JP6389880B2 - システインで変形された鶏の抗体およびこれを用いた部位特異的接合 - Google Patents
システインで変形された鶏の抗体およびこれを用いた部位特異的接合 Download PDFInfo
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Description
本発明の一実施形態による抗体は、鶏の抗体に由来した重鎖可変部位および軽鎖可変部位においてフレームワーク領域に存在する一つ以上のアミノ酸残基がシステインに置換されたフレームワークを含む抗体に関するものである。
配列番号1のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として3番、4番、5番、12番、16番位置(カバット番号として5番、6番、7番、14番、18番位置に相応する)、
配列番号2のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として31番、40番位置(カバット番号として37番、45番位置に相応する)、
配列番号3のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として52番、53番、56番、58番、59番、60番、61番、64番、65番、71番、78番、82番位置(カバット番号として57番、58番、61番、63番、64番、65番、66番、69番、70番、76番、83番、87番に相応する)、および
配列番号4のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として98番、および102番位置(カバット番号として102番、および106番)からなる群より選択された1つ以上のアミノ酸位置であり得る。
配列番号6のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として42番、48番(カバット番号として42番、48番に相応する)、
配列番号7のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として70番、73番、75番、76番、78番、87番、88番、89番、91番、93番(カバット番号として69番、72番、74番、75番、77番、83番、84番、85番、87番、89番に相応する)、および
配列番号8のアミノ酸配列中の順次的アミノ酸番号として123番、および126番位置(カバット番号として110番、および113番位置に相応する)からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置であり得る。
1−1.変異抗体ファージの製造
実施例で用いた抗体はPSA(prostate specific antigen)に対する鶏抗体であり、図1aで抗PSA抗体(野生型)と鶏生殖系列(chicken germ−line)のフレームワーク塩基配列([文献[Andris−Widhopf J.et al.,J Immunol.Methods(2000)242:159−181])を示している。カバット番号付けは、http://www.bioinf.org.uk/abs/で提供するシステムを用いた。
Cys変異抗体製造は先ず文献[Chung J.et al.,FASEB J.(2004)18:361−383]方法によって軽鎖ドメインフレームワーク(VL domain framework)78個残基、重鎖ドメインフレームワーク(VH domain framework)84個残基をランダム化させるためにNNK(N:A/C/G/T、K:G/T)を各残基に挿入するPCRを行った。その後、Barbas,C.F.(2001)Phage display:a laboratory manual.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載された方法によって、確保したscFv(single chain Fv)DNAをファージミドベクター(phagemid vector)であるpcomb3Xに挿入し、これを大腸菌(E.coli)ER2738に形質転換させた。その後、各残基ごとに92個コロニーを選定してファージ(phage)に接合(display)されたscFv(single chain Fv)形態が含まれている培養上清液(culture supernatant)を確保した。
抗体ファージが含まれている培養上清液を用いて図1bに描写された方法のような酵素結合免疫吸着分析法(ELISA)を行った。プレート(マイクロタイタープレート(microtiter plate))に抗原であるPSAをコーティングした後、ファージが含まれている培養上清液を添加し、1時間静置(incubation)と3回の洗浄過程を経た後、HRP(horse radish peroxidase)が接合されたanti−M13抗体を添加した。1時間静置後に3回の洗浄過程を経てH2O2が添加されたABTSを添加して発色を確認した後、吸光度を405nmで測定した。対照群としては野生型ファージを用いた。軽鎖の21個、重鎖の27個残基はシステインに置換された後にも野生型抗体と類似の親和度を示した(図1cおよび図1d)。表1aおよび表1bではCys変異体の順次的番号付けとカバット番号付け、各変異体の野生型塩基配列を示している。
順次的番号付けによって軽鎖(L3、L4、L5)と重鎖(H13、H16)の残基のうちの軽鎖部分の一つの残基と重鎖部分の一つの残基をシステインに置換し組み合わせて総6種類(L3H13、L3H16、L4H13、L4H16、L5H13、L5H16)の二つの反応性システインが添加されたCys変異抗体遺伝子をPCRを通じて製作した。その後、実施例1のようにファージに接合(display)されたscFv形態に発現させた後、酵素結合免疫吸着分析法でPSA抗原に対する親和度を測定した(図2)。
効率的な接合のための実施例1−1で製造したCys変異体5種(LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13そしてHF1−16)の両側アミノ酸を陽イオンアミノ酸(アルギニン、リシン)あるいは陰イオンアミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)に置換するために各残基に該当DNA塩基配列(アルギニン;CGT、リシン;AAG、アスパラギン酸;GAT、グルタミン酸;GAA)をPCRを通じて挿入した。その後、確保したscFv DNAをファージミドベクター(phagemid vector)であるpcomb3Xに挿入し、これを大腸菌(E.coli)ER2738に形質転換させた。その後、ファージに接合されたscFv形態でSB培養液で培養した。陽イオンおよび陰イオン残基を添加したCys変異体塩基配列は表3aおよび表3bに示した。
4−1.Cys変異scFv抗体発現および精製
Cys変異scFvのヒトCkappaを含む融合蛋白質を製造するためにヒトCkappaを含む哺乳類発現ベクターであるpCEP4ベクターにクローニング過程を通じて挿入し、これをHEK293F細胞で発現を誘導した後に最終培養液を確保した。培養液でscFv−Ckappa融合蛋白質の精製は、カッパセレクトビーズ(kappa select bead)を用いて精製した。精製後、蛋白質をポリアクリールアミドゲル(SDS−PAGE gel)にローディングした後に電気泳動し、クマシー染色を通じて発現および精製を確認した。図4aは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、そしてHF1−16scFv蛋白質発現、精製結果を示す。
4−2.Cys周囲のアミノ酸残基が置換されたCys変異scFv抗体発現および精製
Cys周囲のアミノ酸残基が陽イオンまたは陰イオン性アミノ酸に変更されたCys変異抗体で抗原に対する親和度が維持されるクローンを実施例4−1のようにヒトCkappaを含む融合蛋白質としてHEK293F細胞で発現を誘導した後、カッパセレクトビーズ(kappa select bead)を用いて精製した。その後、ポリアクリールアミドゲルで電気泳動を実施し、クマシー染色を通じて発現および精製を確認した。図4bは野生型、HF1−13、R13CK、D13CE、E13CD、E13CE scFv−Ckappa融合蛋白質の発現および精製を確認した結果である。
5−1.Cys変異全抗体発現および精製
鶏−ヒトキメラ全IgG形態の蛋白質を製造するために、実施例1で製造したCys変異抗体可変領域の軽鎖と重鎖DNAをPCRを通じて確保した後、これをIgG発現用ベクターに挿入し、これをHEK293F細胞で発現および培養した。その後、プロテインAビーズ(protein A bead)を用いて全IgG抗体を精製した。精製した蛋白質は電気泳動した後、クマシー染色を通じて発現および精製を確認した。図5aは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、そしてHF1−16全IgG蛋白質の発現および精製結果を示した。
5−2.Cys周囲のアミノ酸残基が置換されたCys変異全IgG抗体発現および精製
実施例3で製造されたCys周囲のアミノ酸残基が置換されたCys変異抗体を実施例5−1のように鶏−ヒトキメラ全IgG形態の抗体として発現するために抗体遺伝子をIgG発現用ベクターに挿入し、HEK293F細胞で発現および培養した。その後、培養液でプロテインAビーズ(protein A bead)を用いて全IgG抗体を精製し、ポリアクリールアミドゲルに精製された蛋白質をローディングした後に電気泳動を実施した。その後、ゲルをクマシーブルー(coomassie blue)染色を行って蛋白質の発現と精製を確認した。図5bは、R13CK、E13CD、E13CE全IgG蛋白質の発現および精製結果である。
6−1.PEG接合によるCys変異抗体−PEG製造および検定
文献[Junutula et al.,(2008)nature biotechnology 925−32]に記載された方法によって、実施例1で製造されたCys変異抗体の10倍TCEPを添加して還元させた後、TCEP除去過程を経て、TCEP量の2倍のDHAを添加して部分的酸化させる。その後、抗体の10倍のマレイミドPEGを添加し4℃で12時間以上静置させて抗体へのPEG接合を誘導した。図6はマレイミドPEGがスルフヒドリル抗体に接合される過程をカートゥーン図面で説明した。
抗体−PEGはポリアクリールアミドゲルにローディングした後、電気泳動を実施した。その後、ゲルをクマシーあるいはアイオダイン(Iodine)染色、免疫ブロット方法を用いて抗体へのPEG接合の有無を確認した。クマシー染色はクマシーブリリアントブルー(coomassie brilliant blue)R250で染色した後、メタノール、酢酸が含まれている脱色溶液で脱色させた後、当該蛋白質を確認した。図7aは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、HF1−16scFv、図8aは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、HF1−16全IgGの結果を示す。
アイオダイン染色はポリアクリールアミドゲルを蒸溜水に15分間洗浄させた後、5%BlCl2に15分間静置させる。その後、ゲルを0.1Mアイオダインで10分間染色し、蒸溜水で10分間脱色してPEGのみ検出させて確認した。図7bは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、HF1−16scFv、図8bは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、HF1−16全IgGの結果を示す。
免疫ブロット方法を用いた確認は、ポリアクリールアミドゲルで 蛋白質大きさ別に分離した後、NCメンブレン(NC membrane)に全IgGは移動させ、scFv−Ckappa融合蛋白質と全IgG軽鎖部分はHRPが接合された抗−Ckappa抗体を、全IgG重鎖部分はHRPが接合された抗−ヒトFc抗体を用いて確認した。図7cは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、HF1−16scFv、図8cは野生型、LF1−2、LF1−3、LF1−4、HF1−13、HF1−16全IgGの結果を示す。
6−2.PEG接合によるCys周囲のアミノ酸残基が置換されたCys変異抗体−PEG製造および検定
陽イオンあるいは陰イオン残基が追加された抗体も実施例6−1のようにTCEPを用いて還元させた後、DHAを添加して部分的酸化させた。その後、抗体にPEGを添加して抗体にPEG接合を誘導し、抗体−PEG接合検定はクマシーブルー染色、アイオダイン染色、免疫ブロット方法を行って実施した。
図9aは野生型、HF1−13、R13CK、D13CE、E13CD、E13CEscFvにPEGが接合された結果を、図10aは野生型、HF1−13、R13CK、E13CE全IgGにPEGが接合された結果をクマシーブルー染色で示す。
図9bは野生型、HF1−13、R13CK、D13CE、E13CD、E13CE scFvにPEGが接合された結果を、図10bはHF1−13、R13CK、E13CE全IgG結果をアイオダイン染色で示す。
図9cは野生型、HF1−13、R13CK、D13CE、E13CD、E13CE scFvにPEGが接合された結果を、図10cはHF1−13、R13CK、E13CE全IgG結果を免疫ブロットで示す。
実施例1で製造したCys変異抗体の10倍TCEPを添加して還元させた後、TCEP除去過程を経て、TCEP量の2倍のDHAを添加して部分的酸化させる。その後、抗体の10倍のGMBS−コチニンを添加し4℃で12時間以上静置させて抗体へのコチニン接合を誘導した。図11aはGMBSコチニンがスルフヒドリル抗体に接合される過程をカートゥーン図面で説明した。
抗体−コチニンは酵素結合免疫吸着分析法(ELISA)を用いて検定した(図11b)。PSA抗原をプレートにコーティングした後、抗体−コチニンを添加して1時間静置させた。その後、3回の洗浄過程を経て、HRPが接合された抗−コチニンIgGあるいは抗−CkappaIgG抗体を添加した。1時間静置後に3回の洗浄過程を経てTMB(3,3’,5,5’−Tetramethylbenzidine)を添加して発色を確認した後、2M H2SO4を用いて反応を停止させ吸光度を450nmで測定した。図12の結果でコチニンが接合されたかどうかは抗−コチニンIgGによって確認され、抗−CkappaIgGはコチニン結合と関係なく抗体のみを測定する抗体として使用された。
6週齢Balb/cマウスを無作為に3つのグループ(HF1−13、E13CD、E13CE)に分けた後、眼窩静脈叢からの採血を実施した。24時間以後、実施例7で製造されたコチニン−scFv抗体Ckappa融合蛋白質3種類(HF1−13、E13CD、E13CE)100μgを各マウスに静脈注射で注入した。コチニン−抗体注入1時間後に、マウス眼窩静脈叢から採血した後、遠心分離機で血清を分離した。分離された血清にコチニン−抗体の有無を確認するために血清を50倍希釈して実施例9のように酵素結合免疫吸着分析法を実施した。マウスを用いた全ての遂行過程は苦痛を最少化するために吸入麻酔させた後に実施した。
Claims (9)
- 鶏抗体の軽鎖可変部位に含まれている配列番号1〜4および重鎖可変部位に含まれている配列番号5〜8のフレームワークに存在するシステイン以外のアミノ酸のうちの一つ以上がシステインに置換された変異フレームワークを含む抗体であって、
前記システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号1のアミノ酸配列中のカバット番号として5番、6番、7番、14番、18番位置、
配列番号2のアミノ酸配列中のカバット番号として37番、45番位置、
配列番号3のアミノ酸配列中のカバット番号として57番、58番、61番、63番、64番、65番、66番、69番、70番、76番、83番、87番位置、
配列番号4のアミノ酸配列中のカバット番号として102番、および106番位置、
配列番号5のアミノ酸配列中のカバット番号として1番、5番、6番、7番、11番、12番、13番、16番、18番、19番、24番、25番位置、
配列番号6のアミノ酸配列中のカバット番号として42番、48番位置、
配列番号7のアミノ酸配列中のカバット番号として69番、72番、74番、75番、77番、83番、84番、85番、87番、89番位置、および
配列番号8のアミノ酸配列中のカバット番号として110番、および113番位置からなる群より選択された一つ以上であり、
前記置換されたシステインの両側に位置する二つのアミノ酸のうちの一つ以上のアミノ酸が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択された1種以上の負電荷を持つアミノ酸に置換されたものである、抗体。 - 前記置換されたシステインの両側に位置する二つのアミノ酸のうちの一つのアミノ酸が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択されたアミノ酸に置換され、他の一つのアミノ酸がアルギニンまたはリシンに置換されたものである請求項1に記載の抗体。
- 前記変異フレームワークは配列番号20、21、23、24、36、37、39、40、52、53、55および56のアミノ酸配列からなる群より選択された1種以上を含むものである請求項1に記載の抗体。
- 前記変異フレームワークは配列番号68、69、71、72、84、85、87、および88のアミノ酸配列からなる群より選択された1種以上を含む請求項1に記載の抗体。
- 前記鶏抗体の軽鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号1のアミノ酸配列中のカバット番号として5番、6番、7番、14番、18番位置、
配列番号2のアミノ酸配列中のカバット番号として37番、45番位置、
配列番号3のアミノ酸配列中のカバット番号として57番、58番、61番、63番、64番、65番、66番、69番、70番、76番、83番、87番、および
配列番号4のアミノ酸配列中のカバット番号として102番、および106番位置からなる群より選択された1つ以上のアミノ酸位置であり
前記鶏抗体の重鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が
配列番号5のアミノ酸配列中のカバット番号として1番、5番、6番、7番、11番、12番、13番、16番、18番、19番、24番、25番、
配列番号6のアミノ酸配列中のカバット番号として42番、48番
配列番号7のアミノ酸配列中のカバット番号として69番、72番、74番、75番、77番、83番、84番、85番、87番、89番、および
配列番号8のアミノ酸配列中の110番、および113番位置からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置である、請求項1または2に記載の抗体。 - 前記鶏抗体の軽鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が配列番号1のアミノ酸配列中のカバット番号として5番、6番および7番位置からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置であり、
前記鶏抗体の重鎖可変部位に存在するフレームワークで、システインに置換されるアミノ酸の位置が配列番号5のアミノ酸配列中のカバット番号として13番および16番からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸位置である請求項5に記載の抗体。 - 前記軽鎖可変部位の変異フレームワークは配列番号20、21、23、24、36、37、39、40、52、53、55および56のアミノ酸配列からなる群より選択された1種以上を含み、
前記重鎖可変部位の変異フレームワークは配列番号68、69、71、72、84、85、87、および88のアミノ酸配列からなる群より選択された1種以上を含むものである請求項5に記載の抗体。 - 前記システイン置換抗体が
システイン置換された抗体をコーディングする核酸配列を突然変異誘発させること;
システイン置換された抗体を発現させること;および
システイン置換された抗体を単離および精製すること
を含む方法によって製造されるものである、請求項1に記載の抗体。 - 請求項1または2による抗体に、薬物、酵素、アプタマー(aptamer)、毒素、親和性リガンド、および検出標識からなる群より選択された1種以上の接合化合物を結合した複合体。
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