CN112285366B - 一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用 - Google Patents
一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用，属于化学技术领域。本发明的方法包括以下步骤，1)用抗人hOX40(Fc Tag)抗原包微孔板，得到包被后的微孔板；2)将BsAb和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成抗原‑抗体复合物；3)将hPD‑L1(his Tag)加入所述抗体包被的微孔板中与抗原‑抗体复合物孵育结合，形成抗原‑抗体‑检测抗体复合物；4）将Anti‑His HRP标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原‑抗体‑检测抗体复合物孵育结合，形成抗原‑抗体‑检测抗体‑HRP标记的亲和素复合物，加入底物显色；5)加入终止液终止反应，测定OD值；6)通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。本发明的有益效果是：检测灵敏度高、误差小、特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用，属于化学技术领域。
背景技术
双特异性抗体(BsAb) 是指同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组DNA技术制备实现。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。在抗体的研发过程中，通过药物在血浆中浓度检测来支持pharmacokinetic (PK) 与toxicokinetic(TK) 实验，快速推进项目进展起到非常重要的作用。通常ELISA检测方法有四大类；1)直接ELISA；2) 间接ELISA；3) 夹心ELISA；4) 竞争抑制ELISA。其它都属于这四类的组合衍生。而且是测定单抗浓度。PD-L1/OX4O作为一种双特异性抗体，在生产过程中通常会出现杂物抗体。如果用现有方法，使用的抗体针对目标抗体Fc段，杂质抗体也含有相同的Fc段，如果清洗步骤不彻底，该方法就会产生杂质抗体干扰，从而影响测定定量下线浓度(LLOQ) ，也就是会影响测定不正确性，PK参数计算错误，特别是半衰期计算(T1/2) 。误导给药频率与剂量产生毒性导致药物开发失败。为排除杂质抗体在测定过程中干扰，有必要开发一种新的定量测定血清中双特异性抗体(PD-L1/OX40)的ELISA方法来满足双特异抗体在研发过程中PK与TK血浆样品测定。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用,提高检测灵敏度。
本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种定量测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，包括如下步骤：
1) 用抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原包微孔板，得到包被后的微孔板；
2) 将双特异性抗体和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成“抗原-抗体”复合物；
3) 加入h PD-L1(hisTag) 所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体复合物孵育结合，形成“抗原-抗体-检测抗体”复合物；
4）加入Anti-His HRP 标记的亲和素所述抗体包被的微孔板中与“抗原-抗体-检测抗体”复合物孵育结合，形成“抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素”复合物，加入底物显色；
5) 终止液终止反应，测定OD值；
6) 通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。
本发明通过以下技术方案进一步解决技术问题，上述方法的
步骤1) 中，所述抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原浓度为0.5ug/mL～4ug/mL；优选地，所述抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原浓度为 0.5ug/mL；用抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原包微孔板，得到包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时，放置后的微孔板加入封闭液，并且在37℃孵育2小时；
步骤2) 中，所述己知BsAb抗体浓度配制在混合食蟹猴血清标准曲线范
围，37ng/mL～10000ng/mL；质量控制样品范围37～8000ng/mL。
步骤3) 中，所述h PD-L1(his Tag) 检测抗体浓度为0.5ug/mL～4ug/mL；
优选地，所述hPD-L1 (his Tag) 0.5ug/mL。
步骤4) 中，所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:1000～1:10000；优选地，所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:8000。
步骤4) 中，所述加HRP酶的底物(TMB)入显色时间5～20分钟；优选地，所述TMB底物显色时间8 分钟。
步骤5) 中，所述加入终止液时间5分钟内，在450nm(参比波长620nm) 处用酶标仪测定吸光度值(OD值)。其中，通过BSAB标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度，如下；
已知标准曲线，QC及血清样品中BsAb浓度计算通过Microsoft Excel 2010软件获取BsAb标准曲线浓度对数，然后通过SimaPlot10.0软件分别获取BsAb标准曲线浓度对数作为X和 Y轴制作标准曲线并进行Logistic四参数拟合。
f=D + (A‐D)/(1+10^((x‐logC)*B))，(权重=1/y^2)
获得方程参数后按标准曲线拟合方程(如上)，用Microsoft Excel 2010计算生物样品中的浓度。
进一步地，以上方法的步骤2～4) ；加入样品后，在37℃孵育1小时。所述封闭液为1%BSA/PBS，样品稀释液为0.5%BSA/PBS/0.05% Tween-20 。
本发明进一步提供定量测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法的应用，包括在PD-L1/OX40药物监测，PD-L1/OX40工艺开发以及PD-L1/OX40生产的应用。
根据现在市场现有ELISA的方法，我们通过抗原中Fc Tag与 双抗孵育结合，然后加入带hisTag检测抗体，再加入Anti-His HRP 标记的亲和素，形成抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素复合物，来提高血浆浓度测定灵敏度。并且通过方法学进行了论证。内容包括标准曲线，精密度和准曲度，稀释线性与钩状效应，基质效应与回收率，稳定性。特别是本方法是在食蟹猴的血浆中开发，有益效果是：检测灵敏度高、误差小、特异性高，能够正确、有效地定量PK与TK抗体在血清中浓度，可以用于临床前PK与TK样品，也可以用于临床样品测定(方法微调整) ,缩短项目进程，尽早进入临床阶段,应用范围可扩大至人血清。
附图说明
图1为本发明BsAb在食蟹猴血清中标准曲线图，图中横坐标为标准曲线理论浓度（ng/ml），横坐标为标准曲线测定浓度（ng/ml）。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，具体数值为典型值，而非以任何方式限制本发明的范围。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程、方法和试剂是本领域中公知的常规方法和产品。
名词解释：
AR：Analytical recovery分析回收率
Cal: Calibrator标准曲线
Conc: Concentration浓度
CV: Coefficient of variation变异系数
BSA: Bovine Serum Albumin , 牛血清蛋白
D,d: Day天
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay酶联免疫分析方法
FT: Freeze Thaw冻融
g：Gram or g-force克
H,h,hr：Hour小时
LLOQ：Lower limit of quantification定量下线
ULOQ：Upper limit of quantification定量上线
HQC：High quality control sample高浓度质控样品
ID：Identification识别
kg：Kilogram千克
LQC：Lower quality control sample低浓度质控样品
M：Molar摩尔
m：Minute分钟
mg：Milligram亳克
mL：Milliliter亳升
MQC：Medium quality control sample中浓度质控样品
n：Number of values included in statistics统计数
NA：Not applicable不适用
ng：Nanogram纳克
nM：Nonomolar纳摩
pg：Picogram皮克
QC：Quality control sample质控样品
r2：Correlation Coefficient相关系数
RE/Bias：Relative Error，相对误差；
RT：Room Temperature室温
SD/S.D.：标准差；
uL：Microliter微升
uM: Micromolar微摩
ug: Microgram微克
V,v: Volume体积
W,w: week周
OD: Optical density 光密度
实施例1
如图1与表1-11所示，一种定量测定食蟹猴血清中BsAb的方法，包括以下步骤：
1 实验准备
1.1把恒温培养箱调至37 ℃。
1.2将洗涤液瓶充满洗涤缓冲液，清空废液瓶，冲洗洗板机。
2 实验操作
2.1 包被抗原
将抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原 1mg/mL用1XPBS液稀释至0.5ug/mL。将稀释好
的抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原加入板内，每孔100ul。用封板膜贴好，封严，放置于4℃过夜（≥16h）。
2.2 封闭板
将过夜包被的板用洗板机洗涤PBST(0.05%Tween/PBS) 4次
(300ul/well)。拍尽残液。每孔加入300ul封闭缓冲液(1%BSA/PBS/0.05%Tween20)，用封板膜贴好，封严37℃放置2h。
2.3 标准品标曲点稀释
用100%食蟹猴血清将己知浓度标准品(GQ001)稀释至40ug/ml，以此作为首浓度；然后空白食蟹猴血清稀释到20ug/ml, 然后从20ug/ml分别稀释:10ug/mL，8ug/mL，5ug/mL，3ug/mL，1ugug/mL，0.33ug/mL，0.11ug/mL，0.037ug/ml至0.012ug/ml，包括首浓度在内共10个梯度，末浓度为0.012ug/ml，编号分别为1-10；再用稀释缓冲液将1-10分别稀释100倍，依次标记为C1-C10，另外做阴性对照，即直接用稀释缓冲液将空白食蟹猴血清稀释100倍，编号为C11。标准曲线锚定点分别为；20ug/mL 与0.012ug/mL。
2.4 标准品质控点稀释
将标准品分别用100%空白食蟹猴血清稀释成20ug/ml，然后从20ug/ml分别稀释:10ug/mL，8ug/mL，1ug/mL， 0.1ug/mL，0.037ug/mL，再用稀释缓冲液将以上五个浓度依次分别稀释100倍，编号依次为QC1，QC2，QC3，QC4与QC5。
2.5 加样与孵育样品
将2.3和2.4中稀释好的样品从上至下加入板中，每个浓度2复孔，复孔横向排列,每孔100ul，用封板膜贴好，封严37℃放置2h。用洗板机洗涤4次，拍尽残液。
2.6 检测抗体(hPD-L1-his Tag)
板内加入hPD-L1-his tag检测抗体；用稀释缓冲液稀释至0.5ug/mL，每孔100ul，用。用封板膜封严，37℃放置1h。用洗板机洗涤4次，拍尽残液。
2.7 孵育2抗
板内加入用稀释缓冲液稀释为1:8000(v/v) anti-His-HRP抗体，每孔100ul，。用封板膜封严，37℃放置1h。用洗板机洗涤4次，拍尽残液。
2.8 显色
板内加入TMB底物，每孔100ul，37℃避光反应8min。用1M H2SO4终止反应，每孔100ul，用酶标仪读取吸光值，波长为450nm，参比波长为620nm。
2.9 数据分析与计算
通过Microsoft Excel 2010软件获取标准曲线浓度对数，然后通过SimaPlot10.0软件获取标准曲线浓度对数和OD值平均值作为X和Y轴制作标准曲线并进行Logistic四参数拟合。
f=D + (A‐D)/(1+10^((x‐logC)*B))，(权重=1/y^2)
获得方程参数后按标准曲线拟合方程(如上)，用Microsoft Excel 2010计算浓度。
浓度回算：取复孔的平均OD值，代入标曲后回算出浓度的log值，进而得出回算浓度值。
2.10用空白食蟹猴制备血清样品（标曲、质控）
表 1GQ001在食蟹猴血清中标准曲线
表 2GQ001 在食蟹猴血清中质控
表3 GQ001标准曲线各浓度点的统计结果
*：STD01和STD09作为锚定点，仅做标准曲线拟合使用
表4 准确度与精密度的统计结果
表5 稀释线性
50μg/mL 稀释50 倍后浓度是1000ng/mL
100μg/mL 稀释100 倍后浓度是1000ng/mL
200μg/mL 稀释200与500 倍后浓度分别是1000与400ng/mL
1000μg/mL 稀释1000 与2000倍后浓度分別是1000与500ng/mL。
表6 钩状效应
表7选择性
AR% = Mean Result x 100/Nominal Conc.
表8特异性
AR% = Mean Observed Conc x 100/Nominal Q
表9 冻融稳定性
AR(N)% = Mean Observed Conc x 100/Nominal QC ConC. AR(C)% = Meanobserved concx100/Based on comparison fresh
表10 实验台稳定性
Condition 1：At 22-28ºC three aliquots and analyze for overnight(24h).
Condition 2：At 2-8ºC three aliquots and analyze for overnight (24h).
Condition 3：Pretreated three aliquots and analyze on ice for 1h.
Condition 4：Pretreated three aliquots and analyze on ice for 2h.
Condition 5：Pretreated three aliquots and analyze on ice for 4h.
表11 长期稳定性
AR (N)% = Mean Observed Conc x 100/Nominal QC Conc.
AR(C)% = Mean observed concx100/Based on comparison fresh
本实施例采用以下方法进行结果验证：
根据中国药典对本方法进行方法学验证，内容包括标准曲线、精密度和准确度、稀释线性与钩状效应，基质效应与回收率，稳定性。包括以下步骤：
1 标准曲线、精密度和准确度
1.1 标准曲线
6次不同实验日期3个不同分析员进行的标准曲线之一见图1；实验统计结果见表3；结果表明标准曲线37 ng/mL到10000.00 ng/mL范围内，各浓度点复孔之间重现性好，精密度CV%范围为：4.00% ～ 13.79%；准确度%RE范围为：-9.99% ～4.72%。标准曲线批间的重现性良好。因此该实验方法测定食蟹猴血清中受试品BsAb浓度的LLOQ为37 ng/mL。其线性范围为37 ng/mL ～10000 ng/mL。
1.2精密度和准确度
6次不同实验日期3个不同分析员进行的验证样品数据显示，各级别验证样品的准确度%RE范围为：-6.12 %～3.57 %；板间精密度CV% ≤ 12.42 %。各级别质控样品的总误差（CV%+|%RE|）分别为：15.38 %、12.22 %、13.23 %、16.21 %和10.50 %。实验结果见表4，数据表明使用本方法经不同的实验员，不同日期测定样品，方法的最大误差不超过16.21%。
1.3稀释线性与钩状效应
线性稀释验证样品50，100，200与1000μg/mL，稀释倍数分别为：50μg/mL稀释50倍，100μg/mL稀释100倍，200μg/mL稀释200与500倍，1000μg/mL稀释1000与2000倍。验证结果见表5。结果显示，验证样品按1：50，1：100，1：200，1：500，1：1000与1：2000稀释后，验证样品的AR%分别为108.42%，112.95%，117.04%，117.83%，110.37%与110.81%，因此，对食蟹猴血清样品进行50倍至2000倍稀释后测定，测得浓度乘以稀释倍数后的结果仍可满足可接受标准。
钩状效应，考察1000000，100000，40000，20000和10000ng/mL浓度点OD值的响应，其OD值分别为1.94，1.97，1.92，1.91与1.90，数据表明BSAB在10000～1000000 ng/mL范围内，随浓度的增加未出现OD值降低的现象。实验结果表明BSAB1在10000 ～ 1000000 ng/mL范围内没有出现“钩状”效应。
1.4 选择性
选择性验证主要考察10个个体基质，数据见表7，每个个体基质考察LLOQ（37 ng/mL）与Blank 的2个水平的样品，结果显示，10个个体在Blank中的回算结果均为BQL；在LLOQ水平下，与理论浓度相比的回收率分别为106.21%，93.41%，89.27%，86.39%，97.03%，104.82%，113.38%，91.51%，98.91%，101.74%。
实验结果表明10个个体基质配制的验证样品回算浓度的分析回收率在可接受范围内，即用于稀释未知样品的混合基质能够代表大多个体基质。
1.5 特异性
特异性验证数据见表8。在HQC（8000ng/mL）、LQC(100ng/mL）和Blank（0 ng/mL）验证样品中分别加入200000、20000 ng/mL的人IgG后，HQC水平测得的BsAb的平均回收率分别为85.95%和81.95%，LQC浓度水平测得的BsAb的平均回收率分别为101.62%和103.06%，Blank浓度水平测得的BsAb均为BQL。当食蟹猴血清中分别存在200000和20000 ng/mL的人IgG时，验证样品的分析回收率（AR%）基本符合可接受标准，人IgG对BsAb的测定没有影响。
1.6 冻融稳定性
验证样品的冻融稳定性实验数据见表9，结果表明冻融0次时，HQC（8000 ng/mL）、MQC(1000ng/mL)、LQC（100ng/mL）稳定性样品与理论浓度相比AR%(N)分别为101.65 %，113.57 %和86.94 %。冻融1次时，与理论浓度相比AR%(N)分别为81.90 %，119.08 %和81.59%，与冻融0次相比，AR%(C)分别为80.57 %，104.85 %和93.85 %。冻融2，3，4和5次时，与理论浓度相比AR%(N)分别为93.97 %，109.13 %和83.26 %；88.80 %，88.92 %和79.86 %；93.91%，95.97 %和83.94%；85.40 %，114.80 %和80.70 %，与冻融0次相比，AR%(C)分别为92.45%，96.09 %和95.77 %；87.36%，78.29 %和91.86%；92.39 %，84.51 %和96.56%；84.01%，101.08%和92.83%。
结果显示，血清样品在冻融5次时，冻融因素对结果分析回收率的影响在可接受范围内。
1.7 实验台稳定性
实验台稳定性验证实验主要考察了验证样品于3种实验条件下的稳定性：稀释液预处理质控样品后放置于2～8 ºC1 hr、2hr与4hr，2 ～8 ºC 与22 ～28ºC放置24 hr，验证结果见表10，在2～8 ºC存放24 hr的AR%(N)分别为109.36%、118.76%和87.82 %，AR%(C)分别为100.96 %，105.57%和88.33 %；HQC、MQC 和LQC验证样品在22～28 ºC放置24hr的AR%(N)分别为108.54%、77.98 %和72.71%，AR%(C)分别为100.20%、69.32%和73.13%；稀释液预处理质控样品后，放置2～8 ºC放置1 hr、2hr与4hr，HQC，MQC和LQC的 AR%(N)分别为84.29%，114.96%与102.26%；89.81%，108.51%与109.43%；96.66%，116.78%与98.96%；AR%(C)80.03%，114.80%与91.50%；106.54%，94.39%与97.92%；107.63%，107.62%与88.55%。结果显示，食蟹猴血清验证样品在稀释液预处理质控样品后，于2～8℃放置1 hr、2hr、4hr，测定结果的影响在可接受范围内。样品在2 ～ 8 ºC条件下放置24 hr，对测定结果的影响在可接受范围内。样品在22 ~ 28 ºC条件下放置24 hr，对测定结果的影响不在接受范围内。
1.8 长期稳定性
长期稳定性主要考察验证样品在-10～ -30 ºC以及-60～ -80 ºC条件下的稳定性，确保生物样品经此条件保存后的可靠性。长期稳定性验证结果见表11。
HQC，MQC与LQC稳定性样品在-10～-30 ºC 与-60～-80 ºC保存0 day的AR%分别为108.32 %，112.49 %和99.42 %。
HQC，MQC与LQC稳定性样品-10～-30 ºC保存15 天的AR(N) %分别为109.36 %，105.75 %和97.27 %，AR (C) %分别93.77 %，95.74 %和97.84 %。
HQC，MQC与LQC稳定性样品在-60～-80 ºC保存15天的AR(N)%分别为116.63 %，110.45 %和97.74 %，AR (C)%分别107.67 %，98.18 %和98.31 %。
HQC，MQC与LQC稳定性样品在-10～-30 ºC 与-60～-80 ºC保存0 day的AR%分别为93.68 %、116.19 %和93.92 %。
HQC，MQC与LQC稳定性样品在-10～-30 ºC保存29天的 AR(N) %分别为99.09，119.13和80.76，AR (C) %分别105.78 %，112.65 %和85.98 %。
HQC，MQC与LQC稳定性样品-60～-80 ºC保存29天的AR(N) %分别为104.65 %，114.02 %和88.01 %，AR (C) %分别111.71 %，98.13 %和93.71 %。
结果显示，样品-10 ～ -30 ºC以及-60 ～ -80 ºC条件贮藏15天与29天对样品的测定结果的影响在可接受范围内。
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (15)
1.一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于:包括以下步骤，
1) 用抗人hOX40-Fc Tag抗原包被微孔板，得到包被后的微孔板；
2) 将BsAb和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成抗原-抗体复合物；
3) 将hPD-L1-hisTag 加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体复合物孵育结合，形成抗原-抗体-检测抗体复合物；
4）将Anti-His HRP 标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体-检测抗体复合物孵育结合，形成抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素复合物，加入底物显色；
5) 加入终止液终止反应，测定OD值；
6) 通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。
2.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤1) 中，所述抗人hOX40-Fc Tag抗原浓度为0.5ug/mL～4ug/mL，包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时；在放置后的微孔板中加入封闭液，并且在37℃孵育2小时。
3.根据权利要求2所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：所述抗人hOX40 -Fc Tag抗原浓度为 0.5ug/mL，所述封闭液为1%BSA/PBS。
4.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤2) 中，所述BSAB抗体浓度为混合食蟹猴血清标准曲线范围，37ng/mL～10000ng/mL；质量控制样品范围为37～8000ng/mL。
5.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤3) 中，所述h PD-L1-his Tag检测抗体浓度为0.5ug/mL～4ug/mL。
6.根据权利要求5所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：所述hPD-L1 -his Tag 检测抗体浓度为0.5ug/mL。
7.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤4) 中，所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:1000～1:10000。
8.根据权利要求7所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:8000。
9.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤4) 中，加入HRP酶的底物TMB显色时间5～20分钟。
10.根据权利要求9所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于： TMB底物显色时间8 分钟。
11.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤5) 中，所述加入终止液时间5分钟内，在450nm、参比波长620nm 处用酶标仪测定吸光度值(OD值)。
12.根据权利要求11所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：计算时，已知标准曲线，QC及血清样品中BSAB浓度计算通过Microsoft Excel 2010软件获取BSAB标准曲线浓度对数，然后通过SimaPlot10.0软件分别获取BSAB标准曲线浓度对数作为X和 Y轴制作标准曲线并进行Logistic四参数拟合，标准曲线拟合方程如下，
f=D + (A‐D)/(1+10^((x‐logC)*B))，权重=1/y^2
获得方程参数后计算生物样品中的浓度。
13.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤2）-4）中，在加入样品后，于37℃孵育1小时。
14.根据权利要求13所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：样品稀释液为0.5%BSA/PBS/0.05% Tween-20 。
15.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法的应用，包括在PD-L1/OX40药物监测，PD-L1/OX40工艺开发以及PD-L1/OX40生产中的应用。
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