CN107406505A - 用于治疗疾病的针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗疾病的针对CD3c和BCMA的双特异性抗体。本发明提供了确定患者对这样的治疗的应答性的方法并涉及诊断测定。

Description

用于治疗疾病的针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体
本发明涉及用于治疗疾病的针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体。本发明提供了确定患者对这样的治疗的应答的方法和有关的诊断测定。
背景技术
人B细胞成熟靶标，也被称作BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223)，是在分化的浆细胞中优先表达的肿瘤坏死受体超家族的一个成员[Laabi等人. 1992;Madry. 1998]。BCMA是一种非糖基化的III型跨膜蛋白，其参与B细胞成熟、生长和存活。BCMA是TNF超家族的两个配体的受体：APRIL (诱导增殖的配体)，其为BCMA的高亲和力配体；和B细胞活化因子BAFF，其为BCMA的低亲和力配体(THANK、BlyS、B淋巴细胞刺激物、TALL-1和zTNF4)。APRIL和BAFF显示结构相似性和重叠但不同的受体结合特异性。负调节物TACI也结合BAFF和APRIL。APRIL和BAFF与BCMA和/或TACI的协同结合激活转录因子NF-κB并增加促存活(pro-survival)的Bcl-2家族成员(例如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1)的表达和促细胞凋亡因子(例如Bid、Bad、Bik、Bim等)的下调，因此抑细胞凋亡并促进存活。该组合作用促进B细胞分化、增殖、存活和抗体产生(如在Rickert RC等人, Immunol Rev(2011) 244 (1): 115-133中所综述的)。
Novak AJ等人. BLOOD, 103, (2004) 689-694涉及BCMA、TACI和BAFF-R在多发性骨髓瘤细胞上的表达和生长机制。Li等人, Med Oncol 27 (2010) 439-445提及，BCMA在浆细胞上表达。Dispenzieri等人, Mayo Clin Proc 82(3), (2007), 323-341涉及基于骨髓瘤的Mayo分层和风险适应的疗法(Mayo Stratification of Myeloma and Risk-AdaptedTherapy, mSMART)来治疗多发性骨髓瘤。Schaumann D. (论文, 柏林2006)报告称，已经发现BCMA是长寿浆细胞的存活所必需的，并且长寿浆细胞是自身免疫疾病中的效应细胞，也参见O'Connor等人, J Exp Med. 199, (2004) 91-98。WO2012143498涉及多发性骨髓瘤(MM)患者的分层方法。WO 200932058涉及预测个体具有与自身免疫活性有关的病症(诸如系统性红斑狼疮SLE)的可能性。
Sanchez E, 等人, Br J Haematology 158, 727-38 (2012)和WO2014089335报告称，BCMA浓度在经培养的来自多发性骨髓瘤(MM)患者的骨髓单核细胞的上清液中比在健康受试者中更高，并且提示，血清BCMA水平可以是用于监测MM患者的疾病状态和总存活率的生物标志物。
T淋巴细胞的TCR/CD3复合物由在细胞表面处与CD3标记的γ(γ)、δ(δ)、ε(ε)、ζ(ζ)和η(η)的不变亚基共表达的TCRα(α)/β(β)或TCRγ(γ)/δ(δ)异源二聚体组成。人CD3ε描述于UniProt P07766 (CD3E_HUMAN)之下。在现有技术中描述的一种抗CD3ε抗体是SP34(Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100)。SP34与灵长类动物和人CD3反应。SP34可以从PharMingen获得。在现有技术中描述的另一种抗CD3抗体是UCHT-1(参见WO2000041474)。在现有技术中描述的另一种抗CD3抗体是BC-3 (Fred HutchinsonCancer Research Institute；用在GvHD的I/II期试验中, Anasetti等人,Transplantation 54: 844 (1992))。
在最近过去的几年中，已经开发了多种重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域(参见Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16)。
针对BCMA的抗体描述于例如Gras M-P. 等人. Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106、WO200124811、WO200124812、WO2010104949和WO2012163805中。针对BCMA的抗体及其用于治疗淋巴瘤和多发性骨髓瘤的用途在例如WO2002066516和WO2010104949中提及。WO2013154760涉及包含BCMA识别部分和T-细胞活化部分的嵌合抗原受体(CAR)。Ryan, MC等人, Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018涉及BCMA对浆细胞恶性肿瘤的靶向和BCMA在多发性骨髓瘤细胞(MM细胞)的表面上的表达。在WO2007117600、WO2009132058、WO2012066058、WO2012143498和WO2013072415、WO2014122143和WO2014122144中提及针对CD3和BCMA的双特异性抗体。WO2013072406和WO2014140248在某些附图和实施例中提及E:T比率；但是，它仅仅报道称，在各个杀死测定实验中，对1个靶细胞(非患者样品的细胞系)使用10个效应细胞。因此，该E:T比率是人为的，而没有显示在骨髓瘤患者骨髓样品中的任何E:T比率或给出关于E:T比率与抗体治疗的关系的任何暗示。
WO2012143498提及一种用于多发性骨髓瘤(MM)患者的分层、诊断或选择基于抗体的多发性骨髓瘤(MM)疗法的方法，条件是恶性B-细胞在它们的表面上表达BCMA蛋白。
需要对患有涉及浆细胞的障碍的患者的改进的疗法。
发明内容
T-细胞双特异性抗体是通过活化在靶细胞附近紧邻处的T细胞有效地杀死例如靶细胞的有效化合物。可以依赖性地施用T-细胞双特异性抗体以杀死这些浆细胞，所述T-细胞双特异性抗体结合BCMA，例如在恶性浆细胞(在多发性骨髓瘤细胞的情况下)或分泌抗核抗体的浆细胞(在系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎的情况下)的表面上的BCMA。本发明人已经认识到某些正在影响浆细胞的杀死的参数。这些参数是通过适当的流式细胞计量术方法测量的BCMA表达的量级、某些浓度的可溶性BCMA的存在、T细胞与恶性浆细胞的比率和某些浓度的可溶性BCMA配体APRIL的存在。本发明人的发现为例如治疗医师提供了一个重要指导以给个别患者定制使用BCMA-T-细胞双特异性抗体的疗法，并且本发明人的发现还提供了试验试剂盒测量所述参数的科学基础。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA (另外还称作“BCMA”)的细胞外结构域和人CD3ε(另外还称作“CD3”)的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，且由此在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中，所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，所述障碍的特征在于，在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中，所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
优选地，本发明涉及一种用于根据本发明的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体和所述抗-BCMA抗体对于BCMA结合而言是单价的。优选地，所述抗-BCMA抗体(所述双特异性抗体的部分)的Kd值是100nM或更低。
优选地，本发明涉及一种用于根据本发明的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体和所述抗-BCMA抗体对于BCMA结合而言是二价的。
优选地，本发明涉及一种用于根据本发明的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体和所述抗-BCMA抗体对于BCMA结合而言是三价的。
优选地，本发明涉及一种用于根据本发明的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含与所述抗-BCMA抗体相同的氨基酸序列的CDR作为它的重链和轻链CDR。
优选地，本发明涉及一种用于根据本发明的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含与所述抗-BCMA抗体相同的氨基酸序列的可变区作为它的重链和轻链可变区。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，由此在所述患者的分离体液样品中T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高。优选地，将E:T比率测量为CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率，优选地测量为CD45+ CD19- CD56- T细胞的CD3+细胞子集与CD138+ CD38+ CD45+CD19- CD56+细胞的比率。如果所述患者患有多发性骨髓瘤，这样的靶细胞因此是多发性骨髓瘤细胞。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，所述障碍的特征在于，在所述患者的分离体液样品中T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1或更高，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，优选10:1或更高，且优选0.35: 1至22: 1。发现可以有效地处理其样品的患者的样品中所见的E:T比率为0.35和更高。分别试验了具有0.35: 1至11:1之间的E:T比率的样品。还在患者样品中检测到高达22:1的E:T比率(未试验)。基于这些发现，本发明人认识到，用根据本发明的双特异性抗体也可以有效地治疗含有这样的样品或者含有具有甚至更高E:T值的样品的患者。优选地，将E:T比率测量为CD3+细胞与CD138+CD38+细胞的比率，优选地测量为CD45+ CD19- CD56- T细胞的CD3+细胞子集与CD138+ CD38+CD45+ CD19- CD56+细胞的比率。如果所述患者患有多发性骨髓瘤，这样的靶细胞因此是多发性骨髓瘤细胞。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离体液样品，
ii) 测量所述样品中可溶性BCMA的量，和
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和
iv) 如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么用所述双特异性抗体以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表治疗所述患者。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，所述障碍的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，特征在于，以1.5倍直到10倍的每周剂量执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔与标准剂量相比从每周1次施用缩短至每天一次。优选地，以相对于标准剂量为1.5倍直到2.0倍的每周一剂执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。优选地，以相对于标准剂量从每周1次施用缩短至每周2次的剂量施用之间的时间间隔执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
本发明涉及一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离体液样品，
ii) 测量所述样品中可溶性BCMA的量，和
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和
iv) 如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么以对于第一剂量而言更高的剂量或以更频繁的治疗时间表使用所述双特异性抗体治疗所述患者，所述治疗时间表具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间更短的时间段或具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第三剂量之间更短的时间段。
本发明涉及一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离包含浆细胞和T细胞的体液样品，
ii) 测量所述样品中APRIL的量，和
iii) 如果所述患者样品中APRIL的量超过100 ng/mL，那么用所述双特异性抗体以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表治疗所述患者。
本发明涉及一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，所述障碍的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，APRIL的量高于10 ng/mL和高达100 ng/mL，其特征在于，相对于标准剂量，每周以1.5倍直到20倍的剂量执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短直到每天1次。优选地，相对于标准剂量，以1.5倍直到3.0倍的每周一剂执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。优选地，相对于标准剂量，以从每周1次施用缩短直到每周3次的剂量施用之间的时间间隔执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
本发明涉及一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离包含浆细胞和T细胞的体液样品，
ii) 测量所述样品中APRIL的量，和
iii) 如果所述患者样品中APRIL的量超过100 ng/mL，那么相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，在以下剂量用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100 ng/mL的APRIL浓度，以高2倍的剂量治疗；和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
本发明涉及一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，所述障碍的特征在于，在所述患者的包含浆细胞和T细胞的分离体液样品中，APRIL的量超过100 ng/mL，其特征在于，相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，在以下剂量用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100 ng/mL的APRIL浓度，以高2倍的剂量治疗；和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
优选地通过使用ELISA方法测量APRIL的量。
本发明涉及一种确定患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的BCMA蛋白表达的方法，所述方法包括：
通过使用意图用于治疗所述患者的抗-BCMA抗体测量所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，和通过流式细胞计量术确定相对中值或平均荧光强度MFI是否比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
本发明涉及一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，所述方法包括：
通过使用意图用于治疗所述患者的抗-BCMA抗体针对所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达来分析来自所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，并且如果相对中值或平均荧光强度MFI比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，那么用所述双特异性抗体治疗所述患者。
优选地，本发明涉及选择对于患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划，且由此所述患者的分离体液样品表现出的关于BCMA的MFI比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
本发明涉及一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，其中在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中，并且通过使用抗-BCMA抗体测量，比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多的细胞表面BCMA表达预示患者对所述治疗做出应答的可能性，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
本发明涉及一种确定分离体液样品中的细胞表面BCMA表达的体外方法，所述方法包括使用抗-BCMA抗体确定所述CD138+ CD38+细胞的相对中值或平均荧光强度MFI是否比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
本发明涉及一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，由此对于所述患者：
使用抗-BCMA抗体测量的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的细胞表面BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高100或更多、优选200或更多、甚至更优选300，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，由此所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体。
本发明涉及一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果使用抗-BCMA抗体测量的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的细胞表面BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果使用抗-BCMA抗体测量的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的细胞表面BCMA表达在作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线以上小于100、优选小于50、甚至优选小于10，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，那么不用所述治疗性抗体治疗所述患者。
本发明涉及一种用于确定在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35:1，优选0.5:1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高的方法。
本发明涉及一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，所述方法包括分析在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35: 1、优选0.5:1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高。
优选地，本发明涉及选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率。
优选地，本发明涉及选择对于患者最有效的治疗计划，由此：
i) 如果所述患者的体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率为0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高，那么在单一疗法中用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体治疗所述患者
ii) 如果所述患者的体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率低于0.5: 1，优选低于0.25: 1，那么与T-细胞增殖疗法或T-细胞化学引诱物疗法联合地用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体治疗所述患者。
本发明涉及一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，其通过测量在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高，这预示患者对治疗做出应答的可能性。
本发明涉及一种确定在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高的体外方法。
本发明涉及一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，由此在所述患者的分离体液样品中确定CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率为0.35: 1，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高，并且由此所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体。
本发明涉及一种为患有涉及浆细胞的障碍的患者选择使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率为0.35:1，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率低于0.35: 1，优选0.5: 1，优选低于0.25: 1，那么与T-细胞增殖疗法或T-细胞化学引诱物疗法联合地用特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体治疗所述患者。
本发明涉及一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的方法。
本发明涉及一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，所述方法包括确定所述体液样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高，优选10 ng/mL或更高，更优选50ng/mL或更高，甚至更优选250 ng/mL或更高。
优选地，本发明涉及选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多的对BCMA的MFI。本发明涉及一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，其中所述体液样品中2.5 ng/mL或更高、优选10ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的可溶性BCMA的量预示所述患者对治疗做出应答的可能性。
本发明涉及一种在分离体液样品中确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的体外方法。
优选地，本发明涉及选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的可溶性BCMA的量。
本发明涉及一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，所述方法包括确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高，且所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体。
本发明涉及一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果所述样品中可溶性BCMA的量低于2.5 ng/mL，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，并且
如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA不结合所述双特异性抗体，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，优选10 ng/mL或更高，更优选50 ng/mL或更高，甚至更优选250 ng/mL或更高，并且
如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么用所述双特异性抗体以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表治疗所述患者。
优选地，本发明涉及一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果所述样品中可溶性BCMA的量低于2.5 ng/mL，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，并且
如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA不结合所述双特异性抗体，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，优选10 ng/mL或更高，更优选50 ng/mL或更高，甚至更优选250 ng/mL或更高，并且如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么以对于第一剂量而言更高的剂量或以更频繁的治疗时间表，使用所述双特异性抗体治疗所述患者，所述治疗时间表具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间更短的时间段或具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第三剂量之间更短的时间段。
本发明涉及一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高的方法。
本发明涉及一种用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者并诊断在所述患者的分离体液样品中的可溶性APRIL的量为100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高的方法。
优选地，本发明涉及选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高的可溶性APRIL的量。
本发明涉及一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，其中所述样品中100 ng/mL、优选1000 ng/mL或更高的可溶性APRIL的量预示所述患者对治疗做出应答的可能性。
本发明涉及一种在分离体液样品中确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为100ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高的体外方法。
本发明涉及一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，其通过确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高，且所述治疗计划包括使用APRIL竞争性的双特异性抗体或APRIL非竞争性的双特异性抗体。
本发明涉及一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 所述样品中可溶性APRIL的量是100 ng/mL或更低、优选20 ng/mL或更低，用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 所述样品中可溶性APRIL的量是100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高，用APRIL非竞争性的双特异性抗体治疗所述患者，或者
iii) 所述样品中可溶性APRIL的量高于100 ng/mL、优选1000 ng/mL或更高，用所述双特异性抗体以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表治疗所述患者。
优选地，本发明涉及一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 所述样品中可溶性APRIL的量是100 ng/mL或更低、优选20 ng/mL或更低，用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii)所述样品中可溶性APRIL的量是100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高，用BCMA配体竞争性的双特异性抗体治疗所述患者，或者
iii) 如果所述患者样品中APRIL的量超过100 ng/mL，那么相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，如下用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100ng/mL的APRIL浓度，以高2倍的剂量治疗；和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
本发明涉及一种用于确定对于患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的方法。
本发明涉及一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者确定治疗计划的方法，所述方法包括：
利用至少一种研究方法，提供所述新患者的BCMA相关的浆细胞状态；
利用至少一种方法的结果，搜索具有至少一种类似表现的患有相同障碍的先前患者的先前治疗计划；和
评论所述先前患者的先前治疗计划，以确定基于至少一个先前治疗计划中的信息如何改进所述新患者的治疗。
本发明涉及一种用于诊断和治疗患者中涉及浆细胞的障碍的方法，所述方法包括，根据本发明在所述患者的分离体液样品中分析CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达，其中如果所述BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，那么诊断所述患者具有所述疾病，并且将使用根据本发明的双特异性抗体的治疗施用给被诊断的患者。
本发明涉及一种用于诊断和治疗患者中涉及浆细胞的障碍的方法，所述方法包括，在分离的体液样品中分析T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)，其中如果所述比率是0.35: 1、优选0.35: 1、优选0.5: 1或更高，那么诊断所述患者具有所述疾病，并且将使用根据本发明的双特异性抗体的治疗施用给被诊断的患者。
本发明涉及一种用于诊断和治疗患者中涉及浆细胞的障碍的方法，所述方法包括，根据本发明在患者的分离体液样品中分析可溶性BCMA的量，其中如果所述可溶性BCMA是2.5 ng/mL或更高，且所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么诊断所述患者具有所述疾病，并且以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表将使用根据本发明的双特异性抗体的治疗施用给被诊断的患者。
本发明涉及一种用于诊断和治疗患者中涉及浆细胞的障碍的方法，所述方法包括，根据本发明在患者的分离体液样品中分析可溶性BCMA的量，其中如果所述可溶性BCMA是2.5 ng/mL或更高，且所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么诊断所述患者具有所述疾病，并且以对于第一剂量而言更高的剂量或以更频繁的治疗时间表进行使用根据本发明的双特异性抗体的对被诊断的患者施用的治疗，所述治疗时间表具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间更短的时间段或具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第三剂量之间更短的时间段。
本发明涉及一种用于诊断和治疗患者中涉及浆细胞的障碍的方法，所述方法包括，根据本发明在患者的分离体液样品中分析APRIL的量，其中如果APRIL的量超过100 ng/mL，那么诊断所述患者具有所述疾病，并且以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表使用所述双特异性抗体，来进行使用根据本发明的双特异性抗体的对被诊断的患者施用的治疗，所述双特异性抗体与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化。
本发明涉及一种用于诊断和治疗患者中涉及浆细胞的障碍的方法，所述方法包括，根据本发明在包含浆细胞和T细胞的患者的分离体液样品中分析APRIL的量，其中如果APRIL的量超过100 ng/mL，那么诊断所述患者具有所述疾病，并且如下使用根据本发明的双特异性抗体进行使用所述双特异性抗体的对被诊断的患者施用的治疗：相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，在100 ng/mL的APRIL浓度以高2倍的剂量治疗，和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL则以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗，所述双特异性抗体与APRIL竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
优选地，所述疾病(障碍)选自多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎。
优选地，在诊断性抗体和治疗性抗体之间的价态应当是类似的(例如用于BCMA确定的单价抗体将用于关于BCMA抗体疗法的患者分层，其单价结合恶性细胞上的肿瘤靶标诸如基于scFV的BiTE分子)。甚至更优选地使用用于BCMA确定的BCMA抗体，其与BCMA抗体疗法的BCMA结合剂相同。
优选地，在亲和力方案表面等离子体共振测定中，在有500 nM或更低浓度的人BCMA Fc融合体存在下，在25 nM的抗体浓度测得，所述双特异性抗体对人BCMA的亲和力是200 nM或更低。
优选地，在重新定向的T-细胞杀死的LDH释放测定中，在人PBCM和H929细胞(在10:1的E:T比率)存在下24h，当以100 nM和更低的浓度使用时，所述双特异性抗体的杀死BCMA-阳性的H929细胞(ATCC CRL-9068)的效能(EC50)被测量为2 nM或更低。
优选地，在亲和力方案表面等离子体共振测定中，在500 nM或更低浓度的人BCMAFc融合体存在下，在25 nM的抗体浓度，在人IgG1类型的抗体中测得的所述BCMA结合部分对人BCMA的亲和力是200 nM或更低。
优选地，根据本发明的抗体进一步特征在于，它也特异性地结合食蟹猴BCMA。
优选地，包含IgG1亚类的恒定重区域CH2/CH3的根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含突变L234A、L235A和P239G (根据Kabat编号)以避免FcR和C1q结合和使ADCC/CDC最小化。优点是，本发明的这样的抗体纯粹通过T-细胞重新定向/活化的强力机制来介导它的肿瘤细胞杀死效力。避免额外作用机制如对补体系统和对表达FcγR的效应细胞的影响，并减小副作用的风险。
优选地，根据本发明的抗体的特征在于，在每周2次或每周1次静脉内地(i.v.)或皮下地(s.c.)或腹膜内地(i.p.)施用的1 mg/kg体重(BW)的剂量，优选地在每周2次或每周1次静脉内地或腹膜内地或皮下地施用的0.5 mg/kg BW，优选地在每周2次或每周1次静脉内地或腹膜内地或皮下地施用的0.1 mg/kg BW，优选地在每周2次或每周1次静脉内地或腹膜内地或皮下地施用的0.05 mg/kg BW，优选地在每周2次或每周1次静脉内地或腹膜内地或皮下地施用的0.01 mg/kg BW，优选地在每周2次或每周1次静脉内地或腹膜内地或皮下地施用的5µg/kg BW，在多发性骨髓瘤异种移植物模型(例如含有NCI-H929细胞或RPMI8226细胞或U266B1细胞或L-363细胞的异种移植物)中表现出超过70%、优选地超过85%、优选地接近100%的肿瘤生长抑制。
优选地，根据本发明的抗体的特征在于在小鼠、优选食蟹猴中长于24小时、优选3天或更长的消除半衰期，优选地针对在每周2次或1次施用时在异种移植物模型中有效的剂量来测量半衰期。
结合肿瘤细胞上的靶标并结合CD3且具有分子形式(scFv)2的双特异性抗体具有1-4小时的非常短的消除半衰期。在使用(scFv)2双特异性的CD19xCD3抗体博纳吐单抗(blinatumomab)的临床试验中，该化合物必须经由患者携带的泵施用数周和数月(Topp等人. J Clin Oncol 2011; 29(18): 2493-8)。与每周2次或每周1次静脉内或皮下施用相比，经由泵施用的治疗对于患者而言不方便得多，并且风险(例如泵的故障，关于导管的问题)也高得多。
优选地，根据本发明的抗体的特征在于显示出500 nM或更低的关于结合NCI-H929细胞(ATCC®CRL-9068™)的EC50值，优选350 nM或更低的EC50值，优选100 nM和更低的EC50值。
优选地，根据本发明的抗体的特征在于它在人T细胞存在下以低于1 nM、优选0.5nM、优选0.1 nM和更低的EC50诱导NCI-H929肿瘤细胞的重新定向杀死的能力。
优选地，根据本发明的双特异性抗体的特征在于它在人T细胞存在下诱导多发性骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞的重新定向杀死的能力。
本发明的另一个实施方案是一种试剂盒，其包含根据本发明的诊断性抗-BCMA抗体和针对BCMA和CD3的治疗性双特异性抗体。
本发明的另一个实施方案是一种试剂盒，其包含抗-BCMA抗体和针对BCMA和CD3的双特异性抗体和使用说明书，尤其是关于如何执行本发明的方法的说明书，其特征在于，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。优选地，所述抗-BCMA抗体和所述针对BCMA和CD3的双特异性抗体都是单价的、二价的或三价的，且优选地具有相同的CDR或VH和VL序列。
所述试剂盒包含至少一个容器和在所述容器上或伴随所述容器的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。所述容器可以具有用于抽取治疗剂的无菌接入端口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的瓶)。所述标签或包装说明书可以指示，所述组合物用于治疗MM、SLE、RA或另一种涉及浆细胞的障碍。
另外，所述试剂盒还可以包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
优选地，所述试剂盒包含；
1) 为了确定细胞表面BCMA表达：管形瓶或试管，其预装载了标记的抗体(优选地四种抗体，一种特异性地结合CD138，一种特异性地结合CD38，一种特异性地结合CD19，和一种特异性地结合BCMA (具有根据本发明的性能))以确定恶性PC上的BCMA；含有同种型对照抗体的试管；
2) 为了确定E:T比率：管形瓶或试管，其预装载了标记的抗体以检测恶性PC和T细胞(优选地四种抗体，一种特异性地结合CD138，一种特异性地结合CD38，一种特异性地结合CD19，和一种特异性地结合CD3)；含有同种型对照抗体的试管；
3) 为了确定可溶性BCMA：ELISA试剂盒，其包含微滴定板、捕获抗体(多克隆BCMA抗体)、生物素缀合的检测抗体(特异性地结合BCMA (具有根据本发明的性能))、经质量校准的标准品、抗生蛋白链菌素-HRP或抗生蛋白链菌素-ALP，详细方案、PBS、洗涤缓冲液-0.05% Tween 20/PBS (pH 7.2-7.4)，试剂稀释剂1 - 1% BSA5/PBS，底物溶液 - 颜色试剂A (H2O2)和颜色试剂B (四甲基联苯胺)的1:1混合物，终止溶液- 2 N H2SO4；
4) 为了确定可溶性APRIL：ELISA试剂盒，其包含微滴定板、捕获抗体(抗-人APRIL抗体)、生物素缀合的检测抗体(抗-人APRIL抗体)、经质量校准的标准品、抗生蛋白链菌素-HRP或抗生蛋白链菌素-ALP，详细方案、PBS、洗涤缓冲液- 0.05% Tween 20/PBS (pH 7.2-7.4)，试剂稀释剂1 - 1% BSA5/PBS，底物溶液-颜色试剂A (H2O2)和颜色试剂B (四甲基联苯胺)的1:1混合物，终止溶液- 2 N H2SO4。
附图说明
图1：通过流式细胞计量术检测的和由相对平均或中值荧光强度定义的在患者恶性浆细胞上的BCMA表达。通过流式细胞计量术(MFI)检测的在患者骨髓瘤细胞上的(A) 中-高BCMA表达、(B) 中BCMA表达和(C) 低BCMA表达的代表性FACS直方图。与阴性对照(在T细胞上门控的APC-缀合的BCMA-1抗体)相比，存在在x轴上向右的明显偏移，其对应于患者骨髓瘤细胞上的阳性BCMA表达。基于相对MFI值，骨髓瘤患者在他们的恶性浆细胞上表达BCMA，但是BCMA表达从低表达(相对MFI值< 103)变至中表达(103 - 0.3 x 104)变至中-高表达(0.3 x 104 - 104) (参见实施例1.1)。
图2：在靶细胞表面上的BCMA表达影响BCMA-TCB的杀死效能：表达BCMA高的H929相对于表达BCMA中/低的U266骨髓瘤细胞。当在头对头(head-to-head)对比中执行时，BCMA-2-TCB诱导表达BCMA高的H929骨髓瘤细胞的杀死，具有115 pM的EC50和60%的最大杀死，而相同的BCMA-TCB抗体仅能够杀死表达BCMA中/低的U266骨髓瘤靶细胞，具有370 pM的EC50和18%的最大杀死(参见实施例1.3)。
图2.1：试验并对比了BCMA-1-TCB的诱导表达BCMA的骨髓瘤细胞系(表达BCMA高的H929、表达BCMA中/低的L363和表达BCMA低的RPMI-8226 MM细胞)的杀死的效能。当在头对头对比中执行时，BCMA-1-TCB诱导(A) 表达BCMA高的H929骨髓瘤细胞的杀死，具有8.49 pM的EC50和82.8%的最大杀死，而相同的BCMA-1-TCB抗体仅能够杀死(B) 表达BCMA中/低的L363骨髓瘤靶细胞，具有12.6 pM的EC50和67.1%的最大杀死，或(C) 表达BCMA低的RPMI-8226，具有229.3 pM的EC50和28.1%的最大杀死(实施例1.3)。
图3：通过流式细胞计量术检测的和由相对平均或中值荧光强度定义的在人骨髓瘤细胞系上的BCMA表达。
图4：通过磷酸化-流式细胞计量术(phosphoflow cytometry)检测的APRIL竞争性BCMA-TCB抗体对APRIL诱导的NF-κB活化的影响。(A) APRIL竞争性J6M0-TCB对APRIL (1000ng/mL)介导的H929细胞中的NF-κB活化的影响。通过磷酸化-流式细胞计量术检测细胞内磷酸化的NF-κB (参见实施例4.2.1)。
图5：如通过比色测量LDH释放测定检测到的，可溶性APRIL对APRIL竞争性BCMA-TCB抗体的诱导BCMA-阳性的H929骨髓瘤细胞的T-细胞重新定向杀死的影响。在没有外源可溶性APRIL存在下和在有100 ng/mL或1000 ng/mL外源可溶性APRIL存在下的APRIL阻断性/竞争性J6M0-TCB。使用的E:T比率为10个PBMC:1个H929细胞；将细胞温育24h，然后测量LDH释放。在没有外源APRIL存在下，APRIL阻断性/竞争性J6M0-TCB以低皮摩尔效能(EC50APRIL0=5.8 pM)诱导BCMA-阳性的H929骨髓瘤的浓度依赖性杀死。当将100 ng/mL的APRIL加入培养物中时，这样的配体浓度仅仅最小地影响由J6M0-TCB介导的杀死效能，如EC50的2.4倍增加(EC50APRIL100= 14.2 pM)所证实的。但是，当将1000 ng/mL的APRIL加入培养物中时，由J6M0-TCB介导的杀死效能极大地下降，如84.3倍的EC50增加(EC50APRIL1000= 488.9 pM)所反映的(参见实施例4.2.2)。
图6：通过流式细胞计量术检测的可溶性APRIL对APRIL竞争性BCMA-TCB抗体的诱导T-细胞活化的影响。温育48小时以后在CD4+和CD8+ T细胞上的早期活化标志物CD69 (B、D)和晚期活化标志物CD25 (A、C)的表达水平(来自两个独立实验的代表性结果)。在有BCMA-阳性的靶细胞存在下，在没有外源可溶性APRIL存在下，APRIL竞争性/阻断性J6M0-TCB抗体以浓度依赖性的和特异性的方式诱导CD69和CD25活化标志物的上调(正方形)。当将100 ng/mL的可溶性APRIL加入培养物中时，对于CD4+和CD8+ T细胞上的两种活化标志物CD69和CD25观察到浓度-响应曲线的向右轻微偏移。当将1000 ng/mL的可溶性APRIL加入培养物中时，存在CD4+和CD8+ T细胞上的T-细胞活化的明显下降。当用DP47-TCB对照抗体处理人PBMC时，没有观察到CD4+和CD8+ T细胞的活化，从而表明，当TCB抗体不结合BCMA-阳性的靶细胞时，尽管与T细胞上的CD3结合，T-细胞活化没有发生(数据未显示)。结果清楚地表明，高水平的可溶性APRIL降低BCMA-TCB抗体在结合肿瘤靶标和T细胞后诱导T-细胞活化的效能，特别当BCMA-TCB与APRIL竞争时(参见实施例4.3)。
图7：BCMA表达和E:T比率对BCMA-TCB通过自体骨髓浸润性T细胞诱导患者骨髓恶性浆细胞的杀死的效能的影响。在温育仅24小时后，BCMA-1-TCB已经诱导来自患者C1 (A)和患者C8 (B)的恶性浆细胞的浓度依赖性的特异性杀死。但是，骨髓瘤细胞杀死在患者C1骨髓样品中比在患者C8骨髓样品中更显著。这可以归因于与在具有不利的0.5:1的E:T比率和在骨髓瘤细胞上的更弱BCMA表达(即1489的相对MFI值)的患者C8骨髓样品相比，在患者C1骨髓样品中更有利的11:1的E:T比率和BCMA表达(即2636的相对MFI值)。结果表明，与患者骨髓中的E:T比率测量组合的恶性浆细胞上的BCMA表达测量可以更准确地预测骨髓瘤患者是否可以对BCMA-TCB治疗做出应答。
具体实施方式
本发明人已经认识到涉及浆细胞的障碍，特别是多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎，可以归类成(分成)几个亚型。这样的亚型是：
1. 在分离的体液样品中包含CD138+ CD38+细胞的患者，其特征在于所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
2. 患者，对其而言在分离的体液样品中，在分离的体液样品中的T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1或更高，优选0.5: 1或更高。
3. 患者，对其而言在分离的体液样品中的可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高。
4. 患者，对其而言在分离的体液样品中的APRIL的量超过100 ng/mL。
4. 在分离的体液中包含CD138+ CD38+细胞的患者，其特征在于所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，且对其而言在所述分离的体液样品中，样品中T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1，优选0.5:1或更高。
BCMA受体通过结合在骨髓瘤患者的骨髓中富含的它的配体APRIL和BAFF而对正常浆细胞和恶性浆细胞(即骨髓瘤细胞)的存活起关键作用，并且许多组已经在mRNA水平和表面蛋白水平检测到骨髓瘤细胞中的BCMA表达(O'Connor等人. J Exp Med 2004, 199(1):91-8; Novak等人. Blood 2004, 103(2): 689-94; Ryan等人. Mol Cancer Ther 2007,6(11): 3009-18; Quinn等人. Blood 2011, 117(3): 890; Carpenter等人. Blood2013, 19(8): 2048-60; Frigyesi等人. Blood 2014, 123(9):1336-40; Claudio等人.Blood 2002,100(6):2175-86; Tai等人. Cancer Res 2006,123(20):3128-38; Moreaux等人, Blood 2004,103(8):3148-57; Ju等人. Clin Biochem 2009,42(4-5):387-99;Moreaux等人. Eur J Haematol 2009, 83(2):119-29)。因此，在骨髓瘤患者中，BCMA在他们的恶性浆细胞上表达。但是，本发明人已经观察到，骨髓瘤患者确实在细胞表面上表达BCMA，但是在从中/高至中至低的不同表达水平，如通过流式细胞计量术的最佳测量所检测到的，本发明人已经认识到，用于检测BCMA表达进行患者分层的次优技术或方法的应用(例如以低亲和力结合人BCMA的BCMA抗体的应用)不可检测骨髓瘤患者的恶性浆细胞上的BCMA的低表达，且在这样的情况下，给临床医师误报这些骨髓瘤患者不对BCMA抗体疗法做出应答，尽管他们可以。
T细胞双特异性的(TCB)抗体在细胞杀死中具有非常高的浓度/肿瘤-细胞-受体-占据依赖性效能(例如在体外细胞杀死测定中在亚皮摩尔或低皮摩尔范围的EC50；Dreier等人. Int J Cancer 2002)，以比常规单特异性抗体低得多的剂量施用T-细胞双特异性抗体(TCB)。例如，以5-15 μg/m2/天(即仅0.035-0.105 mg/m²/周)的连续静脉内剂量施用博纳吐单抗(CD19xCD3)用于治疗急性淋巴细胞白血病，或以60 μg/m2/天施用用于治疗非霍奇金淋巴瘤，并且在这些剂量的血清浓度是在0.5-4 ng/mL的范围内(Klinger等人, Blood2012；Topp等人, J Clin Oncol 2011；Goebeler等人. Ann Oncol 2011)。因为低剂量的TCB可以在患者中发挥高效力，预见到，对于根据本发明的抗体，皮下施用在临床场合中是可能的并优选的(优选0.25-2.5 mg/m2/周的剂量范围)。甚至在这些低浓度/剂量/受体占据，TCB可以引起大量不利事件(Klinger等人, Blood 2012)。因而，控制肿瘤细胞占据/覆盖是至关重要的。因此，应当基于患者分类的有效方法来选择TCB治疗的剂量。
因此，需要关于患者骨髓瘤细胞上的BCMA表达的最佳确定方法。这样的关于BCMA表达的最佳确定方法可以使用流式细胞计量术用适当的确定用BCMA抗体执行。例如，根据本发明关于用于患者分层的骨髓瘤细胞上的BCMA确定的应用，将BCMA抗体用于对人BCMA(例如如通过表面等离子体共振(SPR)测量的)具有与BCMA抗体疗法类似的亲和力范围的检测。进一步优选的是，抗体价应当在检测用BCMA抗体和BCMA抗体疗法之间是相同的(例如用于BCMA检测的单价抗体应当用于关于BCMA抗体疗法的患者分层，其单价结合恶性细胞上的肿瘤靶标，诸如在基于scFV的BiTE分子的情况下)。进一步优选的是，亲合力范围(如通过SPR测量的)在检测用BCMA抗体和BCMA抗体疗法之间是类似的。进一步优选的是，使用用于确定的BCMA抗体，其与BCMA抗体疗法的BCMA结合剂相同。
本文中使用的术语“靶标”是指BCMA或CD3。术语“第一靶标和第二靶标”是指CD3作为第一靶标和BCMA作为第二靶标，或者是指BCMA作为第一靶标和CD3作为第二靶标。
本文中使用的术语“BCMA”指人B细胞成熟靶标，也被称作BCMA；TR17_HUMAN,TNFRSF17 (UniProt Q02223)，其是在分化的浆细胞中优先表达的肿瘤坏死受体超家族的一个成员。BCMA的细胞外结构域根据UniProt由氨基酸1-54(或5-51)组成。本文中使用的术语“针对BCMA的抗体，抗BCMA抗体”指特异性地结合BCMA的抗体。
本文中使用的术语“CD3ε或CD3”指在UniProt P07766 (CD3E_HUMAN)下描述的人CD3ε。术语“针对CD3的抗体，抗CD3抗体”指结合CD3ε的抗体。优选地，所述抗体包含：可变结构域VH，其包含SEQ ID NO: 3、4和5的重链CDR分别作为重链CDR1、CDR2和CDR3；和可变结构域VL，其包含SEQ ID NO: 6、7和8的轻链CDR分别作为轻链CDR1、CDR2和CDR3。优选地，所述抗体包含SEQ ID NO:1 (VH)和SEQ ID NO:2 (VL)的可变结构域。本文中使用的术语“针对CD3的抗体，抗CD3抗体”指特异性地结合CD3ε的抗体。
“特异性地结合CD3或BCMA或特异性地结合CD3ε或BCMA”是指能够以足够的亲和力结合人CD3ε或人BCMA的细胞外结构域(靶标)的抗体，使得所述抗体在靶向CD3或BCMA中用作治疗剂。在某些实施方案中，抗-CD3或BCMA抗体与不相关的非CD3或非BCMA蛋白的结合程度比所述抗体与CD3或BCMA的结合小约10倍，优选>100倍，如例如通过表面等离子体共振(SPR)例如Biacore®、酶联免疫吸附(ELISA)或流式细胞计量术(FACS)测量的。优选地，结合CD3或BCMA的抗体具有10-8 M或更低、优选10-8 M至10-13 M、优选10-9 M至10-13 M的解离常数(Kd)。优选地，抗-CD3和/或抗-BCMA抗体结合在来自不同物种、优选在人和食蟹猴的CD3和/或BCMA之间保守的CD3和/或BCMA的表位。“特异性地结合CD3和BCMA的双特异性抗体”或“根据本发明的抗体”是指关于结合两种靶标的各自定义。特异性地结合BCMA(或BCMA和CD3)的抗体不结合其它人抗原。因而，在ELISA中，这样的不相关靶标的OD值将等于或低于特定测定的检测限度的OD值，优选> 0.3 ng/mL，或等于或低于没有平板结合的BCMA或具有未转染的HEK293细胞的对照样品的OD值。
本文中使用的术语“CD3ε或CD3结合部分”是指由VH和CH1组成的抗体重链与由VL和CL组成的抗体轻链的组合(如在特异性地结合CD3的抗体的Fab片段中包封的)。
本文中使用的术语“BCMA结合部分”是指由VH和CH1组成的抗体重链与由VL和CL组成的抗体轻链的组合(如在特异性地结合BCMA的抗体的Fab片段中包封的)。
术语“特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体或TCB或针对BCMA和CD3的抗体”是指特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体。这样的抗体可以是对BCMA单价的，例如作为单链抗体(如在WO2013072406、WO2013072415和WO2014140248中提及的)，或可以是二价的或三价的(如例如在WO2014122143、WO2014122144中公开的)。WO2013072406和WO2014140248在某些附图和实施例中提及E:T比率；但是，仅报道了在各个杀死测定实验中为1个靶细胞使用10个效应细胞(非患者样品的细胞系)。因此，该E:T比率是假的，且没有证实在骨髓瘤患者骨髓样品中的任何E:T比率或给出关于E:T比率与抗体治疗的关系的任何暗示。优选地，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO: 2-4和6-8的CDR和优选SEQ ID NO: 1和5的VL和VH结构域作为CD3结合部分的CDR。优选地，所述双特异性抗体包含在表1中列出的CDR或优选VH和VL结构域作为BCMA结合部分的CDR。优选地，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO: 10-12和14-16的CDR或优选SEQ ID NO: 9和13的VL和VH结构域作为BCMA结合部分的CDR。优选地，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO: 18-20和22-24的CDR或优选SEQ ID NO: 17和21的VL和VH结构域作为BCMA结合部分的CDR。抗体J6M0描述在WO2012163805中。包含J6M0的TCB包含SEQ ID NO: 2-4和6-8的CDR和优选SEQ ID NO: 1和5的VL和VH结构域作为CD3结合部分的CDR。
术语“APRIL非竞争性的双特异性抗体”是指一种双特异性抗体，其特征在于，在ELISA测定中测得，相对于所述抗体与不含APRIL的人BCMA的结合，100 ng/mL的APRIL没有使所述抗体的结合减少超过20%。术语“APRIL非竞争性的抗-BCMA抗体”是指一种抗-BCMA抗体，其特征在于，在ELISA测定中测得，相对于所述抗体与不含APRIL的人BCMA的结合，100ng/mL的APRIL没有使所述抗体的结合减少超过20%。这样的抗体描述在WO2014122143、WO2014122144、EP14179705和EP14194151中。
表1
术语“治疗性抗体”是指特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体，其在患有多发性骨髓瘤的患者中在消除恶性浆细胞中起作用。所述治疗性抗体介导细胞毒性效应或细胞裂解，特别是通过诱导T-细胞活化和随后涉及穿孔蛋白和颗粒蛋白酶B的T-细胞介导的细胞凋亡。
优选地，根据本发明的治疗性抗体的特征在于，关于与NCI-H929细胞(ATCC®CRL-9068™)的结合，显示出500 nM或更低的EC50值，优选350 nM和更低的EC50值，优选100 nM和更低的EC50值。
优选地，根据本发明的治疗性抗体的特征在于它的结合U266 (ATCC®TIB-196TM)细胞的能力。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的治疗性抗体的特征在于它的结合人T细胞的能力。
优选地，根据本发明的治疗性抗体的特征在于它的结合在HEK-细胞上瞬时表达的食蟹猴BCMA的能力。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的治疗性抗体的特征在于它的在表达BCMA的肿瘤细胞存在下诱导CD4+和CD8+ T-细胞活化的能力。
优选地，根据本发明的治疗性抗体的特征在于它的在有人T细胞存在下以低于1nM、优选地0.5 nM、优选地0.1 nM和更低的EC50诱导NCI-H929肿瘤细胞的重新定向杀死的能力。
术语“诊断性抗体”是指特异性地结合BCMA的细胞外结构域的抗体。根据本发明，如果将确定细胞表面BCMA表达，所述诊断性抗体是抗-BCMA抗体，所述抗-BCMA抗体的Kd值是意图用于治疗所述患者的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。优选地，所述抗体源自所述治疗性双特异性抗体的BCMA结合部分，且优选地包含与所述治疗性抗体的所述BCMA结合部分相同的CDR或VH和VL结构域。根据本发明，如果确定MFI，所述诊断性抗体优选地是经标记的抗体。根据本发明，如果可确定可溶性BCMA，所述诊断性抗体是可用于ELISA的抗体。
术语“经标记的抗体”是指具有连接的可检测标记的抗体。优选地，当将FACS用于分析时，所述可检测标记是荧光团。对于其它分析方法，也可以使用所有其它已知的标记(参见，例如，Harlow和Lane编. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.))。优选荧光团的例子是异硫氰酸荧光素(FITC)、Alexa Fluor、R-藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、PerCP、串联的缀合物(例如PE-酞菁、PerCP-酞菁)、罗丹明(四甲基罗丹明异硫氰酸酯、TRITC)、绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白。
本文中使用的术语“抗体”是指单克隆抗体。抗体由两对“轻链”(LC)和“重链”(HC)组成(这样的轻链(LC)/重链对在本文中缩写为LC/HC)。这样的抗体的轻链和重链是由几个结构域组成的多肽。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含重链恒定结构域CH1、CH2和CH3 (抗体种类IgA、IgD和IgG)和任选的重链恒定结构域CH4(抗体种类IgE和IgM)。每个轻链包含轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。可变结构域VH和VL可以进一步细分为被称为互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的“恒定结构域”不直接参与抗体与靶标的结合，但展示多种效应子功能。
本文中使用的“抗体的轻链”是在N-端至C-端方向包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)的多肽，缩写为VL-CL。本文中使用的“抗体的重链”是在N-端至C-端方向包含重链可变结构域(VH)和恒定重链结构域1 (CH1)的多肽。
术语“抗体”包括例如小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和遗传工程改造抗体(变体或突变抗体)，只要它们的特征性能得以保留。特别优选的是人或人源化抗体，尤其是作为重组人或人源化抗体。本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。
本文中使用的术语“双特异性抗体”和“根据本发明的抗体”是指这样的抗体：其中两对重链和轻链(HC/LC)之一特异性地结合BCMA，且另一对特异性地结合CD3，或优选地结合CD3和BCMA。在本申请中使用的术语“价”表示存在于抗体分子中的指定数目的结合位点。根据本发明的二价抗体具有两个结合位点，一个针对CD3且另一个针对BCMA。这样，术语“三价”表示在根据本发明的抗体中存在三个结合位点，它们是两个针对BCMA的结合位点和一个针对CD3的结合位点。
存在五类用希腊字母表示的哺乳动物抗体重链：α、δ、ε、γ和μ(Janeway CA, Jr等人(2001). Immunobiology. 第5版, Garland Publishing)。所存在的重链类型定义了抗体的种类；这些链分别发现于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中(Rhoades RA, Pflanzer RG(2002). Human Physiology,第4版, Thomson Learning)。不同的重链在大小和组成上不同；α和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε具有大约550个氨基酸。每个重链具有两个区域，恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中均相同，但是在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由三个恒定结构域CH1、CH2和CH3(在一条线上)组成的恒定区，和铰链区用于附加的柔性(Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99)；重链 μ和ε具有由四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4组成的恒定区(Janeway CA, Jr等人(2001).Immunobiology.第5版, Garland Publishing)。重链的可变区在由不同B细胞产生的抗体中不同，但是对于由单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体均相同。每个重链的可变区是大约110个氨基酸长并且由单个抗体结构域构成。
在哺乳动物中，存在两种类型的轻链，它们被称为λ(λ)和κ(κ)。轻链具有两个连续的结构域：一个恒定结构域CL和一个可变结构域VL。轻链的近似长度是211-217个氨基酸。优选地，所述轻链是κ(κ)轻链，而恒定结构域CL优选地源自κ(K)轻链(恒定结构域CK)。优选地，根据本发明的抗体的重链和轻链恒定结构域是人结构域。
根据本发明的“抗体”可以是任何种类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、优选地IgG或IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2、优选地IgG1)，由此根据本发明的二价双特异性抗体的两种来源抗体具有相同亚类的Fc部分(例如IgG1、IgG4等，优选IgG1)，优选相同同种异型的Fc部分(例如高加索人(Caucasian))。
本文中使用的“抗体的Fab片段”是结合抗原的抗体上的片段。抗体的Fab片段由两对结构域组成。在野生型抗体中，它由重链(CH1和VH)和轻链(CL和VL)各自的一个恒定结构域和一个可变结构域组成。在野生型抗体中和根据本发明，Fab片段的重链和轻链结构域对的结构域没有化学连接在一起并因此不是scFv (单链可变片段)。
“抗体的Fc部分”是本领域技术人员众所周知的并基于抗体的木瓜蛋白酶切割而定义的术语。根据本发明的抗体含有Fc部分，优选源自人来源的Fc部分和优选人恒定区的所有其它部分。抗体的Fc部分直接参与补体激活、C1q结合、C3激活和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，但与C1q的结合由Fc部分中确定的结合位点引起。这样的结合位点是现有技术中已知的，并且例如由以下文献描述：Lukas, TJ., 等人, J.Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., 和Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16(1979) 907-917; Burton, D.R., 等人, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen,J.E., 等人, MoI. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., 等人, J.Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., 等人, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., 等人, Immunology 86 (1995) 319-324；和EP 0 307 434。这样的结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引进行编号，参见下文)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体经常显示补体激活、C1q结合和C3激活，而IgG4不激活补体系统，不结合C1q并且不激活C3。优选地，Fc部分是人Fc部分。优选地，Fc部分是人IgG1Fc部分。优选地，根据本发明的抗体在人IgG1 Fc部分中包含甘氨酸或精氨酸对Pro329的氨基酸取代和/或L234A和L235A取代，优选甘氨酸对Pro329的取代和L234A和L235A取代。
优选地，根据本发明的抗体包含野生型人IgG Fc区域的Fc变体作为Fc部分，所述Fc变体包含在位置Pro329处的一个氨基酸取代和至少一个其它氨基酸取代，其中将残基根据Kabat的EU索引编号，并且其中所述抗体表现出与包含野生型IgG Fc区的抗体相比降低的对人FcγRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI的亲和力，并且其中由所述抗体诱导的ADCC降低至包含野生型人IgG Fc区的抗体诱导的ADCC的至少20%。在一个具体实施方案中，根据本发明的抗体中的野生型人Fc区的Pro329被甘氨酸或精氨酸或足够大以破坏Fc/Fcγ受体界面内的脯氨酸夹层的氨基酸残基取代，所述受体界面在Fc的脯氨酸329与FcγRIII的色氨酸残基Trp 87和Tip 110之间形成(Sondermann等人: Nature 406, 267-273 (2000年7月20日))。在本发明的另一个方面，Fc变体中的至少一个其它氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在另一个实施方案中，所述至少一个其它氨基酸取代是人IgGl Fc区的L234A (表示亮氨酸234被丙氨酸取代)和L235A，或人IgG4 Fc区的S228P和L235E。在WO2012130831中详细描述了这样的Fc变体。包含Fc部分的根据本发明的抗体的一个优点是，与不含Fc部分的TCB相比，消除半衰期增加至约12天或甚至更多，并且提供每周一次或两次施用的机会。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其包含来自一种来源或物种的可变区(即结合区)和来自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，所述抗体经常通过重组DNA技术来制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的抗体，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。这样的嵌合抗体也被称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的表达的免疫球蛋白基因的产物。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison, S.L., 等人, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”是指这样的抗体，其中框架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。和Neuberger, M.S., 等人, Nature314 (1985) 268-270。特别优选的CDR对应于代表识别上文为嵌合抗体指出的靶标的序列的那些序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的抗体，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。
本文中使用的术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk, M.A., 和van de Winkel,J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在这样的种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致靶标攻击后人抗体的产生(参见，例如，Jakobovits, A., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., 等人,Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., 等人, Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。还可以在噬菌体展示文库中产生人抗体(Hoogenboom, H.R., 和Winter, G., J.MoI. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., 等人, J. MoI. Biol. 222 (1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77页(1985)；和Boerner, P., 等人, J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如关于根据本发明的嵌合抗体和人源化抗体已经提及的，本文中使用的术语“人抗体”还包含这样的抗体，其在恒定区内被修饰以产生根据本发明的性质，尤其是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即Fc部分的改变或突变(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
本文中使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，诸如从宿主细胞(诸如NSO或CHO细胞)或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体，或使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这样的重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经经历体内体细胞高突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：其尽管源自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但是不会天然地存在于体内人抗体种系组库内。
本文中使用的“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)，重链的可变区(VH))表示直接参与抗体与靶标的结合的每个轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构，并且每个结构域包含四个框架(FR)区，其序列很大程度上保守，由三个“高变区”(或互补性决定区，CDR)连接。框架区采用β-折叠构象并且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每个链中的CDR通过框架区保持其三维结构并与来自另一个链的CDR一起形成靶标结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。
当用于本文中时，术语“高变区”或“抗体的靶标结合区域”是指负责靶标结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过所述框架氨基酸分开。尤其是，重链的CDR3是最有助于靶标结合的区域。根据Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版, 公共卫生署(Public Health Service),国立卫生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)的标准定义确定CDR和FR区域。
术语“表位”包括能够特异性地结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被抗体结合的靶标区域。
本文中使用的“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也被称作转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
优选地通过重组方式产生根据本发明的双特异性抗体。这样的方法为现有技术所广泛熟知并且包括在原核和真核细胞中表达蛋白，随后分离抗体多肽并且经常纯化至药学上可接受的纯度。为了表达蛋白，通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞(如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌细胞)中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。双特异性抗体可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中，或呈部分纯化的或基本上纯的形式。通过标准技术(包括碱/SDS处理、柱色谱法和本领域所熟知的其它技术)进行纯化，以消除其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。参见Ausubel, F.,等人, 编, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and WileyInterscience, New York (1987)。
利用CD19xCD3 T-细胞双特异性的(TCB)抗体博纳吐单抗，已经在具有复发的/难治的急性淋巴细胞白血病ALL的患者中证实了多达80%的应答率。关于ALL，对于多发性骨髓瘤和其它浆细胞疾病，仍然存在高医学需要。尽管有所有目前可得到的治疗，在第一次诊断以后5年，约60%的多发性骨髓瘤患者已经死亡。对于多发性骨髓瘤患者而言，仍然需要有效的治疗。
术语“涉及浆细胞的障碍”是指具有它的对应产物单克隆免疫球蛋白蛋白(M-蛋白)的血清/血浆水平的增加的疾病。M-蛋白可以由重链和轻链组成或者仅由一类链组成。浆细胞障碍是多发性骨髓瘤或表达BCMA的其它B-细胞障碍。多发性骨髓瘤是一种特征在于异常浆细胞在骨髓区室中的单克隆扩增和积累的B-细胞恶性肿瘤。多发性骨髓瘤还涉及具有相同IgG基因重排和体细胞高突变的循环克隆B细胞。多发性骨髓瘤起源于无症状的恶化前病症，被称为未见显著性的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)，其特征在于低水平的骨髓浆细胞和单克隆蛋白。多发性骨髓瘤细胞(MM细胞)以低速率增殖。多发性骨髓瘤起因于多种结构染色体改变(例如不平衡易位)的渐进性发生。多发性骨髓瘤涉及恶性浆细胞和骨髓微环境(例如正常骨髓基质细胞)的相互的互相作用。活跃的多发性骨髓瘤的临床征象包括单克隆抗体簇(spike)、过度围绕骨髓的浆细胞、起因于破骨细胞的过度刺激的溶骨损伤和骨破坏(Dimopulos & Terpos, Ann Oncol 2010; 21增刊7: vii143-150)。涉及浆细胞(即表达BCMA)的另一种B细胞障碍是系统性红斑狼疮(SLE)，也被称作狼疮。SLE是一种全身性自身免疫疾病，其可以影响身体的任何部分并且由攻击身体的自身细胞和组织的免疫系统表现，从而导致慢性炎症和组织损伤。它是III型超敏反应，其中抗体-免疫复合物沉淀并造成其它免疫应答(Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337)。
本发明优选地涉及多发性骨髓瘤的疗法。在另一个实施方案中，本发明也涉及与浆细胞有关的其它B-细胞障碍的疗法。其中涉及表达BCMA的浆细胞的这样的障碍是系统性红斑狼疮(SLE)，也被称作狼疮。其中涉及表达BCMA的浆细胞的其它障碍是涉及抗核抗体(抗-dsDNA抗体)产生的障碍、狼疮肾炎和RA、1型自身免疫性肝炎。还根据http://www.merckmanuals.com将浆细胞障碍分类。
表2
根据多发性骨髓瘤的国际分期系统(http://www.cancer.org)可以将多发性骨髓瘤分期。该系统仅基于血清β-2微球蛋白和血清白蛋白水平将骨髓瘤分成3期：
I期: 血清β-2微球蛋白小于3.5 (mg/L)，且白蛋白水平高于3.5 (g/L)
II期: 不是I期或III期，这意味着：β-2微球蛋白水平是在3.5至5.5之间(具有任意白蛋白水平)；或者白蛋白低于3.5，同时β-2微球蛋白小于3.5
III期: 血清β-2微球蛋白大于5.5。
但是，该分期系统没有给出患者是否对使用特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体的疗法敏感的暗示。以下事实对于有效的疗法不是充分的：BCMA在浆细胞分化过程中被选择性地诱导且以高水平在恶性浆细胞中表达(Ryan, MC等人, Mol. Cancer Ther. 6(2007) 3009-3018；Novak AJ等人, Blood. 2004 Jan 15；103(2):689-94. 2003年9月25日电子公开；Maus MV和June CH, Clin Cancer Res 2013；19:2048-60)，和因此在他们的MM细胞的表面上表达BCMA的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体的疗法是敏感的。本发明人已经认识到，不同患者的MM细胞对使用针对CD3和BCMA的双特异性抗体的疗法具有不同灵敏度。以下特征中的至少一个对于成功疗法而言具有关联性：
-用于测量BCMA表达的诊断性抗体和治疗性抗体在某种程度上有关(MFI)，
-多发性骨髓瘤的E:T比率，
-在体液样品中、特别是在骨髓抽吸物样品(如果所述患者患有多发性骨髓瘤)和滑液(如果所述患者患有SLE或RA)中的可溶性BCMA和/或APRIL的量。
优选地，组合两个、三个或所有四个特征。优选地，为根据本发明的治疗、选择疗法、选择治疗计划和预测可能性的方法，组合两个、三个或所有四个特征的确定。
术语“标准剂量”是指经FDA批准的用于治疗各种浆细胞障碍(特别是选自多发性骨髓瘤、红斑狼疮和类风湿性关节炎)的每周剂量。如果FDA批准的剂量对于不同周是不同的，那么术语“标准剂量”是指在各个周中的剂量。
术语“以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表”是指，从用特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体(优选地FDA批准的剂量)治疗的先前患者的公认的/批准的治疗计划开始，将剂量以1.5-2.0的因数增加至2.0，或甚至多达10和更多的因素，和/或将剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短至每周2次或甚至每周3次或甚至每天1次。
关于高于100和接近1000 ng/mL的APRIL浓度，如果将结合BCMA竞争性BCMA-T-细胞双特异性抗体的APRIL用于疗法，多达80的因素的剂量增加是优选的(参见表9和图5)。在另一个优选的实施方案中，将剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短至每周2次或甚至每周3次或甚至每天1次。一种优选的治疗计划是在基于以下标准而选择的患者中建立的计划：在所述患者的分离体液样品中，可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更低，和/或APRIL浓度低于100 ng/mL。在具有高于100 ng/mL的APRIL和/或2.5 ng/mL的可溶性BCMA的患者中使用特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体的一种优选疗法是适应剂量或剂量间隔。这被表9中的APRIL竞争性的双特异性抗体杀死肿瘤细胞的EC50值证实，在100 ng/mL的APRIL具有2.4的因数，但是在1000 ng/mL的APRIL已经具有80的因数。
术语“治疗计划”是指标准化的治疗计划。在本专利申请的上下文中，它是关于使剂量和给药间隔适应测量的参数：BCMA表达(MFI)、可溶性BCMA、APRIL和E:T比率。给出的指导优选地是：
-如果MFI是50或更低，不用TCB治疗，
-如果可溶性BCMA高于2.5ng/mL，适应性调整剂量/给药时间表，
-如果APRIL高于100 ng/mL或仅仅采用非竞争性的BCMA-TCB，适应性调整剂量/给药时间表，
-如果E:T低于0.5:1，与T细胞扩增/增强疗法组合。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出比基线高80或更多、优选100或更多、和优选200或更多、甚至更优选300或更多的MFI”是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括：
通过使用抗-BCMA抗体确定所述患者的CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，和如果发现MFI比基线高80或更多、优选100或更多，
那么利用所述确定方法的结果搜索具有类似(优选地相同)表现的患有相同障碍的先前患者；和
评论所述先前患者的先前治疗计划，以确定如何基于所述先前治疗计划中的信息来改进所述新患者的治疗。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多的MFI”优选地是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括：
通过使用抗-BCMA抗体确定所述患者的CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，和如果发现MFI比基线高80或更多、优选100或更多，用BCMA- T-细胞双特异性抗体疗法治疗所述患者，但是在基线以上少于100、优选少于50、甚至优选少于10的MFI认为不治疗。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出0.35:1、优选0.5:1或更高的E:T比率”是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括：
确定在所述患者的分离体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率(另外还称作E:T比率)是否为0.35: 1，优选0.5: 1或更高，和
利用所述确定方法的结果搜索具有类似(优选地相同)表现的患有相同障碍的先前患者；和
评论所述先前患者的先前治疗计划，以确定如何基于所述先前治疗计划中的信息来改进所述新患者的治疗。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出0.35: 1、优选0.5: 1或更高的E:T比率”优选地是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括确定在所述患者的分离体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率(另外还称作E:T比率)是否为0.35: 1，优选0.5: 1或更高，和在比率低于0.35: 1、优选0.5: 1的情况下，考虑与T-细胞增殖或T细胞化学引诱物疗法组合。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出2.5 ng/mL或更高的可溶性BCMA值”是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括：
确定在所述患者的分离体液样品中的可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高，和
利用所述确定方法的结果搜索具有类似(优选地相同)表现的患有相同障碍的先前患者；和
评论所述先前患者的先前治疗计划，以确定如何基于所述先前治疗计划中的信息来改进所述新患者的治疗。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出2.5 ng/mL或更高的可溶性BCMA值”优选地是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括确定在所述患者的分离体液样品中的可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高，和然后考虑转换至以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出100 ng/mL或更高的APRIL值”是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括：
确定在所述患者的分离体液样品中的APRIL的量是否为100 ng/mL或更高，和
利用所述确定方法的结果搜索具有类似(优选地相同)表现的患有相同障碍的先前患者；和
评论所述先前患者的先前治疗计划，以确定如何基于所述先前治疗计划中的信息来改进所述新患者的治疗。
术语“选择对于患者最有效的治疗计划，所述患者表现出100 ng/mL或更高的APRIL值”优选地是指一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者选择治疗计划的方法，所述方法包括确定在所述患者的分离体液样品中的APRIL的量是否为100 ng/mL或更高，和然后使用不与APRIL竞争对BCMA的结合的BCMA-T-细胞双特异性抗体，或否则考虑转换至以更高剂量和/或以更频繁的治疗时间表。
术语“研究患者的BCMA相关的浆细胞状态”是指通过一种、两种、三种或所有四种选自以下的方法研究所述浆细胞：
通过使用抗-BCMA抗体确定所述患者的CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，和如果发现MFI比基线高80或更多、优选100或更多，
确定在所述患者的分离体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率(另外还称作E:T比率)是否为0.35: 1，优选0.5: 1或更高，
确定在所述患者的分离体液样品中的可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高，和
确定在所述患者的分离体液样品中的APRIL的量是否为100 ng/mL或更高。
术语“T-细胞增殖疗法”是指治疗性处理或生物学处理，其诱导T细胞的增殖或扩增，例如重组细胞因子(例如干扰素(IFN) IFN-γ、IFN-α；白介素(IL) IL-1、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-16、IL-17、IL-21)、针对共刺激分子的激动性抗体、检验点抑制剂(例如抗-PD-1、抗-PD-L1)，优选对肿瘤部位特异性的T细胞的增殖或扩增。
术语“T-细胞化学引诱物疗法”是指治疗性处理或生物学处理，其诱导T细胞向肿瘤部位的趋化性，例如趋化因子(例如CCL1、CCL2、CCL22、CCL17、IP-10)。
术语“体液样品”是指人患者的分离的体液。根据本发明的优选体液是骨髓抽吸物、血液、血清、血浆、尿、唾液、滑液和脊髓液。
术语“骨髓抽吸(物)”是指通过环钻活检得到的样品或环钻活检。骨髓抽吸和环钻活检经常在髋骨的后面或后髂嵴上进行。抽吸物还可以得自胸骨(胸骨)。骨髓抽吸也可以在胫骨(胫骨)上进行。在患有涉及浆细胞的障碍(如多发性骨髓瘤的恶性细胞)的患者的情况下，血液和骨髓抽吸物是优选的体液样品。特别优选的是，在患有多发性骨髓瘤的患者的情况下，根据本发明使用骨髓抽吸物。
术语“血液样品”是指包含细胞(即红细胞(红血细胞)、白血球(白血细胞)、凝血细胞(血小板))和血浆的血液样品。
在患有SLE或RA的患者的情况下，血液样品和优选地滑液(在发炎的关节周围的流体)是根据本发明使用的优选体液样品。
在患有狼疮肾炎和1型自身免疫性肝炎的患者的情况下，血液样品是根据本发明使用的优选体液样品。
术语“CD138+ CD38+细胞”是指在健康的个体中和在具有多发性骨髓瘤的患者中的浆细胞。因为恶性浆细胞经常以比正常浆细胞更大的频率存在于骨髓瘤患者的骨髓中，所以当提及具有多发性骨髓瘤的患者时，可以将CD138+ CD38+细胞视作该表达谱的骨髓瘤细胞。CD38是在浆细胞上表达的抗原。因为浆细胞是在骨髓中的表达CD138 (即多配体聚糖-1)的唯一细胞，所以该标志物可以用于鉴别和分离该群体。因为骨髓瘤细胞的免疫表型在未治疗的和经治疗的患者之间没有显著不同，所以CD138抗原可以用于在两个患者组中的分析。优选地，最初门控CD138+细胞，随后使用CD38进行后续选择。为了区分“正常的”浆细胞和“恶性的”浆细胞(即骨髓瘤细胞)，CD56和CD19抗原是要在免疫表型分析中包括的有用标志物。从通过流式细胞计量术鉴别为CD138+ CD38+的浆细胞的群体中，具有CD19+ CD56-的细胞的重新门控表示正常浆细胞，且具有CD19- CD56+的细胞的重新门控表示恶性浆细胞- (Rawstron AC, 等人. Report of the European Myeloma Network onmultiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders.Haematologica. 2008;93:431-438, 和Tae-Dong Jeong等人, Korean J Hematol. Dec2012; 47(4): 260-266)。
术语“靶细胞”是指在它的表面上表达BCMA的细胞。在患者患有多发性骨髓瘤的情况下，所述细胞是多发性骨髓瘤浆细胞。在患者患有SLE或RA的情况下，所述细胞是分泌抗核抗体的细胞，优选分泌抗核抗体的浆细胞。优选地，所述靶细胞是CD138 + CD38+细胞。
术语“效应细胞”是指可以影响肿瘤细胞(例如恶性浆细胞或骨髓瘤细胞)的细胞毒性、细胞死亡或细胞凋亡的细胞或细胞群，且是指外周血单核细胞(PBMC)，优选CD3+ T细胞。
术语“CD3+细胞或CD3+T细胞”是指CD3阳性的细胞。T细胞也是T-细胞受体(TCR)阳性的，且也可以通过TCR的表面表达来鉴别。T细胞也是CD45阳性的且CD19和CD56阴性的，且因此也可以通过确定CD45的表面表达且CD19 (阴性的)和CD56 (阴性的)阴性来鉴别。还可以将效应细胞鉴别为选自以下的CD3+细胞：CD3+CD4+辅助性T细胞、CD3+CD8+细胞毒性T细胞、CD3+CD45RA+CD197-原初T细胞、CD3+CD45RA+CD197-CD4+原初CD4 T细胞、CD3+CD45RA+CD197-CD8+原初CD8 T细胞、CD3+CD45RA-记忆T细胞、CD3+CD45RA-CD4+记忆CD4 T细胞、CD3+CD45RA-CD8+记忆CD8 T细胞、CD3+CD45RA-CD197+中央记忆T细胞、CD3+CD45RA-CD197+CD4+中央记忆CD4 T细胞、CD3+CD45RA-CD197+CD8+中央记忆CD8、CD3+CD45RA-CD197-效应记忆T细胞、CD3+CD45RA-CD197-CD4+效应记忆CD4 T细胞；CD3+CD45RA-CD197-CD8+效应记忆CD8 T、CD3+CD45RA+CD197-效应T细胞、CD3+CD45RA+CD197-CD4+效应CD4 T细胞、CD3+CD45RA+CD197-CD8+效应CD8T细胞、CD3+CD4+CD25高CD127低调节性T细胞、CD3+PD-1-非衰竭的T细胞和CD3+PD-1-Tim-3-非衰竭的T细胞。
术语“作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线”是指为用于根据本发明的测定的FACS设备定义的基线。基线由作为参照的T-细胞的MFI定义。
术语“可溶性BCMA”是指存在于患者的流体样品中的BCMA。优选地，将酶联免疫吸附测定用于确定体液样品、优选血清、优选血浆中的BCMA浓度。优选地，所述测定不与人APRIL、BAFF、BAFF-R或TACI交叉反应。
术语“测量可溶性APRIL的量”优选地是指通过使用ELISA方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗自身免疫疾病的针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体。本发明提供了确定患者对这样的治疗的应答性的方法和有关的诊断测定。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗多发性骨髓瘤的针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体。本发明提供了确定患者对这样的治疗的应答性的方法和有关的诊断测定。
本发明的所有实施方案涉及人类的治疗和诊断的领域。
在下面列出了本发明的具体实施方案：
1. 一种特异性地结合人BCMA (另外还称作“BCMA”)的细胞外结构域和人CD3ε(另外还称作“CD3”)的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，且其中在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中，所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
2. 用于根据实施方案1所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体和所述抗-BCMA抗体对于BCMA结合而言是单价的。
3. 用于根据实施方案1所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体和所述抗-BCMA抗体对于BCMA结合而言是二价的。
4. 用于根据实施方案1所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体和所述抗-BCMA抗体对于BCMA结合而言是三价的。
5. 用于根据实施方案1-4中的任一项所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含与所述抗-BCMA抗体相同的氨基酸序列的CDR作为它的重链和轻链CDR。
6. 用于根据实施方案1-5中的任一项所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含与所述抗-BCMA抗体相同的氨基酸序列的可变区作为它的重链和轻链可变区。
7. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中在所述患者的分离体液样品中的T细胞与效应细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1，优选0.5: 1或更高。
8. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离体液样品，
ii) 测量所述样品中可溶性BCMA的量，和
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和
iv) 如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么以对于第一剂量而言更高的剂量或以更频繁的治疗时间表，使用所述双特异性抗体治疗所述患者，所述治疗时间表具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间更短的时间段或具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第三剂量之间更短的时间段。
9. 一种用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合，其中所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，其中所述疗法包括接连地
i) 从所述患者分离包含浆细胞和T细胞的体液样品，
ii) 通过使用ELISA方法测量所述样品中APRIL的量，和
iii) 如果所述患者样品中APRIL的量超过100 ng/mL，那么相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，在以下剂量用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100 ng/mL至1000 ng/mL的APRIL浓度，以高50%至100%的剂量治疗；和高于1000 ng/mL的APRIL浓度，超过2倍和高达80倍治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
10. 一种确定患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的BCMA蛋白表达的方法，所述方法包括通过使用抗-BCMA抗体测量所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达，所述抗-BCMA抗体的Kd值是意图用于治疗所述患者的特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，和确定相对中值或平均荧光强度MFI是否比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
11. 一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，所述方法包括，通过使用抗-BCMA抗体针对所述CD138+ CD38+细胞上的BCMA表达分析来自所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品，所述抗-BCMA抗体的Kd值是意图用于治疗所述患者的特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，并且如果相对中值或平均荧光强度MFI比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，那么用所述双特异性抗体治疗所述患者。
12. 一种用于选择对于患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的方法，且其中所述患者的分离体液样品表现出的关于BCMA的MFI比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多。
13. 一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，其中在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中和使用抗-BCMA抗体测量的比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多的细胞表面BCMA表达预示患者对所述治疗做出应答的可能性，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
14. 一种确定分离体液样品中的细胞表面BCMA表达的体外方法，所述方法包括使用抗-BCMA抗体确定所述CD138+ CD38+细胞的相对中值或平均荧光强度MFI是否比基线高80或更多、优选100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
15. 一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，由此对于所述患者：使用抗-BCMA抗体测量的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的细胞表面BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多、优选100或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，由此所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体。
16. 一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果使用抗-BCMA抗体测量的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中的细胞表面BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高100或更多、优选200或更多、甚至更优选300或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果使用抗-BCMA抗体测量的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品或分离血液样品中的细胞表面BCMA表达在作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线以上小于100、优选小于50、甚至优选小于10，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，那么不用所述治疗性抗体治疗所述患者。
17. 一种用于确定在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35:1，优选0.5:1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高的方法。
18. 一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，所述方法包括分析在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高，由此所述治疗包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体。
19. 一种用于选择对于患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的方法，所述患者在分离体液样品中表现出0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率，由此所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体。
20. 一种用于选择对于患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的方法，由此：
i) 如果所述患者的体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率为0.35: 1，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高，那么在单一疗法中用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体治疗所述患者
ii) 如果所述患者的体液样品中的CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率低于0.35: 1，优选0.5: 1，优选低于0.25: 1，那么与T-细胞增殖疗法或T-细胞化学引诱物疗法联合地用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体治疗所述患者。
21. 一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，所述方法包括测量在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高，其预示患者对治疗做出应答的可能性。
22. 一种确定在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率是否为0.35: 1、优选0.5: 1或更高、优选1:1或更高、更优选5:1或更高、甚至更优选10:1或更高的体外方法。
23. 一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，由此在所述患者的分离体液样品中确定CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率为0.35: 1，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高，和由此所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体。
24. 一种为患有涉及浆细胞的障碍的患者选择使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率为0.35:1，优选0.5: 1或更高，优选1:1或更高，更优选5:1或更高，甚至更优选10:1或更高，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果在所述患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+ CD38+细胞的比率低于0.35: 1，优选0.5: 1，优选低于0.25: 1，那么与T-细胞增殖疗法或T-细胞化学引诱物疗法联合地治疗所述患者。
25. 一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的方法。
26. 一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，所述方法包括确定分离体液样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高，优选10 ng/mL或更高，更优选50 ng/mL或更高，甚至更优选250 ng/mL或更高。
27. 一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，其中2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的在分离体液样品中的可溶性BCMA的量预示所述患者对治疗做出应答的可能性。
28. 一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的体外方法。
29. 一种用于选择对患有涉及浆细胞的障碍的患者最有效的治疗的方法，所述患者在分离的体液样品中表现出2.5 ng/mL或更高、优选10 ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高的可溶性BCMA的量，由此所述治疗包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体。
30. 一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，其通过确定分离体液样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高、优选10ng/mL或更高、更优选50 ng/mL或更高、甚至更优选250 ng/mL或更高，且所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体。
31. 一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果在所述患者的分离体液样品中的可溶性BCMA的量低于2.5 ng/mL，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，并且
如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA不结合所述双特异性抗体，那么用所述治疗性抗体治疗所述患者，或者
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，并且如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，那么以对于第一剂量而言更高的剂量或以更频繁的治疗时间表，使用所述双特异性抗体治疗所述患者，所述治疗时间表具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间更短的时间段或具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第三剂量之间更短的时间段。
32. 一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高的方法。
33. 一种用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体治疗患者的方法，所述患者患有涉及浆细胞的障碍并诊断出在所述患者的分离体液样品中的可溶性APRIL的量为100ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高，其特征在于所述方法包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体。
34. 一种用于选择对于患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的方法，所述患者在分离的体液样品中表现出100 ng/mL或更高的可溶性APRIL的量，其特征在于，所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体。
35. 一种用于预测患有涉及浆细胞的障碍的患者对使用特异性地结合BCMA和CD3的双特异性抗体的治疗做出应答的可能性的方法，由此在所述患者的分离体液样品中的可溶性APRIL的量是100 ng/mL或更高，预示所述患者对治疗做出应答的可能性。
36. 一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为100 ng/mL或更高、优选1000 ng/mL或更高的体外方法。
37. 一种选择对于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者而言最有效的治疗计划的体外方法，其通过确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为100 ng/mL或更高、优选1000ng/mL或更高，且所述治疗计划包括使用APRIL竞争性的双特异性抗体或APRIL非竞争性的双特异性抗体。
38. 一种选择用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的疗法的方法，所述方法包括：
i) 如果在所述患者的分离体液样品中的可溶性APRIL的量为100 ng/mL或更低，那么用APRIL竞争性的双特异性抗体或APRIL非竞争性的双特异性抗体治疗所述患者，或者
ii) 如果所述样品中可溶性APRIL的量是100 ng/mL或更高，那么用APRIL非竞争性的双特异性抗体治疗所述患者。
39. 一种治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的方法，其特征在于，所述患者样品中APRIL的量超过100 ng/mL，相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，如下用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100 ng/mL的APRIL浓度，以高2倍的剂量治疗；和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
40. 一种用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者的、特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其特征在于，所述患者样品中APRIL的量超过100 ng/mL，相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，如下用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100 ng/mL的APRIL浓度，以高2倍的剂量治疗；和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
41. 一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者确定治疗计划的方法，所述方法包括：
利用至少一种研究方法，提供所述新患者的BCMA相关的浆细胞状态；
利用至少一种方法的结果，搜索具有至少一种类似表现的患有相同障碍的先前患者的先前治疗计划；和
评论所述先前患者的先前治疗计划，以确定基于至少一个先前治疗计划中的信息如何改进所述新患者的治疗，由此所述治疗计划包括使用特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体、它的剂量和关于至少在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间的时间段的治疗时间表。
42. 一种用于确定细胞表面BCMA表达的试剂盒，所述试剂盒包含预装载了以下四种经标记的抗体的管形瓶或试管：一种特异性地结合CD138，一种特异性地结合CD38，一种特异性地结合CD19，和一种抗-BCMA抗体，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
43. 一种用于确定E:T比率的试剂盒，所述试剂盒包含预装载了以下四种标记的抗体以检测恶性PC和T细胞的管形瓶或试管：一种特异性地结合CD138，一种特异性地结合CD38，一种特异性地结合CD19，和一种特异性地结合CD3)。
44. 一种用于确定可溶性BCMA的试剂盒，所述试剂盒包含多克隆抗-BCMA抗体作为捕获抗体，和检测性抗-BCMA抗体，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
45. 41. 一种用于为患有涉及浆细胞的障碍的新患者确定治疗计划的方法，所述方法包括，利用至少一种方法提供所述新患者的BCMA介导的浆细胞状态，且以此为基础，通过适应性调整剂量或治疗时间表，使公认的/批准的疗法适应BCMA-T-细胞双特异性抗体。
46. 一种特异性地结合人B-细胞成熟抗原(另外还称作“BCMA”)的细胞外结构域和人CD3ε(另外还称作“CD3”)的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中，所述CD138+CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多。
47. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的分离体液样品中T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1。
48. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，特征在于，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗以更高的剂量和/或以更频繁的治疗时间表执行。
49. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，特征在于，以对于第一剂量而言更高的剂量或以更频繁的治疗时间表进行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，所述治疗时间表具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第二剂量之间更短的时间段或具有在所述双特异性抗体的第一剂量和第三剂量之间更短的时间段。
50. 一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，APRIL的量超过100 ng/mL，其特征在于，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗以更高的剂量和/或以更频繁的治疗时间表执行。
51. 一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的包含浆细胞和T细胞的分离体液样品中，APRIL的量超过100 ng/mL，其特征在于，相对于为具有低于100 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，如下用所述双特异性抗体治疗所述患者：在100 ng/mL的APRIL浓度，以高2倍的剂量治疗；和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/mL，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
52. 一种特异性地结合人B-细胞成熟抗原(另外还称作“BCMA”)的细胞外结构域和人CD3ε(另外还称作“CD3”)的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中，所述CD138+CD38+细胞上的BCMA表达(使用抗-BCMA抗体测量，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍)比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多。
52. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的分离体液样品中T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1或更高。
54. 用于根据实施方案52所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述E:T比率是0.35: 1至22:1。
55. 一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，和所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，特征在于，相对于标准剂量，以1.5倍直到10倍的每周剂量执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短至每天一次。
56. 用于根据实施方案55所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，相对于标准剂量，以1.5倍直到2.0倍的每周一剂执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
57. 用于根据实施方案55所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，相对于标准剂量，以从每周1次施用缩短至每周2次的剂量施用之间的时间间隔执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
58. 一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，APRIL的量高于10 ng/mL和高达100 ng/mL，其特征在于，相对于标准剂量，每周以1.5倍直到20倍的剂量执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短直到每天1次。
59. 用于根据实施方案58所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗以相对于标准剂量1.5倍直到3.0倍的每周一剂执行。
60. 用于根据实施方案58所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗如下执行：剂量施用之间的时间间隔相对于标准剂量从每周1次施用缩短直到每周3次。
材料和一般方法
细胞培养技术
如在Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso,M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. 和Yamada, K.M. (编), John Wiley &Sons, Inc.中所述，使用标准的细胞培养技术。
从PBMC分离原代人pan T细胞
通过得自当地血库的富集的淋巴细胞制品(血沉棕黄层)或来自健康人供体的新鲜血液的Histopaque密度离心，制备外周血单核细胞(PBMC)。简而言之，将血液用无菌PBS稀释，并小心地在Histopaque梯度(Sigma, H8889)上面铺层。在450 x g在室温离心30分钟(关闭制动器)以后，抛弃在含有PBMC的界间物上面的血浆部分。将PBMC转移进新50 ml Falcon试管，并给试管填充PBS至50 ml的总体积。将混合物在400 x g在室温离心10分钟(开启制动器)。抛弃上清液，并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤2次(在350 x g在4℃离心10分钟的离心步骤)。将得到的PBMC群体自动地计数(ViCell)并在37℃、5%CO2在培养箱中储存在含有10%FCS和1%L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Biochrom, K0302)的RPMI1640培养基中直到测定开始。
根据生产商的说明书，使用Pan T细胞分离试剂盒II (Miltenyi Biotec #130-091-156)进行来自PBMC的T细胞富集。简而言之，将细胞沉淀物以每1000万个细胞在40 μl冷缓冲液(含有0.5%BSA、2 mM EDTA的PBS，经无菌过滤)中稀释，并以每1000万个细胞与10μl生物素-抗体混合液一起在4℃温育10分钟。每1000万个细胞加入30 μl冷缓冲液和20 μl抗-生物素磁珠，并将混合物在4℃温育另外15分钟。如下洗涤细胞：加入10-20倍当前体积，并随后在300 x g进行离心步骤10分钟。将多达1亿个细胞再悬浮于500 μl缓冲液中。根据生产商的说明书，使用LS柱(Miltenyi Biotec #130-042-401)执行未标记的人pan T细胞的磁性分离。将得到的T细胞群体自动地计数(ViCell)并在37℃、5%CO2在培养箱中储存在AIM-V培养基中直到测定开始(不长于24 h)。
从PBMC分离原代人原初T细胞
通过得自当地血库的富集的淋巴细胞制品(血沉棕黄层)或来自健康人供体的新鲜血液的Histopaque密度离心，制备外周血单核细胞(PBMC)。根据生产商的说明书，但是跳过最后的CD8+ T细胞分离步骤(也参见关于分离原代人pan T细胞的描述)，使用来自MiltenyiBiotec的原初CD8+ T细胞分离试剂盒(#130-093-244)进行来自PBMC的T细胞富集。
BCMA-阳性的人骨髓瘤细胞系
使用BCMA-阳性的人骨髓瘤细胞系(NCI-H929、RPMI-8226、U266B1和L-363)。将NCI-H929细胞((H929) ATCC®CRL-9068™)在含有10-20%热灭活的FCS的80-90%RPMI 1640中培养，且可含有2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和50µM巯基乙醇。将RPMI-8226细胞((RPMI)ATCC®CCL-155™)在含有90%RPMI 1640和10%热灭活的FCS的培养基中培养。将U266B1((U266) ATCC®TIB-196TM)细胞在经改进含有2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、4500 mg/L葡萄糖和1500 mg/L碳酸氢钠和15%热灭活的FCS的RPMI-1640培养基中培养。将L-363细胞系(Leibniz Institute DSMZ - 德国微生物和细胞培养物保藏中心; DSMZNo. ACC 49)在85%RPMI 1640和15%热灭活的FCS中培养。
实施例
实施例1：在患者骨髓瘤细胞上的BCMA表达的优化测量
实施例1.1：通过流式细胞计量术检测的患者骨髓瘤细胞上的BCMA表达的定性测量(中值荧光强度)
根据当地伦理委员会指南和赫尔辛基宣言，在给出知情同意书以后，从多发性骨髓瘤患者收集血液和骨髓抽吸物。通过流式细胞计量术在来自骨髓抽吸物的患者骨髓瘤细胞的细胞表面上测量BCMA的定性表达。使用APC缀合的二价BCMA-1抗体确定中值荧光强度(MFI)，所述抗体对人BCMA具有10.9±2.7 nM的亲和力，如通过表面等离子体共振检测到的。
为了确定患者骨髓的骨髓瘤细胞上的BCMA受体的表达，使用新鲜分离的骨髓抽吸物执行免疫表型分析。将裂解红细胞的K3-EDTA (乙二胺四乙酸)抗凝的全骨髓样品用于免疫表型分析。使用直接免疫荧光技术和多色染色，将每个试管共计2×106个细胞染色，其目的在于被鉴别为CD138+ CD38+ CD45+ CD56+ CD19-的恶性浆细胞的特异性鉴别和免疫表型表征。然后使用一组荧光染料缀合的抗体(至少包括CD138-APCC750/CD38-FITC/ CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/BCMA-APC)将骨髓细胞在冰上避光染色20-30分钟。使用的荧光染料标记的抗体购自BD Biosciences (San Jose, CA)和Caltag Laboratories (SanFrancisco CA)。在免疫表型分析中使用APC缀合的二价抗-人BCMA-1抗体。使用多色流式细胞计和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACSCalibur流式细胞计)进行获取。将Paint-A-Gate PRO程序(BD Biosciences)用于数据分析。通过在恶性浆细胞群体上门控来测量BCMA表达，并确定中值荧光强度值和在骨髓瘤患者之间对比。如下计算骨髓瘤细胞上的BCMA表达的相对MFI值：从在骨髓瘤细胞上门控的APC缀合的BCMA-1抗体的绝对MFI值减去在CD138+ CD38+ CD45+ CD56- CD19- 骨髓瘤细胞上门控的APC缀合的同位素对照抗体或在CD3+ T细胞(已知是BCMA-阴性的)上门控的APC缀合的BCMA-1抗体的绝对MFI值。图1显示了通过流式细胞计量术(MFI)检测的在患者骨髓瘤细胞上的(A)中-高BCMA表达、(B)中BCMA表达和(C)低BCMA表达的代表性FACS直方图。如在图1中所示，当与阴性对照(在T细胞上门控的APC-缀合的BCMA-1抗体)对比时，存在明显的向右偏移，其对应于患者骨髓瘤细胞上的阳性BCMA表达。基于相对MFI值，所有骨髓瘤患者都在他们的恶性浆细胞上表达BCMA，但是BCMA表达从低表达(相对MFI值< 103)变至中表达(103- 0.3 x 104)至中-高表达(0.3 x 104 - 104)。在研究的患者骨髓的骨髓样品中没有观察到具有> 104的相对MFI值的BCMA表达。表3总结了在患者骨髓瘤细胞上表达的BCMA的相对MFI值。
表3：在骨髓中的患者骨髓瘤细胞上的BCMA表达：相对中值荧光强度
患者编号 相对MFI值 BCMA表达
A1 2636 中
A2 3199 中-高
A3 557 低
A4 342 低
A5 880 低
A6 1387 中
A7 235 低
A8 1489 中
A9 93 低
A10 88 低
A11 1415 中
A12 2396 中
A13 356 低
A14 1964 中
A15 541 低
A16 858 低
A17 1574 中
A18 1147 中
A19 1847 中
A20 913 低
A21 3422 中-高
A22 547 低
A23 136 低
实施例1.2: 通过流式细胞计量术检测的在患者骨髓瘤细胞上的BCMA的定量测量(特异性抗原结合能力)
还使用流式细胞计量术在患者骨髓瘤细胞的细胞表面上测量BCMA的定量表达，即BCMA的特异性抗原结合能力(SABC)。使用Qifikit (Dako)方法相对于H929人骨髓瘤细胞系定量患者的骨髓瘤细胞的细胞表面上的BCMA抗原拷贝数或特异性抗原结合能力。收集骨髓抽吸物，并将细胞用FACS缓冲液洗涤(100µl/孔；350 x g进行5分钟)，并调至1 Mio细胞/ml。将50µl (=0.5 Mio细胞)细胞悬浮液转移进圆底96孔板的每个孔。然后，加入50µl在FACS缓冲液(PBS, 0.1%BSA)中稀释至25µg/ml终浓度(或在饱和浓度)的小鼠抗-人BCMA IgG(BioLegend #357502)或小鼠IgG2a同种型对照(BioLegend # 401501)，并在4℃在暗处执行染色30分钟。接着，将100µl经设置的(Set-up)或校准珠子加入单独的孔，并将细胞以及珠子用FACS缓冲液洗涤2次。将细胞和珠子再悬浮于25µl在Qifikit中提供的，含有荧光素缀合的抗-小鼠第二抗体(在饱和浓度)的FACS缓冲液中。将细胞和珠子在4℃在暗处染色45分钟。将细胞洗涤一次，并将所有样品再悬浮于100µl FACS缓冲液中。在多色流式细胞计和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACSCalibur流式细胞计)上分析样品。将Paint-A-Gate PRO程序(BD Biosciences)用于数据分析。表4总结了通过特异性抗原结合能力(SABC)测量的在患者的骨髓瘤细胞上的定量BCMA表达。
表4: 在骨髓中的患者骨髓瘤细胞上的BCMA表达：特异性抗原结合能力
患者编号 SABC值 BCMA表达
B3 679 低
B4 145 低
B5 957 低
B6 969 低
B7 554 低
B8 4’479 中
B9 350 低
B10 414 低
B11 2756 中
B12 2911 中
B13 1267 中
B14 3453 中
B15 1006 中
B16 1097 中
B17 1622 中
B18 429 低
B19 1684 中
B20 383 低
B21 1602 中
B22 799 低
B23 204 低
H929 38’000 非常高
实施例1.3：靶细胞表面上的BCMA表达影响BCMA-TCB的杀死效能：表达BCMA高的H929相对于表达BCMA中/低的U266相对于表达BCMA中/低的L363相对于表达BCMA低的RPMI-8226骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞的细胞表面上的BCMA的表达水平可以影响BCMA-TCB抗体的效能。使用不同的人骨髓瘤细胞系作为靶细胞(即表达BCMA高的H929相对于表达BCMA中/低的U266骨髓瘤细胞)，在重新定向的T-细胞的细胞毒性测定中测量BCMA-TCB的杀死效能。
简而言之，将表达人BCMA高的H929或表达BCMA中/低的U266多发性骨髓瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤，并再悬浮于补充了10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中。将大约30,000个细胞/孔铺板在圆底96-孔板中，并加入TCB构建体的各稀释液得到期望的终浓度(一式三份)；BCMA-TCB的终浓度范围为0.1 pM至10 nM。为了适当的对比，将所有TCB构建体和对照调至相同摩尔浓度。将人PBMC (效应物)加入孔中以得到10:1的最终E:T比率。阴性对照组由单独效应细胞或靶细胞代表。使用1 μg/ml PHA (Sigma #L8902)作为人pan T细胞的活化的阳性对照。为了归一化，通过与终浓度1%的Triton X-100一起温育靶细胞从而诱导细胞死亡，确定表达BCMA高的H929或表达BCMA中/低的U266骨髓瘤靶细胞的最大裂解(=100%)。最小裂解(= 0%)由与单独效应细胞(即没有任何T细胞双特异性抗体)一起共温育的靶细胞代表。在37℃、5%CO2温育24 h以后，然后按照生产商的说明，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science)测量细胞凋亡的/坏死的表达BCMA高的H929或表达BCMA中/低的U266骨髓瘤靶细胞向上清液中的LDH释放。在浓度-响应曲线中，相对于抗-BCMA/抗-CD3 T细胞双特异性抗体的浓度绘制LDH释放的百分比。使用Prism软件(GraphPad)测量EC50值，并确定为导致最大LDH释放的50%的TCB抗体浓度。如在图2中所示，当在头对头对比中执行时，BCMA-2-TCB诱导表达BCMA高的H929骨髓瘤细胞的杀死，具有115 pM的EC50和60%的最大杀死，而相同的BCMA-TCB抗体仅能够杀死表达BCMA中/低的U266骨髓瘤靶细胞，具有370 pM的EC50和18%的最大杀死。表5总结了BCMA-2-TCB的杀死表达BCMA高的H929或表达BCMA低的U266骨髓瘤靶细胞的EC50值和最大杀死。
还使用类似的实验条件试验了另一种BCMA-TCB抗体，BCMA-1-TCB，诱导表达BCMA的骨髓瘤细胞系(表达BCMA高的H929、表达BCMA中/低的L363和表达BCMA低的RPMI-8226 MM细胞)的杀死的效能。
如在图2.1中所示，当在头对头对比中执行时，BCMA-1-TCB诱导：(A)表达BCMA高的H929骨髓瘤细胞的杀死，具有8.49 pM的EC50和82.8%的最大杀死，而相同的BCMA-1-TCB抗体仅能够杀死(B)表达BCMA中/低的L363骨髓瘤靶细胞，具有12.6 pM的EC50和67.1%的最大杀死，或(C)表达BCMA低的RPMI-8226，具有229.3 pM的EC50和28.1%的最大杀死。表5.1总结了BCMA-1-TCB的杀死表达BCMA高的H929、表达BCMA中/低的L363或表达BCMA低的RPMI-8226骨髓瘤靶细胞的EC50值和最大杀死。
表5：靶细胞上的BCMA表达影响BCMA-2-TCB的杀死表达BCMA的骨髓瘤细胞系的效能
人细胞系 杀死效能EC50 (pM) 最大杀死
表达BCMA高的H929 115 60%
表达BCMA中/低的U266 370 18%
表5.1: 靶细胞上的BCMA表达影响BCMA-1-TCB的杀死表达BCMA的骨髓瘤细胞系的效能
人细胞系 杀死效能EC50 (pM) 最大杀死
表达BCMA高的H929 8.49 82.8%
表达BCMA中/低的L363 12.6 67.1%
表达BCMA低的RPMI-8226 229.3 28.1%
实施例2：骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞:肿瘤细胞(E:T)比率的测量
在骨髓瘤细胞的细胞表面上的BCMA表达水平可以影响BCMA抗体的效能。但是，对于BCMA-TCB抗体，E:T比率也可以影响甚至在表面上表达高水平的BCMA的细胞的杀死效能，所述E:T比率可以显著地变化，如在多发性骨髓瘤患者中观察到的。
实施例2.1：通过流式细胞计量术确定骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的CD3+ T细胞:CD138+ CD38+ 骨髓瘤细胞(E:T)比率
实施例2.1.1: 骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的骨髓瘤细胞的测量
为了确定骨髓瘤患者中浸润骨髓的恶性浆细胞的百分比和绝对数，使用新鲜分离的骨髓抽吸物执行免疫表型分析。将裂解红细胞的K3-EDTA (乙二胺四乙酸)抗凝全骨髓样品用于免疫表型分析。使用直接免疫荧光技术和多色染色，将每个试管共计2×106个细胞染色，其目的在于被鉴别为CD138+ CD38+ CD45+ CD56+ CD19-的恶性浆细胞的特异性鉴别和免疫表型表征。然后使用一组荧光染料缀合的抗体(至少包括CD138-APCC750/CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450)将骨髓细胞在冰上避光染色20-30分钟。使用的荧光染料标记的抗体购自BD Biosciences (San Jose, CA)和Caltag Laboratories (SanFrancisco CA)。使用多色流式细胞计和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACS Calibur流式细胞计)进行获取。将Paint-A-Gate PRO程序(BD Biosciences)用于数据分析。通过在CD138+ CD38+ CD45+ CD56+ CD19- 群体上门控，确定恶性浆细胞的百分比。为了计算恶性浆细胞的绝对数，将恶性浆细胞的百分比乘以骨髓抽吸物样品的体积，所述体积例如用血液学分析仪(Advia®120 System, Siemens)测量。在有些实验中，使用TrucountTM试管(BD Biosciences, San Jose CA USA)来确定血液中白血球的绝对数。
实施例2.1.2：在骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的T细胞和T细胞子集的测量
对于BCMA-TCB，效应细胞主要是T细胞，包括许多T-细胞子集。为了确定T细胞和T-细胞子集的百分比和绝对数，使用新鲜分离的骨髓抽吸物执行免疫表型分析。将裂解红细胞的K3-EDTA (乙二胺四乙酸)抗凝全骨髓样品用于免疫表型分析。使用直接免疫荧光技术和多色染色，将每个试管共计2×106个细胞染色，其目的在于可以被鉴别为CD45+ CD3+ CD56-或CD3+或CD45+ CD19- CD56-的T细胞的特异性鉴别和免疫表型表征。然后使用一组荧光染料缀合的抗体(包括CD138-APCC750/CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450)将骨髓细胞在冰上避光染色20-30分钟。使用的荧光染料标记的抗体购自BD Biosciences (SanJose, CA)和Caltag Laboratories (San Francisco CA)。使用多色流式细胞计和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACS Calibur流式细胞计)进行获取。将Paint-A-Gate PRO程序(BD Biosciences)用于数据分析。通过在CD45+ CD19- CD56- 群体上门控，确定浸润骨髓的T细胞的百分比。为了计算T细胞的绝对数，将T细胞的百分比乘以骨髓抽吸物样品的体积。
还通过用荧光染料缀合的抗体将骨髓瘤患者骨髓细胞染色，测量代表总T细胞或T-细胞子集的效应细胞：CD3+ T细胞、CD3+ CD4+ 辅助性T细胞、CD3+ CD8+细胞毒性T细胞、CD3+ CD45RA+ CD197- 原初T细胞、CD3+ CD45RA+ CD197- CD4+原初CD4 T细胞、CD3+ CD45RA+CD197- CD8+原初CD8 T细胞、CD3+ CD45RA-记忆T细胞、CD3+ CD45RA- CD4+记忆CD4 T细胞、CD3+ CD45RA- CD8+记忆CD8 T细胞、CD3+ CD45RA- CD197+中央记忆T细胞、CD3+ CD45RA- CD197+ CD4+中央记忆CD4 T细胞、CD3+ CD45RA- CD197+ CD8+中央记忆CD8、CD3+ CD45RA-CD197-效应记忆T细胞、CD3+ CD45RA- CD197- CD4+效应记忆CD4 T细胞；CD3+ CD45RA- CD197- CD8+效应记忆CD8 T、CD3+ CD45RA+ CD197-效应T细胞、CD3+ CD45RA+ CD197- CD4+效应CD4T细胞、CD3+ CD45RA+ CD197- CD8+效应CD8 T细胞、CD3+ CD4+ CD25高CD127低调节性T细胞、CD3+ PD-1-非衰竭的T细胞、CD3+ PD-1- Tim-3-非衰竭的T细胞。为了计算T-细胞子集的绝对数，将该T-细胞子集的百分比乘以骨髓抽吸物样品的体积。
因为循环T细胞可以浸润骨髓并因此影响E:T比率，还测量了循环T细胞的百分比和绝对数。使用肝素化的或含有柠檬酸钠的试管从患者收集血液。然后将全血用荧光染料缀合的针对CD3的抗体在冰上避光染色20分钟。然后将红血细胞用裂解缓冲液(BDBioscience)裂解，并将细胞用洗涤缓冲液洗涤2次。使用多色流式细胞计和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACS Calibur流式细胞计)执行获取。将Paint-A-Gate PRO程序(BD Biosciences)用于数据分析。通过在CD3+ 群体上门控，确定循环T细胞的百分比。为了计算T细胞的绝对数，将T细胞的百分比乘以血液样品的体积。
利用在骨髓瘤患者的骨髓抽吸物中测得的浸润骨髓瘤/恶性浆细胞(即肿瘤细胞)和T细胞(例如效应细胞)的百分比，然后可以确定E:T比率。如在表6中所示，E:T比率(T细胞:骨髓瘤细胞)可以在多发性骨髓瘤患者中相当大地变化。
还测量了T-细胞子集CD4+和CD8+的评价。从未处理的骨髓抽吸物培养物(24h或更低)收集细胞悬浮液，并用荧光染料缀合的针对人CD4和人CD8的抗体(BD Bioscience, SanJose CA)染色。表6.1显示了在多发性骨髓瘤患者中的E:T比率(CD4+ T细胞:骨髓瘤细胞)，表6.2显示了在多发性骨髓瘤患者中的E:T比率(CD8+ T细胞:骨髓瘤细胞)。
还通过测量在细胞表面上表达PD-1或TIM-3的CD4或CD8 T-细胞子集的百分比，评价了与非衰竭的CD4+和CD8+ T细胞的E:T比率。从未处理的骨髓抽吸物培养物收集细胞悬浮液，并用荧光染料缀合的针对人PD-1和人TIM-3的抗体(BD Bioscience, San Jose CA)染色。表6.3显示了在多发性骨髓瘤患者中的E:T比率(CD4+ PD-1- T细胞:骨髓瘤细胞)，且表6.4显示了在多发性骨髓瘤患者中的E:T比率(CD8+ PD-1- T细胞:骨髓瘤细胞)。表6.5显示了在多发性骨髓瘤患者中的E:T比率(CD4+ TIM-3- T细胞:骨髓瘤细胞)，且表6.6显示了在多发性骨髓瘤患者中的E:T比率(CD8+ TIM-3- T细胞:骨髓瘤细胞)。
表6: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者中的效应细胞(T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
C1 2.0 21.89 11:1 (11.0)
C2 3.3 7.07 2:1 (2.0)
C3 2.74 18.09 7:1 (7.0)
C4 2.0 11.32 6:1 (6.0)
C5 20.18 9.12 0.5:1 (0.5)
C6 0.40 8.88 22:1 (22.0)
C7 4.37 15.75 3.6:1 (3.6)
C8 20.0 10.34 0.5:1 (0.5)
C9 8.20 8.38 1.02
C10 2.60 8.52 3.28
C11 18.00 6.59 0.37
C12 22 7.7 0.35
C13 12.40 6.72 0.54
C14 4.20 12.21 2.91
C15 1.76 7.16 4.07
C16 31.30 13.62 0.44
C17 12 10.43 0.87
C18 10 27.89 2.79
C19 2.30 5.53 2.40
C20 7.00 2.9 0.41
C21 6.5 6.67 1.03
C22 6.10 8.23 1.35
C23 5.00 14.77 2.95
表6.1: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞(CD4+ T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的CD4+ T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
C12 19.24 2.6 0.14
C13 2.02 2.6 1.29
C17 11.98 10.6 0.88
C18 6.35 4.8 0.76
C19 5.86 4.5 0.77
C21 2.27 6.1 2.69
C22 3.35 2.3 0.69
C23 0.76 20.5 26.97
表6.2: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞(CD8+ T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的CD8+ T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
C12 19.24 6.9 0.36
C13 2.02 4.7 2.33
C17 11.98 12.3 1.03
C18 6.35 25.9 4.08
C19 5.86 2.0 0.34
C21 2.27 6.3 2.78
C22 3.35 3.51 1.05
C23 0.76 5.6 7.37
表6.3: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞(CD4+ PD-1- T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的CD4+ PD-1- T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
CC1 1.19 18.51 15.55
CC2 1.05 10.51 10.01
CC3 2.12 2.00 0.94
CC4 11.01 2.74 0.25
CC5 12.02 1.61 0.13
CC6 3.08 3.85 1.25
CC7 0.1 0.54 5.40
CC8 2 6.10 3.05
表6.4: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞(CD8+ PD-1- T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的CD8+ PD-1- T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
CC1 1.19 11.75 9.87
CC2 1.05 5.90 5.62
CC3 2.12 3.34 1.58
CC4 11.01 4.06 0.37
CC5 12.02 4.47 0.37
CC6 3.08 5.17 1.68
CC7 0.1 1.57 15.70
CC8 2 5.55 2.78
表6.5: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞(CD4+ TIM-3- T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的CD4+ TIM-3- T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
CC1 1.19 19.76 16.61
CC2 1.05 11.24 10.70
CC3 2.12 2.02 0.95
CC4 11.01 2.74 0.25
CC5 12.02 1.67 0.14
CC6 3.08 4.07 1.32
CC7 0.1 0.54 5.40
CC8 2 6.76 3.38
表6.6: 在未治疗的多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中的效应细胞(CD8+ TIM-3- T细胞):肿瘤细胞(E:T)比率
患者编号 浸润骨髓的骨髓瘤细胞(%) 浸润骨髓的CD8+ TIM-3- T细胞(%) 骨髓中的E:T比率
CC1 1.19 12.19 10.24
CC2 1.05 7.07 6.73
CC3 2.12 3.53 1.67
CC4 11.01 4.28 0.39
CC5 12.02 4.84 0.40
CC6 3.08 5.48 1.78
CC7 0.1 1.58 15.80
CC8 2 6.56 3.28
实施例2.2: 尽管在H929骨髓瘤靶细胞的表面上检测到高BCMA表达，E:T比率影响BCMA-TCB的杀死效能
使用不同的E:T比率和在细胞表面上具有高相对于低水平的BCMA表达的人骨髓瘤细胞系，在重新定向的T-细胞细胞毒性测定中测量BCMA-1-TCB的杀死效能。
实施例2.2.1: 通过流式细胞计量术检测的人骨髓瘤细胞系上的BCMA的定性测量(中值荧光强度)
首先使用流式细胞计量术在H929和U266骨髓瘤靶细胞的细胞表面上测量BCMA的定性表达。简而言之，将细胞收获，洗涤，计数存活力，以每个96-孔圆底平板的孔50,000个细胞再悬浮，并与10µg/ml的抗-人BCMA抗体(Abcam, #ab54834, 小鼠IgG1)一起在4℃温育30分钟(以防止内化)。小鼠IgG1用作同种型对照(BD Biosciences, #554121)。然后将细胞离心(在350 x g离心5分钟)，洗涤两次并与FITC缀合的抗小鼠第二抗体一起在4℃温育30分钟。在温育时间结束时，将细胞离心(在350 x g离心5分钟)，用FACS缓冲液洗涤两次，再悬浮在100 ul FACS缓冲液中并在运行FACS Diva软件的CantoII装置上进行分析。图3描绘了H929和U266骨髓瘤细胞上的BCMA表达。与两种人骨髓瘤细胞系对照的阴性相比，存在明显的向右偏移，其中H929细胞是表达BCMA高的细胞且U266是表达BCMA中/低的细胞。
实施例2.2.2：通过流式细胞计量术检测的人骨髓瘤细胞系上的BCMA的定量测量(特异性抗原结合能力SABC)
还使用流式细胞计量术在人骨髓瘤细胞系的细胞表面上测量了BCMA的定量表达，即BCMA的特异性抗原结合能力(SABC)。使用Qifikit(Dako, #K0078)方法定量在H929 (ATCC®CRL-9068™)和U266 (ATCC®TIB-196TM)人骨髓瘤细胞系的细胞表面上的BCMA抗原拷贝数。将细胞用FACS缓冲液洗涤一次(100µl/孔；350 x g保持5分钟)，并调至100万个细胞/ml。如指示的，将50µl (= 50万个细胞)的细胞悬浮液转移进圆底96孔板的每个孔中。然后，加入50µl在FACS缓冲液(PBS, 0.1%BSA)中稀释至25µg/ml的终浓度(或在饱和浓度)的小鼠抗-人BCMA IgG (BioLegend #357502)或小鼠IgG2a同种型对照(BioLegend # 401501)，并在4℃在暗处进行染色30分钟。接着，将100µl经设置的或校准珠子加入单独孔中，并将细胞以及珠子用FACS缓冲液洗涤两次。将细胞和珠子再悬浮于25µl在Qifikit中提供的含有荧光素缀合的抗-小鼠第二抗体(在饱和浓度)的FACS缓冲液中。将细胞和珠子在4℃在暗处染色45分钟。将细胞洗涤一次，并将所有样品再悬浮于100µl FACS缓冲液中。在多色流式细胞计和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACSCalibur流式细胞计)上分析样品。如在表7中所示，H929细胞以最高密度表达人BCMA，多达其它骨髓瘤细胞系的5-6倍，并被定义为表达BCMA高的H929，相反，U266被定义为表达BCMA中/低的骨髓瘤细胞。BCMA定量表达(SABC)与BCMA定性表达(相对MFI)较好地关联。
表7: 通过流式细胞计量术检测的在人骨髓瘤细胞系上的BCMA表达的定量测量(特异性抗原结合能力SABC)
人细胞系 相对BCMA SABC值
H929 50,000
U266 6,000
表7.1: 通过流式细胞计量术检测的在人骨髓瘤细胞系上的BCMA表达的定量测量(特异性抗原结合能力SABC)
实施例1.3: E:T比率影响BCMA-TCB在重新定向的T-细胞细胞毒性测定中的效能
试验了E:T比率对BCMA-TCB抗体的杀死效能的影响。简而言之，将表达人BCMA高的H929和表达BCMA中/低的U266多发性骨髓瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤，并再悬浮于补充了10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中。将大约, 30,000个细胞/孔铺板在圆底96-孔板中，并加入构建体的各种稀释物以得到期望的终浓度(一式三份)；终浓度范围为0.1 pM至100nM。为了适当的对比，将所有TCB构建体和对照调至相同摩尔浓度。将人总T细胞(效应物)加入孔中以得到5:1的最终E:T比率。在不同的E:T比率(包括10:1、2.5:1、1:1)使用人PBMC作为效应细胞。阴性对照组由单独效应细胞或靶细胞代表。使用1 μg/ml PHA-M (Sigma #L8902)作为人pan T细胞的活化的阳性对照。为了归一化，如下确定H929 MM靶细胞的最大裂解(= 100%)：以1%Triton X-100的终浓度温育靶细胞，从而诱导细胞死亡。最小裂解(=0%)由与单独效应细胞(即没有任何T细胞双特异性抗体)一起共温育的靶细胞代表。在37℃、5%CO2温育24h以后，然后按照生产商的说明书用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience)测量细胞凋亡的骨髓瘤靶细胞向上清液中的LDH释放。在浓度-响应曲线中相对于BCMA-TCB抗体的浓度绘制LDH释放的百分比。使用Prism软件(GraphPad)测量EC50值，并确定为导致最大LDH释放的50%的TCB抗体浓度。如在表8中所示，BCMA-1-TCB的杀死表达BCMA高的H929细胞和表达BCMA中/低的U266细胞的效能受到影响，即BCMA-1-TCB的杀死效能随着E:T比率下降而减小。杀死效能的减小(即EC50值的增加)在表达BCMA中/低的U266细胞系中是更显著的，并且当E:T比率从10:1下降至2.5:1和1:1时，BCMA-1-TCB杀死能力丧失。
基于以下结果：1) E:T比率可以在多发性骨髓瘤患者中相当大地变化，和2)BCMA-TCB的杀死效能可以被E:T比率影响，需要包括在BCMA-TCB处理之前测量E:T比率的患者分层方法，因为具有高E:T比率的骨髓瘤患者将具有更多的对BCMA-TCB疗法做出应答的机会，并且具有低E:T比率的患者将具有更少的对BCMA-TCB疗法做出应答的机会。
表8: 不同的E:T比率和靶细胞上的BCMA表达影响BCMA-1-TCB的杀死表达BCMA的骨髓瘤细胞系的效能(EC50值)
1由于观察到的最小杀死而不可测量。
实施例3：通过基于ELISA的方法检测骨髓瘤患者血清/血浆和骨髓抽吸物中的可溶性BCMA
与健康的个体相比，可以在未治疗的多发性骨髓瘤患者的血清中发现高水平的可溶性BCMA，在某些患者中可溶性水平升高至120 ng/mL (Sanchez等人. Brit J Haematol2012)。由于T-细胞双特异性抗体是在体外基于细胞的测定中具有飞摩尔至皮摩尔效力的非常有效的分子，预期在患者中以非常低的剂量施用有效的临床剂量(Bargou等人.Science 2008；321 (5891)；974-7)，并且在骨髓瘤患者中的这样的可溶性BCMA然后可以如下影响BCMA-TCB抗体的效能：结合它们并阻止它们结合骨髓瘤细胞的细胞表面上的BCMA，然后阻止恶性浆细胞的重新定向的T-细胞杀死。
实施例3.1: 在骨髓瘤患者血清/血浆和骨髓抽吸物中的可溶性BCMA的测量
根据当地伦理委员会指南和赫尔辛基宣言，在给出知情同意书以后，从多发性骨髓瘤患者收集外周血和骨髓抽吸物。将来自CorvacTM血清分离试管(Becton Dickinson)的血清通过离心分离并在-80℃储存备用。将骨髓抽吸物或血液收集在肝素化的试管中，离心，并将上清液收集和在-80℃储存备用。在一些实验中，将患者骨髓抽吸物培养多达48h，然后测定可溶性BCMA测量。通过BCMA酶联免疫吸附测定(ELISA) (R&D Systems, 目录号DY193E)分析血清、血浆和上清液样品。将血清/血浆/骨髓样品1:50稀释，并根据生产商的方案进行BCMA ELISA测定。使用设定至450 nm的平板读数器分析ELISA平板。值代表每个样本上的三份样品的平均值。值得注意的是，该特异性BCMA ELISA试剂盒不与重组人APRIL或BAFF、重组人TACI/Fc或重组小鼠BCMA/Fc或小鼠BCMA交叉反应。使用鼠单克隆抗-人BCMA抗体(目录号WH0000608M1；Sigma-Aldrich)或在BCMA ELISA中提供的多克隆捕获抗体温育BCMA抗原标准品或来自骨髓瘤患者的血清/血浆/骨髓(1:50稀释)。然后根据BCMA ELISA方案测定样品。表8.1总结了在培养(大约48h)的未处理的骨髓瘤患者骨髓抽吸物的上清液中测量的可溶性BCMA的水平。
表8.1: 在培养的骨髓瘤患者的骨髓抽吸物上清液中的可溶性BCMA水平 可溶性BCMA (pg/mL)
P1 5625
P8 4630
P12 4951
P13 974
P17 640
P18 1696
P19 757
P20 3060
P21 7340
P22 3420
P23 3317
实施例3.2：验证BCMA-TCB抗体是否结合骨髓瘤患者血清/血浆和骨髓抽吸物中的可溶性BCMA
使用捕获夹心ELISA方法，将针对人BCMA ECD的多克隆BCMA抗体用作捕获抗体，并将代表BCMA-TCB双特异性抗体的BCMA结合剂的BCMA抗体用作检测抗体，针对与BCMA-TCB抗体的结合试验了先前收集并在-80℃储存的含有可溶性BCMA的骨髓瘤患者血清/血浆和骨髓抽吸物上清液样品。简而言之，将多克隆捕获BCMA抗体以1 - 10µg/mL的浓度在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中固定化在PVC微孔滴定板上。然后将平板用粘性塑料覆盖并在4℃温育过夜。然后将包被溶液除去，并将平板通过给孔填充200 μl PBS洗涤2次。通过将平板在槽上轻打，将溶液或洗液除去。通过在纸巾上拍打平板，除去剩余的滴。然后通过每孔加入200 μl封闭缓冲液、5%脱脂奶粉/PBS，封闭包被的孔中的剩余的蛋白结合部位。然后将平板用粘性塑料覆盖并在室温温育至少1-2小时或在4℃温育过夜。一式两份地向每个孔中加入100 μl适当地稀释的样品，其来自含有可溶性BCMA的骨髓瘤患者血清/血浆和骨髓抽吸物上清液样品。用每个平板运行标准和空白。然后将微量培养板在37℃温育90分钟。然后除去样品，并将平板通过给孔填充200 μl PBS洗涤2次。向每个孔加入100 μl稀释的生物素缀合的检测抗体，其由代表BCMA-TCB双特异性抗体的BCMA结合剂的BCMA抗体组成。然后将平板用粘性塑料覆盖并在室温温育2小时。将平板用PBS洗涤4次。洗涤后，向孔中加入100 μl抗生蛋白链菌素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。在即将使用之前在封闭缓冲液中在最佳浓度稀释HRP或ALP缀合的抗生蛋白链菌素。然后将平板用粘性塑料覆盖，并在室温温育1-2小时。然后将平板用PBS洗涤4次。将pNPP (对硝基苯基-磷酸)用作ALP底物并加入孔中和在室温温育15-30分钟。然后通过加入等体积的0.75 M NaOH停止反应。然后使用平板读数器在405 nm测量平板。对于HRP底物，使用过氧化氢，并在450 nm读出最佳密度。然后从由系列稀释物产生的数据制备标准曲线，浓度在x轴(对数标度)上，吸光度在Y轴(线性)上。
实施例4: 在骨髓瘤患者血清/血浆和骨髓中的可溶性APRIL或BAFF的检测
在某些血液学恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤中，循环BCMA-配体APRIL和BAFF的水平可以升高(Moreaux等人. 2004；Blood 103(8): 3148-3157)。因而，本发明人认识到，血清/血浆中的高水平的配体可能干扰BCMA-TCB抗体与肿瘤细胞上的BCMA受体的结合。与健康供体相比，在多发性骨髓瘤患者血液中的循环APRIL (BCMA的高亲和配体)的水平是约100 ng/mL相对于约10 ng/mL。对于BAFF (BCMA的低亲和配体)，水平可以在1-1000 ng/mL之间波动，与此相比，在健康供体中为约3 ng/mL。在肿瘤细胞附近，即在多发性骨髓瘤患者的骨髓微环境中(骨髓是组成性地富含APRIL的器官)，APRIL/BAFF浓度可以可以远远高于在血清中测得的水平。更重要的是，组成性地在骨髓微环境中表达的APRIL是恶性骨髓瘤细胞的一种重要存活因子，并且也主要由骨髓骨髓样前体细胞产生和分泌(Matthes等人. Blood2011; 118 (7): 1838-1844)。因而，骨髓瘤患者的骨髓中的APRIL浓度(其预期具有较高量级，高达1000 ng/mL或甚至更多)在该背景下具有高关联性。在某些自身免疫疾病诸如系统性红斑狼疮中，循环APRIL的水平也升高，具有约85 ng/mL (Koyama等人. 2005；Ann RheumDis 64: 1065-1067)。
关于与可溶性APRIL (具有高亲和力的BCMA配体)竞争对BCMA受体的结合的BCMA-TCB抗体，高水平的可溶性APRIL可能影响它们的效能，特别当预期BCMA-TCB抗体临床有效浓度低(因为它们是有效的分子)时。因而，需要测量多发性骨髓瘤患者血液/血清/血浆或骨髓抽吸物样品中的可溶性APRIL。
实施例4.1：通过基于ELISA的方法可以在骨髓瘤患者的血清/血浆或骨髓抽吸物中测量可溶性APRIL的不同水平
根据当地伦理委员会指南和赫尔辛基宣言，在提供知情同意书以后，从多发性骨髓瘤患者收集外周血和骨髓抽吸物。将来自CorvacTM血清分离试管(Becton Dickinson)的血清通过离心分离并在-80℃储存备用。将骨髓抽吸物和血液收集在肝素化的试管中，离心，并收集上清液和在-80℃储存备用。在有些实验中，将患者骨髓抽吸物培养多达48h，然后测定可溶性APRIL测量。通过APRIL酶联免疫吸附测定(ELISA) (R&D Systems, 目录号DY884B)分析血清、血浆和骨髓上清液样品。将血清样品1:50稀释，并根据生产商的方案进行APRILELISA测定。使用设定至450 nm的平板读数器分析ELISA平板。值代表每个样本上的两份或三份样品的平均值。使用在APRIL ELISA试剂盒中提供的捕获抗体温育APRIL抗原标准或来自骨髓瘤患者的血清/血浆或骨髓抽吸物上清液(1:50稀释)。然后根据APRIL ELISA方案测定样品。
实施例4.2: 可溶性APRIL影响APRIL竞争性/阻断性BCMA-TCB抗体的杀死BCMA-阳性的骨髓瘤靶细胞的效能
为了验证APRIL阻断性/竞争性BCMA-TCB抗体的杀死效能是否受可溶性APRIL影响，在有存在于多发性骨髓瘤患者中的升高浓度(即100 ng/mL至1000 ng/mL)的可溶性APRIL存在下，针对它们在交联构建体(通过抗原结合部分与细胞上的BCMA的结合)后诱导T细胞介导的BCMA-阳性的骨髓瘤靶细胞的杀死的潜力，分析了APRIL阻断性/竞争性BCMA-TCB抗体。由于APRIL以高多达1000倍的亲和力结合人BCMA(相对于BAFF结合所述受体)，可溶性APRIL的高浓度在该背景下是比可溶性BAFF的高浓度更相关的。高水平的可溶性APRIL最可能影响TCB抗体的效力，特别当在非常低的剂量在患者中施用所述治疗剂时(Bargou等人.Science 2008；321 (5891)；974-7)。因而，执行下述实验。
实施例4.2.1：如通过细胞内磷酸化的NF-κB检测到的，APRIL阻断性/竞争性J6M0-TCB抗体阻断APRIL依赖性的NF-κB活化(流式细胞计量术)
计划要在重新定向的T-细胞杀死测定中试验可溶性APRIL对J6M0-TCB(一种用APRIL/BAFF竞争性J6M0 (Tai YT等人. Blood 2014 123(29): 3128-28)作为BCMA结合剂制备的BCMA-TCB双特异性抗体)的杀死效能的影响，但是在这样做之前，进行实验以确认J6M0-TCB实际上阻断并与APRIL竞争。试验了J6M0-TCB以阻断APRIL依赖性的NF-κB活化。通过流式细胞计量术测量细胞内磷酸化的NF-κB的检测，如在Lafarge等人. BMC Molecular Biol2007; 8:64中所述。磷酸化流式细胞计量术方法是通过基于ELISA的发光测定检测NF-κB活化的一种替代方案，其可能是不够灵敏的，且含有艰苦的步骤(Perez和Nolan. NatBiotechnol 2002；20(2):155-62)。评估了J6M0-TCB与BCMA-阳性的H929骨髓瘤细胞的结合是否阻断APRIL依赖性的NF-κB活化，BCMA受体的已知的核因子信号传递途径下游。简而言之，将H929细胞在37℃在细胞培养箱中在不含FCS的RPMI1640中饥饿24 h。在饥饿时间结束时，将细胞收获，计数，并使用ViCell评价细胞生存力。将活细胞在含有BSA的FACS染色缓冲液(BD Biosciences)中调至1 x 106细胞/ml。将100µl该细胞悬浮液进一步每孔等分到圆底96-孔板中并与25µl在饱和浓度400 nM (77µg/ml)的J6M0-TCB抗体或同种型对照抗体一起在37℃温育20分钟，随后与100 ng/mL或1µg/mL重组小鼠Δ-APRIL (R&D SystemsEurope)一起在37℃直接温育另外15分钟。作为阴性对照，将细胞放置不处理，或与400 nM(77µg/ml)的对应IgG同种型对照抗体一起在37℃温育共计45分钟。作为阳性对照，将细胞与100 ng/mL或1µg/mL的单独重组小鼠Δ-APRIL (R&D Systems Europe)一起在37℃温育15分钟。在刺激结束时，将细胞离心(360 x g, 4分钟)，将细胞沉淀物立即在预温热的Cytofix Buffer (BD Biosciences, #554655)中固定，并在37℃温育10分钟。然后将细胞离心，将上清液除去，并将细胞沉淀物通过涡旋打散。然后将细胞在冰上在冰冷的PhosflowPerm Buffer III (BD Biosciences, #558050)中渗透化处理30分钟。然后将细胞离心，将上清液除去，并将细胞沉淀物通过涡旋打散。将细胞再悬浮于100µL Phosflow PermBuffer III中，并将渗透化处理的细胞用抗-NF-κB p65 (pS529)抗体(BD Biosciences, #558423)或同种型对照抗体(小鼠IgG2b, κ, BD Biosciences #555058)在室温避光染色60分钟。染色阶段以后，在流式细胞计数分析之前用PBS + 0.1%的BSA在PBS中的溶液+ 0.1%BS洗涤细胞。测量从如上所述处理的H929细胞得到的相对中值荧光强度。将在有同种型对照存在下Δ-APRIL结合后得到的中值荧光强度(MFI)信号设定为1；将其它信号向它归一化。如在图4中所示，在1000 ng/mL的APRIL介导的H929细胞中的NF-κB活化上试验了具有APRIL竞争性BCMA结合臂的J6M0-TCB抗体的影响。可溶性APRIL向H929细胞的添加诱导NF-κB活化。当将H929细胞暴露于J6M0-TCB的APRIL竞争性BCMA结合臂时，存在NF-κB活化信号的至少79.3%下降，如通过磷酸化流式细胞计量术测得的。已经报道J6M0抗-BCMA抗体(WO2012163805)阻断APRIL诱导的NF-κB活化。当前的结果证实，J6M0是与APRIL竞争对BCMA的结合且阻断APRIL下游信号传递的抗-BCMA抗体。
实施例4.2.2: 高水平的可溶性APRIL影响APRIL竞争性BCMA-TCB抗体的杀死表达BCMA的H929骨髓瘤细胞的效能(比色测量LDH释放测定)
然后在重新定向的T-细胞杀死测定中试验了可溶性APRIL对J6M0-TCB(一种用APRIL/BAFF竞争性J6M0 (Tai YT等人. Blood 2014 123(29): 3128-28)作为BCMA结合剂制备的BCMA-TCB双特异性抗体)的杀死效能的影响。简而言之，将人BCMA-阳性的H929多发性骨髓瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤，并再悬浮于补充了10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中。将大约30,000个细胞/孔铺板在圆底96-孔板中，并将TCB构建体的各种稀释液加入以得到期望的终浓度(一式三份)；J6M0-TCB抗体的终浓度范围为0.1 pM至10 nM，在有或没有100 ng/mL或1000 ng/mL的终浓度的APRIL存在下。为了适当的对比，将所有TCB构建体和对照调至相同摩尔浓度。将人PBMC (效应物)加入孔中以得到10:1的最终E:T比率。阴性对照组由单独效应细胞或靶细胞代表。使用1 μg/mL PHA (Sigma #L8902)作为人pan T细胞的活化的阳性对照。为了归一化，如下确定H929 MM靶细胞的最大裂解(= 100%)：以1%Triton X-100的终浓度温育靶细胞，从而诱导细胞死亡。最小裂解(= 0%)由与单独效应细胞(即没有任何T细胞双特异性抗体)一起共温育的靶细胞代表。在37℃、5%CO2温育24 h以后，然后按照生产商的说明书用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science)测量细胞凋亡的/坏死的H929骨髓瘤靶细胞向上清液中的LDH释放。在浓度-响应曲线中相对于J6M0-TCB抗体的浓度绘制LDH释放的百分比。使用Prism软件(GraphPad)测量EC50值，并确定为导致最大LDH释放的50%的TCB抗体浓度。如在图5中所示，在有或没有外源可溶性APRIL存在下，J6M0-TCB抗体诱导BCMA-阳性的H929骨髓瘤细胞的杀死。如在图5中所示，在没有外源APRIL存在下，APRIL阻断性/竞争性J6M0-TCB以低皮摩尔效能(EC50APRIL0= 5.8 pM)诱导BCMA-阳性的H929骨髓瘤的浓度依赖性杀死。当将100 ng/mL的APRIL加入培养物中时，这样的浓度的配体仅微小影响由J6M0-TCB介导的杀死效能，如EC50的2.4倍增加(EC50APRIL100= 14.2pM)所证实的。但是，当将1000 ng/mL的APRIL加入培养物中时，由J6M0-TCB介导的杀死效能极大地减小，如84.3倍的EC50增加(EC50APRIL1000= 488.9 pM)所反映的。表9总结了在没有和有外源APRIL存在下APRIL阻断性/竞争性J6M0-TCB的EC50值。
结果提示，APRIL阻断性/竞争性BCMA-TCB抗体可以被高浓度的可溶性APRIL影响，所述高浓度的可溶性APRIL可以存在于多发性骨髓瘤患者的骨髓微环境或血液中。将这些观察结果移入临床情形是指，在骨髓或血液中含有高水平的APRIL的患者中，在BCMA-TCB(诸如J6M0-TCB)的给定的低治疗剂量，不能杀死骨髓瘤细胞，并且在具有高水平的可溶性APRIL的患者中的抗肿瘤作用完全丧失。
表9: APRIL/BAFF竞争性BCMA-TCB的杀死H929骨髓瘤细胞的效能(EC50)被高水平的可溶性APRIL降低
外源APRIL (ng/mL) 在24h的H929杀死　EC50 (pM) EC50倍数增加
0 5.8 -
100 14.2 2.4x
1000 488.9 84.3x
实施例4.3: 可溶性APRIL影响APRIL竞争性/阻断性BCMA-TCB抗体的诱导T-细胞活化的效能
还通过流式细胞计量术试验了可溶性APRIL对APRIL竞争性/阻断性J6M0-TCB的诱导T-细胞活化的效能的影响。如下测量T细胞活化：评价在有或没有表达人BCMA的MM细胞存在下早期活化标志物CD69或晚期活化标志物CD25在CD4+和CD8+ T细胞上的表面表达。简而言之，将BCMA-阳性的H929细胞用细胞解离缓冲液收获、计数并检查生存力。将细胞在经改进的RPMI-1640培养基中调至0.3 x 106 (存活的)细胞/ml，将100 μl该细胞悬浮液每孔移入圆底96-孔板中(如指示的)。将50 μl (稀释的) APRIL竞争性/阻断性J6M0-TCB抗体加入含细胞的孔中以得到0.3 pM - 30 nM的终浓度。将人PBMC效应细胞从健康供体的新鲜血液分离，并在经改进的RPMI-1640培养基中调至6 x 106 (存活的)细胞/ml。将50 μl该细胞悬浮液加入测定板的每孔中，以得到10:1的PBMC:骨髓瘤肿瘤细胞的最终E:T比率。为了分析APRIL竞争性/阻断性J6M0-TCB抗体是否能够在有表达人BCMA的靶细胞存在下特异性地活化T细胞，包括了这样的孔：其含有3 nM的J6M0-TCB抗体、以及PBMC，但是不含有靶细胞。在37℃、5%CO2温育15-28 h (CD69)或24-48 h (CD25)以后，将细胞离心(5分钟, 350 x g)，并用150 μl/孔的含有0.1%BSA的PBS洗涤2次。根据供应商的提议，在4℃进行针对CD4 (小鼠IgGl,K；克隆RPA-T4)、CD8 (小鼠IgGl,K；克隆HIT8a；BD #555635)、CD69 (小鼠IgGl；克隆L78；BD #340560)和CD25 (小鼠IgGl,K；克隆M-A251；BD #555434)的表面染色30分钟。将细胞用150 μl/孔的含有0.1%BSA的PBS洗涤2次，并使用100 μl/孔的固定缓冲液(BD #554655)在4℃固定15分钟。离心以后，将样品再悬浮于200 μl/孔的含有0.1%BSA的PBS中，并使用FACS CantoII机器(Software FACS Diva)进行分析。图6描绘了温育48小时以后早期活化标志物CD69 (B、D)和晚期活化标志物CD25 (A、C)在CD4+和CD8+ T细胞上的表达水平(来自两个独立实验的代表性结果)。在有BCMA-阳性的靶细胞存在下，在没有外源可溶性APRIL存在下，APRIL竞争性/阻断性J6M0-TCB抗体以浓度依赖性的和特异性的方式诱导CD69和CD25活化标志物的上调(正方形)。当将100 ng/mL的可溶性APRIL加入培养物中时，对于CD4+和CD8+ T细胞上的活化标志物CD69和CD25观察到浓度-响应曲线的向右轻微偏移。当将1000 ng/mL的可溶性APRIL加入培养物中时，存在CD4+和CD8+ T细胞上的T-细胞活化的明显下降。当用DP47-TCB对照抗体处理人PBMC时，没有观察到CD4+和CD8+ T细胞的活化，从而提示，尽管结合T细胞上的CD3，但是当TCB抗体不结合BCMA-阳性的靶细胞时，不发生T-细胞活化(数据未显示)。结果清楚地提示，高水平的可溶性APRIL减小BCMA-TCB抗体在结合肿瘤靶标和T细胞后诱导T-细胞活化的效能，特别当BCMA-TCB与APRIL竞争时。
实施例5：BCMA-1-TCB抗体的杀死骨髓瘤患者恶性浆细胞的效能在具有较大E:T比率和恶性浆细胞上的较大BCMA表达(相对MFI)的患者骨髓样品中是更显著的。
根据当地伦理委员会指南和赫尔辛基宣言，在给予知情同意书以后，从多发性骨髓瘤患者收集骨髓抽吸物。为了评价BCMA-1-TCB抗体的诱导浸润骨髓的自体T细胞对浸润骨髓的恶性浆细胞的重新定向的T-细胞杀死的效能，从骨髓瘤患者收集全骨髓样品，并将BCMA-1-TCB抗体直接掺入全骨髓样品中。简而言之，将200µl全骨髓样品转移至96深孔平板。在无菌PBS中制备BCMA-1-TCB抗体和对照抗体稀释液，并将制品加入各个孔中以得到0.03 pM至30 nM的终浓度范围。将全骨髓-抗体悬浮液通过轻轻摇动进行混合，然后在37℃、5%CO2温育24 h，用石蜡膜密封。温育时段以后，将细胞悬浮液样品用K3-EDTA (乙二胺四乙酸)裂解红细胞，并制备用于免疫表型分析的细胞样品。将基于抗体集合(包括CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/BCMA-APC/膜联蛋白-V-PerCP-Cy5.5)制备的20µl对应的FACS抗体溶液加入96-U-底平板中。荧光染料标记的抗体购自BD Biosciences (San Jose, CA)和Caltag Laboratories (San FranciscoCA)，并使用自制的APC缀合的抗-人BCMA抗体。然后将样品在暗处在室温温育15分钟，并使用多激光流式细胞计获取和分析。通过评价在恶性浆细胞群体CD138+ CD38+ CD45+ CD19- CD56+上门控的膜联蛋白-V阳性表达来确定骨髓瘤细胞死亡。然后在BCMA-1-TCB双特异性抗体的每种浓度确定骨髓瘤细胞死亡的百分比。如在图7中所示，BCMA-1-TCB诱导已经温育仅24h以后来自患者C1 (A)和患者C8 (B)的恶性浆细胞的浓度依赖性的特异性杀死。但是，骨髓瘤细胞的杀死在患者C1骨髓样品中比在患者C8骨髓样品中更显著。这可以归因于与在具有不利的0.5:1的E:T比率和更弱的在骨髓瘤细胞上的BCMA表达(即1489的相对MFI值)的患者C8骨髓样品中相比在患者C1骨髓样品中更有利的11:1的E:T比率和BCMA表达(即2636的相对MFI值)。结果提示，与患者骨髓中E:T比率的测量组合的恶性浆细胞上的BCMA表达的测量可以更准确地预测骨髓瘤患者是否可以对BCMA-TCB治疗做出应答。
实施例6: 与患者骨髓样品对BCMA-1-TCB的应答性有关的患者生物学参数(在骨髓瘤细胞上的BCMA相对表达、E:T比率、可溶性APRIL和可溶性BCMA)
具有中等相对MFI (范围为1000-5000)的样品对药物做出71.4% (5/7)应答，且具有低BCMA表达(相对MFI < 1000)的样品对药物做出33.3%(1/3)的应答。具有有利的E:T比率(E:T >1)的患者样品对药物做出66.7% (4/6)的应答。具有不利的E:T比率(< 1)的患者样品实际上对药物做出60% (3/5)应答。评价了至少两种生物学参数的组合。当在骨髓瘤细胞上的有利BCMA表达和有利的E:T比率都用于药物应答预测时，发现了75% (3/4)的相关性。
表10: 与患者骨髓样品对BCMA-1-TCB的应答性有关的患者生物学参数(在骨髓瘤细胞上的BCMA相对表达、E:T比率、可溶性APRIL和可溶性BCMA)
患者BM样品 BCMA相对MFI E:T比率(T细胞: MM PC) 可溶性BCMA (pg/mL) 对BCMA-1-TCB的应答
1 2636 11 5625 有应答
8 1489 0.5 4630 有应答
12 2396 0.35 4951 有应答
13 356 0.54 974 无应答
17 1574 0.87 640 无应答
18 1147 2.79 1696 有应答
19 1847 2.4 757 有应答
20 913 0.41 3060 有应答
21 3422 1.03 7340 无应答
22 547 1.35 3420 无应答
23 136 2.95 3317 有应答
序列表
<110> ENGMAB AG
<120>用于治疗疾病的针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体
<130> B218-0008WO1
<150> EP14196168.0
<151> 2014-12-03
<160> 24
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> CH2527 VL
<400> 1
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> CH2527 CDRL1
<400> 2
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
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<213> 小家鼠
<220>
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
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<213> 小家鼠
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro
85 90 95
Asp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
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Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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1 5

Claims (27)

1.一种特异性地结合人B-细胞成熟抗原(另外还称作“BCMA”)的细胞外结构域和人CD3ε(另外还称作“CD3”)的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的包含CD138+CD38+细胞的分离体液样品中，使用抗-BCMA抗体测量的所述CD138+CD38+细胞上的BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
2.一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的分离体液样品中T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1或更高。
3.用于根据权利要求2所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述E:T比率是0.35:1至22:1。
4.一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，并且所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，特征在于，相对于标准剂量，以1.5倍直到10倍的每周剂量执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短至每天一次。
5.用于根据权利要求4所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，相对于标准剂量，以1.5倍直到2.0倍的每周一剂执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
6.用于根据权利要求4所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，相对于标准剂量，以从每周1次施用缩短至每周2次的剂量施用之间的时间间隔，执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
7.一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在来自所述患者的分离体液样品中，APRIL的量高于10 ng/mL和高达100 ng/mL，其特征在于，相对于标准剂量，每周以1.5倍直到20倍的剂量执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔相对于标准剂量从每周1次施用缩短直到每天1次。
8.用于根据权利要求7所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，相对于标准剂量，以1.5倍直到3.0倍的每周一剂执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
9.用于根据权利要求7所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，相对于标准剂量，以从每周1次施用缩短直到每周3次的剂量施用之间的时间间隔，执行所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗。
10.一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有多发性骨髓瘤疾病的患者，所述疾病的特征在于，在所述患者的分离体液样品中包含浆细胞和T细胞，且APRIL的量是至少100 ng/mL直到1000 ng/mL，其特征在于，相对于标准剂量，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗以1.5倍直到80倍的剂量执行，或/和特征在于，剂量施用之间的时间间隔相对于标准剂量从每周1次施用缩短直到每天1次。
11.用于根据权利要求10所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗以相对于标准剂量1.5倍直到10倍的每周一剂执行。
12.用于根据权利要求10所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述用所述双特异性抗体对所述患者的治疗以相对于标准剂量从每周1次施用缩短直到每天1次的剂量施用之间的时间间隔执行。
13.一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，并且由此在所述患者的包含CD138+CD38+细胞的分离体液样品中，使用抗-BCMA抗体测量的所述CD138+CD38+细胞上的BCMA表达比作为相对中值或平均荧光强度MFI测定的基线高80或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是所述双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
14.用于根据权利要求1-13中的任一项所述的用途的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含与所述抗-BCMA抗体相同的氨基酸序列的CDR作为它的重链和轻链CDR。
15.一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，由此在所述患者的分离体液样品中的T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率(E:T比率)是0.35: 1至22:1。
16.一种特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体，其用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，其中所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离体液样品，
ii) 测量所述样品中可溶性BCMA的量，和
iii) 如果所述样品中可溶性BCMA的量是2.5 ng/mL或更高，并且
iv) 如果所述患者样品中的所述可溶性BCMA特异性地结合所述双特异性抗体，以相对于标准剂量1.5-10倍或1.5-2.0倍的每周剂量用所述双特异性抗体治疗所述患者，和/或剂量施用之间的时间间隔从每周1次施用缩短至每周2次或甚至每周3次或每天1次。
17.一种特异性地结合BCMA和CD3ε的双特异性抗体，其与可溶性BCMA竞争对人BCMA受体的结合，由此所述抗体与APRIL竞争对BCMA的结合和/或阻断APRIL介导的NF-κB的活化，所述双特异性抗体用于治疗患有涉及浆细胞的障碍的患者，由此所述疗法包括接连地：
i) 从所述患者分离包含浆细胞和T细胞的体液样品，
ii) 通过使用ELISA方法测量所述样品中APRIL的量，和
iii) 如果所述患者样品中APRIL的量高于10 ng/ml和高达100 ng/mL，那么相对于为具有低于10 ng/mL的可溶性APRIL浓度的患者推荐的剂量，以高2倍的每周剂量用所述双特异性抗体治疗所述患者，和如果APRIL浓度增加直到1000 ng/ml，那么以直到高80倍的进一步增加的剂量进行治疗；或用各自的更频繁的治疗时间表治疗所述患者以在所述双特异性抗体的任意两个剂量之间更短的时间段达到所述更高剂量。
18.一种确定患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+CD38+细胞的分离体液样品中的BCMA蛋白表达的方法，所述方法包括通过使用抗-BCMA抗体测量所述CD138+CD38+细胞上的BCMA表达，所述抗-BCMA抗体的Kd值是意图用于治疗所述患者的特异性地结合人BCMA的细胞外结构域和人CD3ε的双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍，和确定相对中值或平均荧光强度MFI是否比基线高80或更多。
19.一种确定分离体液样品中的细胞表面BCMA表达的体外方法，所述方法包括使用抗-BCMA抗体确定所述CD138+CD38+细胞的相对中值或平均荧光强度MFI是否比基线高80或更多，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
20.一种用于在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中确定CD3+细胞与CD138+CD38+细胞的比率是否为0.35: 1或更高的方法。
21.一种确定在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中CD3+细胞与CD138+CD38+细胞的比率是否为0.35: 1或更高的体外方法。
22.一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+CD38+细胞的分离体液样品中确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高的方法。
23.一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的分离体液样品中确定所述样品中可溶性BCMA的量是否为2.5 ng/mL或更高的体外方法。
24.一种在患有涉及浆细胞的障碍的患者的包含CD138+ CD38+细胞的分离体液样品中确定所述样品中可溶性APRIL的量是否为80 ng/mL或更高的方法。
25.一种用于确定细胞表面BCMA表达的试剂盒，所述试剂盒包含预装载有以下四种经标记的抗体的管形瓶或试管：一种特异性地结合CD138，一种特异性地结合CD38，一种特异性地结合CD19，和一种抗-BCMA抗体，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
26.一种用于确定E:T比率的试剂盒，所述试剂盒包含预装载有以下四种标记的抗体以检测恶性PC和T细胞的管形瓶或试管：一种特异性地结合CD138，一种特异性地结合CD38，一种特异性地结合CD19，和一种特异性地结合CD3。
27.一种用于确定可溶性BCMA的试剂盒，所述试剂盒包含多克隆抗-BCMA抗体作为捕获抗体，和检测性抗-BCMA抗体，所述抗-BCMA抗体的Kd值是特异性地结合BCMA和CD3ε的治疗性双特异性抗体的抗-BCMA抗体部分的Kd值的0.70-1.3倍。
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