーゲン−トリプシン転換 及びキモトリプシノーゲン−キモトリプシン転換）ことができる。生成した活性 体は次に不活性な前駆体を活性化するために使用されることができ、こうして最 終反応が検出可能な終点、例えば着色された生成物を生じさせるために使用され るまで続く。カスケード列中の次の成分の大過剰を活性化するカスケードの所与 の成分の能力により達成される。シグナル防止剤は増幅系の任意の適当な点にお いて、例えば酵素ラベルされた試薬と第一の不活性前駆体との相互作用を回避す るために、酵素ラベルされる試薬が指示薬ゾーンにおいて固定化されるまで使用 されるであろう。

本発明の装置において使用することができるシグナル生成系の特定の例が後記の 第１表に示される。

指示薬ゾーンにおいて酵素ラベルされた試薬が固定化されるところ以外でのシグ ナルを生成を防止する試薬（以後、シグナル防止剤と称する）の正確な性質は使 用されるアッセイ系に依存するであろうが、一般にこの薬剤は酵素−基質対の有 効な相互作用を防止する任意の試薬であることができる。

従って例えば、シグナル防止剤は（１）酵素ラベルされた試薬の可逆的阻害剤； 　（２）基質又はコファクターに関して酵素ラベルされた試薬と競争する他の酵 素又は試薬；　（３）酵素ラベルされた試薬のための他の基質であって発色性で はなくそして該酵素についてシグナル生成基質と競争するもの；（４）酵素ラベ ルされた試薬により触媒される反応の最終生成物であって該酵素を阻害すること ができるもの；又は（５）酵素ラベルされた試薬の存在場所のｐＨを該酵素の最 適ｐＨから離れて維持することができる試薬、であることができる。

タイプ（１）〜（５）の適当なシグナル防止剤の特定の例は後で第１表に記載さ れる。

さらに、例えば、タイプ（１）のシグナル防止剤は該酵素の適切な可逆的阻害剤 、例えば酵素がクエン酸合成酵素である場合はアデノシントリホスフェート、で あることができる。

酵素が酸化還元酵素、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ、又はオキシダーゼ、 例えばグルコースオキシダーゼである場合、タイプ（２）の試薬は、任意の適切 な酵素又は酵素ラベルされた試薬と競争する試薬、例えばレダクターゼ（例えば 、カタラーゼ）、又は還元剤（例えば、アスコルビン酸又はその瓜、例えばアス コルビン酸ナトリウム；又は還元型グルタチオン）であることができる。

酵素が酸化還元酵素である場合、還元剤、特にアスコルビン酸又はその塩が特に 有である。アスコルビン酸ナトリウムが特に好ましい。タイプ（３）の試薬は酵 素のための任意の適切な他の基質、例えば酵素がホスファターゼである場合適切 なリン酸エステル（例えば、二級もしくは三級アルコール、糖アルコール、環状 アルコールフェノール及びアミンのリン酸エステル、そして特にグルコース−６ −ホスフェート又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）、あ るいは酵素がグリコシダーゼ例えばβ−ガラクトシダーゼである場合ラクトース であることができる。タイプ（４）の試薬は、酵素によって触媒される反応の適 切な最終生成物、例えば酵素がアルカリ性ホスファターゼのごときホスファター ゼである場合オリゴホスフェートであることができる。タイプ（５）の試薬は酵 素の最適ｐＨ値から離れた値にｐＨを維持することができる適切な試薬、例えば アルカリ性の生成物を生じさせることによりｐ）ｌを上昇せしめる試薬（例えば 、−緒になってアンモニアを生じさせるウレアーゼと尿素）及び、酸ゼ及びペニ シリンＧ）であることができる。

あるいは、シグナル防止剤は、シグナル生成基質又は使用する場合には基質生成 酵素のための基質もしくはその誘導体、又は該酵素のための補基質（ｃｏ−ｓｕ ｂｓｔｒａｔｅ）を物理的又は化学的手段により固定化することができる−又は 複数の化合物であることができる。

使用されるシグナル防止剤の量は、酵素ラベルされた試薬が指示薬ゾーン中で固 定化される時を除くアッセイの操作の期間のいずれの時においても酵素とシグナ ル生成基質とが相互作用して指示薬ゾーンにおいてシグナルを生成せしめること がない様なものである。一般に、使用されるシグナル防止剤の濃度は各アッセイ 装置について実験的に決定する必要があり、そして存在するシグナル生成酵素及 びシグナル生成基質の濃度並びにそれらの相互の及びシグナル防止剤に対する相 対親和性のごとき因子に依存するであろう。しがしながら、−ｍに、指示薬ゾー ンにおいて以外、シグナル防止剤は通常シグナル生成酵素及びシグナル生成基質 の濃度に関して過剰な濃度で存在するであろう。

長いストリップの形態であることができる吸収材料は毛細管作用により展開溶液 を輸送することができる任意の材料であることができる。必要な毛細管特性及び 低レベルの非特異的結合を示す任意の材料を使用することができるが、好ましい 材料は吸水性紙、例えばガラス繊維紙である。

吸収材料の物理的寸法が過大にならないように、酵素ラベルされた試薬又は同時 に移動する抗原と複合体を形成した酵素ラベルされた試薬は好ましくは０．７以 上のＲｆ値を示すべきである。

吸収材料がシグナル防止剤及び特定のアッセイ法のための他の試薬により含浸さ れていて、これらが該材料中又は該材料上の別々のゾーンに存在するようにされ ていてもよい。所望により、一種類より多くの試薬が任意の特定のゾーンに存在 することができ、例えばシグナル防止剤及び酵素ラベルされた試薬が１つのゾー ンに一緒に存在することができる。

指示薬ゾーンが固定化された抗体を含んで成る場合、この固定化は当業界におい てよく知られている技法［Ｒ，Ａｘｅｎ等（１９６７）、Ｎａｔｕｒｅ、　２１ ４，１３０２；Ｓ、Ａｕｒａｍｅａｓ及びＴ、Ｔｅｒｎｙｎｅｋ　（１９６９） 　。

１＊ｍｕｎｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ、　６．５３；Ｇ、Ｓ、Ｂｅｔｈｅｌｌ等 （１９７９）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

玉、　２６７２　；並びにＪ、Ｍ、Ｊ、Ｆｒｅｃｈｅｔ　（１９８１）　＋　Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｕ＋　６６３　）を用いてのストリップへの抗体の物理 的吸着又は化学的カップリングにより達成することができる。

しかしながら好ましい技法は、吸収ストリップ材料のフレームワーク中に捕捉さ れ又はその繊維に吸着されそして展開溶液と一緒に移動することができないため に正しいサイズ及び性質を有する不溶性粒子に抗体を付着せしめることである。

適当なタイプの粒子は西独バイチルスタンド、ローム・ファルマ社によって供給 されるユーパーギッ）　（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）ＣＩＺである。例えば例１に後記 するように標準的方法を用いて粒子に抗体を付加しそして付加された抗体を有す るこの粒子を例えばスラリーとして吸収材料に添加することができる。

試薬ゾーンは一般に、展開溶液が次々とそれらに接触するように配置することが できる。試薬ゾーンが配置される順序は変えることができるが、但しシグナル防 止剤が酵素ラベルされた試薬とは異るゾーンに存在する場合にはシグナル防止ゾ ーンは常に、展開溶液により接触される２つのゾーンの内に第一のものであろう 。隣接する試薬ゾーンとの接触の間に所定のインキュベーション期間が可能であ るように、試薬ゾーンは材料上又は材料中に配置することができる。

装置の好ましい形態において、吸収材料は横断する試薬ゾーンを有する長いスト リップの形態であることができる。装置はまた、吸収材料のバッドに末端におい て取り付けられた長いストリップを有することもできる。

本発明の装置における展開溶液は、シグナル生成基質を含有することができ、又 は基質生成酵素が使用される場合には該酵素のための基質を含有することができ る。展開溶液はサンプルそれ自体に前記の基質を添加したものでもよいが、しか し好ましくはサンプルとは別のものである。有利には、この溶液は、吸収材料の 部分に隣接した、適切には吸収材料のストリップの一端にある破ることができる サックに収容されている。あるいは、この発明の装置は定義されるような吸収材 料及び展開溶液の容器を含んで成るキットの形であることができる。好ましくは 、展開溶液はアッセイ系と適当性の緩衝液を含んで成る。酵素ラベル化イムノア ッセイのための特に好ましい展開溶液は、０．２％（ｖ／ｖ））ウィーン２０及 びシグナル生成基質又は適当な場合には基質生成酵素のための基質を含有する０ 、　１　Ｍ酢酸塩−クエン酸塩（ｐＨ６）から成る。

この装置は、所望により、細胞性材料又は破片のごとき固体物質を除去するため の濾過パッドのごとき濾過膜を備えることができるサンプル受理ゾーンを含むこ とができる。

この発明の装置は、アッセイの完了を示すための固定化された酵素を含んで成る アッセイ完了標示ゾーンを含むことができる。吸収材料がストリップの形態であ る場合、アッセイ完了標示ゾーンは好ましくは展開溶液が適用される末端から離 れたストリップの末端近傍に位置する。

吸収材料は、透明な窓が設けられる指示薬ゾーンの部位を除き不透明な被覆で覆 うことができる。サンプルゾーンへのアクセスはサンプルの適用の後に元に戻す ことができる再封可能なプラグの除去により行うことができる。装置へのサンプ ルの通用は、一定容易のサンプルを供給するアプリケーター、例えばサンプリン グループによることができる。

装置は１個ずつ包装することができるが、しかし例えば月経期間にわたる家庭で の毎日の尿サンプルのモニターを容易に行うために本発明の複数の装置を一緒に 包装することもできる。従って本発明者等はまた、本発明の複数の装置を含んで 成る試験シートを提供する。

−ａ的使用において、シグナル防止剤が酵素ラベルされた試薬と共に移動するこ とが意図される場合、展開溶液がまず吸収材料に通用される。例えば、吸収材料 がストリップの形である場合、好ましくは、シールされたサックを例えば指の圧 力により内容物を放出してストリップの一端に展開溶液を適用する。展開溶液が 吸収材料を通ってサンプル受理ゾーンに適用されたサンプル、並びに材料中の試 薬ゾーンとして存在するシグナル防止剤及び酵素ラベルされた試薬を含む他の試 薬を取り上げながら前進する。アッセイ反応は展開溶剤の前進中の溶剤フロント において行われるが、シグナル防止剤の存在によりシグナルは生成されない。試 薬ゾーンの場所的な分離によって決定されるインキュベーション期間の後、一定 量の酵素ラベルされた試薬がアッセイ結果に依存する量で指示薬ゾーンに固定化 される。シグナル防止剤は固定化されず、展開溶液により洗い流されそして指示 薬ゾーンから除去される。展開溶液による連続する洗浄が指示薬ゾーンからシグ ナル防止剤を除去し、そして該ゾーン中に固定化された酵素が基質と反応しそし てシグナルを発生せしめることを可能にする。

好ましくは、シグナル防止剤は酵素ラベルされた試薬と共に移動するであろう。

しかしながら、シグナル防止剤は、吸収材料に、例えば抗体の固定化に関して前 に検討したように物理的吸着又は化学的カップリングにより、展開溶液が酵素ラ ベルされた試薬に達する前にシグナル防止剤に達するような位置に固定化するこ とができる。固定化されるシグナル防止剤の量は、限定された期間の後に該薬剤 が基質により飽和されてさらなる基質の結合が生じないか、又は基質によって消 費されてさらなる基質の代謝が生じないような量である。

こうして、溶剤フロントの直ぐ後に基質を含有しないゾーンが生成され、その程 度が、シグナル防止剤が飽和され又は消費されるのに要した時間に依存するであ ろう。使用されるシグナル防止剤の正確な量は使用されるアッセイ系に依存じ、 そして常法に従って小規模な予備試験を用いて実験的に決定する必要があろう。

一般に、使用される量が基質不含ゾーンの程度を決定するであろう。

シグナル防止剤が吸収材料中に固定化される場合、このものは直接的又は間接的 に基質と反応することができる。すなわち、例えば、シグナル防止剤は、常法に より基質がそれに共有結合しているハブテンと結合するモノクローナル抗体のご とき抗体であることができる。あるいは、シグナル防止剤は基質の誘導体と相互 作用する化合物であることができ、例えばシグナル防止剤がストレプトアビジン でありそして基質がビオチン化誘導体（すなわち、常用技法を用いて基質に共有 結合したビオチン）であることができる、あるいはまた、シグナル防止剤は基質 と直接的に相互作用することができる任意の化合物であることができ、例えば基 質がグルコースである場合、シグナル防止剤はコンカナバリンＡであることがで きる。

本発明の装置によって示されるアッセイの結果は定性的であることができ、指示 薬ゾーンにおけるシグナル、特に着色シグナル、の単なる不存在又は存在によっ て読み取られ得る。

このタイプの結果は、サンプル中の特定の分析対象の闇値がモニターされる場合 （例えば特定のホルモンのレベル）にかなり有用である。しかしながら、この装 置は定量的なアッセイ結果を得るためにも使用され得る。指示薬ゾーンにおいて 生成されるシグナルの強度は、サンプル中に存在する分析対象の濃度に比例する か又は逆比例するであろう。従って、アッセイの後、装置の指示薬ゾーンを反射 分光計又は蛍光計（生成されるシグナルが蛍光であれば）に挿入して、生成した シグナルの強度を測定することができる。

２皿食里生星址ユ ここで、本発明を添付図面に言及しながら例によって記載する。図面において： 第１図は、競争的ハブテンアッセイを行うための装置を示し； 第２図は、非競争的ハブテンアッセイを行うための装置を示し； 第３図は、二部位サンドインチ又はイムノメトリーアンセイを行うための装置を 示し； 第４図は、二重分析対象アッセイを行うための装置を示し：第５図は、二重分析 対象アッセイを行うための他の装置を示し； 第６図は、月経サイクルをモニターするために配置された本発明の多数の装置を 含んで成る試験シートを示す。

本発明の具体例をまず第１図〜第６図に言及しながら一般的に記載し、そして次 に例１〜３に言及しながらさらに具体的に記載する。

押入ステロイド　７、　ＭＳＡ 混合ステロイド抗原（ＭＳＡ）はオニストロン−３−グルクロニド（Ｅ１３Ｇ） 及びプレグナンジオール−３−グルクロニド（ＰＤ３Ｇ）を含んで成る三官能リ ガンドである。この化合物の合成は英国特許明細書ＧＢ−Ｂ−２１１６３１８に 記載されている。

第１図は尿サンプル中のプレグナンジオール−３−グルクロニド（ＰＤ３Ｇ）の 濃度を競争的ハブテンアッセイ法を用いて測定するための装置を示す。第１図に 関し、この装置は吸水性紙のストリップ１、及び基質−緩衝液から成る展開溶液 ３を含有する液槽２を有する。該ストリップはシグナル防止剤ゾーンＳＰ、サン プル受理ゾーン４、第一の試薬ゾーン５、及び第二の指示薬ゾーン６を有する。

シグナル防止剤ゾーンＳＰはシグナル防止剤を含有し、そして第一の試薬ゾーン ５はシグナル生成酵素又は基質生成酵素に共有結合により付加されたＰＤ３Ｇハ ブテンを含んで成る酵素ラベルされたＰＤ３Ｇを含有する。シグナル防止剤及び 酵素ラベルされたＰＤ３Ｇはそれぞれストリップに含浸されており、使用に際し これらは溶解しそしてストリップを通る展開溶液の通過により該ストリップを通 って移行する。指示薬ゾーン６はストリップに共有結合した、ＰＤ３Ｇに対する 抗体及び必要な場合にはシグナル生成酵素を含んで成る。第１表はこのアッセイ において使用するための適当なその他の酵素、基質及びシグナル防止剤の例を含 む。

使用の際、尿のサンプルがサンプル受理ゾーン４に通用され、そして展開溶液３ が指の圧力でサック２を破ることによりストリップの端に放出される。展開溶液 ３が毛細管作用によりストリップを通過し、溶剤フロントにおいてシグナル防止 剤、サンプル及び酵素ラベルされたＰＤ３Ｇをそれぞれシグナル防止剤ゾーンＳ Ｐ、サンプル受理ゾーン４及び第一の試薬ゾーン５から取り上げる。

展開溶液３の溶剤フロントが第一の試薬ゾーン５に達するとき、シグナル防止剤 、基質及び酵素ラベルされたＰＤ３Ｇがサンプル由来のＰ０３Ｇと共に溶剤フロ ントに存在する。しかしながらこの段階では、又は溶剤フロントが引き続いて試 薬類を指示薬ゾーン６に輸送する際にシグナルは生成されない。なぜなら、シグ ナル防止剤が基質と酵素との相互反応を止めるからである。溶剤フロントが指示 薬ゾーン６に達するとき、サンプルからの存在するＰＤ３Ｇが指示薬ゾーン中の 限定された数の結合部位に関して酵素ラベルされたＰＤ３Ｇと競争する。従って 、指示薬ゾーン６においてストリップに結合する酵素ラベルされたＰＤ３Ｇの量 がサンプル中のＰ０３Ｇの濃度に逆比例する。

ストリップの連結する展開がシグナル防止剤を洗浄し、そしてすべての未反応試 薬が指示ゾーン６を通過し、このゾーンがシグナル防止剤を含まなくなる。同時 に、連続する展開が新鮮な基質を指示ゾーンに運び、ここでこれがシグナル防止 剤の不存在下で結合したシグナル生成酵素及び必要な基質生成酵素により転換さ れ着色生成物を与える。こうして着色された生成物指示ゾーン６においてシュー ブな色バンドをもたらす。第１図に示される距離Ａ及びＢの差は、サンプル及び 酵素ラベルされたＰＤ３Ｇが指示ゾーン６に達するまで相互作用しないように比 較的小さくされ、こうしてストリップの長さが短縮される。指示ゾーン６におい て生ずる競争反応の持続時間はサンプル及び酵素ラベルされたＰＤ３Ｇが指示ゾ ーン６を通過するために要する時間と同じである。これは、ストリップが作られ た材料の物理的性質により決定される。

第２図は、非競争的ハブテンアッセイ法を用いて尿サンプル中のＰ０３Ｇの濃度 を測定するだめの他の装置を示す。第２図に関し、この装置は吸水性紙のストリ ップ１１、及び基質−緩衝液から成る展開溶液１３を収容する液槽１２を有する 。

ストリップはシグナル防止剤ゾーンＳＰ、サンプル受理ゾーン１４、第一の試薬 ゾーン１５、第２の指示薬ゾーン１６を有する。第一試薬ゾーン１６は、シグナ ル生成酵素又は基質生成酵素に共有結合により付加されたＰＤ３Ｇに対する抗体 を含んで成る酵素ラベルされた抗−Ｐ０３Ｇを含有し、この酵素ラベルされた抗 −ＰＤ３Ｇはストリップに含浸されていて、使用に際しストリップを通しての展 開溶剤１３の通過により該ストリ・７ブを通って移行する。指示ゾーンはＰＤ３ Ｇ、及び必要によりストリップに共有結合したシグナル生成酵素を含んで成る。

液槽１２、展開溶液１３、シグナル防止剤及び酵素ラベルは第１図に関して前記 した通りである。

使用に際し、尿のサンプルがサンプル受理ゾーンに適用され、そして展開溶液１ ３が指の圧力によりサック１２を破ることによりストリップの末端に放出される 。展開溶液１３は毛細管作用によりストリップを通過し、シグナル防止剤及びサ ンプルを持ち上げる。サンプル中に存在するＰＤ３Ｇが過剰に存在する酵素ラベ ルされた抗−Ｐ［１３Ｇにより第一の試薬ゾーン５において結合される。この反 応が行われるためのインキュベーション時間は、第２図に示す距離Ｂ及びＡの間 の差により調節される。溶剤フロントが指示ゾーン１６に接触する場合、ストリ ップに共有結合したＰＤ３ＧはＰＤ３Ｇに対する酵素ラベルされた抗体の未反応 のものと結合する。やはり、シグナル防止対が酵素ラベルされた抗−ＰＤ３Ｇ及 び基質と共に動くため、シグナル生成酵素及び必要な基質生成酵素が固定化され ている指示ゾーン１６において且つシグナル防止剤が該ゾーンから洗い去られた 時にのみ発色が生ずる。

第３図は、二部位サンドイッチアッセイ又はイムノメトリーアッセイ、法を用い てサンプル中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の所与の濃度を検出するための装 置を示す。第３図に関し、この装置は吸水性紙のストリップ２１、及び基質−緩 衝液から成る展開溶剤２３を含有する液槽２２を有する。

液槽２２及び展開溶液２３は第１図に関連して記載した通りである。ストリップ はシグナル防止剤ゾーンＳＰ、サンプル受理ゾーン２４、第一の試薬ゾーン２５ 、及び第二の指示薬ゾーン２６を有する。第一の試薬ゾーン２５は、シグナル生 成酵素又は基質生成酵素に共有結合された、ＴＳＨに対する抗体を含んで成る酵 素ラベル化抗−ＴＳ）（はストリップ２１に含浸されていて、使用に際して展開 溶剤２３の通過によりストリップを通って移動する。指示ゾーン２６はＴＳＨに 対する第二抗体及び必要な場合にはストリップ２１に共有結合したシグナル生成 酵素を含んで成る。第二の抗体は、酵素ラベルされた抗体のそれとは異り且つ非 競争的なＴＳＨのエピトープに対する特異性を有する。このシグナル防止剤及び 酵素ラベルは第１図に関して前記した通りである。

使用に際し、サンプル中に存在するＴＳＨは過剰に存在する酵素ラベルされた抗 体により、これらがストリップを同時移行する間に結合される。この第一の反応 のために許容される時間は第３図に示す距離Ｂ及びＡの間の差により支配される 。指示ゾーンを通る際、ＴＳＨ（抗体複合体の形の）は第二抗体により結合され る。第二のインキュベーションの時間はストリップの材料を通す溶剤フロントの 毛細管移行の速度により支配される。やはり、シグナル生成酵素及びなんらかの 必要な基質生成酵素が指示ゾーンに固定化されそしてシグナル防止剤が該ゾーン から洗い去られた場合にのみ発色が生ずる。

第４図は尿サンプル中のＰＤ３Ｇ及びオニストロン−３−グルクロニド（Ｅ１３ Ｇ）の比率を測定するための装置を示す、これらの２種類の生成物の比率は女性 の月経サイクルの妊娠可能期を指示するものであることが示されている（例えば 、公開された英国特許明細書ＧＢ−Ｂ−２０２９０１１及びＧＢ−Ｂ−２１１６ ３１８を参照のこと）。

第４図に関し、この装置は吸水性紙のストリップ３１、及び基質−緩衝液から成 る展開溶液３３を収容する液槽３２を有する。液槽３２及び展開溶液３３は第１ 図に関連して記載した通りである。ストリップはシグナル防止剤ゾーンＳＰ。

サンプル受理ゾーン３４、第一の試薬ゾーン３５、第二の試薬ゾーン３６、第三 の試薬ゾーン３７、及び第四の指示薬ゾーン３８を有する。第一の試薬ゾーン３ ５は架橋構造に共有結合したＥ１３Ｇハプテン及びＰＤ３Ｇハプテンから成る混 合ステロイド抗原（ＭＳＡ）を含んで成る。ＭＳＡはストリップ３１に含浸され 、このものは展開溶液３３の前進する溶剤フロント中でストリップを通って移行 する。第二の試薬ゾーン３６はＥ１３Ｇに対する抗体を含んで成り、このものは 好ましくはストリップに共有結合されるが、前進する溶剤フロント中でストリッ プを通して移行するために自由であってもよい、第三の試薬ゾーン３７は酵素ラ ベルされた抗−Ｅ１３Ｇを含んで成り、このものは展開溶液３３と共にストリッ プを通して移行することができるようにストリップ３１に含浸される。第四の指 示薬ゾーン３８はストリップに共有結合したＰＤ３Ｇに対する抗体を含んで成る 。シグナル防止剤及び酵素ラベルは第１図に関連して前記した通りである。

使用に際し、尿サンプルがサンプルゾーン３４に適用され、そして展開溶液３３ の液槽３２が破られ、展開溶液がストリップの一端に放出される。展開溶液が毛 細管作用によってストリップ３１を通り、シグナル防止剤ゾーンＳＰからシグナ ル防止剤を、サンプル受理ゾーン３４からサンプルを、そして第一の試薬ゾーン ３５から混合ステロイド抗原を持ち上げる。シグナル防止剤、サンプル及びＭＳ Ａはストリップにそって、Ｅ１３Ｇに対する抗体が共有結合により固定化されて いる第二の試薬ゾーン３６に一緒に移行する。サンプル中に存在するＭＳＡ及び Ｅ１３Ｇは、これらが第二の試薬ゾーン３６を通る際に阻害された結合部位に関 して競争する。サンプル中のＥ１３Ｇの濃度が低い場合、ＭＳＡの実質的な部位 が第二の試薬ゾーン３６において結合され、そしてさらに移行することができな い、しかしながら、Ｅ１３Ｇのサンプル濃度が高い場合、ＭＳＡはシグナル防止 剤及びサンプルと一緒に、Ｅ１３Ｇに対する酵素ラベルされた抗体を含んで成る 次の試薬ゾーンすなわち第三の試薬ゾーン３７に移行するために自由であろう。

この後者の試薬は過剰に存在し、そしてストリップ３１に非共有結合により吸収 されている。酵素ラベルされた抗体及びＭＳＡの両者がシグナル防止剤及びサン プルと一緒にストリップにそって、ＰＤ３Ｇに対する抗体がストリップに共有結 合している第四の指示薬ゾーン３８に移行する際に、該酵素ラベルされた抗体が ＭＳＡに結合する。第四の指示薬ゾーン３８において、サンプル中に存在するＰ Ｄ３Ｇが、共有結合により固定化された抗−Ｐ０３Ｇ抗体の限定された数の結合 部位への結合についてＭＳＡ／抗−Ｅ１３Ｇ複合体と競争する。酵素ラベルされ た免疫複合体は、ＰＤ３Ｇのサンプル濃度が低い場合のみ指示ゾーン３８におい て結合されるであろう、過剰の試薬がシグナル防止剤と共に、ストリップの連続 する展開により測定位置から洗われる。ストリップの連続する展開により指示薬 ゾーン３８に洗い込まれた基質が次に酵素ラベルされ抗体が結合したＭＳＡによ り着色された生成物に転換され、透明な陽性シグナルが生ずる。所定の上昇した レベルのＥ１３Ｇが所定の低レベルのＰＤ３Ｇと共存する場合にのみ陽性反応を 与えるようにアッセイを調整することができる。共有結合した酵素を含んで成る 他の試薬ゾーン（示してない）を液槽３２から離れた位置に設けることができる 。この試薬ゾーンは、基質がストリップの長さにわたって移行したことの標示を 与え、従ってアッセイが完了したことが示される。シグナル防止剤のＲｆ価によ りストリップ上の該ゾーンの位置が決定される。

第５図は、尿サンプル中のＰＤ３Ｇ及びＥ１３Ｇの濃度の比率を測定するための 他の装置を示す。

第５図に関し、この装置は吸水性紙のストリップ４１、及び展開溶液を含有する 液槽４２を有する。ストリップはサンプル受理ゾーン４３、第一の試薬ゾーン４ ４、第二の試薬ゾーン４５、第三の試薬ゾーン４６、第四の試薬ゾーン４７、第 五の試薬ゾーンＳＰ、第六の試薬ゾーン４８、第七の指示薬ゾーン４９、及び任 意的な第への対照指示薬ゾーン５０を有する。第一の試薬ゾーン４４は抗−２１ ３Ｇ　（Ｅ１３Ｇに対する抗体）を含んで成る。第二の試薬ゾーン４５は例４に 記載したような混合ステロイド抗原（ＭＳＡ）を含んで成る。第三の試薬ゾーン ４６はビオチンでラベルされた抗−Ｐ０３Ｇ　（ＰＤ３Ｇに対する抗体がビオチ ンに共有結合したもの）を含んで成る。

第四の試薬ゾーン４７はデキストランでコートされた木炭を含んで成る。第五の 試薬ゾーンＳＰはシグナル防止剤を含んで成る。第六の試薬ゾーン４８は酵素ラ ベルされた抗−Ｅ１３Ｇ（Ｅ１３Ｇに対する抗体がシグナル生成酵素又は基質生 成酵素に共有結合したもの）を含んで成る。第七の試薬ゾーン４９は固定化され たストレプトアビジン及びある種の必要なシグナル生成酵素を含んで成る。任意 的な第への試薬ゾーン５０は使用される基質のための酵素を含んで成る。

試薬ゾーンの活性成分は、横断的なバンドとしてストリップ上に乾燥される。第 七の試験指示薬ゾーン４９はストリップ上に共有結合され、そして第四の試薬ゾ ーン４７中のデキストランでコートされた木炭は、微粒木炭の水性懸Ｓ液を添加 しそして次に水を除去することによりストリップ上に沈着される。すべての他の 成分は可溶性であり、そしてそれらをそれぞれ溶液として適用しそして次に乾燥 することによりストリップ中に含浸される。使用に際し可溶性試薬は展開溶液の 溶剤フロントと共に移動する。液槽４２は展開溶液を収容する破ることができる サンタから成る。展開溶液、シグナル防止剤及び酵素ラベルは第１図に関連して 記載した通りである。

使用に際し、尿サンプルがサンプル受理ゾーン４３に通用され、そして展開溶液 の液槽４２が破られ、展開溶液がストリップの一端に適用される。展開溶液は毛 細管作用によりストリップを通り、サンプル受理ゾーン４３からサンプルを、そ して次に抗−Ｅ１３Ｇ　、　ＭＳＡ及びビオチンラベルされた抗−ＰＤ３Ｇを取 り上げる。このアッセイのための可溶性成分は前進する溶剤フロント中でストリ ップを通り、そして同時に混合されそして反応が許容される。試薬ゾーンの分離 は反応のための最適インキュベーション時間達成するために調整することができ る。

ＭＳＡ及びステロイドのごとき未結合の低分子量種は第四の試薬ゾーン４７中の 木炭により溶剤フロントから除去される。溶剤フロントは第五の試薬ゾーンを通 ってシグナル防止剤を取り上げそして第六の試薬ゾーンを通って酵素ラベルされ た抗−Ｅ１３Ｇを取り上げ、こうしてアッセイを完了する。酵素ラベルされた抗 −Ｅ１３Ｇ／？ｌＳＡ　／ビオチンラベルされたＰＤ３Ｇの複合体の存在が高レ ベルのＥ１３Ｇ及び低レベルのＰＤ３Ｇを示す。

この様な複合体はビオチンと固定化されたストレプトアビジンとの反応により第 七の試験指示薬ゾーン４９に固定化される。

前記のように展開液は酵素ラベルされた試薬のための基質を含む。この基質は装 置中の酵素ラベルされた種と実質的に同じＲｆ値を存するが、シグナル防止剤の 存在のため第六の試薬ゾーンに達した時溶剤フロントにおいて反応しないであろ う。溶剤フロントが第七の試験指示薬ゾーン４９に達しそしてこれを通過する場 合、新たな展開溶液が入り込むことによりシグナル防止剤が洗い去られるであろ う、しかしながら、酵素ラベルされた抗−Ｅ１３Ｇを含む複合体が固定化されて おれば、この第七の試験指示薬ゾーンにおいて発色が起こるであろう。従って、 第七の試薬ゾーンの色が陽性試験結果を示す。

好ましい他の方法においては、使用される基質のための酵素を含んで成る第への 対照指示薬ゾーン５０が、アッセイの完了に対応してストリップの所定の部分で の基質の到達を示すために設けられる。

第６図は、第４図及び第５図に関して前記した試験ストリップの多数を用いる、 月経サイクルをモニターするだめの試験シートを示す。

第６図に関し、この試験シートは、多数のこの発明の試験ストリップ、例えば５ ２、を支持する硬質のプラスチック製裏打ちプレート又はスタンドを有する。（ この図においては、吸収ストリップの詳細は示されていない。）示された具体例 においては、１５個の試験ストリップが横並びに平行に設けられている。試験ス トリップを覆うため、裏打ちプレート又はスタンド５１はサンプル受理ゾーン５ ３から離れてプラスチックフィルムにより覆われる。プラスチックフィルム（第 ６図中では明瞭にするため透明なものとして示されている）は、試験指示薬ゾー ン５４において不透明である。プラスチックフィルムはサンプル受理ゾーン及び 試験指示ゾーンを明瞭に示すために適切にマスクされ又は印刷されていてもよい 。

展開溶液は、各試験ストリップにつき１個ずつの別個の破ることができるサック ５６中に収容される。

使用に際し、使い捨て採取器により排尿の中程で尿を採取し、そしてアリコート を試験ストリップ５２のサンプル受理ゾーン５３上にプロットする。展開溶液の 破ることができるサック５６のシールを指の圧力で破り、試験を開始す条、１５ 〜２０分間の後、アッセイ結果を試験指示薬ゾーン５４から読み取る。

試験ゾーンでの色の存在が陽性結果、すなわち女性が妊娠可能期間に又はそれに 近い状態にあることを示す。色の不存在はその逆を示す。妊娠を回避することを 望む女性のため、彼女は自己のサイクルの約６日月又は７日目から始めて１日１ 回自分の尿を試験することが意図される。彼女は、持続する陽性結果が観察され （２日より多く）次に持続する陰性結果（２日より多く）が観察されるまで、毎 日試験を続けるべきである。これは、典型的なサイクルにおいて通常１０〜１５ 回の試験を意味するであろう。陽性結果が観察されるときは常に女性は性交を控 えるべきであり、２日間続けて陰性結果が観察されるまで、それを続けるべきで ある。

ストリップ中に現われる色は安定であり、そして女性の循環活動の半永久的記録 を構成することが意図される。

肛　２部亡　サンドイッチ　アッセイ　いての−　”クレアチンホスホキ　−ゼ アイソエンザイム（ＣＰＫ　−？ｌＢ）のアッセイ 特にことわらない限り、すべての試薬はシグマ・ケミカル社、英国、ボール（Ｐ ｏｏｌｅ）から入手した。

２」二ＬＬブｆｉｌＬ竪 （ａ）　ス　１−　。

Ｇｅｌｍａｎ　ＡＰ２５超薄ガラス繊維祇［１５ＣＩＸＩＣ１１、ゲルマン・サ イエンシス社（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、）＋Ａｎｎ　Ａｒｂ ｏｒ、ミシガン、米国〕 （ｂ）　汁ｒ゛　°゛ 基質緩衝液を次の様にして調製した。１０００１ｄの無菌蒸留水に、 ２．５ｇ　β−サイクロデキストリン ８．２ｇ　酢酸ナトリウム ０．３５７　ｇ　クエン酸 ５０Ｊ１１３０％Ｈ２０□ １００Ｉ　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０■／戚のテトラメチルベン ジジン（ＴＭＢ） ５ｇ　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）’ｌｄ　）ウィーン２０ ５ｇ　塩化ナトリウム ＊シグマ・ケミカル社ＮαＡ３６４７、フラクション■（Ｃ）１丞ｌｊニヱ ＣＰＫ　−ＭＢに・ゝる ■盃液人 １０００ｄの蒸留水に、 ５．９６　ｇ　ＮａｚＨＰＯａ １．２４　ｇ　ＮａＨｔＰＯａ ２９−２２ｇ　ＮａＣｊ！ を加えた。５００Ｉの緩衝液（Ａ）に、ＣＰＫ　−ＭＢに対する抗体３〜４■及 びＥｕｐｅｒｇｉｔ　ＣＩＺ　（ローム・ファーマＧｍＢＨ，パイチルスタット 、西独）を加えた。これらの試薬を短時間混合し、そして次に室温で４８時間放 射した。次に、Ｅｕｐｅｒｇｉｔを次の緩衝液（緩衝液Ｂ）２０１Ｒ１に再懸濁 した。

１血丘１ １０００−の蒸留水に、 ５．９６　ｇ　ＮａｚＲＰＯ４ １，２４ｇ　ＮａＨｚＰＯａ ３．７５ｇ　グリシン を加えた。Ｅｕｐｅｒｇｉｔ　ＣＩＺを４°Ｃにて１２時間沈降せしめた。

次に、上滑を吸引除去し、そして次にＥｕｐｅｒｇｉ　ｔを２０ｄの緩衝液已に 再懸濁し、そして再び沈降せしめた０次に、上滑を再び吸引除去し、そしてＥｕ ｐｅｒｇｉｔ／抗体を１２．５ｄの緩衝液Ｂに再懸濁した。上滑を再び吸引除去 し、次にＥｕｐｅｒｇｉｔ／抗体を、５％ＢＳＡを含有する１０ｍＭリン酸ナト リウム緩衝液（ｐＨ７，４）に添加して１０％懸濁液を生成せしめた。次に、５ ０Ｉの懸濁液をゲルマン紙〔セクション（ａ）を参照のこと〕の端から５ｃｍの ところに加えて指示薬ゾーンを形成した。

（’ｄ）ｕ−ベル　れた゛−ゾーン ｇ辷り犯２引ＬｉＷ生／バニｌま之に工■金生Ａｕｒａｍｅａｓ　（Ｔｍａ＋ｕ ｎｏｃｈｅｓ＋、、（１９６９）、６．４３−７２）のグルグルアルデヒド法を 適合せしめて用いることにより、西洋ワサビパーオキシダーゼ（）ＩＲＰ）をＣ ＰＫ　−ＭＢに対するモノクローナル抗体に接合せしめた。このモノクローナル 抗体は、指示薬ゾーンのために使用されるモノクローナル抗体とは異るエピトー プを認識するように選択された。１００ｍｇのＨＲＰを５００Ｉの０．０５Ｍ炭 酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解し、これに同じ緩衝液中に調製されたグル タルアルデヒド（ＩＩＷ／Ｖ％）５００ｄを加えた。穏和に振とうしながら、室 温（２０″Ｃ〜２５°Ｃ）にて２時間反応を行った。次に、この反応混合物を、 ０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，５）によりあらかじめ平衡化したＰＤＩ Ｏカラム　（ファルマシア社）に通用した。同じ緩衝液により溶出を行い、活性 化されたＨＲＰを含有する両分をプールした。０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐ Ｈ９，５）中の抗体を活性化されたＨＲＰに加えて、活性化されたＨＲＰ　：抗 体の質量比を６：１とした。反応を４°Ｃにて１６〜２１時間行い、この後、抗 体−ＨＲＰ接合体をゲル濾過により、典型的にはＴＳＭ　Ｇ３０００Ｓ＋＋カラ ム（東ソー、日本）上で精製した。

前記のようにして調製された抗体−ＨＲＰ接合体〔２０１ＢＥＳＣｐＨ６，２） 中５％ＢＳＡ中１４／ｉを２５４〕を、前記（ｅ）において調製したゲルマン紙 に加えて、咳紙の末端から２ＣＩ１１で前記指示薬ゾーンから３ＣＩ１１のとこ ろに酵素ラベルされた試薬のゾーンを形成した。

（ｅ）シグナル方　ソ゛−ン ５０ｄのアスコルビン酸（０，１Ｍ）を、上記（ｄ）で調製したゲルマン紙に、 咳紙の末端から１０で前記酵素ラベルされた試薬ゾーンからＩＣコのところにシ グナル防止剤ゾーンを形成した。

（ｆ）ストリ・ブの　汗＝クレアチン・ホスホキ　−ゼのア５０ｄのＣＲＭ−Ｍ Ｂ　（カルバイオ・ケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　、米国；５０％ウシ胎児血清 中１２０ｎｇ／ｍｉ）を、前記（ｃ）−（ｅ）で調製されたゲルマンストリップ の酵素ラベルされた試薬ゾーンに通用した。対照として、５０Ｊｌｔの５０％ウ シ胎児血清を同様にして調製された酵素ラベルされた試薬ゾーンに通用した。次 に、各ストリップを展開溶液（ｂ）により十分な長さムこ展開した。展開溶液が 各ストリップの頂点に達した後１０分間で、クレアチンホスホキナーゼが適用さ れたストリップの指示薬ゾーンに青色が観察された。他のストリップには色が現 われなかった。指示薬ゾーンでの青色の出現は、展開溶液中のＴＭＢが固定化さ れたＨＲＰの存在下でＢ２Ｏ２により酸化されたことを示した。すなわち、この ゾーンに通用された固相抗体は、展開溶液により該ゾーンに輸送された抗体−Ｈ ＲＰ接合体及びクレアチンホスホキナーゼと共に複合体を形成した。基質（Ｔ　 Ｍ　Ｂ及びＨｚＯｚ）及びＨＲＰ　（ストリップの他のいずれの部分においても 色が存在しないことによって示されるように、Ｈ２Ｏ２を還元しそしてこれをＴ ＭＢとの反応に利用できなくする）と−緒に移行したシグナル防止剤（アスコル ビン酸）は指示薬ゾーンに固定化されず、ストリップの連続する展開によってこ のゾーンから輸送され、これによってＴＭＢ　、　ＨｚＯｚ及びＨＲＰが反応し て観察される青色シグナルが生ずることが許容された。

前記の実験を反復したが、シグナル防止剤を１％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化 塩溶液中１００ｘ／ｍｅのカタラーゼ（ＢＣＬ　。

Ｌｅｗｅｓ　、イースト・サセックス、イングランド）５０ｄとした。

前記のごとく、ＣＰＫ　−ＭＢを含有するストリップのみが指示薬ゾーンにおい て青色を与えた。

Ｕ　二＠在　サンドイッチ　アーセイ　いてのストレプトコ・・カス、Ａ−１の ア・セイ ス」」−二乙１１裂 （ａ）、咬双２ユ」」とｔ１粧 ワットマンＧＦＤガラス繊維紙（１５■×１０）ワットマン・ペーパー社、メイ ドストーン、ケント、イングランド（ｂ）、ｆ＋）六゛　−・ 例１の（ｂ）と同様。

（ｃ）指丞果しニヱ ストレプトコッカス、Ａ　、、、に・する　１痰Δ上　０．８２ｇ　酢酸ナトリ ウム ０．０３５７　ｇ　クエン酸 １０００ｄ　蒸留水 ストレプトコッカスＡ、抗原に対する抗体５■に緩衝液Ａ（４５ｄ）及びＤｙｎ ｏｓｈｅｒｅｓ　５Ｓ−０５２−Ｒ（５ｄ　；　Ｄｙｎｏ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａ−Ｓ、リレストローム（Ｌｉ　１１ｅｓｔｒｏｍ）　ｒ　ノルウｓ−；ＩＯＷ ／Ｖ％スラリーとして供給される〕を加えた。反応混合物を室温にて２４時間上 下逆転させながら混合した。ビーズを遠心分離により沈降せしめ、上滑を廃棄し 、そしてビーズを、ＩＷ−中に再懸濁した。沈降及び再懸濁の工程をさらに４回 反復した。

る、ストレプトコッカス、Ａ抗原上のエピトープを認識した。

例１の（ｄ）に記載した方法を用いて抗体をＨＲＰに共有結合せしめた。

（ｅ）ジグ　ル方しゾーン 蒸留水中５０ａ＋Ｍアスコルビン酸ナトリウム下記の試薬をストリップに加えた 。

（ｉ）蒸留水中５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム５１ｔストリツプの下端から ４　ｃｍの位置に通用。

（ｊ）５０ｍの抗体−パーオキシダーゼ〔１％ＢＳＡを含有する（ｃ）からの緩 衝液中５■／ｄ）をストリップの下端から５Ｃ１＋の位置に適用。

（ｉｉｉ）５０ｘの固相抗体をストリップの下端から６ｃｍの位置に通用。５０ ｄのストレプトコッカスＡ抗原（０，１％トリトン×１００を含有する蒸留水中 １Ｍ１当り１０’個のストレプトコッカス・グループＡ）を酵素ラベルされた試 薬のゾーンに通用した。対照として、５０Ｉのストレブトコッヵス、Ｃ抗原（０ ，１％トリトン×１００を含有する蒸留水中ｄ当り１０７個のストレプトコッカ ス、Ｃ抗原）を、同様にして調製されたストリップの酵素ラベルされた試薬のゾ ーンに通用した。次に、各ストリップを展開溶液（ｂ）により十分な長さに展開 した。展開溶液が各ストリップの頂部に達した後１５分間で、ストレプトコッカ スＡ抗原が通用されたストリップの指示薬ゾーンに青色が観察された。ストレプ トコッカスＣ抗原が通用されたストリップ上には色が現われなかった。

指示薬ゾーンにおける色の出現は、展開溶液中のＴＭＢが固定化されたＨＲＰの 存在下でＨ２０□により酸化されたことを示した。すなわち、このゾーンに通用 された固相抗原は、展開溶液により該ゾーンに輸送された抗体−ＨＲＰ接合体及 びストレプトコッカスＣ抗原と共に複合体を形成した。基質（ＴＭＢ及び１ｈｏ ｚ）並びにＨＲＰ　（ストリップの他のいずれの部分においても色が存在しない ことにより示されるように、ＨｔＯ□を還元しそしてそれをＴＭＢとの反応に利 用できなくする）と−緒に移行したシグナル防止剤（アスコルビン酸）は指示薬 ゾーンにおいて固定化されず、ストリップの連続する展開により該ゾーンから輸 送され、これによりＴＭＢ　、　ＨｚＯ□及びＨＲＰが反応して観察される青色 シグナルが生ずることが許容された。

例２の（ａ）と同じ。

（ｂ）旦Ｊ旧１痕 例１の（ｂ）と同じ。

（ｃ）指孟ｌＬニヱ プロゲステロンに・する口 拭１人二例２の（ｃ）におけるようにして、抗−プロゲステロン抗体をＤｙｎｏ ｓｐｈｅｓｅｓ　５Ｓ−０５２−Ｈに連結した。

ここでは、ストレプトコッカスＡ抗原に対する抗体の代りに抗−プロゲステロン 抗体を用いた。

拭ｌ旦：例２の（ｃ）におけるようにしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を５Ｓ −０５２−Ｒに連結した。但し、ストレプトコッカスＡ抗原の代りにＢＳＡを用 いた。

試薬Ａ及び試薬Ｂを１：１０（ｖ／ｖ）の比率で混合することにより指示薬ゾー ンを調製した。

（ｄ）酵、−ベルされた試薬のゾーン 画性ワサビ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に−Ｉｔｈ駐ムしたプロ　゛ステロン プロゲステロン−ＨＲＰ接合体をシグマ・ケミカル社、Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓ ｅｔ、　イングランド、から入手した。

（ｅ）ジグ　ル方　ゾーン 蒸留水中７５１アスコルビン酸ナトリウム（ｆ）ストリップの展汁＝プロゲステ ロンのアッセイ下記の試薬をストリップに加えた。

（ｉ）蒸留水中７０１１１Ｍアスコルビン酸ナトリウム５０ｉｌｌをストリップ の下端から４ｃｍの位置に適用。

（ｉｉ）１％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化塩溶液中プロゲステロン−ＨＲＰの １　：２０，０００稀釈物５０．ｉをストリップの下端から６Ｃ１１１の位置に 適用。

（市）５０Ｊｔｌの固相抗体試薬をストリップの下端から９ｃｍの位置に通用。

０．１％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化塩溶液中にプロゲステロンを０．５及び １０ｎｇ／ｌａＴ：溶解することにより３種類の試薬サンプルを調製した。各試 薬サンプルを試験ストリップの酵素ラベルされた試薬のゾーンに適用した。次に 、各ストリップを展開溶液（ｂ）により十分な長さに展開した。展開溶液が各ス トリップの頂部に達した後１ｏ分間で、Ｏｎｇ／ｍｌ及び５ｎｇ／−のプロゲス テロンが通用されたストリップの指示薬ゾーンにおいて青色が観察された。しか しながら、１゜ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンが適用されたストリップの指示薬ゾ ーンにおいては色が観察されなかった。従って、このアッセイは１０ｎｇ／−よ り多くのプロゲステロンの存在を検出することができた。

色の不存在は、１０ｎｇ／−においてサンプルのプロゲステロンは固定化された 抗体の結合部位に関してプロゲステロン−ＨＲＰ接合体と好結果に競争し、他方 ５ｎｇ／ｍｅにおいて十分な接合体が抗体に結合し、次にＨ２Ｏ２及びＴＭＢと 反応して青色シグナルが生じたことを示した０例２におけるように、アスコルビ ン酸塩の存在が指示薬ゾーン以外のストリップ全体にわたって青色シグナルの発 生を防止した。

ＦＩＧ、　１　ＦＩＧ、　２ 国際調査報告 国際調査報告 Ｃ二８８００３２９ １　・

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素ラベル化結合アッセイに用いるための装置であって、該装置は吸収材料 、及び前記酵素のための基質を含有する展開溶液を有し、該吸収材料は指示薬ゾ ーンを含む複数の試薬ゾーンを有しそして毛細管作用により前記展開溶液を前記 試薬ゾーンを逐次通って輸送することができるものであり、そして前記指示薬は 酵素ラベルされた試薬をアッセイ結果に依存する量で直接的又は間接的に固定化 することができ、前記指示薬ゾーンにおいて酵素ラベルされた試薬が固定化され る場合以外にはシグナルの生成を防止する試薬を前記吸収材料が含有する、こと を特徴とする方法。
2. ２．前記吸収材料が横断的な試薬ゾーンを有する長いストリップの形態をとって いる、請求項１に記載の装置。
3. ３．前記展開溶液が前記吸収材料の部分に隣接する破ることができるサック中に 収容されている、請求項２に記載の装置。
4. ４．前記シグナルの生成を防止する試薬が（１）酵素ラベルされた試薬の可逆的 阻害物質、（２）基質又はコファクターについて前記酵素ラベルされた試薬と競 争する他の酵素又は試薬、（３）前記酵素ラベルされた試薬のための他の基質で あって、発色性ではなく、そして該酵素についてシグナル生成基質と競争するも の、（４）前記酵素ラベルされた試薬により触媒される反応の最終生成物であっ て該酵素を阻害することができるもの、又は（５）前記酵素ラベルされた試薬の 存在場所において該酵素の最適ｐＨから離れたｐＨを維持することができる試薬 である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
5. ５．前記シグナルの生成を防止する試薬が酵素であるか、又は基質もしくはコフ ァクターに関して酵素ラベルされた試薬と競争する試薬である、請求項４に記載 の装置。
6. ６．前記シグナルの生成を防止する試薬が還元酵素又は還元剤であり、そして前 記酵素ラベルされた試薬が酸化還元酵素でラベルされた試薬である、請求項５に 記載の装置。
7. ７．前記酸化還元酵素がパーオキシダーゼである、請求項６に記載の装置。
8. ８．前記パーオキシダーゼが西洋ワサビ・パーオキシダーゼてある、請求項７に 記載の装置。
9. ９．前記シグナルの生成を防止する試薬がカタラーゼである、請求項５〜８のい ずれか一項に記載の装置。
10. １０．前記シグナルの生成を防止する試薬がアスコルビン酸又はその塩である、 請求項５〜８のいずれか１項に記載の装置。
11. １１．前記シグナルの生成を防止する試薬がアスコルビン酸ナトリウムである、 請求項１０に記載の装置。
12. １２．請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置の複数個を含んで成るシート 。
13. １３．請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置を用いる酵素ラベル化結合ア ッセイ法。
14. １４．前記アッセイ法がイムノアッセイである、請求項１３に記載の酵素ラベル 化結合アッセイ法。
15. １５．前記アッセイ注が尿中のプレグナンジオール−３−グルクロニド及びオエ ストン−３−グルクロニドの相対濃度を決定するための二重分析対象アッセイ法 である、請求項１４に記載の酵素ラベル化結合アッセイ法。