KR20190104411A - 항-pd-l1 항체에 대한 이디오타입 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-pd-l1 항체에 대한 이디오타입 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20190104411A
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앤지 이
크리스틴 탄
조이스 라이
조앤 아담키비츠
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-PD-L1 항체에 대한 이디오타입 항체 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2017년 1월 18일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/447,886호 및 2017년 1월 31일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/452,934호(이들은 각각 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 우선권 이익을 주장한다.
ASCII 텍스트 파일에서 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일에서 하기 제출의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(computer readable form: CRF)(파일명: 146392038540SEQLIST.txt, 기록된 날짜: 2018년 1월 16일, 크기: 40KB).
기술분야
본 발명은 항-PD-L1 이디오타입 항체(idiotypic antibody) 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
T 세포 기능이상 또는 아네르기가 예정 사멸 1 폴리펩타이드(PD-1)인 저해 수용체의 유도되고 지속된 발현과 동시에 일어나는 것으로 발견되었다. 그 결과, 치료학적 표적화 PD-1 및 PD-1과의 상호작용을 통해 신호전달하는 다른 분자, 예컨대, 예정 사멸 리간드 1(PD-L1)은 매우 관심 대상의 분야이다. PD-L1 신호전달의 저해가 암의 치료를 위한 T 세포 면역력(예를 들어, 종양 면역력)을 증대시키기 위한 수단으로 입증되었다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 사용하는 치료가 개발되었고, 상이한 유형의 암을 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 미국 특허 제8,217,149호를 참조한다.
PD-L1(예를 들어, 내인성 면역글로불린)에 지향되거나 지향되지 않는 다른 항체를 또한 검출하지 않으면서, 생물학적 샘플 및/또는 임상 샘플에서 PD-L1에 치료학적 단일클론 항체를 지향시키고자 하는 수요가 당해 분야에 존재한다. 본 발명은 소정의 항-PD-L1 항체를 특이적으로 검출하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. 이 항체는 예를 들어, 약동학적(pharmacokinetic: PK) 및 약력학적 연구에서 그리고 환자에서의 치료학적 항-PD-L1 항체의 정량화 및 모니터링에 유용하다.
일 양태에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는,
(a) (ⅰ) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 1)를 포함하는 HVR-L1;
(ⅱ) 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 2)를 포함하는 HVR-L2; 및
(ⅲ) 아미노산 서열 QQYLYHPAT(서열 번호 3)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(b) (ⅰ) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH(서열 번호 4)를 포함하는 HVR-H1;
(ⅱ) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG(서열 번호 5)를 포함하는 HVR-H2; 및
(ⅲ) 아미노산 서열 RHWPGGFDY(서열 번호 6)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 53의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 60의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 번호 59의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 55의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 62의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 번호 61의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 58의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 64의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 번호 63의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 항-PD-L1 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 항-이디오타입 항체는 비상동성 모이어티 또는 검출 가능한 모이어티에 접합된다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티는 표지(label) 또는 바이오틴이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공하고, 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a) HVR-H1은 아미노산 서열 SYDMS(서열 번호 35)를 포함하고;
(b) HVR-H2는 아미노산 서열 YISSGGGSTYYPDTVKG(서열 번호 36)를 포함하고;
(c) HVR-H3은 아미노산 서열 LVYYDYDDAMDY(서열 번호 34)를 포함하고;
(d) HVR-L1은 아미노산 서열 SASSSVSYMH(서열 번호 14)를 포함하고;
(e) HVR-L2는 아미노산 서열 STSNLAS(서열 번호 15)를 포함하고;
(f) HVR-L3은 아미노산 서열 QQRSSYPPTF(서열 번호 16)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공하고, 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a) HVR-H1은 아미노산 서열 DYIML(서열 번호 43)을 포함하고;
(b) HVR-H2는 아미노산 서열 NINPYYGSTSYNLKFKG(서열 번호 44)를 포함하고;
(c) HVR-H3은 아미노산 서열 WGGNYEGWFAY(서열 번호 42)를 포함하고;
(d) HVR-L1은 아미노산 서열 HASQGISSNIG(서열 번호 20)를 포함하고;
(e) HVR-L2는 아미노산 서열 HGTNLED(서열 번호 21)를 포함하고;
(f) HVR-L3은 아미노산 서열 VQYAQFPLTF(서열 번호 22)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공하고, 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a) HVR-H1은 아미노산 서열 SYDMS(서열 번호 51)를 포함하고;
(b) HVR-H2는 아미노산 서열 YISSGGGSTYYPDTVKG(서열 번호 52)를 포함하고;
(c) HVR-H3은 아미노산 서열 TIYYGYDDVMDY(서열 번호 50)를 포함하고;
(d) HVR-L1은 아미노산 서열 SASSSVSYMH(서열 번호 26)를 포함하고;
(e) HVR-L2는 아미노산 서열 STSNLAS(서열 번호 27)를 포함하고;
(f) HVR-L3은 아미노산 서열 QQRSGYPPTF(서열 번호 28)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵생물이다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류이다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포이다.
몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵생물이다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-이디오타입 항체를 코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 본 명세서에 제공된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항-이디오타입 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 생물학적 샘플을 포획 물질과 접촉시켜서, 면역복합체를 형성하는 단계(여기서, 포획 물질은 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함하는 조성물임);
(b) (a)로부터의 면역복합체를 항-PD-L1 항체에 결합하는 검출 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및
(c) 검출 가능한 항체를 검출함으로써 조성물에 결합된 항-PD-L1 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 생물학적 샘플을 포획 물질과 접촉시켜서, 면역복합체를 형성하는 단계(여기서, 포획 물질은 샘플에 존재하는 항-PD-L1 항체에 결합하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체임);
(b) (a)로부터의 면역복합체를 항-PD-L1 항체에 결합하는 검출 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및
(c) 검출 가능한 항체를 검출함으로써 항-이디오타입 항체에 결합된 항-PD-L1 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 고체 지지체에 부동화되고, 상기 방법은 항-PD-L1 항체에 결합된 부동화된 항-이디오타입 항체로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 부동화된 항-이디오타입 항체는 바이오틴에 접합되고, 스트렙타비딘 코팅된 미량역가 플레이트에 결합된다.
몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 인간에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체 또는 인간화된 항체이다.
몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 직접적으로 검출 가능하거나, 겨자무 과산화효소에 접합되거나, 형광분석 또는 열량측정 시약에 의해 검출된다.
몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 단리된다.
몇몇 실시형태에서, 인간 대상체는
(a) (ⅰ) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 1)를 포함하는 HVR-L1;
(ⅱ) 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 2)를 포함하는 HVR-L2; 및
(ⅲ) 아미노산 서열 QQYLYHPAT(서열 번호 3)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(b) (ⅰ) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH(서열 번호 4)를 포함하는 HVR-H1;
(ⅱ) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG(서열 번호 5)를 포함하는 HVR-H2; 및
(ⅲ) 아미노산 서열 RHWPGGFDY(서열 번호 6)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체에 의해 치료된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 표준 곡선을 이용하여 항-PD-L1 항체의 공지된 수준과 비교된 항-PD-L1 항체의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 특이적으로 검출하기 위한 면역검정 키트를 제공하고, 상기 키트는,
(a) 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물;
(b) 항-PD-L1 항체에 결합하는 검출 가능한 항체; 및
(c) 상기 항-PD-L1 항체를 검출하기 위한 설명서를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 항-PD-L1 항체를 검출하기 위한 면역검정에서 유용하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 생물학적 샘플을 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물과 접촉시켜서, 복합체를 형성하는 단계;
(b) 면역고정 전기영동에 의해 샘플을 분석하여서, 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플을 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플과 비교하는 단계;
(c) 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 단계(여기서, 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플과 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플 사이의 이동의 차이는 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체의 존재를 나타냄)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 생물학적 샘플을 항-PDL1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물과 접촉시켜서, 복합체를 형성하는 단계;
(b) 면역고정 전기영동에 의해 샘플을 분석하여서, 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플을 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플과 비교하는 단계; 및
(c) 생물학적 샘플에서 M-단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단계 (b)는 M-단백질로부터 항-PD-L1 항체 및 항-이디오타입 항체의 복합체를 분리시킨다. 몇몇 실시형태에서, 단계 (c) 전에, 상기 방법은 이의 이동이 항-이디오타입 항체의 첨가에 의해 영향을 받는지를 결정함으로써 밴드가 M-단백질인지 또는 아닌지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 뇨 또는 혈청이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 생물학적 샘플을 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 조성물과 접촉시켜서, 복합체를 형성하는 단계(여기서, 생물학적 샘플은 대상체 유래이고, 대상체는 다발성 골수종을 갖고, 항-PD-L1 항체에 의해 치료됨);
(b) 면역고정 전기영동에 의해 상기 샘플을 분석하여서, 상기 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플을 상기 항-이디오타입 항체와 접촉하지 않은 샘플과 비교하는 단계;
(c) 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 단계(여기서, 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플과 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플 사이의 이동의 차이는 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체의 존재를 나타냄); 및
(d) 생물학적 샘플에서 M-단백질의 수준을 검출하는 단계(여기서, 생물학적 샘플에서 M-단백질의 수준은 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 나타냄)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단계 (b)는 M-단백질로부터 항-PD-L1 항체 및 항-이디오타입 항체의 복합체를 분리시킨다. 몇몇 실시형태에서, 단계 (d) 전에, 상기 방법은 이의 이동이 항-이디오타입 항체의 첨가에 의해 영향을 받는지를 결정함으로써 밴드가 M-단백질인지 또는 아닌지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 뇨 또는 혈청이다.
본 명세서에 기재된 다양한 실시형태의 특성의 하나, 몇몇 또는 모두가 본 발명의 다른 실시형태와 조합될 수 있다고 이해되어야 한다.
도 1은 항-이디오타입 항체 105D11(서열 번호 54), 43B5(서열 번호 56) 및 48C1(서열 번호 58)의 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 중쇄 접촉 CDR, 쵸티아 CDR 및 카밧 CDR 서열이 표시된다.
도 2는 항-이디오타입 항체 105D11(서열 번호 53), 43B5(서열 번호 55) 및 48C1(서열 번호 57)의 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 경쇄 접촉 CDR, 쵸티아 CDR 및 카밧 CDR 서열이 표시된다.
도 3은 항-PDL1 항체 Fab 및 항체 YW167B.43(프레임워크 대조군 Fab)에 대한 항체 105D11 결합에 대한 SPR 생성된 동역학(ka, kd 및 KD)을 보여준다.
도 4는 항-PDL1 항체 Fab 및 항체 YW167B.43(프레임워크 대조군 Fab)에 대한 항체 43B5 결합에 대한 SPR 생성된 동역학(ka, kd 및 KD)을 보여준다.
도 5는 항-PDL1 항체 Fab 및 항체 YW167B.43(프레임워크 대조군 Fab)에 대한 항체 48C1 결합에 대한 SPR 생성된 동역학(ka, kd 및 KD)을 보여준다.
도 6은 Sebia 면역고정 전기영동(IFE) 검정에 대한 항-이디오타입 항체의 스크리닝을 보여준다.
도 7은 IFE 검정에서 고해상에 의해 검출된 다발성 골수종 환자의 혈청에서의 IgA/Ig 카파 M 단백질 스파이크(패널 1, 레인 A 및 레인 K)를 보여준다. 환자 'MM5' 혈청은 하기 조건에서 2시간 동안 예비항온처리된다: 1500㎍/㎖에서 스파이킹된 아테졸리주맙 항-이디오타입 마우스 mAB 클론 48C1 단독(패널 2), 1500㎍/㎖에서 스파이킹된 아테졸리주맙 단독(패널 3, 레인 G 및 레인 K) 및 각각 1500㎍/㎖에서 함께 첨가된 아테졸리주맙 + 아테졸리주맙 항-이디오타입 클론 48C1(패널 4).
도 8은 IFE 검정에서 아테졸리주맙의 이동도를 변경하는 항-이디오타입 항체의 능력에 대한 아테졸리주맙 혈청 농도의 효과를 보여준다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 본 출원에 사용된 많은 용어에 대한 일반 가이드를 당업자에게 제공한다. 특허 출원 및 공보를 포함하는 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
본 명세서를 해석할 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 때마다, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함하고, 그 반대도 그럴 것이다. 본 명세서에서 사용된 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이고, 제한인 것으로 의도되지 않는다고 이해되어야 한다. 하기 기재된 임의의 정의가 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문헌과 상충하는 경우에, 하기 기재된 정의가 지배해야 한다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 바대로, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 분해 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 흔한 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 실시형태는 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되고, 이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, "Fab" 단편이라 불리는, 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔류 "Fc" 단편(이의 명칭은 쉽게 결정화하는 이의 능력을 반영함)을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 조합 부위를 갖고, 항원을 여전히 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하고, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 제조 동안 생긴 가능한 변이체 항체(이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다중클론 항체 제제와 반대로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 생긴 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 전이유전자 동물을 사용하는 방법, 본 명세서에 기재된 단일클론 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
"네이키드 항체"는 비상동성 모이어티(예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지(radiolabel)에 접합되지 않은 항체를 의미한다. 네이키드 항체는 약제학적 제제에 존재할 수 있다.
"네이티브 항체"는 변하는 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 의미한다. 예를 들어, 네이티브 IgG 항체는 이황화 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000달톤의 이종사합체 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL), 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라 불리는 2개의 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
항체의 "클래스"는 이의 중쇄가 보유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 항체의 주요 클래스가 존재하고, 이들의 몇몇은 하위클래스(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다.
용어 항-PD-L1 항체", "항-PD-L1", "PD-L1 항체" 또는 "PD-L1에 결합하는 항체"는 항체가 PD-L1을 표적화하는 데에 진단학적 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 PD-L1에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 일 실시형태에서, 비관련된 PD-L1 단백질에 대한 항-PD-L1 항체의 결합의 정도는 예를 들어, 방사선면역검정(RIA)에 의해 측정된 바대로 PD-L1에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 소정의 실시형태에서, PD-L1에 결합하는 항체는 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하 또는 0.001nM 이하(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13M)의 분해 상수(KD)를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 상이한 종으로부터의 PD-L1 중에서 보존된 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
"인간 항체"는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 사용하는 비인간 소스로부터 유래되거나, 인간 또는 인간 세포에 의해 제조되거나 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 소스 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 소스 또는 종으로부터 유래된 항체를 의미한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 공통으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹 유래이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 Kabat 등의 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서처럼 하위그룹이다. 일 실시형태에서, VL에 대해, 하위그룹은 상기 Kabat 등의 문헌에서처럼 하위그룹 카파 I이다. 일 실시형태에서, VH에 대해, 하위그룹은 상기 Kabat 등의 문헌에서처럼 하위그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)이 비인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 항체의 것에 상응하는 실질적으로 모든 적어도 1개 및 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪는 항체를 의미한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 네이티브 항체 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하도록 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변이고/이거나, 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역의 각각을 의미한다. 일반적으로, 네이티브 4개-사슬 항체는 VH에서의 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서의 3개(L1, L2, L3)의 6개의 HVR을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성이고/이거나, 항원 인식에 관여한다. 예시적인 초가변 루프는 26번 내지 32번(L1), 50번 내지 52번(L2), 91번 내지 96번(L3), 26번 내지 32번(H1), 53번 내지 55번(H2) 및 96번 내지 101번(H3) 아미노산 잔기에서 발생한다(Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 24번 내지 34번, L2의 50번 내지 56번, L3의 89번 내지 97번, H1의 31번 내지 35B번, H2의 50번 내지 65번 및 H3의 95-102번 아미노산 잔기에서 발생한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). VH에서의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 축약된-CDR 또는 a-CDR이라 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 31번 내지 34번, L2의 50번 내지 55번, L3의 89번 내지 96번, H1의 31번 내지 35B번, H2의 50번 내지 58번 및 H3의 95번 내지 102번 아미노산 잔기에서 발생한다(문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)]을 참조한다). 달리 표시되지 않는 한, 가변 도메인에서의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본 명세서에서 상기 Kabat 등의 문헌에 따라 넘버링된다.
용어 "검출"은 표적 분자의 정성적 측정 및 정량적 측정 둘 다를 포함하도록 가장 광의로 사용된다. 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출 방법은 생물학적 샘플에서 관심 대상의 항체의 단순한 존재를 확인하도록 사용된다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 샘플에서 관심 대상의 항체가 검출 가능한 수준으로 존재하는지를 시험하도록 사용된다. 훨씬 또 다른 양태에서, 상기 방법은 샘플에서의 관심 대상의 항체의 양을 정량화하고 추가로 상이한 샘플로부터 항체 수준을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 관심 대상의 항체를 함유할 수 있는 임의의 생물학적 물질을 의미한다. 샘플은 생물학적 유체, 예컨대, 전혈 또는 전혈 성분, 예를 들어, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 관절 낭액, 난포액, 정액, 양수, 젖, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 및 관심 대상의 항체를 함유할 수 있는 신체의 다른 구성성분일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터의 신체 샘플이다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 포유류 유래이다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 인간 대상체 유래이다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 치료학적 항-PD-L1 항체 또는 항체에 의해 치료되는 환자 유래이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자로부터의 혈청이다.
용어 "포획 시약"은, 적합한 조건 하에 포획 시약 및 관심 대상의 표적(예를 들어, 항체)의 복합체가 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있도록, 생물학적 샘플에서 관심 대상의 표적(예를 들어, 항체)에 결합하고 관심 대상의 표적(예를 들어, 항체)을 포획할 수 있는 시약(예를 들어, 항체) 또는 이러한 시약의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 포획 시약은, 적합한 조건 하에 포획 시약 및 관심 대상의 항체의 복합체가 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있도록, 생물학적 샘플에서 관심 대상의 항체의 이디오타입에 결합하고 관심 대상의 항체에 결합하고 이를 포획할 수 있는 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체의 혼합물일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 포획 시약은 부동화되거나 부동화 가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항-이디오타입 항체"는 동족 항체의 VH 및/또는 VL 도메인에 결합하는 항체, 이 경우에 관심 대상의 항체이다. 통상적으로, 이러한 항-이디오타입 항체는 포유류, 예컨대, 마우스를 관심 대상의 항체에 의해 면역화하고 하이브리도마 라이브러리를 제조하고 하이브리도마로부터 유래된 항체의 패널로부터, 포획 시약 또는 검출 가능한 항체이든, 검정에서 깨끗한 신호를 제공하는 항체를 선택함으로써 제조된다. 소정의 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 부동화되거나 부동화 가능하다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 단일클론 항체이고, 예를 들어, 설치류 항체, 예컨대, 쥣과 또는 래트 항체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항-PD-L1 이디오타입 항체"는 항-PD-L1 항체의 검출에서 유용한 충분한 특이성 및 친화도로 항-PD-L1 단일클론 항체에 특이적으로 결합하는 것이다.
용어 "검출 가능한 항체"는 관심 대상의 항체에 결합하고, 직접적으로 검출 수단에 의해 증폭되는 표지를 통해, 또는 간접적으로 예를 들어, 표지된 또 다른 항체를 통해 검출될 수 있는 항체를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 관심 대상의 항체의 이디오타입에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체의 혼합물이다. 직접적인 표지화를 위해, 항체는 통상적으로 몇몇 수단에 의해 검출 가능한 모이어티에 접합된다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 겨자무 과산화효소에 접합된다.
용어 "검출 수단"은 신호 리포팅을 통해 검출 가능한 항체의 존재를 검출하도록 사용되는 모이어티 또는 기법을 의미하고, 이 리포팅은 이후 본 명세서에서 검정에서 판독된다. 이것은 부동화된 표지, 예컨대, 미량역가 플레이트에 포획돈 표지를 증폭시키는 시약을 포함한다.
"Fab" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇몇 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본 명세서에서 Fab'에 대한 지칭이고, 여기서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)는 유리 티올기를 보유한다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 제조된다. 항체 단편의 다른 화학 커플링은 또한 공지되어 있다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하도록 사용된다. 상기 용어는 네이티브 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실 말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C 말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 달리 기재되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바대로, EU 지수라고도 칭해지는, EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4인 4개의 FR 도메인으로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4인 순서로 보인다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 네이티브 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미하도록 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양"은 상호 교환되어 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포, 예를 들어, 이러한 세포의 자손을 의미한다. 숙주 세포는 계대배양의 수와 관련 없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 모 세포에 대해 핵산 함량에서 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 명세서에 포함된다.
"면역접합체"는 하나 이상의 비상동성 분자(들), 예를 들어, 세포독성제(이들로 제한되지는 않음)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류는 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 맞춤(isoelectric focusing: IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바대로 95% 초과 또는 99%의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 대개는 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 이의 천연 염색체 위치로부터 상이한 염색체 위치에서 또는 염색체외 존재한다.
"항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서의 핵산 분자(들), 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자(들)를 포함하는, 항-이디오타입 항체의 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 의미한다.
용어 "패키지 인서트"는 적응증, 용법, 투약량, 투여, 병용 치료, 금기 및/또는 이러한 치료학적 생성물의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 치료학적 생성물의 상업용 패키지에서 관례상 포함된 설명서를 의미하도록 사용된다.
기준 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하도록, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 기준 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 백분율 아미노산 서열 동일성의 결정의 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공공으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 당해 분야의 지식 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 권한부여되고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(20559 워싱턴 디.씨.)에서 사용자 서류에 의해 제출되고, 여기서 이것은 미국 저작권 등록 TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc.(캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코)로부터 공공에게 이용 가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 조작 시스템에서 사용자에 대해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 하기한 바대로 계산된다:
분수 X/Y의 100배
(여기서, X는 A 및 B의 그 프로그램의 정렬에서의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 일치로서 점수 매긴 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 전체 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, A 대 B의 % 아미노산 서열 동일성이 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않는 것으로 이해될 것이다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 즉시 이전의 문단에 기재된 바대로 얻어진다.
"치료학적 유효량"은 특정한 장애의 측정 가능한 개선 또는 예방을 실행시키는 데 필요한 적어도 최소 농도이다. 본 명세서에서 치료학적 유효량은 환자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 변할 것이다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 항체의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 것이다.
항-PD-L1 항체의 "서명 펩타이드"는 하나의 항체 아이소타입에 배타적으로 존재하는 단백질분해 펩타이드(예를 들어, 트립신 펩타이드)를 의미한다.
용어 "약제학적 제제" 또는 "약제학적 조성물"은 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게끔 하는 형태이고, 제제가 투여되는 대상체에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "유효량"은 대상체에게 비독성인 활성 성분 이외의 약제학적 제제에서의 성분을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바대로, "치료"(및 이의 문법상 변형어, 예컨대, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 과정을 변경하려는 시도로 임상 중재를 의미하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 질환 진행의 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 질환의 진행을 느리게 하도록 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈으로 도입된 벡터를 포함한다. 소정의 벡터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"라 칭해진다.
본 명세서에 사용된 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는, 달리 표시되지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 이 기술 분야의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 일반 오차 범위를 의미한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 매개변수의 언급은 특히 그 값 또는 매개변수에 지시된 실시형태를 포함한다(그리고 기재한다).
본 명세서에 기재된 발명의 양태 및 실시형태가 양태 및 실시형태를 "포함하고", "이루어지고" 그리고 "본질적으로 이루어진다"고 이해된다.
II. 조성물 및 방법
일 양태에서, 본 발명은 항-PD-L1 단일클론 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 임상 샘플에서 항-PD-L1의 검출 및/또는 정량화에 유용하다. 몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 단일클론, 키메라, 인간화된 또는 인간이다.
A. 항-PD-L1 항체
i. 예시적인 항-PD-L1 항체
소정의 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 1)를 포함하는 HVR-L1, 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 2)를 포함하는 HVR-L2 및 아미노산 서열 QQYLYHPAT(서열 번호 3)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (b) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH(서열 번호 4)를 포함하는 HVR-H1, 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG(서열 번호 5)를 포함하는 HVR-H2 및 아미노산 서열 RHWPGGFDY(서열 번호 6)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(TECENTRIQ(등록상표))이다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 HVR을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 단일클론, 키메라 또는 인간화이다.
항-PD-L1 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호 7)
항-PD-L1 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 번호 8)
항-PD-L1 항체 경쇄 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호 9)
항-PD-L1 항체 중쇄 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열 번호 10)
B. 항-이디오타입 항체
i. 예시적인 항-이디오타입 항체
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 항-PD-L1 항체에 결합하고, 여기서 항-PD-L1 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 1)를 포함하는 HVR-L1, 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 2)를 포함하는 HVR-L2 및 아미노산 서열 QQYLYHPAT(서열 번호 3)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (b) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH(서열 번호 4)를 포함하는 HVR-H1, 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG(서열 번호 5)를 포함하는 HVR-H2 및 아미노산 서열 RHWPGGFDY(서열 번호 6)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 항-PD-L1 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 6개의 HVR에 특이적으로 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 항체 105D11의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR(Kabat)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 항체 105D11의 VH 및/또는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 54의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 54의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 VH 서열을 포함하는 항-PD-L1 이디오타입 항체는 기준 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체와 동일한 항-PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 소정의 실시형태에서, 전체 1개 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 54에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정의 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 서열 번호 54의 VH 서열과 그 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정한 실시형태에서, VH는 (a) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 번호 53의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 53의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 VL 서열을 포함하는 항-PD-L1 이디오타입 항체는 기준 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체와 동일한 항-PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 소정의 실시형태에서, 전체 1개 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 53에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정의 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 서열 번호 53의 VL 서열과 그 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정한 실시형태에서, VL은 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 상기 제공된 임의의 실시형태에서의 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서의 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 서열 번호 54의 VH 서열 및 서열 번호 53의 VL 서열과 이들 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-이디오타입 항체는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 항체 43B5의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR(Kabat)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 항체 43B5의 VH 및/또는 VL을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 VH 서열을 포함하는 항-PD-L1 이디오타입 항체는 기준 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체와 동일한 항-PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 소정의 실시형태에서, 전체 1개 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 56에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정의 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 서열 번호 56의 VH 서열과 그 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정한 실시형태에서, VH는 (a) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (c) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 번호 55의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 55의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 VL 서열을 포함하는 항-PD-L1 이디오타입 항체는 기준 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체와 동일한 항-PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 소정의 실시형태에서, 전체 1개 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 55에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정의 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 서열 번호 55의 VL 서열과 그 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정한 실시형태에서, VL은 (a) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 상기 제공된 임의의 실시형태에서의 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서의 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열 번호 56 및 서열 번호 55에서의 VH 및 VL 서열과 이들 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 항체 48C1의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR(Kabat)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 항체 48C1의 VH 및/또는 VL을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 VH 서열을 포함하는 항-PD-L1 이디오타입 항체는 기준 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체와 동일한 항-PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 소정의 실시형태에서, 전체 1개 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 58에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정의 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 서열 번호 58의 VH 서열과 그 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정한 실시형태에서, VH는 (a) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 VL 서열을 포함하는 항-PD-L1 이디오타입 항체는 기준 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체와 동일한 항-PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 소정의 실시형태에서, 전체 1개 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 57에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정의 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 서열 번호 57의 VL 서열과 그 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정한 실시형태에서, VL은 (a) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 상기 제공된 임의의 실시형태에서의 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서의 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열 번호 58 및 서열 번호 57에서의 VH 및 VL 서열과 이들 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 항-PD-L1 이디오타입 항체는 단일클론 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 전장 항체, 예를 들어, 온전한 IgG 1 항체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 아이소타입이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 또는 본 명세서에 기재된 항-PD-L1 이디오타입 항체는 비상동성 모이어티 또는 물질에 접합된다.
또 다른 양태에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항-PD-L1 이디오타입 항체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 기재된 항-이디오타입 항체를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터 및 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본 명세서에 또한 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 단리되거나 정제된다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 세포 배양 배지이다.
ii. 제조 방법
설명은 본 발명에 따라 사용되는 항-이디오타입 항체의 제조를 위한 예시적인 기법에 따른다.
1. 다중클론 항체
본 발명의 항체는 다중클론 항체를 포함할 수 있다. 다중클론 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다중클론 항체는 포유류, 예를 들어, 면역화제 및, 원하는 경우, 애쥬번트의 하나 이상의 주사에 의해 키워질 수 있다. 통상적으로, 면역화제 및/또는 애쥬번트는 다수의 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유류에서 주사될 것이다. 면역화제는 항-PD-L1, 이의 항원 결합 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화제를 면역화되는 포유류에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 접합하는 것이 유용할 것이다. 이러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림페트 헤모사이아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린 및 대두 트립신 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 애쥬번트의 예는 프로인트 완전 애쥬번트 및 MPL-TDM 애쥬번트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 부당한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이후, 포유류는 사혈되고, 혈청은 항-이디오타입 항체 역가에 대해 평가될 수 있다. 원하는 경우, 포유류는 항체 역가가 증가하거나 플래토일 때까지 부스팅될 수 있다.
2. 단일클론 항체
본 발명의 항체는 대안적으로 단일클론 항체일 수 있다. 단일클론 항체는 처음에 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대, 햄스터는 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발하도록 상기 기재된 바대로 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구는 단리되고 이후 적합한 융합 물질, 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지에서 시딩되고 성장하고, 이 배지는 비융합된 모 골수종 세포(융합 파트너라고도 칭함)의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유한다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 전환효소(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되면, 하이브리도마에 선택적인 배양 배지는 통상적으로 하이폭산틴, 아미노프테린 및 타이미딘(HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT 결핍 세포의 성장을 막는다.
융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 제조를 지지하고, 비융합된 모 세포에 대해 선택하는 선택적인 배지에 민감한 것이다. 골수종 세포주는 쥣과 골수종 라인, 예컨대, Salk Institute Cell Distribution Center(미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어, 미국 균주 협회(American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 매너서스)로부터 입수 가능한 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 제조에 대해 기재되어 있다(Kozbor, J. Irnmunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지향된 단일클론 항체의 제조에 대해 평가된다. 하이브리도마 세포에 의해 제조된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대, 방사선면역검정(radioimmunoassay: RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 단일클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌[Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어, 마우스로의 세포의 i.p. 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 예를 들어, (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-Sepharose를 사용한) 친화도 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등과 같은 종래의 항체 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 절차를 이용하여(예를 들어, 쥣과 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 소스로서 작용한다. DNA는, 단리되면, 발현 벡터에 배치될 수 있고, 이것은 이후 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 얻기 위해 숙주 세포, 예컨대, 이. 콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 (달리 항체 단백질을 생성하지 않는) 골수종 세포로 형질주입된다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 검토 논문은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 참조한다.
추가의 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기법을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 각각 쥣과 및 인간 항체의 단리를 기재한다. 후속하는 간행물은 연쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 제조를 기재한다. 따라서, 이 기법은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기법의 실행 가능한 대안이다.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대해 스크리닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고, 이에 따라 라이브러리에서 비결합 클론으로부터 분리된다. 이후, 결합 클론은 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가적인 사이클에 의해 추가로 농후화될 수 있다.
가변 도메인은 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바대로 단일 사슬 Fv(scFv) 단편(여기서, VH 및 VL은 짧은 가요성 펩타이드를 통해 공유 연결됨)으로서 또는 Fab 단편(여기서, 이들은 각각 불변 도메인에 융합되고 비공유로 상호작용함)으로서 파지에서 기능적으로 디스플레이될 수 있다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 분리하여 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있고, 이 라이브러리는 이후 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바대로 항원 결합 클론에 대해 조사될 수 있다. 면역화된 소스로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 네이티브 레퍼토리는 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같은 어떠한 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 항원 및 또한 자가 항원에 인간 항체의 단일 소스를 제공하도록 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 미경험 라이브러리는 고도로 가변적인 CDR3 영역을 코딩하도록 그리고 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바대로 시험관내 재배열을 달성하도록 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝함으로써, 그리고 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 합성으로 또한 제조될 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당해 분야에 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1은, 흡착 플레이트에 고정된 또는 세포 분류에 사용된 숙주 세포에서 발현된, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드에 의한 포획을 위해 바이오틴에 접합된, 또는 디스플레이 라이브러리의 패닝을 위한 임의의 다른 방법에서 사용된, 흡착 플레이트의 웰을 코팅하도록 사용될 수 있다.
느린 해리 동역학(및 양호한 결합 친화도)을 갖는 항체의 선택은 문헌[Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바대로 긴 세척 및 1가 파지 디스플레이의 사용, 및 문헌[Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바대로 항원의 낮은 코팅 밀도에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명의 임의의 항-이디오타입 항체는 관심 대상의 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차의 설계, 이어서 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 관심 대상의 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 적합한 불변 영역(Fe) 서열을 사용한 전장 항-이디오타입 항체 클론의 작제에 의해 얻어질 수 있다.
3. 항체 변이체
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 이것으로의 삽입 및/또는 이것의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하도록 이루어질 수 있되, 단 최종 작제물은 원하는 특징, 예를 들어, 항원 결합을 보유한다.
a. 치환, 삽입, 및 결실 변이체
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 대상의 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 제목 하에 표 1에 기재되어 있다. 가장 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 제목 하에 그리고 아미노산 측쇄 종류를 참조하여 하기 추가로 기재된 바대로 표 1에 제공된다. 아미노산 치환은 원하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝 되는 관심 대상의 항체 및 생성물로 도입될 수 있다.
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아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
- 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
- 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
- 산성: Asp, Glu;
- 염기성: His, Lys, Arg;
- 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
- 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 또 다른 클래스에 대한 이 클래스의 중 하나의 구성원의 교환을 수반할 것이다.
하나의 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구에 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 소정의 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 갖고/갖거나, 모 항체의 실질적으로 보유된 소정의 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어, 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기법, 예컨대, 본 명세서에 기재된 것을 이용하여, 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙된 항체이다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고, 변이체 항체는 파지에서 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Afol. Biol. 207: 179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구성 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 몇몇 실시형태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오차 발생이 쉬운 PCR, 사슬 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이후, 2차 라이브러리가 생성된다. 이후, 라이브러리는 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하도록 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 HVR 지시된 접근법을 수반하고, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4개 내지 6개의 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는 구체적으로 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특히 자주 표적화된다.
소정의 실시형태에서, 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에 치환, 삽입 또는 결실이 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 밖에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 소정의 실시형태에서, 각각의 HVR은 비변경되거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발에 표적화될 수 있는 항체의 영역 또는 잔기의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바대로 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대, arg, asp, his, lys 및 glu)은 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 결정하기 위해 확인되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가의 치환은 아미노산 위치에서 도입될 수 있어서 초기 치환에 대한 작용기 민감도를 나타낸다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉 점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이것이 원하는 특성을 함유하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 길이의 범위의 아미노 및/또는 카복실 말단 융합, 및 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예를 들어, ADEPT에 대한) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 대한 융합을 포함한다.
4. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바대로 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 일 실시형태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어, 이들에 의해 형질주입된다). 일 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프구 세포(예를 들어, YO, NSO, Sp20 세포)이다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 제공된 바대로 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-PD-L1 이디오타입 항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산은 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 단리되고 하나 이상의 벡터로 삽입된다. 이러한 핵산은 종래의 절차를 이용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글라이코실화 및 Fe 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 항체가 박테리아에서 제조될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현을 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참조한다(또한 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재한 문헌[Charlton, Methods in Afolecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 섬질 진균 또는 효모는 글라이코실화 경로가 "인간화"되어서, 부분 또는 완전한 인간 글라이코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 발생시키는 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리이코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(비척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 비척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질주입을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양은 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, (전이유전자 식물에서 항체를 제조하기 위한 PLANTIBODIES(상표명) 기술을 기재한) 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호를 참조한다.
척추동물 세포는 숙주로서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질주입된 원숭이 신장 CV 1 라인(COS-7); 인간 배아 신장 라인(예를 들어, 문헌[Graham et al., J. Gen Viral. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV 1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VER0-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개과 신장 세포(MOCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep 02); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어, DHFK CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NSO 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 제조에 적합한 소정의 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본 명세서에 제공된 항-PD-L1 이디오타입 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 검정에 의해 이의 물리/화학 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나, 규명될 수 있다.
i. 결합 검정 및 다른 검정
일 양태에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 공지된 방법, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 결합 친화도는 당해 분야에 공지된 흔한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체의 KD는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하의 (125I) 표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시키고, 이후 항-Fab 항체 코팅된 플레이트에 의해 결합된 항원을 포획함으로써 하기 검정에 의해 기재된 바대로 항체 및 항원 분자의 Fab 버전에 의해 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다(Chen, et al., (1999) J. Mol . Biol 293:865-881). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, 미량역가 플레이트(Dynex)를 50mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중에 5㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)에 의해 밤새 코팅하고, 후속하여 실온(대략 23℃)에서 2시간 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민에 의해 차단하였다. 비흡착제 플레이트(Nunc 269620호)에서, 100 pM 또는 26pM[125I]-항원을 관심 대상의 Fab의 연속 희석액과 혼합한다(예를 들어, 문헌[Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서 Fab-12인 항-VEGF 항체의 평가와 일치). 이후, 관심 대상의 Fab를 밤새 배양하지만, 항온처리는 평형이 도달된다는 것을 보장하도록 더 긴 기간(예를 들어, 65시간) 동안 계속할 수 있다. 이후, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리를 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% Tween-20에 의해 8회 세척한다. 플레이트가 건조될 때, 150㎕/웰의 섬광제(MicroScint-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 Topcount 감마 계수기(Packard)에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁적 결합 검정에서의 사용을 위해 선택된다.
또 다른 실시형태에 따르면, KD는 약 10 반응 단위(RU)에서 부동화된 항원 CM5 칩에 의해 25℃에서 BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(BIAcore, Inc.(뉴저지주 피츠카타웨이))을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정된다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIAcore Inc.)을 공급사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)에 의해 활성화한다. 항원을 10mM 아세트산나트륨(pH 4.8)에 의해 5㎍/㎖(0.2μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10의 반응 단위(RU)를 달성하기 위해 5㎕/분의 유속에서 주입한다. 항원의 주입 후, 1M 에탄올아민을 주입하여 비치료된 그룹을 차단한다. 역동학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액(0.78nM 내지 500nM)을 대략 25㎕/분의 유속에서 25℃에서 0.05% TWEEN 20(상표명) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에 주입한다. 결합 및 분해 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모델(BIAcore(등록상표) Evaluation 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 결합 속도(kon) 및 분해 속도(koff)를 계산한다. koff/kon 비율로서 평형 분해 상수(KD)를 계산한다. 예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 결합 속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106M-1 s-1을 초과하는 경우, 분광계, 예컨대, 중단-흐름 구비된 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표명) 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정된 바대로 항원의 증가하는 농도의 존재 하에 PBS(pH 7.2) 중의 20nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도(여기 = 295㎚; 방출 = 340㎚, 16㎚ 대역 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기법을 이용함으로써 결합 속도를 결정할 수 있다.
또 다른 양태에서, 경쟁 검정은 본 명세서에 기재된 임의의 항-PD-L1 이디오타입 항체와 항-PD-L1 항체의 결합에 경쟁하는 또 다른 항-이디오타입 항체를 확인하도록 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 항-PD-L1 항체의 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체배좌 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Afethods in Afolecular Biology vol. Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 부동화된 항-PD-L1 항체는 각각 항-PD-L1 항체에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들어, 제1 표지된 항-PD-L1 이디오타입 항체) 및 항-PD-L1 항체에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 이의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체(예를 들어, 제2 비표지된 항-PD-L1 이디오타입 항체)를 포함하는 용액 중에 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 부동화된 항-PD-L1 항체는 제2 비표지된 항체가 아니라 제1 표지된 항체를 포함하는 용액 중에 항온처리된다. 항-PD-L1 항체에 대한 제1 항체의 결합에 허용 가능한 조건 하에 항온처리 후, 과량의 비결합된 항체가 제거되고, 부동화된 항-PD-L1 항체와 연관된 표지의 양은 측정된다. 부동화된 항-PD-L1 항체와 연관된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 그것은 제2 항체가 항-PD-L1 항체에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory A1anual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다. 경쟁 검정은 또한 항-PD-L1 항체에 의해 형질주입되고 세포 표면에서 발현된 세포를 사용하여 FACS에 의해 상기 기재된 바와 같은 방식으로 수행될 수 있다. 추가적으로, 항-PD-L1 항체에 의한 ELISA는 또한 경쟁 검정에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 겔 이동 검정은 본 발명의 항-이디오타입 항체와 표적 항체, 예컨대, 항-PD-L1 항체 사이의 상호작용을 확인하도록 사용될 수 있다.
예시적인 겔 이동 검정에서, 항-PD-L1 항체는 항-이디오타입 항체와 예비항온처리된다. 예비항온처리된 항-PD-L1 항체 및 항-이디오타입 항체와 예비항온처리되지 않은 대조군 항-PD-L1 항체는 겔 전기영동으로 처리되고, 2차 항체(예를 들어, IgG/Ig 카파 항-PD-L1 항체에 대한 IgG 및 Ig 카파 2차 항체)에 의해 프로빙된다. 예비항온처리된 항-PD-L1 항체 및 대조군 항-PD-L1 항체의 이동도는 비교되고, 여기서 예비항온처리된 항-PD-L1 항체와 대조군 항-PD-L1 항체의 이동도의 차이는 항-PD-L1 항체와 항-이디오타입 항체 사이의 상호작용을 나타낸다.
D. 항-이디오타입 항체를 사용하는 방법
i. 사용 방법
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 임의의 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 데 유용하다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 임의의 항-PD-L1 이디오타입 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 항-PD-L1 항체를 정량화하는 데 유용하다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예컨대, 전혈 또는 전혈 성분, 예를 들어, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 관절 낭액, 난포액, 정액, 양수, 젖, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 뇨 및 관심 대상의 항체를 함유할 수 있는 신체의 다른 구성성분이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터의 신체 샘플이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 인간으로부터의 샘플이다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 임의의 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 또 다른 분자(예를 들어, 항-PD-L1 항체의 Fc 영역에 결합하는 항체)에 결합하는 이의 능력에 영향을 미치지 않으면서 면역검정에서 항-PD-L1의 존재를 검추하는 데 유용하다.
항-PD-L1 이디오타입 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 ELISA, 비드 기반 면역검정 및 질량 분광법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다양한 상이한 검정에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 항-PD-L1 항체에 결합하는 임의의 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 검정에서 이의 간섭을 감소시키도록 환자 샘플로부터의 항-PD-L1 항체를 고갈, 검출 또는 분화시키는 데 유용하다.
몇몇 실시형태에서, 샘플은 포유류 유래이다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 예를 들어, 임상 샘플에서 항체, 예컨대, 인간화된 항체를 측정할 때 인간 대상체 유래이다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 치료학적 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아테졸리주맙)에 의해 치료되는 환자 유래이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자로부터의 혈청이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 뇨이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자로부터의 뇨이다.
소정의 실시형태에서, 표지된 항-PD-L1 이디오타입 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광성, 색소생산성, 전자-밀도, 화학발광 및 방사성 표지), 및 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대, 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 겨자무 과산화효소(HRP), 알칼리 포스파타제, J3-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소짐, 사카라이드 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 헤테로사이클릭 산화효소, 예컨대, 유리카제 및 잔틴 산화효소(염료 전구체를 산화시키도록 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대, HRP, 락토과산화효소 또는 마이크로과산화효소와 커플링됨), 바이오틴/아비딘, 스핀 표지(spin label), 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
ii. 항-PD-L1 항체의 검출을 위한 방법 및 조성물
1. ELISA
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 ELISA 검정에서 사용된다. 본 명세서에 기재된 검정은 관심 대상의 항체에 대한 포획 시약으로서 항-PD-L1 이디오타입 항체를 사용하는 ELISA이다. 검정의 제1 단계에서, 관심 대상의 항체를 함유하는 것으로 의심되거나 함유하는 생물학적 샘플은 포획(또는 코트) 항체와 접촉하고 항온처리되어서, 포획 항체는 관심 대상의 항체를 포획하거나 결합하여서, 이것은 검출 단계에서 검출될 수 있다. 검출 단계는, 관심 대상의 임의의 결합된 항체와 접촉할 때, 존재하는 경우 관심 대상의 항체에 결합하는 검출 가능한 항체의 사용을 수반한다. 검출 수단은 항체에서의 표지 및 그러므로 존재하는 관심 대상의 항체의 존재 또는 양을 검출하도록 사용된다.
소정의 실시형태에서, 검정은 하기 단계를 이용한다.
제1 단계
본 명세서에서 검정의 제1 단계에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 관심 대상의 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 관심 대상의 항체에 지향된 항-이디오타입 항체인 부동화된 포획(또는 코트) 시약과 접촉하고 항온처리된다. 몇몇 실시형태에서, 이 항-이디오타입 항체는 단일클론 항체이고, 임의의 종 유래일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이 항-이디오타입 항체는 설치류 항체, 추가의 실시형태에서 쥣과 또는 래트, 추가의 실시형태에서 쥣과 항체이다.
다양한 실시형태에서, 항-이디오타입은 본 명세서에 개시된 임의의 항-이디오타입 항체이다. 소정의 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 함유하는 항체이고, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, (f) HVR-L3은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 54의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하는 항체이고, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, (f) HVR-L3은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 56의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 55의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하는 항체이고, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, (f) HVR-L3은 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 58의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 57의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
부동화는 종래대로 검정 절차 전에 수불용성 매트릭스 또는 표면에 대한 흡착에 의해(미국 특허 제3,720,760호) 또는 비공유 또는 공유 커플링(예를 들어, 미국 특허 제3,645,852호 또는 문헌[Rotmans et al.; J. Immunol. Methods, 57:87-98 (1983)]에 기재된 바와 같이 예를 들어, 질산 및 환원제에 의한 지지체의 이전의 활성화에 의해 또는 이것 없이 글루타르알데하이드 또는 카보다이이미드 가교결합을 사용하여), 또는 이후, 예를 들어, 면역침전에 의해 포획 시약을 불용성화시킴으로써 달성된다. 몇몇 실시형태에서, 포획 항체는 바이오틴에 접합되고, 스트렙타비딘 코팅된 표면에 결합된다. 다른 실시형태에서, 포획 항체는 단백질 태그, 예컨대, His 태그 또는 GST에 접합되고, 적합한 표면, 예를 들어, 니켈 또는 구리 코팅된 표면, 또는 글루타티온 코팅된 표면에 결합된다.
부동화에 사용된 고상은, 예를 들어, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태의 지지체를 포함하는, 본질적으로 수불용성이고 면역측정 검정에서 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 캐리어일 수 있다. 흔히 사용되는 지지체의 예는 작은 시트, SEPHADEX(등록상표) 겔, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드, 및 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스타이렌 등으로부터 제조된 검정 플레이트 또는 시험 관, 예를 들어, 96웰 미량역가 플레이트, 및 미립자 재료, 예컨대, 필터 페이퍼, 아가로스, 가교결합된 덱스트란 및 다른 다당류를 포함한다. 대안적으로, 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 반응성 수불용성 매트릭스, 예컨대, 사이아노겐-브로마이드-활성화된 탄수화물 및 반응성 기질은 포획-시약 부동화에 적절하게 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 부동화된 포획 시약은 미량역가 플레이트에 코팅된다. 몇몇 실시형태에서, 사용된 고상은 한 번에 몇몇 샘플을 분석하도록 사용될 수 있는 다중 웰 미량역가 플레이트, 예를 들어, MICROTEST(상표명) 또는 MAXISORP(상표명) 96웰 ELISA 플레이트, 예컨대, NUNC MAXISORB(상표명)로서 판매되는 것 또는 IMMULONT(상표명)이다.
고상은 원하는 바대로 비공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 연결에 의해 연결될 수 있는 상기 정의된 바와 같은 포획 시약에 의해 코팅된다. 부착에 대한 기법은 미국 특허 제4,376,110호 및 여기 인용된 참고문헌에 기재된 것을 포함한다. 공유인 경우, 플레이트 또는 다른 고상은 예컨대, 1시간 동안 실온에서 당해 분야에 널리 공지된 조건 하에 포획 시약과 함께 가교결합제와 항온처리된다.
포획 시약을 고상 기질에 부착하기 위해 흔히 사용되는 가교결합제는 예를 들어, 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스터, 예를 들어, 4-아지도살리실산을 갖는 에스터, 호모이작용성 이미도에스터, 예를 들어, 다이숙신이미딜 에스터, 예컨대, 3,3'-다이티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 및 이작용성 말레이미드, 예컨대, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함한다. 유도체화 물질, 예컨대, 메틸-3-((p-아지도페닐)-다이티오)프로피오이미데이트는 광의 존재 하에 가교결합을 형성할 수 있는 광 활성화 가능한 중간체를 생성한다.
96웰 플레이트를 사용할 때, 이것은 적어도 약 10시간 동안 항온처리에 의해 완충제, 예컨대, 0.05M 탄산나트륨 중에 통상적으로 희석된 포획 시약의 혼합물에 의해 코팅될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 약 4 내지 20℃, 또는 약 4 내지 8℃의 온도에서 및 약 8 내지 12, 약 9 내지 10, 또는 약 9.6의 pH에서 적어도 밤새이다. 더 짧은 코팅 시간(1 내지 2시간)이 바람직한 경우, 37℃에서 나이트로셀룰로스 필터 바닥(Millipore MULTISCREEN(상표명)) 또는 코트를 갖는 96웰 플레이트를 사용할 수 있다. 플레이트는 검정 자체 전에 길게 적층되고 코팅될 수 있고, 이후 검정은 수동, 반자동 또는 자동 방식으로, 예컨대, 로봇을 사용함으로써 몇몇 샘플에서 동시에 수행될 수 있다.
이후, 코팅된 플레이트는 통상적으로 플레이트의 웰에서 과량의 자리에 대한 유리 리간드의 원치 않는 결합을 막도록 결합 자리에 비특이적으로 결합하고 이를 포화시키는 차단제에 의해 처리된다. 이 목적을 위한 적절한 차단제의 예는 예를 들어, 젤라틴, 소 혈청 알부민, 난 알부민, 카세인 및 탈지 우유를 포함한다. 차단 처리는 통상적으로 약 1시간 내지 4시간, 또는 약 1.5 내지 3시간 동안 상온의 조건에서 발생한다.
코팅 및 차단 후, 분석되고, 적절히 희석되는, 표준(관심 대상의 정제된 항체) 또는 생물학적 샘플은 부동화된 상에 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 희석률은 약 5 내지 15용적% 또는 약 10용적%이다. 이 목적을 위해 희석에 사용될 수 있는 완충제는 (a) 0.5% BSA, 0.05% TWEEN 20(상표명) 세제(P20), 0.05% PROCLIN(상표명) 300 항생제, 5mM EDTA, 0.25% 3-((3-콜라미도프로필) 다이메틸암모니오)-1-프로판설포네이트(CHAPS) 계면활성제, 0.2% 베타-감마 글로불린 및 0.35M NaCl을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS); (b) 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.05% P20 및 0.05% PROCLIN(상표명) 300(pH 7)을 함유하는 PBS; (c) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN(상표명) 300, 5mM EDTA 및 0.35M NaCl(pH 6.35)을 함유하는 PBS; (d) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN(상표명) 300, 5mM EDTA, 0.2% 베타-감마 글로불린 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS; 및 (e) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN(상표명) 300, 5mM EDTA, 0.25% CHAPS 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS를 포함한다. PROCLIN(상표명) 300은 보존제로서 작용하고, TWEEN 20(상표명)은 비특이적 결합을 제거하기 위한 세제로서 작용한다.
사용되는 포획 시약의 양은 샘플에서 관심 대상의 항체의 최대 예상된 수준과 비교하여 몰 과량은 아니지만 표준과 비교하여 양호한 신호를 주기에 충분히 크다. 소정의 실시형태에서, 첨가되는 생물학적 샘플의 양은 부동화된 포획 시약이 샘플의 적절한 희석 후 생물학적 샘플에서 기대된 관심 대상의 유리 항체의 최대 몰 농도의 몰 과량인 것이다. 이 기대된 수준은 환자의 임상 상태에 의해 분석되는 특정한 생물학적 샘플에서 관심 대상의 유리 항체의 농도 수준 사이의 임의의 공지된 상관관계에 따라 주로 달라진다. 따라서, 예를 들어, 성인 환자는 꽤 높은 혈청에서의 관심 대상의 유리 항체의 최대 예상된 농도를 가질 수 있는 한편, 아동은 주어진 용량에 기초하여 혈청에서의 관심 대상의 유리 항체의 더 낮은 수준을 가질 것으로 예상될 것이다.
포획 시약의 농도는, 생물학적 샘플의 임의의 필요한 희석을 고려하여, 관심 대상의 항체의 관심 대상의 농도 범위에 의해 결정될 수 있다. 포획 시약의 최종 농도는 관심 대상의 범위에 걸쳐 검정의 민감도를 최대화하도록 경험적으로 또한 결정될 수 있다. 일반적으로, 몰 과량은 샘플의 임의의 적절한 희석 후 적절하게는 생물학적 샘플 내의 관심 대상의 항체의 최대 예상된 몰 농도의 약 10배 미만이다.
샘플 및 부동화된 포획 시약의 항온처리를 위한 조건은 검정의 민감도를 최대화하고 해리를 최소화하고, 그리고 샘플에 존재하는 임의의 관심 대상의 항체가 부동화된 포획 시약에 결합한다는 것을 보장하도록 선택된다. 항온처리는 약 0℃ 내지 약 40℃의 범위의 꽤 일정한 온도에서, 예를 들어, 실온에서 또는 대략 실온에서 달성된다. 항온처리에 대한 시간은 일반적으로 약 10시간 이하이다. 다양한 실시형태에서, 항온처리 시간은 포획 시약에 대한 관심 대상의 항체의 결합을 최대화하도록 실온에서 또는 대략 실온에서 약 0.5 내지 3시간, 또는 약 1.5 내지 3시간이다. 프로테아제 저해제가 생물학적 유체 내의 프로테아제가 관심 대상의 항체를 분해하는 것을 막도록 첨가되는 경우, 항온처리의 기간은 더 길 수 있다.
이 단계에서, 항온처리 혼합물의 pH는 대개는 약 4 내지 9.5의 범위 또는 약 6 내지 9, 또는 약 7 내지 8의 범위일 것이다. 항온처리 완충제의 pH는 포획되는 관심 대상의 항체에 대한 포획 시약의 특이적 결합의 유의미한 수준을 유지시키도록 선택된다. 다양한 완충제, 예를 들어, 보레이트, 포스페이트, 카보네이트, TRIS-HCl 또는 TRIS-포스페이트, 아세테이트, 바비탈 등은 이 단계 동안 원하는 pH를 달성하고 유지시키도록 사용될 수 있다. 사용된 특정한 완충제는 본 발명에 중요하지 않지만, 개별 검정에서 하나의 완충제는 또 다른 것에 비해 바람직할 수 있다.
선택적인 제2 단계
검정 방법의 선택적인 제2 단계에서, 생물학적 샘플은 관심 대상의 비포획된 항체를 제거하도록 부동화된 포획 시약으로부터 (예를 들어, 세척에 의해) 분리된다. 세척에 사용된 용액은 일반적으로 고려사항을 이용하여 결정된 pH를 갖는 완충제("세척 완충제") 및 약 6 내지 9의 pH 범위의 항온처리 단계에 대해 상기 기재된 완충제이다. 세척은 3회 이상 수행될 수 있다. 세척의 온도는 일반적으로 냉장고로부터 보통의 온도(일정한 온도는 검정 기간 동안 유지됨), 통상적으로 약 0 내지 40℃, 또는 약 4 내지 30℃이다. 예를 들어, 세척 완충제는 세척 전에 저장소에서 4℃에서 얼음에 배치될 수 있고, 플레이트 세척기는 이 단계에 사용될 수 있다. 가교결합제 또는 다른 적합한 물질은 또한, 관심 대상의 포획된 항체가 후속하는 단계에서 어느 정도로 해리할 수 있다는 어떠한 우려가 있는 경우, 관심 대상의 이제 결합된 항체가 포획 시약에 공유로 부착되게 하도록 이 단계에서 첨가될 수 있다.
제3 단계
제3 단계에서, 존재하는 관심 대상의 임의의 결합된 항체에 의해 부동화된 포획 시약은 약 20 내지 40℃, 또는 약 36 내지 38℃의 온도에서 검출 가능한 항체와 접촉하고, 2개의 접촉을 위한 정확한 온도 및 시간은 주로 사용되는 검출 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-갈락토사이드(MUG), 스트렙타비딘-HRP, 또는 스트렙타비딘-β-갈락토시다제를 검출에 대한 수단으로서 사용할 때, 접촉은 신호를 최대로 증폭시키도록 밤새(예를 들어, 약 15 내지 17시간 또는 이것 초과) 수행될 수 있다. 검출 가능한 항체가 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있지만, 바람직하게는 이것은 배경 노이즈를 감소시키기 위해 단일클론 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 동일한 항-이디오타입 항체는 검정에서 코트 및 검출에 사용된다. 다른 실시형태에서, 상이한 항-이디오타입 항체는 배경 노이즈가 최소화되도록 선택된 코트 및 검출에 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 항-huIgG Fc 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 마우스 항-huIgG Fcγ 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 직접적으로 검출 가능하다. 소정의 실시형태에서, 검출 가능한 항체는 바이오틴일화된다. 이러한 경우에, 바이오틴일화 표지에 대한 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP일 수 있고, 검출 수단의 판독은 형광분석 또는 비색분석일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 HRP에 접합되고, 검출 수단은 비색분석이다.
(상기 기재된 바대로) 예상된 관심 대상의 유리 항체의 최대 농도와 관련하여 검출 가능한 항체의 몰 과량은 이것이 세척된 후 플레이트에 첨가된다. (직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한) 이 항체는 단일클론 항체이지만, 임의의 항체를 사용할 수 있다. 검출 가능한 항체의 친화도는 소량의 관심 대상의 유리 항체가 검출될 수 있도록 충분히 높아야 하지만, 관심 대상의 항체가 포획 시약으로부터 당겨지게 하도록 높지 않아야 한다.
제4 단계
검정 방법의 마지막 단계에서, 포획 시약에 이제 결합된 샘플로부터의 관심 대상의 임의의 유리 항체의 수준은 검출 가능한 항체에 대한 검출 수단을 이용하여 측정된다. 생물학적 샘플이 임상 환자 유래인 경우, 측정 단계는 공지된 양과 비교된 관심 대상의 항체의 수준을 결정하도록 상기 3개의 단계의 결과로서 생긴 반응을 표준 곡선과 비교하는 것을 포함한다.
부동화된 포획 시약에 첨가된 항체는 직접적으로 표지되거나, 과량의 제1 항체를 세척한 후, 제1 항체의 동물 종의 IgG에 대해 지향된 제2의 표지된 항체의 몰 과량의 첨가에 의해 간접적으로 검출될 것이다. 차후의, 간접 검정에서, 제1 항체에 대한 표지된 항혈청은 인시츄로 표지된 항체를 생성하도록 샘플에 첨가된다.
제1 항체 또는 제2 항체에 사용된 표지는 항-이디오타입 항체에 대한 관심 대상의 유리 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출 가능한 작용기이다.
적합한 표지의 예는 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티, 예컨대, 형광단, 화학발광 및 방사성 표지, 및 검출되도록 반응되거나 유도체화되어야 하는 모이어티, 예컨대, 효소를 포함하는, 면역검정에서 사용하기 위해 공지된 많은 표지이다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대, 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, HRP, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소짐, 사카라이드 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 헤테로사이클릭 산화효소, 예컨대, 유리카제 및 잔틴 산화효소(염료 전구체를 산화시키도록 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대, HRP, 락토과산화효소 또는 마이크로과산화효소와 커플링됨), 바이오틴(예를 들어, MUG에 의한 아비딘, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘-HRP 및 스트렙타비딘-β-갈락토시다제에 의해 검출 가능), 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
종래의 방법은 이 표지를 단백질 또는 폴리펩타이드에 공유로 결합시키도록 이용 가능하다. 예를 들어, 커플링제, 예컨대, 다이알데하이드, 카보다이이미드, 다이말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-다이아조화된 벤지딘 등은 항체를 상기 기재된 형광성, 화학발광성 및 효소 표지에 의해 태그화하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제3,940,475호(형광측정법) 및 미국 특허 제3,645,090호(효소); 문헌[Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982)]을 참조한다.
항체에 대한 이러한 표지, 예를 들어, 효소의 접합은 면역검정 기법에서의 당업자에 대한 표준 조작 절차이다. 예를 들어, 문헌[O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166]을 참조한다. 적합한 상업적으로 구입 가능한 표지된 항체를 또한 사용할 수 있다.
마지막 표지된 항체의 첨가 이후에, 결합된 항체의 양은 세척을 통해 과량의 비결합된 표지된 항체를 제거하고 이후 표지에 적절한 검출 방법을 이용하여 부착된 표지의 양을 측정하고, 측정된 양을 생물학적 샘플 내의 관심 대상의 항체의 양과 상관시킴으로써 결정된다. 예를 들어, 효소의 경우에, 전개되고 측정된 색상의 양은 존재하는 관심 대상의 항체의 양의 직접 측정일 것이다. 구체적으로, HRP가 표지인 경우, 색상은 450㎚ 판독 파장 및 620 또는 630㎚ 기준 파장을 이용하여 기질 TMD를 사용하여 검출될 수 있다.
일 예에서, 제1의 비표지된 항체에 대해 지향된 효소 표지된 제2 항체를 부동화된 상으로부터 세척한 후, 색상 또는 화학발광은 부동화된 포획 시약을 효소의 기질과 항온처리함으로써 전개되고 측정된다. 이후, 관심 대상의 항체의 농도는 동시에 실행되는 관심 대상의 표준 항체에 의해 생성된 색상 또는 화학발광을 비교함으로써 계산된다.
2. 질량 분광법
몇몇 실시형태에서, 항-PD-L1 이디오타입 항체는 항-PD-L1 항체에 대한 질량 분광법 검정에 사용된다. 본 명세서에 기재된 검정은 생물학적 샘플로부터의 항-PD-L1 항체의 면역친화도 포획을 위해 항-PD-L1 이디오타입 항체를 사용한다. 샘플은 질량 분광법에 의한 항-PD-L1 항체의 정량화 전에 분리 기법, 예컨대, 크로마토그래피를 이용하여 추가로 처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 특징적인 펩타이드 단편은 단백질분해에 의해 제조되고, 선택된 서명 펩타이드는 항-PD-L1 항체에 대한 대리 분석물질로서 측정된다. 소정의 실시형태에서, 대리 펩타이드는 탠덤 질량 분광법(MS/MS)에 의한 검출에 의해 HPLC를 이용하여 정량화된다.
a. 생물학적 샘플의 처리
항-PD-L1 항체는 포유류, 예컨대, 인간에게 투여되거나, 조직, 세포 배양, 혈장 또는 혈청으로부터 선택된 생물학적 소스와 접촉한다. 혈청 및 혈장 샘플로부터의 분석은 이의 높은 단백질체학적 배경, 즉 많은 단백질 및 다른 분석물질로 인해 문제가 된다고 공지되어 있다. 투여 후 분, 시간, 일의 범위의 소정의 시간 기간 후, 항-PD-L1 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 생물학적 샘플은 수집된다. 생물학적 샘플은 주사기 또는 캐뉼라에 의해 유체를 배출시키는 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 수집될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈액 생성물, 예컨대, 관심 대상의 항체를 함유하는 혈청, 혈장 또는 유사한 또는 다른 체액일 수 있다.
생물학적 샘플은 종래의 절차, 예를 들어, 제제화, 부동화, 원심분리, 단리, 분해, 혈액 세포 응고의 유도 또는 예방, 가수분해 또는 정제에 의해 분석 샘플을 형성하도록 처리된다. 생물학적 샘플의 처리는 불순물을 제거하고 샘플 구성성분의 분리를 방해하거나 데이터 수집 또는 분석을 모호하게 할 수 있는 샘플 불균일성을 감소시키도록 작용한다. 대안적으로, 또는 또한, 처리는 샘플 취급을 단순화하거나, 분해로부터 보존하거나, 샘플 용적을 최소화하거나, 질량 분광 분석에서 관심 대상의 샘플 구성성분(분석물질)을 선택한다. 대안적으로, 또는 또한, 처리는 생물학적 샘플을 약물 대사 또는 약동학적 효과를 결정하는 데 관심 대상인 대사물질, 단편 또는 유도체로 전환시킨다.
b. 처리된 분석 샘플의 포획
항체는 면역친화도 비드에서 포확되고, 여기서 비드는 투여된 항-PD-L1 항체에 특이적인 부동화된 항-이디오타입 항체를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 항-이디오타입은 본 명세서에 개시된 임의의 항-이디오타입 항체이다. 투여된 항-PD-L1 항체에 특이적인 항-이디오타입 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 면역친화도 비드에 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 투여된 항-PD-L1 항체에 특이적인 항-이디오타입은 바이오틴일화되고, 강한 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용(KD = l0-15M)을 통해 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드에 결합된다. 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드를 사용하는 것의 이유는 (i) 강한 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용(KD = 10-15M), (ii) 부동화된 스트렙타비딘/바이오틴일화된 분석물질이 입증된 방법이라는 것, (iii) 고결합 커패시티(온전한 단백질에 대한 충분한 재료), (iv) 낮은 비특이적 결합, (v) 질량 분광법 상용성 용매에 의한 샘플의 용리, (vi) 비드로부터의 양호한 샘플 회수, 및 (vii) 사용의 용이성 및 자동화에 수정 가능함을 포함한다.
면역친화도 비드는 다공성 중합체 모노리쓰를 포함할 수 있고, 수집 저장소와 유체 통신하여 관통 채널에 구성될 수 있다. 비드는 생물학적 소스로부터의 샘플이 일 말단 또는 오리피스에서 도입되고, 샘플이 또 다른 말단 또는 오리피스로부터 용리되는 관통 용기, 예컨대, 칼럼 또는 깔때기에 함유될 수 있다. 면역친화도 비드는 각각 별개의 수집 저장소와 통신하는 복수의 관통 용기에서 분포될 수 있다. 용기 및 저장소는 자동화 및 결과의 재현성의 목적을 위해 12x8 행 및 열의 96 미량역가 웰 포맷 또는 24xl6 행 및 열의 384 미량역가 웰 포맷에 구성될 수 있다.
항-PD-L1 항체를 받은 포유류(생물학적 소스)로부터의 혈장 또는 혈청 샘플은 수동 피펫팅 또는 자동화 로봇 분배에 의해 비드에 적용된다.
비드는 웰 또는 다른 용기에서 구성되거나, 샘플이 일 말단 또는 오리피스에서 도입되고, 세척 용리물 또는 용리된 샘플이 또 다른 말단 또는 오리피스로부터 용리되는 칼럼 또는 다른 관통 용기에서 구성될 수 있다. 비드 결합된 항-이디오타입 항체에 특이적인 샘플 구성성분은 결합하도록 허용된다. 비드는 비특이적 단백질 및 다른 비특이적 샘플 구성성분을 세정하도록 세척된다. 결합된 항체는 예를 들어, PNGaseF에 의해 비드에서 탈글라이코실화될 수 있다. 결합된 샘플 구성성분은 격리된 수신 용기 또는 웰에 의해 샘플 플레이트로 용리될 수 있다. 이후, 용리된 샘플은 수동 피펫팅 또는 로봇 이동에 의해 보내지고 역상 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있고, 분리된 샘플 구성성분은 질량 분광법에 의해 분석된다.
몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 프로테아제에 의해 분해될 수 있다. 특징적인 펩타이드 단편은 단백질분해에 의해 제조되고, 선택된 서명 펩타이드는 항-PD-L1 항체에 대한 대리 분석물질로서 측정된다. 예시적인 실시형태에서, 생물학적 샘플은 트립신 분해에 의해 분해될 수 있다. 트립신 분해에 대해, 샘플은 DTT에 의해 환원되고, 나트륨 요오도아세테이트에 의해 S-카복시메틸화되고, 이후 트립신에 의해 분해될 수 있다. 분해된 샘플은 분리 방법, 예를 들어, 역상 HPLC, 예를 들어, Nucleosil Cl8 칼럼; 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 예를 들어, TSK 3000SWxL 칼럼; 또는 TSK Boronate 칼럼을 사용한 보로네이트 친화도 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다.
c. 샘플 구성성분의 분리
분석 샘플을 형성하기 위해, 생물학적 샘플은 하나 초과의 샘플 구성성분의 분리를 실행하도록 분리 매질에 적용될 수 있다. 분리 방법은 친화도, 크로마토그래피 및 전기영동 방법을 포함한다. 친화도 방법은 친화도 크로마토그래피, 흡착 및 부동화된 친화도 매트릭스를 포함한다. 크로마토그래피 방법은 HPLC, 소수성 상호작용(HIC), 음이온 교환, 양이온 교환, 역상, 순상, 이온-쌍 역상, 박층, 모세관 흐름 및 크기 배제를 포함한다. 전기영동 방법은 단일 2차원, 슬랩 겔, 모세관, 폴리아크릴아미드, 변성, 네이티브, 유리 용액, 종이, 2차원, 등전점 맞춤 및 구배 전압을 포함한다. 다른 분리 방법은 투석, 원심분리, 침강, 부상분리, 침전, 면역침전 및 겔 여과를 포함한다.
분리 방법은 하나 이상의 물리화학 특성, 예를 들어, 용리 시간, 소수화도, 친수화도, 이동 시간, 속도, 속력, 크로마토그래피 보유 시간, 용해도, 분자 용적 또는 크기, 순전하, 전하 상태, 이온성 전하, 등전점, 해리 상수(pKa), 항체 친화도, 전기영동 이동도, 이온화 전위, 다이폴 이동, 수소 결합 모세관 및 기상에서의 이온 이동도(이들로 제한되지는 않음)에 의해 생물학적 샘플의 구성성분의 분리를 실행할 수 있다.
질량 분광법 입구 장치로의 모세관 흐름 인퓨젼에 의한 흐름의 낮은 속도는 질량 검출의 민감도를 수월하게 하여서, 더 낮은 농도의 분석물질 및 더 높은 분자량의 종, 예컨대, 검출하고 규명하고자 하는 온전한 단백질 및 항체를 허용한다.
d. 분리된 샘플 구성성분의 질량 분광법
질량 분광법 분석에 대한 샘플의 제조는 일반적으로 공지된 기법에 따라 수행될 수 있다. 문헌["Modem Protein Chemistry: Practical Aspects", Howard, G. C. and Brown, W. E., Eds. (2002) CRC Press, Boca Raton, Florida]을 참조한다.
본 발명의 방법은 혼합물의 상이한 화학 구성성분이 처음에 하나 이상의 공정, 예를 들어, 구성성분이 순차적으로 또는 배치 방식으로 용리되거나, 질량 분광법에 의해 직접적으로 검출되게 하는 친화도 또는 크로마토그래피에 의해 단리되거나, 분리되거나, 부분적으로 분리되는 생물학적 샘플로부터 유래된 항체 혼합물의 분석에 적절하다. 항체의 다양한 구조 특징 및 특성은 질량 분광법 분석, 예를 들어, 단편화, 탈아미노화, 글라이코실화, 산화, 부분 서열 정보, 예를 들어, N 말단 및 C 말단, 이합체 및 응집 상태로부터 밝혀질 수 있다. 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 화학 구성성분은, 투여된 항-PD-L1 항체가 공지된 서열, 구조 및 분자량을 가지므로, 이의 정확한 질량의 측정에 의해 고도로 특이적인 방식으로 규명될 수 있다.
높은 질량 정확성, 높은 민감도 및 높은 해상도가 가능한 다양한 질량 분광법 시스템은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 질량 분광계의 질량 분석장치는 4중극(Q), 비행 시간(time of flight: TOF), 이온 트랩, 자기 섹터 또는 FT-ICR 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 질량 분광계의 이온 소스는 주로 샘플 분자 이온 또는 유사 분자 이온, 및 소정의 규명 가능한 단편 이온을 생성시켜야 한다. 이러한 이온 소스의 예는 대기압 이온화 소스, 예를 들어, 전기분무 이온화(electrospray ionization: ESI) 및 대기압 화학 이온화(atmospheric pressure chemical ionization: APCI) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization: MALDI)를 포함한다. ESI 및 MALDI는 질량 분광법 분석을 위해 단백질을 이온화하기 위한 2개의 가장 흔히 사용되는 방법이다. ESI 및 APCI는 LC/MS에 의한 작은 분자의 분석을 위한 가장 흔히 사용되는 이온 소스 기법이다(Lee, M. "LC/MS Applications in Drug Development" (2002) J. Wiley & Sons, New York).
표면 증대 레이저 탈착 이온화(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization: SELDI)는 높은 쓰루풋 질량 분광법을 허용하는 표면 기반 이온화 기법의 예이다(미국 특허 제6,020,208호). 통상적으로, SELDI는 단백질 및 다른 생물분자의 복잡한 혼합물을 분석하도록 사용된다. SELDI는 용액 주에 분석물질, 예를 들어, 단백질과 상호작용하는 화학적으로 반응성인 표면, 예컨대, "단백질 칩"을 사용한다. 이러한 표면은 선택적으로 분석물질과 상호작용하고, 이들을 위에 부동화시킨다. 따라서, 본 발명의 분석물질은 칩에서 부분적으로 정제되고, 이후 질량 분광계에서 신속히 분석될 수 있다. 기질 표면에서의 상이한 부위에 다수의 반응성 모이어티를 제공함으로써, 쓰루풋이 증가할 수 있다.
기능적인 시스템에서, 질량 분광계는 이의 정확한 또는 계산된 질량의 20ppm 내로, 통상적으로 이의 정확한 또는 계산된 질량의 5ppm 이하 내로 관심 대상의 화학 종의 질량을 정확히 측정할 것이다. 상업적으로 구입 가능한 질량 분석장치는, 질량 분광법 신호 강도 또는 피크 면적이 정량적으로 표시된다는 것을 보장하도록, 혼합물에서 복수의 구성성분에 충분한 스펙트럼이 획득되게 하는 빈도로 동시에 전체 질량 스펙트럼을 샘플링하고 기록할 수 있다. 이는 또한 모든 질량에 대해 관찰된 용리 시간이 질량 분석장치에 의해 변형되거나 왜곡되지 않는다는 것을 보장할 것이고, 이는 정량적 측정이 일시적인 신호의 풍부도를 측정하려는 필요에 의해 손상되지 않는다는 것을 보장하는 것을 도울 것이다.
분석 가변성은 표적 분석물질과 유사한 물리화학 특성을 갖는 내부 표준품(IS)의 사용에 의해 수정될 수 있다. (Mesmin et al. (2011) Bioanalysis 3: 477-480). 몇몇 실시형태에서, 서명 펩타이드가 항-PD-L1 항체에 대한 대리 분석물질로서 측정되는 경우, 서명 펩타이드에 상응하는 안정한 동위원소 표지된(SIL) 펩타이드는 내부 표준품으로서 사용될 수 있다. (Hagman et al. (2008) Anal. Chem. 80: 1290-1296; Mesmin et al. (2010) Rapid Commun. Mass Spectrom. 24: 2875-2884).
3. 전기분무 이온화 질량 분광법(ESI)
증가된 분석물질 이온화 효율로 인해 더 낮은 유속에서 더 높은 민감도가 달성된다(Gale et al (1993) Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:1017). 따라서 분당 나노리터 범위의 유속에서 샘플 함유 유체의 전기분무 주사를 수행함으로써 적절한 보정 후 질량 분광법과 조합될 때 유체 내에 함유된 분석물질에 대해 정확한 정량화 및 높은 민감도를 제공한다. MS에 대한 프런트 엔드로서 정확한 정성적 분석, 및 높은 선택도 및 민감도를 제공하는, 친화도 크로마토그래피 흡착제를 갖는 소형화된 통합된 마이크로-칼럼 및 마이크로-칼럼 어레이를 포함하는 시스템 및 장치가 기록되어 있다(미국 특허 제6,811,689호; 미국 특허 제6,020,208호; 미국 특허 제6,579,719호).
비교적 높은 분자량 화합물, 예컨대, 항체의 질량은 대부분의 질량 분광계에 의해 용이하게 결정되는 질량 대 전하 비율(m/z)(2000 내지 3000의 통상적인 m/z 범위)에서 검출될 수 있다. 전기분무 이온화 질량 분광법 ESI-MS는 특히 하전된, 극성 또는 염기성 화합물에 그리고 훌륭한 검출 한계를 갖는 다수의 하전된 화합물을 분석하기에 적합하다. ESI는 이에 따라 큰 생물분자, 예컨대, 150,000 이상의 분자량(MW)을 갖는 항체 및 항체-약물 접합체의 검출 및 규명을 허용한다. 높은 질량 이온에 의해, 일련의 다수의 하전된 분자 이온이 통상적으로 관찰된다. 양이온에 대한 분자량은 측정된 m/z 비율과 전하의 수(n)의 곱에 양이온(C+)의 질량과 그 이온에 대한 전하의 수(n)의 곱을 빼서 결정된다.
ESI 방법은 계면 렌즈 전위를 제어함으로써 제어되는 단편화의 존재 또는 부재를 허용한다. 전기분무 이온화(ESI)는 액체 분리 방법(프런트 엔드), 및 질량 분광법 검출 방법(백 엔드)에 맞는다("Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications”, Cole, R. B., Ed. (1997) Wiley, New York).
ESI-MS 데이터는 다수의 스캔을 함께 평균하고 데이터를 평활화하여 양호한 피크 강도 및 형상을 제공함으로써 획득될 수 있다. 낮은 질량 화합물에 대해, 관찰되는 대부분의 풍부한 피크는 대개 양이온 모드에서 [M+H]+ 이온 및 음이온 모드에서 [M-H]-이다. 이중 및 삼중 하전된 이온, 및 이합체가 또한 관찰될 수 있다. 이중 하전된 양이온은 질량 (MW+2C+)/2에서 관찰될 것이고, 여기서 MW는 분자량이고, C+는 이온화 양이온, 예컨대, H+, Na+ 또는 NH4+이다. 매우 낮은 질량 화합물을 제외하고, 검출된 이온은 다중으로 하전될 것이다. ESI의 부드러운(낮은 이온화 전위) 조건으로 인해, 통상적으로 유일한 분자 이온이 관찰된다. ESI 스펙트럼은 이온이 보유하는 다양한 전하 수로 인해 질량 대 전하 비율이 다른 몇몇 분자 이온 피크를 가질 수 있다.
샘플, 예를 들어, ADC 또는 다른 생물분자의 희석 용액은 ESI-MS 분석에 대한 피하 주사바늘을 통해 천천히 펌프질될 수 있다. 샘플은 흐름 주입 또는 LC/MS를 통해 도입될 수 있다. 통상적인 유속은 분당 1마이크로리터(㎕) 미만 내지 분당 약 1밀리리터(㎖)의 범위이다. ESI는 큰 생물학적 분자에 특히 적합하고, 이 분자는 그렇지 않으면 기화하거나 이온화하기 어렵다. 주사바늘은 높은 전압에서 보유되고, 주사바늘의 끝에서의 강한 전기장은 분무된 용액을 하전시키고 하전된 액적을 생성한다. 하전된 액적은 물을 증발시켜서 작은 오리피스를 통해 진공 챔버로 이동하는 분자를 궁극적으로 생성시킨다. 용매 증발의 공정 동안, 비공유로 결합된 복합체는 용액으로부터 기상으로 이동한다(Hu et al(1994)).
온화한 탈용매화 조건은 일반적으로 온전한 기상 복합체를 유지시키는 데 필요하다. 오리피스는 이온이 완전히 탈용매화되도록 보장하도록 가열될 수 있다. 몇몇 MS 시스템은 역류하는 가열된 가스를 사용할 수 있다. 하전된 액적은 진공 챔버에 진입하기 전에 용매를 증발시키므로 피하 주사바늘로부터 방출되고 줄어든다. 열 및 가스 흐름은 탈용매화를 돕도록 사용될 수 있다. ESI 측정에 필요한 샘플의 양은 작은 모세관 전기분무 에미터, 선단, 나노전기분무로 공지된 공정의 이용에 의해 유체 흐름을 감소시킴으로써 감소할 수 있다. 나노전기분무 방법은 1㎕의 샘플에 대해 약 10 내지 30분 동안 일정한 신호를 생성할 수 있다. 낮은 흐름은 이온 효율을 증가시키고 이온 억제를 감소시키는 것으로 나타났다. 나노전기분무 방법은 MS/MS 단백질 연구에 흔히 사용된다(Komer et al (1996) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 7:150-156; Mann, M. and Wilm, M. (1996) Anal. Chem. 68:1-8).
단백질의 ESI는 분자량이 증가하면서 전하의 수가 증가하는 경향으로 다중으로 하전된 이온을 생성한다. 소정의 이온성 종에 대한 전하의 수는 (i) 하나의 전하만큼 다른 2개의 전하 상태를 비교하고 동시의 식을 푸는 것; (ii) 동일한 전하, 그러나 상이한 부가물 질량을 갖는 종을 찾는 것; 및 (iii) 분할된 동위원소 클러스터에 대한 질량 대 전하 비율의 조사와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다. ESI 및 ESI-MS의 방법 및 이들 방법을 수행하는 데 필요한 매개변수는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 전기분무 이온화 공정의 온화함은 온전한 항체 접합체가 질량 분광법에 의해 직접적으로 검출되게 한다.
일 실시형태에서, 단백질, 항체, 항체 단편 또는 항체-접합체(큰 분자)의 Q1 질량 스펙트럼은 방법의 일부로 실행된다. 큰 분자의 적합한 품질 Q1 질량 스펙트럼은 얻어질 수 있다. 단백질 엔벨로프가 이동할 가능성이 있으므로, 크로마토그래피에 사용된 모든 용매는 새로 만들어지고, 산은 관찰된 범위에서 스펙트럼 엔벨로프를 배치시키도록 용리 용매에 첨가된다. 100,000 질량 단위 초과의 단백질에 대해, 폼산과 같은 산은 용리 용매, 예를 들어, 용매 A(물) 및 용매 B(아세토나이트릴) 둘 다 중에 약 0.1%(용적)로 사용될 있다. 더 강한 산, 예컨대, 100,000 질량 단위 미만을 갖는 단백질에 대해 A 및 B 용매 둘 다에 대해 0.05%(용적) TFA에서 트라이플루오로아세트산(TFA)을 사용할 수 있다. 폼산의 양이 증가하면서, 트라스투주맙인 온전한 글라이코실화 항체는 더 많은 전하를 집어서, 엔벨로프를 더 왼쪽으로 그리고 m/z의 관찰된 범위(1800 내지 3000m/z)로 이동시킨다. 탈클러스터링 전위(declustering potential: DP) 전압이 약 30 내지 120V로부터 약 70 내지 190V로 증가하면서, 항체에서의 전하는 훨씬 더 증가한다. 따라서, 인가된 전압, 용매 조성물 및 이온 쌍 짓기 물질은 고려하고 조정하려는 인자이다. 탈클러스터링 전위(DP)는 최고의 전하 이온 범위를 선택하기에 충분한 해상도를 획득하도록 증가(상승)할 수 있다. 선형성은 m/z의 넓은 범위에 걸쳐 얻어질 수 있다. 항체의 탈글라이코실화는 온전한 항체 또는 중쇄, 단편 또는 ADC의 정량화를 보조한다. 글라이코실화는 더 낮은 이온화 효율 및 이에 따라 감소된 민감도에 기여한다. 항체 또는 항체 단편 접합체를 정량화할 때, 항체의 탈글라이코실화는 질량 스펙트럼의 불균일성을 감소시키고, 민감도를 증가시키고, 이에 따라 분석을 단순화시킬 수 있다.
디콘볼루션 표는 정량화되는 각각의 종에 대해 정확한 질량 대 전하 비율(m/z)을 결정하도록 사용된다. 디콘볼루션 소프트웨어 어플리케이션, 예컨대, Analyst.TM. QS(Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티))는 상업적으로 구입 가능하고/하거나, 질량 분광계에 의해 제공된다. 디콘볼루션 소프트웨어는 일반적으로 디콘볼루션된 질량의 표, 및 이 질량을 계산하기 위해 사용된 m/z 이온의 하위표를 사용자에게 제공한다.
iii. M-단백질 검출
다발성 골수종(multiple myeloma: MM)은 골수에서의 혈장 세포의 암이다. 다발성 골수종은 혈액, 뇨 및 기관, 예를 들어, M-단백질 및 다른 면역글로불린(항체) 및 베타-2-마이크로글로불린(이들로 제한되지는 않음)에서의 높은 수준의 단백질을 야기한다. 파라단백질로도 공지된 단일클론 단백질의 약어인 M-단백질은 골수종 혈장 세포에 의해 제조되고, 다발성 골수종을 갖는 거의 모든 환자의 혈액 또는 뇨에서 발견될 수 있다.
면역조절 약물, 예컨대, 레날리도마이드(Revlimid(등록상표))는 새로 진단된 환자, 화학치료 또는 이식에 실패한 진행된 질병을 갖는 환자, 및 재발된 또는 불응성 다발성 골수종을 갖는 환자에서 골수종의 치료를 위한 중요한 옵션으로서 생겼다. 또 다른 강력한 면역조절 물질은 4-(아미노)-2-(2,6-다이옥소(3-피페리딜))-아이소인돌린-1,3-다이온(포말리도마이드, Actimid(등록상표))이다. 몇몇 경우에, 이러한 물질은 표준 화학치료 물질과 조합되어 사용된다. 예를 들어, 덱사메타손과 조합된 레날리도마이드는 적어도 하나의 이전의 치료를 받은 다발성 골수종을 갖는 환자의 치료에 최근에 승인되었다. 포말리도마이드는 또한 덱사메타손과 조합되어 투여될 수 있다. 다른 치료와 조합된 아테졸리주맙(Tecentriq(등록상표))은 다발성 골수종에 대한 치료로서 다수의 임상 실험에서 시험되고 있다.
국제 골수종 연구 그룹(International Myeloma Working Group: IMWG)은 혈청 단백질 전기영동(SPE), 및 면역고정 전기영동(IFE)에 의한 혈청/뇨 M-단백질 수준의 변화, 골수 혈장 세포의 백분율 및 유리 경쇄(FLC) 비율을 포함하는 MM에서의 치료에 대한 임상 반응에 대한 기준을 확립하였다. IMWG 기준에 의해 완전한 반응(CR)을 갖는 것으로 분류된 환자에 대해, 혈청 및 뇨는 IFE 및 SPE에 의해 결정된 바대로 M-단백질에 음성이어야 하고, 골수 혈장 세포는 5% 미만이어야 한다. MM의 치료는 치료학적 단일클론 항체의 도입에 의해 발달한다. SPE 및 IFE가 각각 면역글로불린의 클론 성질을 정량화하고 규명하도록 사용되므로, 이 검정은 치료 동안 사용된 단일클론 항체에 의한 간섭으로 처리된다. 본 발명의 항-이디오타입 항체는 M 단백질을 검출하기 위한 임상 검정 동안 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 이동시키도록 사용될 수 있다.
면역고정 전기영동(IFE)
면역고정 전기영동(IFE)은 당해 분야에 공지되어 있고, 제1 단계에서 아가로스 겔 단백질 전기영동 및 제2 단계에서 면역침전을 이용한 2단계 절차이다. 시편은 임의의 생물학적 샘플일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 시편은 혈청, 뇨 또는 뇌 척추 유체이다. 일 실시형태에서, IFE는 (a) 아가로스 겔에서 전기영동에 의한 단백질의 분리; (b) 전기영동된 단백질의 면역고정(면역침전)의 수행(여기서, 적절한 전기영동된 이동 트랙은 개별 항혈청에 의해 덮이고, 항혈청은 겔로 확산하고 존재할 때 상응하는 항원을 침전시키고, 기준 트랙에서의 단백질은 고정제에 의해 고정됨); (c) 블로팅 및 세척에 의한 겔로부터의 비침전된 가용성 단백질의 제거(여기서, 항원-항체 복합체의 침전소는 겔 매트릭스 내에 포함됨); 및 (d) 염색에 의한 침전된 단백질의 가시화의 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 면역고정 전기영동 공정은 (a) 전기영동된 겔에서 적어도 2개의 적용 부위에 대한 샘플의 적용; (b) 겔의 전기영동; (c) 주형의 전기영동된 겔로의 정렬(주형은 각각의 전기영동된 부위에 상응하는 주형 슬롯을 가짐); (d) 단백질을 고정할 수 있는 조성물을 인시츄로 적어도 하나의 주형 슬롯에 적용하고 하나의 단백질과 반응할 수 있는 항혈청을 남은 주형 슬롯의 적어도 하나에 적용하는 것; (e) 단계 (d)의 생성된 생성물의 항온처리; (f) 항온처리된 전기영동된 겔로부터의 주형의 제거; (g) 단계 (f)의 항온처리된 전기영동된 겔의 세척; (h) 단계 (g)의 세척된 겔의 건조; (i) 단계 (h)의 건조된 겔의 염색; (j) 단계 (i)의 염색된 겔의 탈염색; (k) 단계 (j)의 탈염색된 겔의 건조; 및 (1) 단계 (k)의 건조된 겔의 분석을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플을-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 조성물과 접촉시켜서 복합체를 형성하는 단계; (b) 전기영동 겔을 로딩하고, 면역고정 전기영동에 의해 항-이디오타입 항체와 접촉된 생물학적 샘플과 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 생물학적 샘플에서의 단백질의 이동을 비교하는 단계를 포함하고; 항-이디오타입 항체와 접촉된 생물학적 샘플과 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 생물학적 샘플 사이의 밴드의 이동의 차이는 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체의 존재를 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하기 위해 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 조성물과 접촉시켜서 복합체를 형성하는 단계; (b) 전기영동 겔을 로딩하고, 면역고정 전기영동에 의해 항-이디오타입 항체와 접촉된 생물학적 샘플과 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 생물학적 샘플에서의 단백질의 이동을 비교하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, M-단백질은 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플 및 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플에서의 밴드의 이동 사이의 차이가 없는 경우 검출된다. 몇몇 실시형태에서, M-단백질은 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플 및 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플에서의 밴드의 이동의 부분 이동이 있는 경우 검출된다. 몇몇 실시형태에서, M-단백질은 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플 및 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플에서의 밴드의 이동 사이에 차이가 있는 경우 검출되지 않는다.
몇몇 회사는 하나 이상의 이들 단계를 통합하는 자동화 옵션을 제공한다. 검정은 면역고정 전기영동 검정을 상업화하는 회사에 의해 제공된 설명서에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 검정은 http://www.ilexmedical.com/files/Sebia%20inserts/IF_Standard_mask_Hydrasis.pdf에 기재된 바대로 수행될 수 있다.
III. 키트
본 발명의 검정 방법은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 항-이디오타입 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 키트는 관심 대상의 항체에 대한 항-이디오타입 항체로 이루어진 포획 시약; 관심 대상의 항체에 결합하는 검출 가능한(표지된 또는 비표지된) 항체; 및 이 시약을 사용하여 검정 방법을 수행하는 방법에 대한 설명서의 기본적인 부재를 포함하는 패키징된 조합이다. 이 기본적인 부재는 상기 정의되어 있다.
키트는, 별개의 부재로서 제공될 수 있거나, 포획 시약이 이미 부동화된, 포획 시약에 대한 고체 지지체를 추가로 포함할 수 있다.
그러므로, 키트에서의 포획 항체는 고체 지지체에 부동화될 수 있거나, 이들은 키트와 포함되거나 키트로부터 별개로 제공된 이러한 지지체에 부동화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 고체 재료(예를 들어, 미량역가 플레이트, 비드 또는 빗(comb))에 코팅되거나 부착된다. 검출 가능한 항체는 직접적으로 검출된 표지된 항체 또는 상이한 종에서 키워진 비표지된 항체에 대해 지향된 표지된 항체에 의해 검출된 비표지된 항체일 수 있다. 표지가 효소인 경우, 키트는 효소가 필요로 하는 기질 및 보인자를; 표지가 형광단인 경우, 검출 가능한 발색단을 제공하는 염료 전구체를; 그리고 표지가 바이오틴인 경우, MUG에 의해 HRP 또는 β-갈락토시다제에 접합된 아비딘, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 아비딘을 보통 포함할 것이다.
다양한 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 임의의 항- 이디오타입 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 항-이디오타입 항체는 (a) 서열 번호 54의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체; (b) 서열 번호 56의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 55의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체; (c) 서열 번호 58의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 57의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체 및 (d) 이들의 조합으로부터 선택된다.
키트는 또한 통상적으로 표준품으로서 관심 대상의 항체, 및 다른 첨가제, 예컨대, 안정화제, 세척 및 항온처리 완충제 등을 함유한다.
키트의 성분은 미리 결정된 비율로 제공될 것이고, 다양한 시약의 상대 양은 검정의 민감도를 실질적으로 최대화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공하도록 적합하게 변한다. 특히, 시약은 분해 시 시험되는 샘플과 배합하기에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 사용하여 건조 분말로서 제공되고, 보통 동결건조될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함하는 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법(예를 들어, M-단백질을 검출하는 방법)에서 사용하기 위한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 M-단백질을 검출하는 방법에서 사용하기 위해 빗에 코팅되거나 부착된 항-이디오타입 항체를 추가로 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 자세히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태가 오직 예시적인 목적을 위한 것이고, 이의 견지에서의 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안되고, 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1. 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙에 대한 항- 이디오타입 항체의 생성 및 규명
하이브리도마의 생성.
5마리의 Balb/c 마우스(Charles River Laboratories International, Inc.(미국 매사추세츠주 윌밍턴))를 각각의 뒷 발바닥에서 및 복강내로 3일 내지 4일 간격에서 대사 가능한 스쿠알렌, Tween 80, 트레할로스 6,6-다이마이콜레이트 및 모노포스포릴 지질 A를 함유하는 애쥬번트(모든 성분을 Sigma Aldrich(미국)로부터 얻음) 중에 항-PDL1 항체 아테졸리주맙에 의해 과면역화시켰다. 11 부스트 후, 혈청 역가를 표준 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 평가하여 항-PD-L1 항체에 대한 양의 혈청 역가에 의해 마우스를 확인하였다. 비장 및 슬와 림프절로부터의 B 세포를 전기융합(Hybrimune-Hybridoma Production System; Harvard Apparatus, Inc.(미국 매사추세츠주 홀리스턴))에 의해 마우스 골수종 세포(X63.Ag8.653 또는 P3X63Ag.Ul; 미국 균주 협회(미국 버지니아주 매너서스))와 융합하였다. 10일 내지 14일 후, 하이브리도마 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 CDR 특이적 항체 제조에 대해 스크리닝하였다.
항체 클로닝 및 서열.
재조합 항체 제조에 대한 하이브리도마 세포의 항체 서열을 클로닝하기 위해, 배양된 하이브리도마 세포로부터 단리된 전체 RNA는 항체 가변 영역 증폭에 대한 PCR 주형인 cDNA를 생성하기 위해 사용되었다. PCR에 사용된 올리고는 마우스 V-유전자 및 J-유전자 생식선 서열에 기초한다. PCR 산물을 포유류 발현 벡터에 직접적으로 서브클로닝하기 위해, 플랭킹 벡터 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 5'- 및 3'-말단에서 첨부하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 혼주된 생식선 올리고에 의해 별개로 증폭시키고, PCR 산물을 DNA 겔에서 가시화하여 예상된 크기에서의 단일 밴드(중쇄에 대해 400bp 및 경쇄에 대해 350bp)를 확인시켜주었다.
정제된 중쇄 및 경쇄 PCR 산물을 각각 In-Fusion(Clontech) 키트에 의해 pRK5P-마우스 IgG2a 및 pRK5P-마우스 카파 벡터로 서브클로닝하였다. 결찰 산물의 형질전환 후, 몇몇 단일 콜로니를 DNA 서열분석에 선별하였다. DNA 서열을 IMGT 생식선 데이터베이스로 정렬하고; 공통 서열을 갖는 클론을 선택하고 단백질 발현에 대해 스케일링하였다.
재조합 항체 서열을 확인하기 위해, 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 HEK293T 세포로 일시적으로 동시형질주입하였다. 정제된 재조합 IgG를 규명하고, 하이브리도마 배양물로부터 단리된 IgG와 결합 활성 및 친화도를 비교하였다.
단일클론 항체 105D11, 43B5 및 48C1에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 도 1 및 도 2에 도시된 바대로 결정되었다.
BIAcore에 의한 아테졸리주맙에 대한 항-이디오타입 항체 결합의 규명
항-PDL1 항-ID 항체의 결합 친화도는 BIAcore(상표명)-T2000 기계를 이용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정되었다. 항-이디오타입 항체를 CM5 바이오센서 칩에서 코팅된 항-마우스-Fc 항체에 의해 포획하여 대략 200 반응 단위(RU)를 달성하였다. 동역학 측정을 위해, 500nM의 항-PD-L1 Fab 또는 프레임워크 대조군 Fab(YW167B.43)(Genentech(캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코)를 25℃에서 30㎕/분의 유속에 의해 HBS-P+ 완충제(0.1M HEPES, 1.5M NaCl, 0.5% 계면활성제 P20 - GE Life Science) 중에 주입하였다. 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 단순한 1-대-1 Langmuir 결합 모델(BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)는 비율 k off/k on으로서 계산되었다. 표 2를 참조한다. 또한 도 3 내지 도 5를 참조한다.
Figure pct00002
실시예 2. 면역고정 전기영동 검정에서 사용하기 위한 항- 이디오타입 항체의 스크리닝
아테졸리주맙에 대한 항-이디오타입(항-ID) 항체의 스크린을 Sebia IFE 플랫폼에서 수행하여 아테졸리주맙에 결합하는 항-ID 항체를 확인하고, Sebia IFE 플랫폼에서 깨끗한 '겔 이동'을 발생시킨다. 도 6을 참조한다.
간단히, 샘플을 겔 전기영동에서 사용하기 위한 혈청의 취급, 저장 및 제조를 위해 표준 실험실 절차에 따라 설정하였다. HYDRASYS 장치를 제조사의 가이드라인에 따라 설정하였다. 이동 프로토콜 및 겔 공정처리 설정은 제조사가 기재한 프로토콜에 따라 수행되었다.
아테졸리주맙(1500㎍/㎖)을 PBS 중에 재현탁시키고, 각각의 항-ID 항체 또는 샴 대조군(PBS 단독)과 진탕 플랫폼에서 실온에서 2시간 동안 예비항온처리하였다. 샘플을 Maxikit Hydragel 41F 또는 91F(Sebia(미국 조지아주 노크로스))를 사용하여 반자동 Hydrasys 또는 Hydrasys 2에서 수행되는 전기영동을 이용하여 분리하였다. 이후, 겔의 면역고정(IFE)을 Sebia IFE 프로토콜에 따라 2차 항체, 예컨대, IgG, Ig 카파, Ig 람다, IgA 및/또는 IgM을 사용하여 제조사의 사양에 따라 수행하였다. 결과는 아테졸리주맙이 임상 검정 플랫폼에서 검출 가능하고, 아테졸리주맙과 항-ID의 특정한 복합체가 아테졸리주맙 단독으로부터 분리될 수 있다는 것을 예시한다. 따라서, 항-아테졸리주맙(항-ID) 항체의 첨가 후 IgG/Ig 카파 항체의 전기영동 이동도의 변화는 항체의 식별, 즉 아테졸리주맙의 증거를 제공한다. 도 6을 참조한다. 도 6에 도시된 데이터에 기초하여, 아테졸리주맙과 이들 항체 중 하나의 복합체가 Sebia IFE 플랫폼에서 깨끗한 겔 이동을 나타내므로, 항체 48C1, 105D11 및 43B5를 선택하였다.
혈청 중의 아테졸리주맙의 농도가 증가할 때, 아테졸리주맙의 전기천공 이동도를 변화시키는 항-ID 항체의 능력은 항-ID 항체의 농도 및 항온처리 시간에 따라 달라진다. 도 8을 참조한다. 혈청 중의 아테졸리주맙의 농도가 500㎍/㎖이고, 항온처리 시간이 2시간일 때, 아테졸리주맙:항-ID 항체의 1:1 비율에 의해 아테졸리주맙의 완전한 겔 이동이 관찰되었다. 그러나, 혈청 중의 아테졸리주맙의 농도가 1000㎍/㎖로 증가할 때, 아테졸리주맙:항-ID 항체의 1:4 비율은 아테졸리주맙의 완전한 겔 이동을 발생시키도록 필요하였다. 도 8을 참조한다.
실시예 3. M 단백질의 존재 하의 아테졸리주맙의 검출은 다발성 골수종 환자로부터의 혈청 샘플에서 스파이킹한다
다발성 골수종을 갖는 환자로부터의 인간 혈청 샘플을 사용하였다. 환자의 샘플은 검출 가능한 IgA/Ig 카파 M 단백질이 IFE 후 혈청에서 스파이킹한다는 것을 보여주었다(도 7, 패널 1 레인 A 및 레인 K). 환자의 혈청을 하기 조건에서 30분 내지 2시간 동안 예비항온처리하였다: 1500㎍/㎖에서의 아테졸리주맙 항-ID 항체 48C1 단독(도 7 패널 2), 1500㎍/㎖에서 스파이킹된 아테졸리주맙 단독(도 7, 패널 3) 및 각각 1500㎍/㎖에서의 아테졸리주맙 + 아테졸리주맙 항-ID 항체 48C1(도 7, 패널 4). 면역고정(IFE) 검정을 Maxikit Hydragel 41F 또는 91F(Sebia(미국 조지아주 노크로스))를 사용하여 반자동 Hydrasys 2에서 수행하였다. IFE 검정을 제조사의 사양에 따라 수행하였다. 데이터를 분석하여, 다발성 골수종 환자에서 임상 반응 평가에 일상적으로 사용되는 IFE 검정에서 아테졸리주맙 밴드를 이동시키는 아테졸리주맙 항-ID 항체의 유효성을 결정하였다.
도 7, 패널 2에서, 환자 혈청 샘플을 아테졸리주맙 항-ID 항체와 예비항온처리하였다. 패널 1과 패널 2의 비교는 혈청과 아테졸리주맙 항-ID 항체의 예비항온처리가 환자의 검출 가능한 M-단백질의 결과를 방해하지 않는다는 것을 보여준다.
도 7, 패널 3에서, 환자 혈청 샘플을 1500㎍/㎖의 아테졸리주맙과 예비항온처리하였다. 패널 1의 패널 3과의 비교는 패널 3(화살표 레인 G 및 K)에서 검출 가능한 마이너 밴드의 첨가를 보여준다. 이것은 IgG/Ig 카파 인간 mAB인 큰 생물학적 약물, 예컨대, 아테졸리주맙이 검출 가능하고, 다발성 골수종 환자에서 임상 반응 평가를 위해 일상적으로 사용되는 IFE 검정의 결과를 방해할 수 있다는 것을 확인시켜준다.
도 7, 패널 4에서, 환자 혈청 샘플을 아테졸리주맙 및 아테졸리주맙 항-이디오타입 마우스 mAB 클론 #48C1 둘 다와 예비항온처리하였다. 패널 3과 패널 4의 비교(도 7)는 아테졸리주맙에 의해 스파이킹된 혈청 샘플에 대한 아테졸리주맙 항-이디오타입 마우스 단일클론 항체이 첨가가 항-이디오타입 단일클론 항체 및 아테졸리주맙의 결합 복합체를 생성시켜서, M 단백질 이동을 방해하지 않으면서, IFE 겔에서 더 낮은 분자량으로부터 더 높은 분자량으로 아테졸리주맙 IgG 및 Ig 카파의 검출 가능한 IgG 및 Ig 카파 이동을 생성시킨다는 것을 보여준다(도 7, 패널 4, 레인 G 및 K).
상기 발명이 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 약간 자세히 기재되어 있지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전문이 참고로 명확히 포함된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
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Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> IDIOTYPIC ANTIBODIES AGAINST ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> WO2018/136553 <140> PCT/US2018/014099 <141> 2018-01-11 <150> US 62/447,886 <151> 2017-01-18 <150> US 62/452,934 <151> 2017-01-31 <160> 64 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 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Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 210 215 220 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 245 250 255 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 260 265 270 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 275 280 285 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 290 295 300 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 305 310 315 320 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 370 375 380 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 405 410 415 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 420 425 430 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 61 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 62 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 210 215 220 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 260 265 270 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 355 360 365 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 370 375 380 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 405 410 415 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 420 425 430 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 63 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 64 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 210 215 220 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 245 250 255 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 260 265 270 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 275 280 285 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 290 295 300 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 305 310 315 320 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 370 375 380 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 405 410 415 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 420 425 430 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 435 440 445 Pro Gly Lys 450

Claims (47)

  1. 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체(anti-idiotypic antibody)로서, 상기 항-PD-L1 항체는,
    (a) (ⅰ) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 1)를 포함하는 HVR-L1;
    (ⅱ) 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 2)를 포함하는 HVR-L2; 및
    (ⅲ) 아미노산 서열 QQYLYHPAT(서열 번호 3)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (b) (ⅰ) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH(서열 번호 4)를 포함하는 HVR-H1;
    (ⅱ) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG(서열 번호 5)를 포함하는 HVR-H2; 및
    (ⅲ) 아미노산 서열 RHWPGGFDY(서열 번호 6)를 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및/또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-H1은 아미노산 서열 SYDMS(서열 번호 35)를 포함하고;
    (b) HVR-H2는 아미노산 서열 YISSGGGSTYYPDTVKG(서열 번호 36)를 포함하고;
    (c) HVR-H3은 아미노산 서열 LVYYDYDDAMDY(서열 번호 34)를 포함하고;
    (d) HVR-L1은 아미노산 서열 SASSSVSYMH(서열 번호 14)를 포함하고;
    (e) HVR-L2는 아미노산 서열 STSNLAS(서열 번호 15)를 포함하고;
    (f) HVR-L3은 아미노산 서열 QQRSSYPPTF(서열 번호 16)를 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호 53의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-H1은 아미노산 서열 DYIML(서열 번호 43)을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 아미노산 서열 NINPYYGSTSYNLKFKG(서열 번호 44)를 포함하고;
    (c) HVR-H3은 아미노산 서열 WGGNYEGWFAY(서열 번호 42)를 포함하고;
    (d) HVR-L1은 아미노산 서열 HASQGISSNIG(서열 번호 20)를 포함하고;
    (e) HVR-L2는 아미노산 서열 HGTNLED(서열 번호 21)를 포함하고;
    (f) HVR-L3은 아미노산 서열 VQYAQFPLTF(서열 번호 22)를 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  7. 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호 55의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-H1은 아미노산 서열 SYDMS(서열 번호 51)를 포함하고;
    (b) HVR-H2는 아미노산 서열 YISSGGGSTYYPDTVKG(서열 번호 52)를 포함하고;
    (c) HVR-H3은 아미노산 서열 TIYYGYDDVMDY(서열 번호 50)를 포함하고;
    (d) HVR-L1은 아미노산 서열 SASSSVSYMH(서열 번호 26)를 포함하고;
    (e) HVR-L2는 아미노산 서열 STSNLAS(서열 번호 27)를 포함하고;
    (f) HVR-L3은 아미노산 서열 QQRSGYPPTF(서열 번호 28)를 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  9. 제1항 내지 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 서열 번호 58의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호 57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 상기 항-PD-L1 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합하는, 단리된 항-이디오타입 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항-이디오타입 항체는 비상동성 모이어티 또는 검출 가능한 모이어티에 접합된, 단리된 항-이디오타입 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 검출 가능한 모이어티는 표지(label) 또는 바이오틴인, 단리된 항-이디오타입 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체를 포함하는 조성물.
  14. 제13항의 조성물을 포함하는 키트.
  15. 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-H1은 아미노산 서열 SYDMS(서열 번호 35)를 포함하고;
    (b) HVR-H2는 아미노산 서열 YISSGGGSTYYPDTVKG(서열 번호 36)를 포함하고;
    (c) HVR-H3은 아미노산 서열 LVYYDYDDAMDY(서열 번호 34)를 포함하고;
    (d) HVR-L1은 아미노산 서열 SASSSVSYMH(서열 번호 14)를 포함하고;
    (e) HVR-L2는 아미노산 서열 STSNLAS(서열 번호 15)를 포함하고;
    (f) HVR-L3은 아미노산 서열 QQRSSYPPTF(서열 번호 16)를 포함하는, 단리된 핵산.
  16. 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-H1은 아미노산 서열 DYIML(서열 번호 43)을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 아미노산 서열 NINPYYGSTSYNLKFKG(서열 번호 44)를 포함하고;
    (c) HVR-H3은 아미노산 서열 WGGNYEGWFAY(서열 번호 42)를 포함하고;
    (d) HVR-L1은 아미노산 서열 HASQGISSNIG(서열 번호 20)를 포함하고;
    (e) HVR-L2는 아미노산 서열 HGTNLED(서열 번호 21)를 포함하고;
    (f) HVR-L3은 아미노산 서열 VQYAQFPLTF(서열 번호 22)를 포함하는, 단리된 핵산.
  17. 항-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 항-이디오타입 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-H1은 아미노산 서열 SYDMS(서열 번호 51)를 포함하고;
    (b) HVR-H2는 아미노산 서열 YISSGGGSTYYPDTVKG(서열 번호 52)를 포함하고;
    (c) HVR-H3은 아미노산 서열 TIYYGYDDVMDY(서열 번호 50)를 포함하고;
    (d) HVR-L1은 아미노산 서열 SASSSVSYMH(서열 번호 26)를 포함하고;
    (e) HVR-L2는 아미노산 서열 STSNLAS(서열 번호 27)를 포함하고;
    (f) HVR-L3은 아미노산 서열 QQRSGYPPTF(서열 번호 28)를 포함하는, 단리된 핵산.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 진핵생물인, 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 포유류인, 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포인, 숙주 세포.
  24. 제20항에 있어서, 원핵생물인, 숙주 세포.
  25. 제24항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli)인, 숙주 세포.
  26. 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 항-이디오타입 항체를 코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항-이디오타입 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법.
  27. 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 포획 물질과 접촉시켜서, 면역복합체를 형성하는 단계로서, 상기 포획 물질은 제13항의 조성물인, 상기 면역복합체를 형성하는 단계;
    (b) (a)로부터의 상기 면역복합체를 상기 항-PD-L1 항체에 결합하는 검출 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 검출 가능한 항체를 검출함으로써 상기 조성물에 결합된 항-PD-L1 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  28. 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 포획 물질과 접촉시켜서, 면역복합체를 형성하는 단계로서, 상기 포획 물질은 상기 샘플에 존재하는 항-PD-L1 항체에 결합하는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체인, 상기 면역복합체를 형성하는 단계;
    (b) (a)로부터의 상기 면역복합체를 상기 항-PD-L1 항체에 결합하는 검출 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 검출 가능한 항체를 검출함으로써 상기 항-이디오타입 항체에 결합된 항-PD-L1 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 고체 지지체에 부동화되고, 상기 방법은 상기 항-PD-L1 항체에 결합된 부동화된 항-이디오타입 항체로부터 상기 생물학적 샘플을 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 부동화된 항-이디오타입 항체는 바이오틴에 접합되고, 스트렙타비딘 코팅된 미량역가 플레이트에 결합된, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 인간 또는 인간화된 항체에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체인, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  32. 제28항에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 직접적으로 검출 가능하거나, 겨자무 과산화효소에 접합되거나, 형광분석 또는 열량측정 시약에 의해 검출되는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 단리된, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 인간 대상체는
    (a) (ⅰ) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 1)를 포함하는 HVR-L1;
    (ⅱ) 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 2)를 포함하는 HVR-L2; 및
    (ⅲ) 아미노산 서열 QQYLYHPAT(서열 번호 3)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (b) (ⅰ) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH(서열 번호 4)를 포함하는 HVR-H1;
    (ⅱ) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG(서열 번호 5)를 포함하는 HVR-H2; 및
    (ⅲ) 아미노산 서열 RHWPGGFDY(서열 번호 6)를 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체에 의해 치료되는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 방법은 표준 곡선을 이용하여 상기 항-PD-L1 항체의 공지된 수준과 비교된 상기 항-PD-L1 항체의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청인, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  37. 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 특이적으로 검출하기 위한 면역검정 키트로서,
    (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 제13항의 조성물;
    (b) 상기 항-PD-L1 항체에 결합하는 검출 가능한 항체; 및
    (c) 상기 항-PD-L1 항체를 검출하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  38. 제37항에 있어서, 상기 키트는 상기 항-PD-L1 항체를 검출하기 위한 면역검정에서 유용한, 키트.
  39. 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 제13항의 조성물과 접촉시켜서, 면역복합체를 형성하는 단계;
    (b) 면역고정 전기영동(Immunofixation Electrophoresis)에 의해 상기 샘플을 분석하여서, 상기 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플을 상기 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 생물학적 샘플에서 상기 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 단계로서; 상기 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플과 상기 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플 사이의 이동의 차이는 상기 생물학적 샘플에서 상기 항-PD-L1 항체의 존재를 나타내는, 상기 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 항-PD-L1 항체를 검출하는 방법.
  40. 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 제13항의 조성물과 접촉시켜서, 면역복합체를 형성하는 단계;
    (b) 면역고정 전기영동에 의해 상기 샘플을 분석하여서, 상기 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플을 상기 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 생물학적 샘플에서 M-단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 단계 (b)는 상기 M-단백질로부터 상기 항-PD-L1 항체 및 항-이디오타입 항체의 복합체를 분리시키는, 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하는 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 단계 (c) 전에, 상기 방법은, 이의 이동이 항-이디오타입 항체의 첨가에 의해 영향을 받는지를 결정함으로써, 밴드가 M-단백질인지 또는 아닌지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하는 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 뇨 또는 혈청인, 생물학적 샘플에서 M-단백질을 검출하는 방법.
  44. 대상체에서 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 항-PD-L1 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 제13항의 조성물과 접촉시켜서, 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 상기 대상체 유래이고, 상기 대상체는 다발성 골수종을 갖거나 상기 항-PD-L1 항체에 의해 치료되는, 상기 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 면역고정 전기영동에 의해 상기 샘플을 분석하여서, 상기 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플을 상기 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플과 비교하는 단계;
    (c) 상기 생물학적 샘플에서 상기 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 단계로서; 상기 항-이디오타입 항체와 접촉된 샘플과 상기 항-이디오타입 항체와 접촉되지 않은 샘플 사이의 이동의 차이는 상기 생물학적 샘플에서 상기 항-PD-L1 항체의 존재를 나타내는, 상기 항-PD-L1 항체의 존재를 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 생물학적 샘플에서 M-단백질의 수준을 검출하는 단계로서; 상기 생물학적 샘플에서 M-단백질의 수준은 상기 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 나타내는, 상기 M-단백질의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 모니터링하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 단계 (b)는 상기 M-단백질로부터 상기 항-PD-L1 항체 및 항-이디오타입 항체의 복합체를 분리시키는, 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 모니터링하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 단계 (d) 전에, 상기 방법은, 이의 이동이 항-이디오타입 항체의 첨가에 의해 영향을 받는지를 결정함으로써, 밴드가 M-단백질인지 또는 아닌지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 모니터링하는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 뇨 또는 혈청인, 항-PD-L1 항체 치료의 유효성을 모니터링하는 방법.
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