ES2959635T3 - Anticuerpos biespecíficos contra CD3 épsilon y BCMA para su uso en el tratamiento de enfermedades - Google Patents
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Abstract
La divulgación se refiere a anticuerpos biespecíficos contra CD3c y BCMA para su uso en el tratamiento de enfermedades. La divulgación proporciona métodos para determinar la capacidad de respuesta de un paciente a dicho tratamiento y se relaciona con ensayos de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos contra CD3 épsilon y BCMA para su uso en el tratamiento de enfermedades
La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos contra CD3<e>y BCMA para su uso en el tratamiento de mieloma múltiple.
Antecedentes de la invención
La diana de maduración de linfocitos B humanos, también conocida como BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), es un miembro de la superfamilia de receptores de necrosis tumoral que se expresa preferentemente en células plasmáticas diferenciadas [Laabiet al.1992; Madryet al.1998]. BCMA es una proteína transmembrana de tipo III no glicosilada, que participa en la maduración, crecimiento y supervivencia de los linfocitos B. BCMA es un receptor de dos ligandos de la superfamilia TNF: APRIL (un ligando inductor de proliferación), el ligando de alta afinidad para BCMA y el factor de activación de linfocitos B BAFF, el ligando de baja afinidad a BCMA (THANK, BlyS, estimulador de linfocitos B, TALL-1 y zTNF4). APRIL y BAFF muestran similitud estructural y especificidad de unión a receptor superpuesta pero distinta. El regulador negativo TACI también se une tanto a BAFF como a APRIL. La unión coordinada de APRIL y BAFF a BCMA y/o TACI activa el factor de transcripción NF-<k>B y aumenta la expresión de miembros de la familia DE Bcl-2 que favorecen la supervivencia (por ejemplo, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1) y la disminución de factores proapoptóticos (por ejemplo, Bid, Bad, Bik, Bim, etc.), inhibiendo así la apoptosis y promoviendo la supervivencia. Esta acción combinada promueve la diferenciación, proliferación, supervivencia de los linfocitos B y producción de anticuerpos (como se revisa en Rickert RCet al.,Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133).
Novak AJet al.BLOOD, 103, (2004) 689-694 se refiere a la expresión de BCMA, TACI y BAFF-R sobre células de mieloma múltiple y el mecanismo de crecimiento. Liet al.,Med Oncol 27 (2010) 439-445 menciona que BCMA se expresa en células plasmáticas. Dispenzieriet al.,Mayo Clin Proc 82(3), (2007), 323-341 se refiere al tratamiento del mieloma múltiple basado en la estratificación de mieloma de Mayo y la terapia adaptada al riesgo (mSMART, por sus siglas en inglés). Schaumann D. (tesis, Berlín 2006) informa que se ha descubierto que BCMA es esencial para la supervivencia de las células plasmáticas de larga vida y que las células plasmáticas de larga vida son células efectoras en enfermedades autoinmunitarias, véase también O'Connoret al.,J Exp Med.199, (2004) 91-98. El documento WO2012143498 se refiere a un método para la estratificación de pacientes con mieloma múltiple (MM). El documento WO 2009/032058 se refiere a la predicción de la probabilidad de que un individuo tenga una afección asociada con actividad autoinmunitaria, tal como lupus eritematoso sistémico (LES).
Sanchez E,et al.,Br J Hematology 158, 727-38 (2012) y el documento WO2014089335 informan que las concentraciones de BCMA fueron mayores en los sobrenadantes de células mononucleares de médula ósea cultivadas de pacientes con mieloma múltiple (Mm ) que en sujetos sanos y sugieren que los niveles séricos de BCMA pueden ser un biomarcador de monitorizar el estado de la enfermedad y la supervivencia general de los pacientes con MM.
El complejo TCR/CD3 de los linfocitos T consiste en un heterodímero TCR alfa (a)/beta (p) o TCR gamma (y)/delta (8) coexpresado en la superficie celular con las subunidades invariantes de CD3 marcadas con gamma (<y>), delta (8), épsilon (£), zeta (Z) y eta (n). El CD3<e>humano se describe en UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). Un anticuerpo anti-CD3e descrito en el estado de la técnica es SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reacciona con CD3 tanto de primates como humano. SP34 está disponible en PharMingen. Otro anticuerpo anti-CD3 descrito en el estado de la técnica es UCHT-1 (véase el documento WO2000041474). Otro anticuerpo anti-CD3 descrito en el estado de la técnica es BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; utilizado en ensayos de fase I/II de GvHD, Anasettiet al.,Transplantation 54: 844 (1992)).
En el pasado reciente se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos biespecíficos recombinantes, por ejemplo mediante fusión de, por ejemplo un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (véase Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16).
Los anticuerpos contra BCMA se describen, por ejemplo, en Gras MP.et al.Int Inmunol. 7 (1995) 1093-1106, y en los documentos WO200124811, WO200124812, WO2010104949 y WO2012163805. Se mencionan, por ejemplo, anticuerpos contra BCMA y su uso para el tratamiento de linfomas y mieloma múltiple en los documentos WO2002066516 y WO2010104949. El documento WO2013154760 se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR, por sus siglas en inglés) que comprenden un resto de reconocimiento de BCMA y un resto de activación de linfocitos T. Ryan, MCet al.,Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018 se refieren al direccionamiento de BCMA hacia neoplasias malignas de células plasmáticas y la expresión de BCMA en la superficie de células de mieloma múltiple (células MM). Los anticuerpos biespecíficos contra CD3 y BCMA se mencionan en los documentos WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, WO2012143498 y WO2013072415, WO2014122143 y WO2014122144. Los documentos WO2013072406 y WO2014140248 mencionan relaciones E:T en algunas figuras y ejemplos; sin embargo, sólo se informa que en los correspondientes experimentos de ensayo de destrucción se utilizaron 10 células efectoras por 1 célula diana (líneas celulares, no muestras de pacientes). Esta relación E:T es, por lo tanto, artificial y no se mostró ninguna relación E:T en muestras de médula ósea de pacientes con mieloma ni se dio ninguna pista sobre la vinculación de la relación E:T con el tratamiento con anticuerpos.
El documento WO2012143498 menciona un método para la estratificación, diagnóstico o selección de una terapia de mieloma múltiple (MM) basada en anticuerpos de un paciente con mieloma múltiple (MM) si los linfocitos B malignos expresan la proteína BCMA en su superficie.
Existe la necesidad de una terapia mejorada para un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas.
Sumario de la invención
La presente invención y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia
Los anticuerpos biespecíficos de linfocitos T son compuestos potentes para destruir eficazmente, por ejemplo, células diana mediante la activación de linfocitos T directamente en la proximidad de las células diana. Se pueden administrar anticuerpos biespecíficos de linfocitos T que se unen a BCMA, por ejemplo, en la superficie de células plasmáticas malignas en el caso de células de mieloma múltiple o células plasmáticas secretoras de anticuerpos antinucleares en el caso de lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide, de forma dependiente para destruir estas células plasmáticas. Los presentes inventores han reconocido determinados parámetros que influyen en la destrucción de las células plasmáticas. Estos parámetros son la magnitud de la expresión de BCMA medida mediante un método de citometría de flujo apropiado, la presencia de determinadas concentraciones de BCMA soluble, la relación de linfocitos T respecto a células plasmáticas malignas y la presencia de determinadas concentraciones del ligando de BCMA soluble APRIL. Los hallazgos de los inventores proporcionan una guía importante para, por ejemplo, que el uno o más médicos tratantes puedan adaptar la terapia con anticuerpos biespecíficos de BCMA-linfocitos T al paciente individual y los hallazgos de los inventores también proporcionan la base científica para determinar kits de prueba para medir dichos parámetros.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano (denominado también "BCMA") y CD3<e>humano (denominado también "CD3"), para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, y de manera que en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente, que comprende células CD138+ CD38+, la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como la intensidad de fluorescencia media o media relativa (MFI, por sus siglas en inglés). En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3 humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a células plasmáticas, caracterizándose dicho trastorno porque en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente, que comprende células CD138+ CD38+, la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como la intensidad de fluorescencia media o media relativa (MFI, por sus siglas en inglés). En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico y dicho anticuerpo anti-BCMA son monovalentes para la unión a BCMA. Preferentemente, el valor Kd de dicho anticuerpo anti-BCMA (parte de dicho anticuerpo biespecífico) es 100 nM o inferior.
Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico y dicho anticuerpo anti-BCMA son bivalentes para la unión a BCMA.
Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico y dicho anticuerpo anti-BCMA son trivalentes para la unión a BCMA.
Preferentemente dicho anticuerpo biespecífico comprende como CDR de cadena pesada y ligera, CDR de las mismas secuencias de aminoácidos que dicho anticuerpo anti-BCMA.
Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico comprende como regiones variables de cadena pesada y ligera, regiones variables de las mismas secuencias de aminoácidos que dicho anticuerpo anti-BCMA.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3<e>humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a células plasmáticas, de manera que la relación de linfocitos T (células efectoras) a células diana (relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior. Preferentemente, la relación E:T se mide como la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+, preferentemente como la relación del subconjunto de células CD3+ de linfocitos T CD45+ CD19- CD56- respecto a células CD138+ CD38+ CD45+ CD19- CD56+. Si el paciente padece mieloma múltiple, dichas células diana son, por tanto, células de mieloma múltiple. En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3<e>humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, caracterizándose dicho trastorno porque la relación de linfocitos T (células efectoras) a células diana (relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, preferentemente 10:1 o superior y preferentemente 0,35:1 a 22:1. Las relaciones E:T encontradas en las muestras de los pacientes para quienes las muestras podían tratarse eficazmente fueron de 0,35 y superiores. Se analizaron muestras con una relación E:T entre 0,35:1 y 11:1, respectivamente. También se detectaron relaciones E:T de hasta 22:1 en muestras de pacientes (no analizadas). Basándose en estos hallazgos, los presentes inventores reconocieron que los pacientes con dichas muestras o con muestras con valores de E:T aún mayores también podrían tratarse de manera eficaz con un anticuerpo biespecífico para su uso según la invención. Preferentemente, la relación E:T se mide como la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+, preferentemente como la relación del subconjunto de células CD3+ de linfocitos T CD45+ CD19-CD56- respecto a células CD138+ CD38+ CD45+ CD19- Cd 56+. Si el paciente padece mieloma múltiple, dichas células diana son, por tanto, células de mieloma múltiple. En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3e humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a células plasmáticas, de manera que dicha terapia comprende sucesivamente
i) aislar de dicho paciente una muestra de fluido corporal,
ii) medir la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra, y
iii) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es 2,5 ng/ml o superior, y
iv) si dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico en dosis más altas y/o en un programa de tratamiento más frecuente.
En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3<e>humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a células plasmáticas, caracterizándose dicho trastorno porque en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente la cantidad de BCMA soluble es 2,5 ng/ml o superior, y dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, caracterizado por que dicho tratamiento de dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico se realiza con una dosis por semana que es de 1,5 veces hasta 10 veces o/y porque el intervalo de tiempo entre administraciones de dosis se acorta desde una administración por semana hasta una vez al día en comparación con una dosis convencional. Preferentemente, dicho tratamiento de dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico se realiza con una dosis por semana que es de 1,5 veces hasta 2,0 veces en comparación con una dosis convencional. Preferentemente, dicho tratamiento de dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico se realiza de manera que el intervalo de tiempo entre administraciones de dosis se acorta desde una administración por semana hasta dos veces a la semana en comparación con la dosis convencional. En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3<e>humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a células plasmáticas, de manera que dicha terapia comprende sucesivamente
i) aislar de dicho paciente una muestra de fluido corporal,
ii) medir la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra, y
iii) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es 2,5 ng/ml o superior, y
iv) si dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico a una dosis más alta para la primera dosis o en un programa de tratamiento más frecuente con un período más corto entre la primera dosis y la segunda dosis de dicho anticuerpo biespecífico o con un período más corto entre la primera dosis y la tercera dosis de dicho anticuerpo biespecífico.
En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e que compite con BCMA soluble por la unión al receptor de BCMA humano y/o bloquea la activación mediada por APRlL de NF-kB para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, de manera que dicha terapia comprende sucesivamente
i) aislar de dicho paciente una muestra de fluido corporal que comprende células plasmáticas y linfocitos T,
ii) medir la cantidad de APRIL en dicha muestra, y
iii) si la cantidad de APRIL en dicha muestra de paciente es superior a 100 ng/ml, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico en dosis más altas y/o en un programa de tratamiento más frecuente.
En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e que compite con BCMA soluble por la unión al receptor de BCMA humano y/o bloquea la activación mediada por APRlL de NF-kB para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, caracterizándose dicho trastorno porque en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente la cantidad de APRIL es superior a 10 ng/ml y hasta 100 ng/ml, caracterizado por que dicho tratamiento de dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico se realiza por semana con una dosis que es de 1,5 veces hasta 20 veces o/y porque el intervalo de tiempo entre administraciones de dosis se acorta desde una administración por semana hasta una vez al día en comparación con una dosis convencional. Preferentemente, dicho tratamiento de dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico se realiza con una dosis por semana que es de 1,5 veces hasta 3,0 veces en comparación con una dosis convencional. Preferentemente, dicho tratamiento de dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico se realiza de manera que el intervalo de tiempo entre administraciones de dosis se acorta desde una administración por semana hasta tres veces a la semana en comparación con la dosis convencional. En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e que compite con BCMA soluble por la unión al receptor de BCM<a>humano, de manera que dicho anticuerpo compite con APRIL por la unión a BCMA, de manera que dicho anticuerpo compite con APRIL por la unión a BCMA, de manera que dicho anticuerpo compite con APRIL por la unión a BCMA y/o bloquea la activación de NF-<k>B mediada por APRIL para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, de manera que dicha terapia comprende sucesivamente
i) aislar de dicho paciente una muestra de fluido corporal que comprende células plasmáticas y linfocitos T,
ii) medir la cantidad de APRIL en dicha muestra, y
iii) si la cantidad de APRIL en dicha muestra de paciente es superior a 100 ng/ml, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico a una dosis dos veces mayor a concentraciones de APRIL de 100 ng/ml y una dosis adicional aumentada hasta 80 veces mayor si la concentración de APRIL aumenta hasta 1000 ng/ml, en comparación con la dosis recomendada para un paciente con una concentración de APRIL soluble inferior a 100 ng/ml o tratar a dicho paciente con un programa de tratamiento correspondiente más frecuente para alcanzar dichas dosis más altas con un período más corto entre dos dosis cualesquiera de dicho anticuerpo biespecífico.
En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e que compite con BCMA soluble por la unión al receptor de BCM<a>humano, de manera que dicho anticuerpo compite con APRIL por la unión a BCMA, de manera que dicho anticuerpo compite con APRIL por la unión a BCMA, de manera que dicho anticuerpo compite con APRIL por la unión a BCMA y/o bloquea la activación de NF-kB mediada por APRIL para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, caracterizándose dicho trastorno por que en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente que comprende células plasmáticas y linfocitos T, la cantidad de APRIL es superior a 100 ng/ml, caracterizado por tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico a una dosis dos veces mayor a concentraciones de APRIL de 100 ng/ml y una dosis adicional aumentada hasta 80 veces mayor si la concentración de APRIL aumenta hasta 1000 ng/ml, en comparación con la dosis recomendada para un paciente con una concentración de APRIL soluble inferior a 100 ng/ml o tratar a dicho paciente con un programa de tratamiento correspondiente más frecuente para alcanzar dichas dosis más altas con un período más corto entre dos dosis cualesquiera de dicho anticuerpo biespecífico. En la presente invención, el trastorno que afecta a las células plasmáticas es mieloma múltiple.
La cantidad de APRIL se mide preferentemente mediante el uso de un método ELISA.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se encuentra un método para determinar la expresión de la proteína BCMA en una muestra aislada de fluido corporal que comprende células CD138+ CD38+, de un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, comprendiendo dicho método medir la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+ utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>, destinado a su uso en el tratamiento de dicho paciente, y determinar mediante citometría de flujo si la intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende analizar una muestra aislada de fluido corporal que comprende células CD138+ CD38+ de dicho paciente para determinar la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+ mediante el uso de un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e, destinado para su uso en el tratamiento de dicho paciente, y si la si la intensidad de fluorescencia media m Fi o media relativa es 80 o más, preferentemente 100 o más por encima del valor inicial, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más tratando a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico.
Preferentemente, la divulgación se refiere a la selección de un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, y de manera que una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente muestra una MFI para BCMA de 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para predecir la probabilidad de que un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, responda a un tratamiento con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>, en el que la expresión de BCMA en la superficie celular en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente, que comprende células CD138+ CD38+, y medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, es 80 o más, preferentemente, 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa es predictiva de la probabilidad de que el paciente responda a dicho tratamiento.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitropara determinar la expresión de BCMA en la superficie celular en una muestra aislada de fluido corporal, que comprende determinar si la intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa para dichas células CD138+ CD38+, utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de un anticuerpo biespecífico terapéutico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>, es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitropara seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, en el que para dicho paciente la expresión de BCMA en la superficie celular en una muestra aislada de fluido corporal, que comprende células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de un anticuerpo biespecífico terapéutico, que se une específicamente a BCMA y CD3<e>, es 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 por encima del valor inicial determinado como la intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa, de manera que el plan de tratamiento implica el uso de un anticuerpo biespecífico terapéutico que se une específicamente a BCMA y CD3e.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para seleccionar una terapia para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende
i) si la expresión de BCMA en la superficie celular en una muestra aislada de fluido corporal, que comprende células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de un anticuerpo biespecífico terapéutico, que se une específicamente a BCMA y CD3e, es 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como la intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
ii) si la expresión de BCMA en la superficie celular en una muestra aislada de fluido corporal, que comprende células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de un anticuerpo biespecífico terapéutico, que se une específicamente a BCMA y CD3e, es inferior a 100, preferentemente inferior a 50, incluso preferentemente inferior a 10 con respecto al valor inicial determinado como intensidad de fluorescencia media MFI o mediana relativa, no tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para determinar en una muestra aislada de fluido corporal de un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para tratar a un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior.
Preferentemente, la divulgación se refiere a seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestre una relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ de 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior.
Preferentemente, la divulgación se refiere a la selección de un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente, de manera que
i) si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ en una muestra de fluido corporal de dicho paciente es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior, tratar a dicho paciente con un anticuerpo biespecífico terapéutico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>en monoterapia
ii) si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es inferior a 0,5:1, preferentemente inferior a 0,25:1, tratar a dicho paciente con un anticuerpo biespecífico terapéutico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>en combinación con terapia proliferativa de linfocitos T o terapia quimioatrayente de linfocitos T.
La divulgación se refiere a un método para predecir la probabilidad de que un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, responda a un tratamiento con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e, midiendo en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior, que es indicativa de la probabilidad de que el paciente responda a un tratamiento.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitropara determinar en una muestra aislada de fluido corporal de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ es 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitropara seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, de manera que en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ se determina como 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior y de manera que el plan de tratamiento implica el uso de un anticuerpo biespecífico terapéutico que se une específicamente a BCM<a>y CD3<e>.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para seleccionar una terapia con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e para un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende
i) si en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, preferentemente 1:1 o superior, más preferentemente 5:1 o superior, incluso más preferentemente 10:1 o superior, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
ii) si en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ es inferior a 0,35:1, preferentemente de 0,5:1, preferentemente inferior a 0,25:1, tratar a dicho paciente con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3 en combinación con terapia proliferativa de linfocitos T o terapia quimioatrayente de linfocitos T.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se encuentra un método para determinar en una muestra aislada de fluido corporal que comprende células CD138+ CD38+, de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es de 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para tratar a un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende determinar si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra de fluido corporal es 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior.
Preferentemente, la divulgación se refiere a seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestre una MFI para BCMA de 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial. La invención se refiere a un método para predecir la probabilidad de que un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, responda a un tratamiento con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3e, de manera que una cantidad de BCMA soluble en dicha muestra de fluido corporal de 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior es predictiva de la probabilidad de que el paciente responda a un tratamiento.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitrode determinación en una muestra aislada de fluido corporal, si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es de 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior.
Preferentemente, la divulgación se refiere a seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestre una cantidad de BCMA soluble de 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitropara seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, determinando si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior, y el plan de tratamiento implica el uso de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para seleccionar una terapia para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas una terapia, que comprende
i) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es inferior a 2,5 ng/ml, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
ii) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es de 2,5 ng/ml o superior y,
si dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente no se une a dicho anticuerpo biespecífico, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
iii) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior y,
si dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico en dosis más altas y/o en un programa de tratamiento más frecuente.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para seleccionar una terapia para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas una terapia, que comprende
i) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es inferior a 2,5 ng/ml, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
ii) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es de 2,5 ng/ml o superior y,
si dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente no se une a dicho anticuerpo biespecífico, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
iii) si la cantidad de BCMA soluble en dicha muestra es 2,5 ng/ml o superior, preferentemente 10 ng/ml o superior, más preferentemente 50 ng/ml o superior, incluso más preferentemente 250 ng/ml o superior y, si dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico en una dosis más alta para la primera dosis o en un programa de tratamiento más frecuente con un período más corto entre la primera dosis y la segunda dosis de dicho anticuerpo biespecífico o con un período más corto entre la primera dosis y la tercera dosis de dicho anticuerpo biespecífico.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se encuentra un método para determinar en una muestra aislada de fluido corporal que comprende células CD138+ CD38+, de un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, si la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es de 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas y se le diagnostica que la cantidad de APRIL soluble en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es de 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior, con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>.
Preferentemente, la divulgación se refiere a seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestre una cantidad de APRIL soluble de 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para predecir la probabilidad de que un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, responda a un tratamiento con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3<e>, de manera que la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es de 100 ng/ml, preferentemente 1000 ng/ml o superior es predictiva de la probabilidad de que el paciente responda a un tratamiento.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitrode determinación en una muestra aislada de fluido corporal, si la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es de 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un métodoin vitropara seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, determinando si la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior, y el plan de tratamiento implica el uso de un anticuerpo biespecífico competitivo de APRIL o un anticuerpo biespecífico no competitivo de APRIL.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para seleccionar una terapia para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas una terapia, que comprende
i) la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es 100 ng/ml o menos, preferentemente 20 ng/ml o menos tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
ii) la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior, tratar a dicho paciente con anticuerpos biespecíficos no competitivos de APRIL, o
iii) la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es superior a 100 ng/ml, preferentemente 1000 ng/ml o superior, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico en dosis más altas y/o en un programa de tratamiento más frecuente.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para seleccionar una terapia para tratar a un paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas una terapia, que comprende
i) la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es 100 ng/ml o menos, preferentemente 20 ng/ml o menos tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo terapéutico, o
ii) la cantidad de APRIL soluble en dicha muestra es 100 ng/ml o superior, preferentemente 1000 ng/ml o superior, tratar a dicho paciente con anticuerpos biespecíficos competitivos de ligando de BCMA, o
iii) si la cantidad de APRIL en dicha muestra de paciente es superior a 100 ng/ml, tratar a dicho paciente con dicho anticuerpo biespecífico a una dosis dos veces mayor a concentraciones de APRIL de 100 ng/ml y una dosis adicional aumentada hasta 80 veces mayor si la concentración de APRIL aumenta hasta 1000 ng/ml, en comparación con la dosis recomendada para un paciente con una concentración de APRIL soluble inferior a 100 ng/ml o tratar a dicho paciente con un programa de tratamiento correspondiente más frecuente para alcanzar dichas dosis más altas con un período más corto entre dos dosis cualesquiera de dicho anticuerpo biespecífico.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para determinar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se encuentra un método para determinar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende:
proporcionar, utilizando al menos un método para investigar el estado de las células plasmáticas relacionadas con BCMA de dicho nuevo paciente;
buscar, utilizando al menos el resultado de un método, para determinar un plan de tratamiento previo para un paciente anterior que padecía el mismo trastorno con al menos una representación similar; y
revisar el plan de tratamiento anterior para el paciente anterior con el fin de determinar cómo mejorar el tratamiento del nuevo paciente basándose en la información de al menos un plan de tratamiento anterior.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para diagnosticar y tratar un trastorno que afecta a las células plasmáticas en un paciente que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente la expresión de BCMA en células CD138+ CD38+ según la divulgación, en donde al paciente se le diagnostica dicha enfermedad, si dicha expresión de BCMA es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más sobre el valor inicial determinada como intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa y administrar tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la divulgación al paciente diagnosticado.
La divulgación se refiere a un método para diagnosticar y tratar un trastorno que afecta a las células plasmáticas en un paciente que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal la relación de linfocitos T (células efectoras) a células diana (relación E:T), en donde al paciente se le diagnostica dicha enfermedad si dicha relación es 0,35:1, preferentemente de 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior y administrar tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la divulgación al paciente diagnosticado.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para diagnosticar y tratar un trastorno que afecta a las células plasmáticas en un paciente que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal del paciente la cantidad de BCMA soluble según la divulgación, en donde al paciente se le diagnostica dicha enfermedad si dicho BCMA soluble es 2,5 ng/ml o superior, y dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, y administrar tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la divulgación al paciente diagnosticado en dosis más altas y/o en un programa de tratamiento más frecuente.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para diagnosticar y tratar un trastorno que afecta a las células plasmáticas en un paciente que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal del paciente la cantidad de BCMA soluble según la divulgación, en donde al paciente se le diagnostica dicha enfermedad si dicho BCMA soluble es 2,5 ng/ml o superior, y dicho BCMA soluble en dicha muestra del paciente se une específicamente a dicho anticuerpo biespecífico, y la administración del tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la divulgación al paciente diagnosticado se realiza en una dosis más alta para la primera dosis o en un programa de tratamiento más frecuente con un período más corto entre la primera dosis y la segunda dosis de dicho anticuerpo biespecífico o con un período más corto entre la primera dosis y la tercera dosis de dicho anticuerpo biespecífico.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para diagnosticar y tratar un trastorno que afecta a las células plasmáticas en un paciente que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal del paciente la cantidad de APRIL según la divulgación en donde al paciente se le diagnostica dicha enfermedad si la cantidad de APRIL es superior a 100 ng/ml, y la administración del tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la divulgación al paciente diagnosticado se realiza con dicho anticuerpo biespecífico que compite con BCMA soluble para unirse al receptor de BCMA humano y/o bloquea la activación de NF-<k>B mediada por APRIL a dosis más altas y/o en un programa de tratamiento más frecuente.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un método para diagnosticar y tratar un trastorno que afecta a las células plasmáticas en un paciente que comprende analizar en una muestra aislada de fluido corporal del paciente que comprende células plasmáticas y linfocitos T, la cantidad de APRIL según la divulgación en donde al paciente se le diagnostica dicha enfermedad si la cantidad de APRIL es superior a 100 ng/ml, y la administración del tratamiento con un anticuerpo biespecífico según la divulgación al paciente diagnosticado se realiza con dicho anticuerpo biespecífico que compite con APRIL por la unión al receptor de BCMA humano y/o bloquea la activación de NF-kB mediada por APRIL a una dosis dos veces mayor en concentraciones de APRIL de 100 ng/ml y a una dosis aún mayor hasta 80 veces mayor si la concentración de APRIL aumenta hasta a 1000 ng/ml, en comparación con la dosis recomendada para un paciente con una concentración de APRIL soluble inferior a 100 ng/ml o tratar a dicho paciente con un programa de tratamiento correspondiente más frecuente para alcanzar dichas dosis más altas con un período más corto entre dos dosis cualesquiera de dicho anticuerpo biespecífico.
Preferentemente la enfermedad (trastorno) se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide.
Preferentemente, la valencia debe ser similar entre el anticuerpo de diagnóstico y el anticuerpo terapéutico (por ejemplo, se debe usar un anticuerpo monovalente para la determinación de BCMA para la estratificación de pacientes para una terapia con anticuerpos de BCMA con unión monovalente a la diana tumoral en células malignas, como las moléculas BiTE basadas en scFV). Aún más preferentemente es utilizar un anticuerpo de BCMA para la determinación de BCMA que sea el mismo que el aglutinante de BCMA de la terapia con anticuerpos de BCMA.
Preferentemente, la afinidad por BCMA humano de dicho anticuerpo biespecífico es 200 nM o inferior, medida a una concentración de anticuerpo de 25 nM en presencia de fusión de Fc a BCMa humano a una concentración de 500 nM o inferior en un ensayo de resonancia de plasmón superficial con configuración de afinidad.
Preferentemente, la potencia (CE50) para destruir células H929 BCMA positivas (ATCC CRL-9068) de dicho anticuerpo biespecífico se mide como 2 nM o inferior, cuando se utiliza en concentraciones de 100 nM e inferiores, en presencia de PBCM humanas y células H929 en una relación E:T de 10:1 durante 24 h, en un ensayo de liberación de LDH de destrucción redirigida por linfocitos T.
Preferentemente la afinidad por BCMA humano de dicha parte de unión a BCMA, medida en un anticuerpo de tipo IgG1 humano, es 200 nM o inferior a una concentración de anticuerpo de 25 nM en presencia de fusión a Fc de BCMa humano a una concentración de 500 nM o inferior en un ensayo de resonancia de plasmón superficial con configuración de afinidad.
Preferentemente, el anticuerpo para su uso según la invención se caracteriza además porque se une también específicamente a BCMA de mono cynomolgus (macaco).
Preferentemente, el anticuerpo biespecífico para su uso según la invención que comprende regiones pesadas constantes CH2/CH3 de la subclase IgG1 se caracteriza por comprender las mutaciones L234A, L235A y P239G (numeración según Kabat) para evitar la unión de FcR y C1q y minimizar las ADCC/CDC. La ventaja es que dicho anticuerpo para el uso de la invención media su eficacia de destrucción de células tumorales puramente por el potente mecanismo de redirección/activación de linfocitos T. Se evitan mecanismos de acción adicionales, como efectos sobre el sistema del complemento y sobre las células efectoras que expresan FcgammaR y se reduce el riesgo de efectos secundarios.
Preferentemente, un anticuerpo para su uso según la invención se caracteriza por mostrar una inhibición del crecimiento tumoral de más del 70 %, preferentemente de más del 85 %, preferentemente de cerca del 100 % en un modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple (por ejemplo, xenoinjerto con células NCI-H929 o células RPMI8226 o células U266B1 o células L-363) a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal (PC) administrada por vía intravenosa (i.v.) o por vía subcutánea (s.c.) o intraperitoneal (i.p.) dos veces a la semana o una vez a la semana, preferentemente 0,5 mg/kg de peso corporal administrados i.v. o i.p. o s.c. dos veces a la semana o una vez a la semana, preferentemente a 0,1 mg/kg de peso corporal administrados i.v. o i.p. o s.c. dos veces a la semana o una vez a la semana, preferentemente a 0,05 mg/kg de peso corporal administrados i.v. o i.p. o s.c. dos veces a la semana o una vez a la semana, preferentemente a 0,01 mg/kg de peso corporal administrados i.v. o i.p. o s.c. dos veces a la semana o una vez a la semana, preferentemente a 5 pg/kg de peso corporal administrados i.v. o i.p. o s.c. dos veces a la semana o una vez a la semana.
Preferentemente, un anticuerpo para su uso según la invención se caracteriza por una semivida de eliminación en ratones, preferentemente monos cynomolgus de más de 24 horas, preferentemente 3 días o más, preferentemente se mide la semivida para las dosis que son eficaces en el modelo de xenoinjerto con una administración de dos o una vez a la semana.
Los anticuerpos biespecíficos que se unen a una diana en las células tumorales y a CD3 y que tienen el formato molecular (scFv)2 tienen una semivida de eliminación muy corta, de 1 a 4 horas. En los ensayos clínicos con el anticuerpo biespecífico CD19xCD3 (scFv)2 blinatumomab, este compuesto tuvo que administrarse mediante una bomba que llevaban los pacientes durante semanas y meses (Toppet al.J Clin Oncol 2011; 29(18): 2493-8). En comparación con una administración i.v. o s.c. dos veces a la semana o una vez a la semana, el tratamiento administrado mediante una bomba es mucho menos conveniente para los pacientes y también mucho más arriesgado (por ejemplo, fallo de la bomba, problemas con el catéter).
Preferentemente, un anticuerpo para su uso según la invención se caracteriza por mostrar un valor de CE50 para la unión a células NCI-H929 (ATCC® CRL-9068™) de 500 nM o inferior, preferentemente un valor de CE50 de 350 nM o inferior, preferentemente un valor de CE50 de 100 nM e inferior.
Preferentemente, un anticuerpo para su uso según la invención se caracteriza por su capacidad para inducir la destrucción redirigida de células tumorales NCI-H929 en presencia de linfocitos T humanos con una CE50 inferior a 1 nM, preferentemente 0,5 nM, preferentemente 0,1 nM e inferior.
Preferentemente, un anticuerpo biespecífico para su uso según la invención se caracteriza por su capacidad para inducir la destrucción redirigida de células de mieloma primario en pacientes con mieloma múltiple en presencia de linfocitos T humanos.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un kit que comprende un anticuerpo anti-BCMA de diagnóstico y un anticuerpo biespecífico terapéutico contra BCMA y CD3 para su uso según la invención.
En el presente documento, pero no en el alcance de las reivindicaciones, se divulga un kit que comprende un anticuerpo anti-BCMA y un anticuerpo biespecífico contra BCMA y CD3, caracterizado por que el anticuerpo anti-BCMA tiene un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como la intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa e instrucciones de uso, en particular instrucciones sobre cómo realizar los métodos de la presente divulgación. Preferentemente, dicho anticuerpo anti-BCMA y dicho anticuerpo biespecífico contra BCMA y CD3 son ambos mono, bi, o trivalentes y tienen preferentemente las mismas CDR o secuencia VH y VL.
El kit comprende un envase y una etiqueta o prospecto en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar formados de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase también puede tener un puerto de acceso estéril para extraer un agente terapéutico (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tenga un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o el prospecto pueden indicar que la composición se usa para tratar MM, LES, AR u otro trastorno que afecte a las células plasmáticas.
De manera adicional, el kit puede comprender además un envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Preferentemente el kit comprende;
1) Para la determinación de la expresión de BCMA en la superficie celular: Viales o tubos precargados con anticuerpos marcados (preferentemente cuatro anticuerpos, uno que se une específicamente a CD138, uno a CD38, uno para CD19 y otro a BCMA (con las propiedades según la presente invención)) para determinar BCMA en PC malignas; tubos con anticuerpos de control de isotipo;
2) Para la determinación de la relación E:T: Viales o tubos precargados con anticuerpos marcados para detectar linfocitos T y PC malignas (preferentemente cuatro anticuerpos, uno que se une específicamente a CD138, uno a CD38, uno a CD19 y otro a CD3); tubos con anticuerpos de control de isotipo;
3) Para la determinación de BCMA soluble: Kit ELISA compuesto por una placa de microtitulación, un anticuerpo de captura (anticuerpo policlonal de BCMA), anticuerpo de detección conjugado con biotina (que se une específicamente a BCMA (con las propiedades según la presente invención)), patrón calibrado en masa, estreptavidina-HRP o estreptavidina-ALP, protocolo detallado, PBS, tampón de lavado - Tween 20 al 0,05 % en PBS, pH 7,2-7,4, Diluyente reactivo1 - BSA5 en PBS al 1 %, Solución de sustrato - mezcla 1:1 de reactivo de color A, (H2O2) y reactivo de color B (tetrametilbencidina), Solución de detención- 2 N H2SO4;
4) Para la determinación de APRIL soluble: Kit ELISA que comprende placa de microtitulación, anticuerpo de captura (anticuerpo anti-APRIL humano), anticuerpo de detección conjugado con biotina (anticuerpo anti-APRIL humano), patrón calibrado en masa, estreptavidina-HRP o estreptavidina-ALP, protocolo detallado, PBS, tampón de lavado - Tween 20 al 0,05 % en PBS, pH 7,2-7,4, Diluyente reactivo1 -<b>S<a>5 en PBS al 1 %, Solución de sustrato - mezcla 1:1 de reactivo de color A, (H2O2) y reactivo de color B (tetrametilbencidina), Solución de detención- 2 NH2SO4.
Descripción de las figuras
Figura 1. Expresión de BCMA en células plasmáticas malignas del paciente detectada mediante citometría de flujo y definida por la intensidad de fluorescencia media o media relativa. Gráficos de histograma FACS representativos de (A) expresión de BCMA media-alta (hi), (B) expresión BCMA moderada (mod) y (C) expresión BCMA baja (lo) en células de mieloma del paciente detectadas por citometría de flujo (MFI). Hay un claro desplazamiento hacia la derecha en el eje x correspondiente a la expresión positiva de BCMA en las células de mieloma del paciente en comparación con el control negativo (anticuerpo deBCMA-1 conjugado con APC seleccionado en linfocitos T). Basándose en los valores de MFI relativa, los pacientes con mieloma expresan BCMA en sus células plasmáticas malignas, pero la expresión de BCMA varía desde una expresión baja (valores de MFI relativa <103) a expresión moderada (103- 0,3 * 104) a expresión media-alta (0,3 * 104- 104) (véase el ejemplo 1.1).
Figura 2. La potencia letal de BCMA-TCB está influenciada por la expresión de BCMA en la superficie de las células diana: Células de mieloma H929 que expresan BCMAhi frente a células de mieloma U266 que expresan BCMAmed/l° BCMA-2-TCB indujo la destrucción de células de mieloma H929 que expresan BCMAhi con una CE50 de 115 pM y una destrucción máxima del 60 %, mientras que el mismo anticuerpo BCMA-TCB solo pudo destruir células de mieloma U266 diana que expresan BCMAmed/l° con una CE50 de 370 pM y una destrucción máxima del 18 % cuando se realiza en una comparación directa (véase el ejemplo 1.3).
Figura 2,1. Se probó y comparó la potencia de BCMA-1-TCB para inducir la destrucción de líneas celulares de mieloma que expresan BCMA (H929 que expresan BCMAhi, L363 que expresan BCM A™ ^ y RPMI-8226 MM que expresan BCMA^). BCMA-1-t Cb indujo la destrucción de (A) células de mieloma H929 que expresan BCMAhi con una CE50 de 8,49 pM y una destrucción máxima del 82,8 %, mientras que el mismo anticuerpo BCMA-1-TCB solo pudo destruir (B) células diana de mieloma L363 que expresan BCMa ™ ^ con una CE50 de 12,6 pM y una destrucción máxima del 67,1 % o (C) RPMI-8226 que expresan BCMA^ con una CE50 de 229,3 pM y una destrucción máxima del 28,1 % cuando se realiza en una comparación directa (ejemplo 1.3).
Figura 3. Expresión de BCMA en líneas celulares de mieloma humano detectada mediante citometría de flujo y definida por la intensidad de fluorescencia media o mediana relativa.
Figura 4. Efecto del anticuerpo BCMA-TCB que compite con APRIL sobre la activación de NF-<k>B inducida por APRIL detectada mediante citometría de fosfoflujo. (A) Efecto de J6M0-TCB que compite con APRIL sobre la activación de NF-kB mediada por APRIL (1000 ng/ml) en células H929. Detección de NF-kB fosforilado intracelular mediante citometría de fosfoflujo (véase el ejemplo 4.2.1).
Figura 5. Influencia de APRIL soluble sobre el anticuerpo BCMA-TCB que compite con APRIL para inducir la destrucción de células de mieloma H929 BCMA positivas redirigida con linfocitos T detectada mediante un ensayo colorimétrico de liberación de LDH. Bloqueo/competencia de APRIL con J6M0-TCB en ausencia de APRIL soluble exógeno y en presencia de 100 ng/ml o 1000 ng/ml de APRIL soluble exógeno. Relación E:T utilizada como 10 PBMC:1 célula H929; las células se incubaron durante 24 h antes de medir la liberación de LDH. El bloqueo/competencia de APRIL con J6M0-TCB indujo una destrucción dependiente de la concentración del mieloma H929 BCMA positivo con una potencia picomolar baja (CE50april0= 5,8 pM) en ausencia de APRIL exógeno. Cuando se añadieron 100 ng/ml de ApRIL al cultivo, dicha concentración de ligando solo afectó mínimamente la potencia de destrucción mediada por J6M0-TCB como se muestra con un aumento de 2,4 veces en la CE50 (CE50<april>100= 14,2 pM). Sin embargo, cuando se añadieron 1000 ng/ml de APRIL al cultivo, la potencia de destrucción mediada por J6M0-TCB se redujo considerablemente, como se refleja en un aumento en la CE50 de 84,3 veces (CE50april1000= 488,9 pM) (véase el ejemplo 4.2.2).
Figura 6. Influencia de APRIL soluble sobre el anticuerpo BCMA-TCB que compite con APRIL para inducir la activación de linfocitos T detectada por citometría de flujo. Nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 (B, D) y del marcador de activación tardía CD25 (A, C) en linfocitos T CD4+ y CD8+ después de 48 horas de incubación (resultados representativos de dos experimentos independientes). El bloqueo/competencia de APRIL con J6M0-TCB indujo un aumento de los marcadores de activación CD69 y CD25 de una manera específica y dependiente de la concentración en presencia de células diana BCMA positivas en ausencia de APRIL soluble exógeno (recuadros). Cuando se añadieron 100 ng/ml de APRIL soluble al cultivo, se observó un ligero desplazamiento hacia la derecha de las curvas de concentración-respuesta para ambos marcadores de activación CD69 y CD25 en linfocitos T CD4.+ y CD8+. Cuando se añadieron 1000 ng/ml de APRIL soluble al cultivo, hubo una clara reducción de la activación de los linfocitos T tanto en linfocitos T CD4+ como CD8+. NO se observó activación de linfocitos T CD4+ y CD8+ cuando se trataron PBMC humanas con el anticuerpo de control DP47-TCB, lo que sugiere que a pesar de unirse a CD3 en los linfocitos T, la activación de los linfocitos T no se produce cuando el anticuerpo TCB no se une a las células diana BCMA positivas (datos no mostrados). Los resultados sugieren claramente que los niveles elevados de APRIL soluble reducen la potencia de los anticuerpos BCMA-TCB para inducir la activación de los linfocitos T al unirse a la diana tumoral y a los linfocitos T, especialmente cuando el BCMA-TCB compite con APRIL (véase el ejemplo 4.3).
Figura 7: Influencia de la expresión de BCMA y de la relación E:T sobre la potencia de BCMA-TCB para inducir la destrucción de células plasmáticas malignas de la médula ósea del paciente mediante linfocitos T autólogos infiltrantes de médula ósea. BCMA-1-TCB indujo una destrucción específica dependiente de la concentración de células plasmáticas malignas tanto del paciente C1 (A) como del paciente C8 (B) tras solamente 24 horas de incubación. Sin embargo, la destrucción de las células de mieloma fue más pronunciada en las muestras de médula ósea del paciente C1 que en las muestras de médula ósea del paciente C8. Esto podría atribuirse a una relación E:T más favorable de 11:1 y a una expresión de BCMA (es decir, un valor de MFI relativa de 2636) en muestras de médula ósea del paciente C1 que en muestras de médula ósea del paciente C8 con una relación E:T desfavorable de 0,5: 1 y una expresión de BCMA más débil en células de mieloma (es decir, valor de MFI relativa de 1489). Los resultados sugieren que la medición de la expresión de BCMA en células plasmáticas malignas en combinación con una medición de la relación E:T en la médula ósea del paciente puede predecir con mayor precisión si los pacientes con mieloma pueden responder al tratamiento con BCMA-TCB.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han reconocido que los trastornos que afectan a las células plasmáticas, en especial, mieloma múltiple, lupus eritematoso sistémico y/o artritis reumatoide se pueden clasificar (dividir) en varios subtipos. Dichos subtipos son:
1. Pacientes, que comprenden células CD138+ CD38+ en una muestra aislada de fluido corporal, caracterizados por la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, es 80 o más, 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como la intensidad de fluorescencia media o media relativa (MFI, por sus siglas en inglés).
2. Pacientes para quienes en una muestra aislada de fluido corporal la relación de linfocitos T (células efectoras) a células diana (relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal es de 0,35:1 o superior, preferentemente 0,5:1 o superior.
3. Pacientes, para quienes la cantidad de BCMA soluble en una muestra aislada de fluido corporal es de 2,5 ng/ml o superior.
4. Pacientes, para quienes la cantidad de APRIL en una muestra aislada de fluido corporal es superior a 100 ng/ml.
4. Pacientes, que comprenden células CD138+ CD38+ en un fluido corporal aislado, caracterizados por la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+, medida utilizando un anticuerpo anti-BCMA con un valor Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, es 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial determinado como intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa y para quienes en dicha muestra aislada de fluido corporal la relación de linfocitos T (células efectoras) a una muestra de células diana (relación E:T) es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior.
El receptor de BCMA desempeña un papel fundamental para la supervivencia de las células plasmáticas normales y malignas (es decir, células de mieloma) al unirse a sus ligandos APRIL y BAFF que abundan en la médula ósea de pacientes con mieloma y muchos grupos han detectado la expresión de BCMA en células de mieloma. tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína de superficie (O'Connoret al.J Exp Med 2004, 199(1):91-8; Novaket al.Blood 2004, 103(2): 689-94; Ryanet al.Mol Cancer Ther 2007, 6(11): 3009-18; Quinnet al.Blood 2011, 117(3): 890; Carpenteret al.Blood 2013, 19(8): 2048-60; Frigyesiet al.Blood 2014, 123(9):1336-40; Claudioet al.Blood 2002,100(6):2175-86; Taiet al.Cancer Res 2006, 123(20):3128-38; Moreauxet al.,Blood 2004,103(8):3148-57; Juet al.Clin Biochem 2009,42(4-5):387-99; Moreauxet al.Eur J Haematol 2009, 83(2):119-29). Por lo tanto, en pacientes con mieloma, BCMA se expresa en sus células plasmáticas malignas. Sin embargo, los presentes inventores han observado que los pacientes con mieloma expresan BCMA en la superficie celular pero a diferentes niveles de expresión, variando desde medio/alto a moderado a bajo, según lo detectado por medición óptima mediante citometría de flujo, habiendo reconocido los presentes inventores que el uso de técnicas o métodos subóptimos para la detección de la expresión de BCMA para la estratificación de pacientes (por ejemplo, uso de anticuerpo contra BCMA con baja afinidad de unión a BCMA humano) no pudo detectar la baja expresión de BCMA en células plasmáticas malignas de pacientes con mieloma. y en tal caso informaría erróneamente a los médicos de que estos pacientes con mieloma no responderían a una terapia con anticuerpos contra BCMA mientras que sí podrían hacerlo.
Los anticuerpos biespecíficos de linfocitos T (TCB, por sus siglas en inglés) tienen una potencia muy alta dependiente de la concentración/ocupación del receptor de células tumorales en la destrucción celular (por ejemplo, CE50 en ensayos de destrucción celularin vitroen el intervalo sub o bajo picomolar; Dreieret al.Int J Cancer 2002), los anticuerpos biespecíficos de linfocitos T (TCB) se administran en dosis mucho más bajas que los anticuerpos monoespecíficos convencionales. Por ejemplo, blinatumomab (CD19xCD3) se administra en una dosis intravenosa continua de 5 a 15 |jg/m2/día (es decir, solamente 0,035 a 0,105 mg/m2/semana) para el tratamiento de la leucemia linfocítica aguda o 60 jg /m 2/día para el tratamiento del linfoma no hodgkiniano, y las concentraciones séricas en estas dosis se encuentran en el intervalo de 0,5 a 4 ng/ml (Klingeret al.,Blood 2012; Toppet al.,J Clin Oncol 2011; Goebeleret al.Ann Oncol 2011). Debido a que dosis bajas de TCB pueden ejercer una alta eficacia en los pacientes, se prevé que para un anticuerpo para su uso según la invención, la administración subcutánea es posible y preferida en los entornos clínicos (preferentemente en el intervalo de dosis de 0,25 a 2,5 mg/m2/semana). Incluso a estas bajas concentraciones/dosis/ocupaciones de receptores, el TCB puede causar efectos adversos considerables (Klingeret al.,Blood 2012). Por lo tanto, es fundamental controlar la ocupación/cobertura de las células tumorales. Por lo tanto, las dosis para el tratamiento con un TCB deben elegirse basándose en un método eficaz para clasificar a los pacientes.
Por consiguiente, se necesita un método de determinación óptimo para la expresión de BCMA en las células de mieloma de los pacientes. Este método de determinación óptimo para la expresión de BCMA se puede realizar mediante citometría de flujo con anticuerpos de BCMA apropiados para la determinación. Por ejemplo, para el uso de la determinación de BCMA en células de mieloma para la estratificación de pacientes, según la invención, se utiliza para la detección un anticuerpo BCMA que tiene un intervalo de afinidad similar a BCMA humano (por ejemplo, medido mediante resonancia de plasmón superficial (SPR)) que la terapia con anticuerpos de BCMA. Se prefiere aún más que la valencia del anticuerpo sea la misma entre el anticuerpo de BCMA para la detección y la terapia con anticuerpos de BCMA (por ejemplo, se debe usar un anticuerpo monovalente para la detección de BCMA para la estratificación de pacientes para determinar una terapia con anticuerpos BCMA con unión monovalente a la diana tumoral en células malignas como en el caso de las moléculas BiTE basadas en scFV). Se prefiere aún más que el intervalo de avidez (medido por SPR) sea similar entre el anticuerpo de BCMA para detección y la terapia con anticuerpos de BCMA. Se prefiere además utilizar un anticuerpo de BCMA para la determinación que sea el mismo que el aglutinante de BCMA de la terapia con anticuerpos de BCMA.
El término "diana", tal como se utiliza en el presente documento, significa BCMA o CD3. La expresión "primera diana y segunda diana" significa CD3 como primera diana y BCMA como segunda diana o significa BCMA como primera diana y CD3 como segunda diana.
El término "BCMA", como se usa en el presente documento, se refiere a la diana de maduración de linfocitos B humanos, también conocida como BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), que es miembro de la superfamilia de receptores de necrosis tumoral que se expresa preferentemente en células plasmáticas diferenciadas. El dominio extracelular de BCMA se compone según UniProt en los aminoácidos 1-54 (o 5-51). La expresión "anticuerpo contra BCMA, anticuerpo anti-BCMA", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo<que se une específicamente a>BCM<a>.
El término "CD3£ o CD3" como se usa en el presente documento se refiere a CD3£ humano descrito en UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). La expresión "anticuerpo contra CD3, anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo que se une a CD3<e>.<Preferentemente, el anticuerpo comprende un dominio variable VH que comprende las CDR de cadena pesada>de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada respectivamente y un dominio variable VL<que comprende las>C<d>R<de cadena ligera de las SEQ ID NO: 6, 7. y 8 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera>respectivamente. Preferentemente, el anticuerpo comprende los dominios variables de la SEQ ID NO:1 (VH) y la SEQ ID NO:2 (VL). La expresión "anticuerpo contra CD3, anticuerpo anti-CD3", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a CD3£.
"Unión específica a CD3 o BCMA o a CD3 £ o BCMA" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse al CD3 £ humano o al dominio extracelular de BCMA humano (las dianas) con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico en el direccionamiento a CD3 o BCMA. El alcance de la unión de un anticuerpo anti-CD3 o BCMA a una proteína no relacionada, distinta de CD3 o distinta de BCMA puede ser aproximadamente 10 veces, preferentemente >100 veces menor que la unión del anticuerpo a CD3 o BCMA medida, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), por ejemplo, Biacore®, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), o citometría de flujo (FACS). Preferentemente el anticuerpo que se une a CD3 o BCMA tiene una constante de disociación (Kd) de 10-8 M o menos, preferentemente a partir de 10-8 M a 10-13 M, preferentemente a partir de 10-9 M a 10-13 M. Preferentemente, el anticuerpo anti-CD3 y/o anti-BCMA se une a un epítopo de CD3 y/o BCMA que está conservado entre CD3 y/o BCMA de diferentes especies, preferentemente entre seres humanos y monos cynomolgus. "Anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD3 y BCMA" o "anticuerpo según la invención" se refiere a una definición correspondiente para la unión a ambas dianas. Un anticuerpo que se une específicamente a BCMA (o<BCMA y CD3) no se une a otros antígenos humanos. Por lo tanto en un e>L<is>A,<los valores de DO para dichas dianas>no relacionadas serán iguales o inferiores al límite de detección del ensayo específico, preferentemente > 0,3 ng/ml, o iguales o inferiores a los valores de DO de las muestras de control sin BCMA unido a placa o con células HEK293 sin transfectar.
La expresión "CD3£ o parte de unión a CD3" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de una cadena pesada de anticuerpo que consiste en VH y CH1 y una cadena ligera de anticuerpo que consiste en VL y CL encerrada en un fragmento Fab de un anticuerpo que se une específicamente a CD3.
La expresión "parte de unión a BCMA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de una cadena pesada de anticuerpo que consiste en VH y CH1 y una cadena ligera de anticuerpo que consiste en VL y CL encerrada en un fragmento Fab de un anticuerpo que se une específicamente a BCMA.
La expresión "anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3 o TCB o anticuerpo contra BCMA y CD3" se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3£ humano. Dicho anticuerpo puede ser monovalente para BCMA, por ejemplo como anticuerpo de cadena sencilla como se menciona en los documentos WO2013072406, WO2013072415 y WO2014140248, o puede ser bi o trivalente como se describe, por ejemplo, en los documentos WO2014122143, WO2014122144. Los documentos WO2013072406 y WO2014140248 mencionan relaciones E:T en algunas figuras y ejemplos; sin embargo, sólo se informa que en los correspondientes experimentos de ensayo de destrucción se utilizaron 10 células efectoras por 1 célula diana (líneas celulares, no muestras de pacientes). Esta relación E:T es, por lo tanto, artificial y no se mostró ninguna relación E:T en muestras de médula ósea de pacientes con mieloma ni se dio ninguna pista sobre la vinculación de la relación E:T con el tratamiento con anticuerpos. Preferentemente el anticuerpo biespecífico comprende como CDR de la parte de unión a CD3 las CDR de las SEQ ID NO: 2 a 4 y 6 a 8 y preferentemente los dominios VL y VH de las SEQ ID NO: 1 y 5. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico comprendía como CDR de la parte de unión a BCMA las CDR o preferentemente los dominios VH y VL enumerados en la tabla 1. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico comprende como CDR de la parte de unión a BCMA las CDR de las SEQ ID NO: 10 a 12 y 14 a 16 o preferentemente los dominios VL y VH de las SEQ ID NO: 9 y 13. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico comprende como CDR de la parte de unión a BCMA las CDR de las SEQ ID NO: 18 a 20 y 22 a 24 o preferentemente los dominios VL y VH de las SEQ ID NO: 17 y 21. El anticuerpo J6M0 se describe en el documento WO2012163805. Un TCB que comprende J6M0 comprende como CDR de la parte de unión a CD3 las CDR de las SEQ ID NO: 2 a 4 y 6 a 8 y preferentemente los dominios VL y VH de las SEQ ID NO: 1 y 5.
La expresión "un anticuerpo biespecífico no competitivo con APRIL" se refiere a un anticuerpo biespecífico, caracterizado por que la unión de dicho anticuerpo no se reduce mediante 100 ng/ml de APRIL en más del 20 % medido en un ensayo ELISA en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL. La expresión "un anticuerpo anti-BCMA no competitivo con APRIL" se refiere a un anticuerpo anti-BCMA, caracterizado por que la unión de dicho anticuerpo no se reduce mediante 100 ng/ml de APRIL en más del 20 % medido en un ensayo ELISA en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL. Dichos anticuerpos se describen en los documentos WO2014122143, WO2014122144, EP14179705 y EP14194151.
Tabla 1
La expresión "anticuerpo terapéutico" se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3 y que funciona agotando las células plasmáticas malignas en un paciente que padece mieloma múltiple. El anticuerpo terapéutico media un efecto citotóxico o lisis celular, particularmente mediante la inducción de la activación de linfocitos T seguida de apoptosis mediada por linfocitos T que implica a perforina y granzima B.
Preferentemente, un anticuerpo terapéutico para su uso según la invención se caracteriza por mostrar un valor de CE50 para la unión a células NCI-H929 (ATCC® CRL-9068™) de 500 nM o menos, preferentemente un valor de CE50 de 350 nM e inferior, preferentemente un valor de CE50 de 100 nM e inferior.
Preferentemente, un anticuerpo terapéutico para su uso según la presente invención se caracteriza por su capacidad para unirse a células U266 (ATCC® TIB-196™).
En una realización preferida, un anticuerpo terapéutico para su uso según la invención se caracteriza por su capacidad para unirse a linfocitos T humanos.
Preferentemente, un anticuerpo terapéutico para su uso según la presente invención se caracteriza por su capacidad para unirse a BCMA de mono cynomolgus expresado transitoriamente en células HEK.
En una realización preferida, un anticuerpo terapéutico para su uso según la presente invención se caracteriza por su capacidad para inducir la activación de linfocitos T<c>D4+ y CD8+ en presencia de células tumorales que expresan BCMA.
Preferentemente, un anticuerpo terapéutico para su uso según la invención se caracteriza por su capacidad para inducir la destrucción redirigida de células tumorales NCI-H929 en presencia de linfocitos T humanos con una CE50 inferior a 1 nM, preferentemente 0,5 nM, preferentemente 0,1 nM e inferior.
La expresión "anticuerpo de diagnóstico" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA. Dicho anticuerpo de diagnóstico es, si se va a determinar la expresión de BCMA en la superficie celular, un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA del anticuerpo biespecífico terapéutico destinado a su uso para el tratamiento del paciente. Preferentemente, el anticuerpo procede de la parte de unión a BCMA de dicho anticuerpo biespecífico terapéutico y preferentemente comprende las mismas CDR o dominios VH y VL que dicha parte de unión a BCMA de dicho anticuerpo terapéutico. Dicho anticuerpo de diagnóstico es, si se determina la MFI, preferentemente un anticuerpo marcado. Dicho anticuerpo de diagnóstico es, si se va a determinar BCMA soluble un anticuerpo útil para ELISA.
La expresión "anticuerpo marcado" se refiere a un anticuerpo, al que se ha unido un marcador detectable. Preferentemente, el marcador detectable es un fluoróforo cuando se usa FACS para analizar. Para otros métodos de análisis también se pueden utilizar todos los demás marcadores conocidos (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York)). Ejemplos de fluoróforos preferidos son isotiocianato de fluoresceína (FITC), Alexa Fluor, R-ficoeritrina (PE), Aloficocianina (APC), PerCP, conjugados en tándem (por ejemplo, PE-cianina, PerCP-cianina), rodamina (isotiocianato de tetrametilrodamina, TRITC), proteínas fluorescentes verdes (GFP) y ficobiliproteínas.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo consiste en dos pares de una "cadena ligera" (LC) y una "cadena pesada" (HC) (dichos pares de cadena ligera (LC)/cadena pesada se abrevian en el presente documento como LC/HC). Las cadenas ligeras y pesadas de dichos anticuerpos son polipéptidos que consisten en varios dominios. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3 (clases de anticuerpos IgA, IgD e IgG) y opcionalmente el dominio constante de cadena pesada CH4 (clases de anticuerpos IgE e IgM). Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera VL y un dominio constante de cadena ligera CL. Los dominios variables VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro Fr , dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los "dominios constantes" de la cadena pesada y de la cadena ligera no participan directamente en la unión de un anticuerpo a una diana, sino que muestran diversas funciones efectoras.
La "cadena ligera de un anticuerpo" como se usa en el presente documento es un polipéptido que comprende en la dirección aminoterminal a carboxiterminal un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL), abreviados como VL-CL. "La "cadena pesada de un anticuerpo" como se usa en el presente documento es un polipéptido que comprende en la dirección aminoterminal a carboxiterminal un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio constante 1 de cadena pesada (CH1).
El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de ratón, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos genéticamente modificados (anticuerpos variantes o mutantes) siempre que se conserven sus propiedades características. Se prefieren especialmente anticuerpos humanos o humanizados, especialmente como anticuerpos humanos o humanizados recombinantes. Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales" tal como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.
Las expresiones "anticuerpo biespecífico" y "anticuerpo según la invención" como se usan en el presente documento se refieren a un anticuerpo en el que uno de los dos pares de cadena pesada y cadena ligera (HC/LC) se une específicamente a BCMA y el otro se une específicamente a CD3 o preferentemente a CD3 y BCMA. El término "valente", tal como se utiliza en la presente solicitud, denota la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo bivalente para su uso según la presente invención tiene dos sitios de unión, uno para CD3 y el otro para BCMA. De esta manera, el término "trivalente", indica la presencia de tres sitios de unión en un anticuerpo para su uso según la invención, que son dos sitios de unión para BCMA y un sitio de unión para CD3.
Hay cinco tipos de cadenas pesadas de anticuerpo de mamíferos indicadas con letras griegas: a, 8, £, y y H (Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5a ed., Garland Publishing). El tipo de cadena pesada presente define la clase de anticuerpo; estas cadenas se encuentran en los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente (Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4.a ed., Thomson Learning). Las distintas cadenas pesadas difieren en tamaño y composición; a y<y>contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que<h>y £ tienen aproximadamente 550 aminoácidos. Cada cadena pesada tiene dos regiones, la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero difiere en anticuerpos de diferente isotipo. Las cadenas pesadas y, a y 8 tienen una región constante compuesta por tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3 (en una línea), y una región bisagra para mayor flexibilidad (Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); las cadenas pesadas H y £ tienen una región constante compuesta por cuatro dominios constantes CH1, CH2, CH3 y CH4 (Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5a ed., Garland Publishing). La región variable de la cadena pesada difiere en los anticuerpos producidos por diferentes linfocitos B, pero son iguales para todos los anticuerpos producidos por un único linfocito B o un clon de linfocitos B. La región variable de cada cadena pesada tiene aproximadamente 110 aminoácidos de longitud y está compuesta por un único dominio de anticuerpo.
Existen dos tipos de cadenas ligeras en mamíferos, que se denominan lambda (A) y kappa (<k>). Una cadena ligera tiene dos dominios sucesivos: un dominio constante CL y un dominio variable VL. La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 aminoácidos. Preferentemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa (k), y el dominio constante CL procede preferentemente de una cadena ligera kappa (K) (el dominio constante CK). Preferentemente los dominios constantes de cadena pesada y ligera del anticuerpo para su uso según la invención son dominios humanos.
Los "anticuerpos" para su uso según la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, preferentemente IgG o IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2, preferentemente IgG1), donde ambos anticuerpos, de los que procede el anticuerpo biespecífico bivalente para su uso según la invención, tienen una parte Fc de la misma subclase (por ejemplo, IgG1, IgG4 y similares, preferentemente IgG1), preferentemente del mismo alotipo (por ejemplo, caucásico).
Un "fragmento Fab de un anticuerpo" como se usa en el presente documento es un fragmento de un anticuerpo que se une a antígenos. Un fragmento Fab de un anticuerpo consiste en dos pares de dominios. En un anticuerpo natural, está compuesto por un dominio constante y uno variable de cada una de la cadena pesada (CH1 y VH) y la cadena ligera (CL y VL). En un anticuerpo natural, el dominio de los pares de dominios de cadena pesada y ligera de un fragmento Fab no están unidos químicamente entre sí y, por lo tanto, no son scFv (fragmentos variables monocatenarios).
Una "parte Fc de un anticuerpo" es una expresión bien conocida por el experto en la materia y está definido en función de la escisión de anticuerpos con papaína. Los anticuerpos para su uso según la invención contienen como parte Fc, preferentemente una parte Fc procedente de origen humano y preferentemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. La parte Fc de un anticuerpo está directamente implicada en la activación del complemento, unión a C1q, activación de C3 y unión al receptor de Fc. Si bien la influencia de un anticuerpo en el sistema del complemento depende de determinadas condiciones, la unión a C1q está causada por sitios de unión definidos en la parte Fc. Dichos sitios de unión son conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, por Lukas, TJ.,et al.,J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. y Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R.,et al.,Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E.,et al.,MoI. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E.,et al.,J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M.,et al.,J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A.,et al.,Immunology 86 (1995) 319-324; y el documento EP 0307434. Dichos sitios de unión son, por ejemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat, véase a continuación). Los anticuerpos de la subclase IgG1, IgG2 e IgG3 suelen mostrar activación del complemento, unión de C1q y activación de C3, mientras que los de IgG4 no activan el sistema del complemento, no se unen a C1q y no activan C3. Preferentemente la parte Fc es una parte Fc humana. Preferentemente la parte Fc es una parte Fc de IgGI humana. Preferentemente, el anticuerpo para su uso según la invención comprende en la parte Fc de IgG1 humana una sustitución de aminoácidos de Pro329 con glicina o arginina y/o sustituciones L234A y L235A, preferentemente Pro329 con glicina y sustituciones L234A y L235A.
Preferentemente, el anticuerpo para su uso según la invención comprende como parte Fc una variante de Fc de una región Fc de IgG humana natural, comprendiendo dicha variante de Fc una sustitución de aminoácidos en la posición Pro329 y al menos una sustitución de aminoácidos adicional, en donde los restos están numerados según el índice EU de Kabat, y en donde dicho anticuerpo muestra una afinidad reducida por FcyRIIIA y/o FcyRIIA y/o FcyRI humanos en comparación con un anticuerpo que comprende la región Fc de IgG natural, y en donde la ADCC inducida por dicho anticuerpo se reduce a al menos un 20 % de la ADCC inducida por el anticuerpo que comprende una región Fc de IgG humana natural. En una realización específica, Pro329 de una región Fc humana natural en el anticuerpo para su uso según la invención se sustituye con glicina o arginina o un resto de aminoácido lo suficientemente grande como para destruir el sándwich de prolina dentro de la interfaz del receptor Fc/Fcy, que se forma entre la prolina329 del Fc y los restos de triptófano Trp 87 and Tip 110 de FcgRIII (Sondermannet al.:Nature 406, 267-273 (20 de julio de 2000)). En un aspecto adicional de la invención, la al menos una sustitución de aminoácido adicional en la variante de Fc es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S y, en otra realización más, dicha al menos una sustitución de aminoácidos adicional es L234A (indica que la leucina 234 se sustituye por alanina) y L235A de la región Fc de IgG1 humana o S228P y L235E de la región Fc de IgG4 humana. Dichas variantes de Fc se describen con más detalle en el documento WO2012130831. Una ventaja de un anticuerpo para su uso según la invención que comprende una parte Fc, es que la semivida de eliminación aumenta hasta ~12 días o incluso más y ofrece la oportunidad de administraciones una o dos veces a la semana en comparación con los TCB sin una porción Fc.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir, una región de unión, de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante procedente de una fuente o especie diferente, usualmente preparada por técnicas de ADN recombinante. Se prefieren los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de "anticuerpos quiméricos" son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente en lo referente a la unión a C1q y/o la unión a receptor de Fc (FcR). Dichos anticuerpos quiméricos también se denominan "anticuerpos de cambio de clase". Dichos anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas de ADN recombinante y de transfección génica convencionales bien conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Morrison, S.L.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.202.238 y 5.204.244.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que el marco o las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para comprender la CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad en comparación con la de la inmunoglobulina original. Una CDR murina se injerta en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véanse, por ejemplo, Riechmann, L.,et al.,Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S.,et al.,Nature 314 (1985) 268-270. Las CDR particularmente preferidas corresponden a aquellas que representan secuencias que reconocen las dianas indicadas anteriormente para anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente en lo referente a la unión a C1q y/o la unión a receptor de Fc (FcR).
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a la diana (véanse, por ejemplo, Jakobovits, A.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A.,et al.,Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M.,et al.,Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. MoI. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D.,et al.,J. MoI. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Coleet al.y Boerneret al.también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); y Boerner, P.,et al.,J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Como ya se mencionó para los anticuerpos quiméricos y humanizados, la expresión "anticuerpo humano" como se usa en el presente documento también comprende aquellos anticuerpos que se modifican en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente en lo referente a la unión a C1q y/o a la unión aFcR, por ejemplo mediante "cambio de clase", es decir, cambio o mutación de partes Fc (por ejemplo, de IgG1 a IgG4 y/o mutación de IgG1/IgG4).
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula hospedadora tal como una célula NSO o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulinas humanas o anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora. Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes de forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes se han sometido a hipermutación somáticain vivo.Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias de VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir de manera natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.
El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)), tal como se usa en el presente documento, indica cada uno de los pares de cadenas ligera y pesada que participa directamente en la unión del anticuerpo a la diana. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas humanas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de la complementariedad, CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de lámina p y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina p. Las<c>D<r>de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional mediante las regiones marco y forman junto con las CDR de la otra cadena el sitio de unión a la diana. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos para su uso según la invención.
Las expresiones "región hipervariable" o "región de unión a diana de un anticuerpo" cuando se usan en el presente documento se refieren a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a la diana. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de las "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las "regiones marco" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes a los restos de regiones hipervariables como se define en el presente documento. Por consiguiente, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden desde el extremo N al C los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por dichos aminoácidos de la región marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que más contribuye a la unión a la diana. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición convencional de Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, m D (1991).
El término "epítopo" incluye cualquier determinante de polipéptido que puede unirse específicamente a un anticuerpo. El determinante de epítopo puede incluir agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana que está unida por un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual un ácido nucleico se transcribe en ARNm y/o al proceso mediante el cual el ARNm transcrito (también denominado transcrito) se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan en conjunto producto génico. Si el polinucleótido procede de ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el corte y empalme del ARNm.
Los anticuerpos biespecíficos para su uso según la invención se producen preferentemente por medios recombinantes. Dichos métodos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el aislamiento posterior del polipéptido del anticuerpo y normalmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteínas, los ácidos nucleicos que codifican cadenas ligeras y pesadas o sus fragmentos se insertan en vectores de expresión mediante métodos convencionales. La expresión se realiza en células hospedadoras procariotas o eucariotas apropiadas como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levaduras o células deE. coli,y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células después de la lisis). Los anticuerpos biespecíficos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se realiza para eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, cromatografía en columna y otros bien conocidos en la técnica. Véase Ausubel, F.,et al.,ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Con el anticuerpo biespecífico de linfocitos T (TCB) CD19xCD3 blinatumomab se han demostrado tasas de respuesta de hasta el 80 % en pacientes con leucemia linfocítica aguda ALL (por sus siglas en inglés) en recaída/refractaria, En cuanto a la ALL por mieloma múltiple y otras enfermedades de células plasmáticas, todavía existe una gran necesidad médica. A pesar de todo el tratamiento disponible hoy en día, cinco años después del primer diagnóstico, aproximadamente el 60% de los pacientes con mieloma ya han fallecido. Todavía existe la necesidad de un tratamiento eficaz para los pacientes con mieloma múltiple.
La expresión "un trastorno que afecta a las células plasmáticas" se refiere a una enfermedad con un aumento en el nivel sérico/plasmático de su producto correspondiente, la proteína inmunoglobulina monoclonal (proteína M). Las proteínas M pueden consistir tanto en cadenas pesadas como ligeras o en un solo tipo de cadena. Los trastornos de las células plasmáticas son mieloma múltiple u otros trastornos de los linfocitos B que expresan BCMA. El mieloma múltiple es una neoplasia maligna de linfocitos B caracterizada por una expansión monoclonal y acumulación de células plasmáticas anormales en el compartimento de la médula ósea. El mieloma múltiple también afecta a los linfocitos B clonales circulantes con el mismo reordenamiento del gen de IgG e hipermutación somática. El mieloma múltiple surge de una afección premaligna asintomática llamada gammapatía monoclonal de significado desconocido (MGUS, por sus siglas en inglés), caracterizada por niveles bajos de células plasmáticas de la médula ósea y una<proteína monoclonal. Las células de mieloma múltiple (células>M<m>)<proliferan a un ritmo bajo. El mieloma múltiple es>el resultado de una aparición progresiva de múltiples cambios cromosómicos estructurales (por ejemplo, translocaciones desequilibradas). El mieloma múltiple implica la interacción mutua de células plasmáticas malignas y un microambiente de la médula ósea (por ejemplo, células estromales normales de la médula ósea). Los signos clínicos del mieloma múltiple activo incluyen picos de anticuerpos monoclonales, células plasmáticas que sobrepoblan la médula ósea, lesiones óseas líticas y destrucción ósea resultado de la sobreestimulación de los osteoclastos (Dimopulos & Terpos, Ann Oncol 2010; 21 supl 7: vii143-150). Otro trastorno de los linfocitos B que afecta a las células plasmáticas, es decir, que expresan BCMA, es el lupus eritematoso sistémico (LES), también conocido como lupus. El LES una enfermedad autoinmunitaria sistémica que puede afectar cualquier parte del cuerpo y se representa con el sistema inmunitario atacando las células y tejidos del propio organismo, dando como resultado inflamación crónica y daño tisular. Es una reacción de hipersensibilidad de tipo III en la que los complejos inmunitarios de anticuerpos precipitan y provocan una respuesta inmunitaria adicional (Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337).
La invención se refiere a la terapia del mieloma múltiple. La divulgación se refiere en otro caso también a la terapia de otros trastornos de linfocitos B que afectan a las células plasmáticas. Dicho un trastorno, en donde están afectadas células plasmáticas que expresan BCMA, es lupus eritematoso sistémico (LES), también conocido como lupus. Otros trastornos, en donde están afectadas células plasmáticas que expresan BCMA, son trastornos que implican la producción de anticuerpos antinucleares (anticuerpos anti-ADNbc), nefritis lúpica y AR, hepatitis autoinmunitaria de tipo 1. Los trastornos de las células plasmáticas también se clasifican según http://www.merckmanuals.com.
Tabla 2
continuación
El mieloma múltiple se puede clasificar según el Sistema Internacional de Estadificación del Mieloma Múltiple (http://www.cancer.org). Este sistema divide el mieloma en 3 estadios basándose únicamente en los niveles séricos de microglobulina beta-2 y albúmina sérica:
Estadio I: La microglobulina beta-2 sérica es inferior a 3,5 (mg/l) y el nivel de albúmina es superior a 3,5 (g/l)
Estadio II: Ni estadio I ni III, lo que significa que: el nivel de beta-2 microglobulina está entre 3,5 y 5,5 (con cualquier nivel de albúmina), o la albúmina está por debajo de 3,5 mientras que la beta-2 microglobulina es inferior a 3,5.
Estadio III: La microglobulina beta-2 sérica es superior a 5,5.
Sin embargo, este sistema de estadificación no indica si un paciente es susceptible a una terapia con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3. Además el hecho, de que BCMA se induzca selectivamente durante la diferenciación de células plasmáticas y se exprese en niveles elevados en células plasmáticas malignas (Ryan, MCet al.,Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018; Novak AJet al.,Blood. 15 de enero de 2004;103(2):689-94. Publicación electrónica del 25 de septiembre de 2003; Maus MV y June CH, Clin Cancer Res 2013;19:2048-60) y por tanto los pacientes, que expresan BCMA en la superficie de sus células MM serían susceptibles de una terapia con un anticuerpo biespecífico que se una específicamente a BCMA y CD3 no es suficiente para una terapia eficaz. Los presentes inventores han reconocido que las células MM de diferentes pacientes son sensibles de manera diferente a una terapia con un anticuerpo biespecífico contra CD3 y BCMA. Al menos una de las siguientes características
- el anticuerpo de diagnóstico para la medición de la expresión de BCMA y el anticuerpo terapéutico están relacionados en cierta medida (MFI),
- la relación E:T para el mieloma múltiple,
- la cantidad de BCMA y/o APRIL soluble en una muestra de fluido corporal, especialmente en una muestra de aspirado de médula ósea, si el paciente padece mieloma múltiple y líquido sinovial, si el paciente padece LES o AR
- es relevante para una terapia exitosa. Preferentemente se combinan dos, tres o las cuatro características. Se combinan preferentemente la determinación de dos, tres o las cuatro características para determinar el método de tratamiento, la selección de una terapia, la selección de un plan de tratamiento y la predicción de la probabilidad según la divulgación.
La expresión "dosis patrón" se refiere a la dosis semanal aprobada por la FDA para el tratamiento del trastorno de células plasmáticas correspondiente, en especial, seleccionado del grupo que consiste en mieloma múltiple, lupus eritematoso y artritis reumatoide. Si la dosis aprobada por la FDA difiere para diferentes semanas, la expresión "dosis patrón" se refiere a la dosis en la semana correspondiente.
La expresión "a dosis más altas y/o con un esquema de tratamiento más frecuente" significa, que partiendo de un plan de terapia reconocido/aprobado para un paciente anterior tratado con un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3 (preferentemente la dosis aprobada por la FDA), la dosis se aumenta en un factor de 1,5 a 2,0, a 2,0 o incluso hasta un factor de 10 y más y/o el intervalo de tiempo entre administraciones de dosis se acorta de una administración por semana a dos veces a la semana o incluso tres veces a la semana o incluso una vez al día.
Con respecto a concentraciones de APRIL superiores a 100 y cercanas a 1000 ng/ml hasta un factor de 80, se prefiere un aumento de dosis si se utiliza para terapia una unión de APRIL a un anticuerpo biespecífico de linfocitos T-BCMA que compite con BCMA (véanse la tabla 9 y la figura 5). El intervalo de tiempo entre administraciones de dosis se puede acortar de una administración por semana a dos veces a la semana o incluso tres veces a la semana o incluso una vez al día. Un plan terapéutico preferido es aquel establecido en los pacientes, los cuales se seleccionaron basándose en que la cantidad de BCMa soluble era de 2,5 ng/ml o inferior, y/o la concentración de APRIL era inferior a 100 ng/ml en una muestra aislada de fluido corporal de dichos pacientes. Una terapia preferida para usar un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a BCMA y CD3 en pacientes que tienen niveles superiores a 100 ng/ml de APRIL y/o 2,5 ng/ml de BCMA soluble es adaptar la dosis o el intervalo de dosis. Esto se confirma mediante los valores de CE50 para la destrucción de células tumorales con un anticuerpo biespecífico que compite con APRIL en la tabla 9 con un factor de 2,4 a 100 ng/ml de APRIL pero a un factor de 80 a 1000 ng/ml de APRIL.
La expresión "plan de tratamiento" se refiere a un plan de tratamiento normalizado. En el contexto de la presente solicitud de patente se trata de adaptar la dosis y los intervalos de dosificación a los parámetros medidos de expresión BCMA (MFI), BCMA soluble, APRIL y relación E:T. La pauta proporcionada es preferentemente:
- No tratar con un TCB si la MFI es 50 o menos,
- Adaptar la dosis/pauta posológica si el BCMA soluble es superior a 2,5 ng/ml,
- Adaptar la dosis/pauta posológica si APRIL es superior a 100 ng/ml o simplemente tomar un BCMA-TCB que no compita,
- Combinar con una terapia de expansión/potenciación de linfocitos T si E:T es inferior a 0,5:1
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestra una MFI de 80 o más, preferentemente 100 o más" y, más preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial, se refiere a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende:
determinar la expresión de BCMA en células CD138+ CD38+ de dicho paciente, mediante el uso de un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, y si se observa que la MFI es 80 o más, preferentemente 100 o más por encima del valor inicial,
buscar, utilizando el resultado de dicho método de determinación un paciente anterior que padezca el mismo trastorno con una representación similar (preferentemente la misma); y
revisar el plan de tratamiento anterior para el paciente anterior para determinar cómo mejorar el tratamiento del nuevo paciente basándose en la información del plan de tratamiento anterior.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestra una MFI de 80 o más, preferentemente 100 o más, preferentemente 200 o más, incluso más preferentemente 300 o más por encima del valor inicial" se refiere preferentemente a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende:
determinar la expresión de BCMA en células CD138+ CD38+ de dicho paciente, mediante el uso de un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, y si se observa que la MFI es 80 o más, preferentemente 100 o más por encima del valor inicial, para tratar al paciente con terapia con anticuerpos biespecíficos de linfocitos T-BCMA, pero considerar no tratar a una MFI inferior a 100, preferentemente inferior a 50, incluso preferentemente inferior a 10 sobre el valor inicial.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestre una relación E:T de 0,35: 1, preferentemente 0,5: 1 o superior", se refiere a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende:
determinar si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ (también denominada relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior, y
buscar, utilizando el resultado de dicho método de determinación un paciente anterior que padezca el mismo trastorno con una representación similar (preferentemente la misma); y
revisar el plan de tratamiento anterior para el paciente anterior para determinar cómo mejorar el tratamiento del nuevo paciente basándose en la información del plan de tratamiento anterior.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestre una relación E:T de 0,35: 1, preferentemente 0,5: 1 o superior", se refiere preferentemente a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende determinar si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ (denominada también relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 0,35:1, preferentemente 0,5: 1 o superior, y considerar la combinación con una terapia quimioatrayente de linfocitos T o proliferativa de linfocitos T en caso de que la relación sea inferior a 0,35:1, preferentemente 0,5:1.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestra valores de BCMA soluble de 2,5 ng/ml o superiores" se refiere a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende:
determinar si la cantidad de BCMA soluble en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 2,5 ng/ml o superior, y
buscar, utilizando el resultado de dicho método de determinación un paciente anterior que padezca el mismo trastorno con una representación similar (preferentemente la misma); y
revisar el plan de tratamiento anterior para el paciente anterior para determinar cómo mejorar el tratamiento del nuevo paciente basándose en la información del plan de tratamiento anterior.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestra valores de BCMA soluble de 2,5 ng/ml o superiores" se refiere preferentemente a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende determinar si la cantidad de BCMA soluble en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es de 2,5 ng/ml o superior, y luego considerar cambiar a dosis más altas y/o a un programa de tratamiento más frecuente.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestra un valor de APRIL de 100 ng/ml o superior" se refiere a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende:
determinar si la cantidad de APRIL en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 100 ng/ml o superior, y
buscar, utilizando el resultado de dicho método de determinación un paciente anterior que padezca el mismo trastorno con una representación similar (preferentemente la misma); y
revisar el plan de tratamiento anterior para el paciente anterior para determinar cómo mejorar el tratamiento del nuevo paciente basándose en la información del plan de tratamiento anterior.
La expresión "seleccionar un plan de tratamiento que sea más eficaz para un paciente que muestra un valor de APRIL de 100 ng/ml o superior" se refiere preferentemente a un método para seleccionar un plan de tratamiento para un nuevo paciente, que padece un trastorno que afecta a las células plasmáticas, que comprende determinar si la cantidad de APRlL en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 100 ng/ml o superior, y después usar un anticuerpo biespecífico de linfocitos T-BCMA que no compita con APRIL por la unión a BCMA o considerar de otro modo cambiar a dosis más altas y/o a un esquema de tratamiento más frecuente.
La expresión "investigación del estado de las células plasmáticas relacionadas con BCMA de un paciente" se refiere a la investigación de dichas células plasmáticas mediante uno, dos, tres o los cuatro métodos seleccionados del grupo que consiste en
determinar la expresión de BCMA en células CD138+ CD38+ de dicho paciente, mediante el uso de un anticuerpo anti-BCMA con un valor de Kd, que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA de dicho anticuerpo biespecífico, y si se observa que la MFI es 80 o más, preferentemente 100 o más por encima del valor inicial,
determinar si la relación de células CD3+ a células CD138+ CD38+ (también denominada relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 0,35:1, preferentemente 0,5:1 o superior,
determinar si la cantidad de BCMA soluble en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 2,5 ng/ml o superior, y
determinar si la cantidad de APRIL en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 100 ng/ml o superior.
La expresión "terapia proliferativa de linfocitos T" se refiere a un tratamiento terapéutico o un tratamiento biológico que induce la proliferación o expansión de linfocitos T tales como, por ejemplo, citocinas recombinantes (por ejemplo,<interferones (IFN) IFN-gamma, IFN-a; interleucinas (IL) IL-IL-1, i>L-2,<IL-7, IL-9, IL-15, IL-16, IL-17, IL-21), anticuerpos>agonistas contra moléculas coestimuladoras, inhibidores de puntos de control (por ejemplo, anti-PD-1, anti-PD-L1), siendo preferentemente la proliferación o expansión de linfocitos T específica del sitio tumoral.
La expresión "terapia quimioatrayente de linfocitos T" se refiere a un tratamiento terapéutico o un tratamiento biológico que induce la quimiotaxis de linfocitos T al sitio tumoral, tal como por ejemplo quimiocinas (por ejemplo, CCL1, CCL2, CCL22, CCL17, IP-10).
La expresión "muestra de fluido corporal" se refiere a un fluido corporal aislado de un paciente humano. Los fluidos corporales preferidos según la invención son aspirado de médula ósea, sangre, suero, plasma, orina, saliva, líquido sinovial y líquido espinal.
La expresión "aspirado de médula ósea" se refiere a una muestra recuperada mediante biopsia con trefina. La aspiración de médula ósea y la biopsia con trefina generalmente se realizan en la parte posterior del hueso de la cadera o en la cresta ilíaca posterior. También se puede obtener un aspirado del esternón. La aspiración de médula ósea también se puede realizar en la tibia (espinilla). En el caso de pacientes que padecen un trastorno que afecta a las células plasmáticas, como las células malignas del mieloma múltiple, el aspirado de sangre y médula ósea son las muestras de fluidos corporales preferidas. Se prefiere especialmente utilizar según la invención aspirado de médula ósea en pacientes que padecen mieloma múltiple.
La expresión "muestra de sangre" se refiere a una muestra de sangre que comprende células (es decir, eritrocitos (glóbulos rojos), leucocitos (glóbulos blancos), trombocitos (plaquetas)) y plasma.
En el caso de pacientes que padecen LES o AR, las muestras de fluido corporal preferidas utilizadas según la divulgación son muestras de sangre y preferentemente líquido sinovial (líquido que rodea las articulaciones inflamadas).
En el caso de pacientes que padecen nefritis lúpica y hepatitis autoinmunitaria de tipo 1, las muestras de sangre preferidas son las muestras de fluidos corporales utilizadas según la divulgación. En la presente invención, el paciente padece mieloma múltiple.
La expresión "células CD138+ CD38+" se refiere a células plasmáticas en individuos sanos y en pacientes con mieloma múltiple. Debido a que las células plasmáticas malignas generalmente se encuentran con mayor frecuencia que las células plasmáticas normales en la médula ósea de los pacientes con mieloma, las células CD138+ CD38+ pueden considerarse células de mieloma de este perfil de expresión cuando se refieren a pacientes con mieloma múltiple. CD38 es un antígeno expresado en células plasmáticas. Debido a que las células plasmáticas son las únicas células de la médula ósea que expresan CD138 (es decir, sindecan-1), este marcador se puede utilizar para identificar y aislar esta población. Debido a que el inmunofenotipo de las células de mieloma no es significativamente diferente entre pacientes tratados y no tratados, el antígeno CD138 podría usarse para el análisis en ambos grupos de pacientes. Preferentemente se seleccionan las células CD138+ inicialmente y después se seleccionan posteriormente utilizando CD38. Para distinguir entre células plasmáticas "normales" y células plasmáticas "malignas" (es decir, células de mieloma), los antígenos CD56 y<c>D19 son marcadores útiles para incluir en el análisis inmunofenotípico. De la población de células plasmáticas identificadas como CD138+ CD38+ por citometría de flujo, la nueva selección de células con CD19+ CD56- se refiere a células plasmáticas normales y con CD19- CD56+ se refiere a células plasmáticas malignas- (Rawstron AC,et al.Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 2008;93:431-438, y Tae-Dong Jeonget al.,Korean J Hematol. diciembre de 2012; 47(4): 260-266).
La expresión "célula diana" se refiere a una célula, que expresa BCMA en su superficie. En caso de que el paciente padezca mieloma múltiple, dicha célula es una célula plasmática de mieloma múltiple. En caso de que el paciente padezca LES o AR, dicha célula es una célula que secreta anticuerpos antinucleares, preferentemente una célula plasmática que secreta anticuerpos antinucleares. Preferentemente la célula diana es una célula CD138+ CD38+.
La expresión "células efectoras" se refiere a células o un grupo de células que pueden inducir citotoxicidad, destrucción celular o apoptosis de células tumorales (por ejemplo, células plasmáticas malignas o células de mieloma), y se refiere a células mononucleares de sangre periférica (PBMC), preferentemente linfocitos T CD3+.
La expresión "células CD3+ o linfocitos T CD3+" se refiere a células que son positivas para CD3. Los linfocitos T también son positivos para el receptor de linfocitos T (TCR) y también pueden identificarse mediante la expresión superficial de TCR. Los linfocitos T también son positivos para CD45 y negativos para CD19 y CD56 y, por lo tanto, también pueden identificarse mediante la determinación de la expresión superficial de CD45 y negativas para CD19 (negativo) y CD56 (negativo). Las células efectoras también pueden identificarse como células CD3+, seleccionadas del grupo formado por linfocitos T auxiliares CD3+ CD4+, linfocitos T citotóxicos CD3+ CD8+, linfocitos T indiferenciados CD3+ CD45RA+ CD197', linfocitos T CD4 indiferenciados CD3+ CD45RA+ CD197' CD4+, linfocitos T CD8 indiferenciados CD3+ CD45RA+ CD197' CD8+, linfocitos T de memoria CD3+ CD45RA', linfocitos T CD4 de memoria CD3+ CD45RA' CD4+, linfocitos T CD8 de memoria CD3+ CD45RA' CD8+, linfocitos T de memoria central CD3+ CD45RA' CD197+, linfocitos T CD4 de memoria central CD3+ CD45RA' CD197+ CD4+, linfocitos T CD8 de memoria central CD3+ CD45RA' CD197+ CD8+, linfocitos T de memoria efectora CD3+ CD45RA' CD197', linfocitos T CD4 de memoria efectora CD3+ CD45RA' CD197' CD4+; linfocitos T CD8 de memoria efectora CD3+ CD45RA' CD197' CD8+, linfocitos T efectores CD3+ CD45RA+ CD197', linfocitos T CD4 efectores CD3+ CD45RA+ CD197' CD4+, linfocitos T CD8 efectores CD3+ CD45RA+ CD197- CD8+, linfocitos T reguladores CD3+ CD4+ CD25hi CD127l0, linfocitos T no agotados CD3+ PD-1- y linfocitos T no agotados CD3+ PD-1- Tim-3-.
La expresión "valor inicial determinado como intensidad de fluorescencia media MFI o media relativa" se refiere al valor inicial definido para el aparato FACS usado para la determinación según la divulgación. Un valor inicial se define por MFI de un linfocito T como referencia.
La expresión "BCMA soluble" se refiere al BCMA presente en muestras de fluido de un paciente. Preferentemente se utiliza un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas para determinar las concentraciones de BCMA en muestras de fluidos corporales, preferentemente suero, preferentemente plasma. Preferentemente el ensayo no tiene reacción cruzada con Ap RIL, BAFF, BAFF-R o TACI humanos.
La expresión "medir la cantidad de APRIL soluble" se refiere preferentemente al uso de un método ELISA.
En un ejemplo, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico contra CD3<e>y BCMA para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. La divulgación proporciona métodos para determinar la capacidad de respuesta de un paciente a dicho tratamiento y ensayos de diagnóstico relacionados.
La invención se refiere a un anticuerpo biespecífico contra CD3e y BCMA para su uso en el tratamiento de mieloma múltiple. La divulgación proporciona métodos para determinar la capacidad de respuesta de un paciente a dicho tratamiento y ensayos de diagnóstico relacionados.
La invención se refiere al campo de la terapia de seres humanos.
Materiales y métodos generales
Técnicas de cultivo celular
Se utilizan técnicas de cultivo celular convencional como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios a partir de PBMC
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad Histopaque a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidos (capas leucocitarias) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre nueva de donantes humanos sanos. Brevemente, la sangre se diluyó con PBS estéril y se colocó cuidadosamente en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, H8889). Después de una centrifugación de 30 minutos a 450 x g a temperatura ambiente (freno desconectado), se descartó parte del plasma por encima de la interfase que contenía PBMC. Las PBMC se transfirieron a tubos Falcon nuevos de 50 ml y los tubos se llenaron con PBS hasta un volumen total de 50 ml. La mezcla se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 x g (freno activado). Se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBM<c>se lavó dos veces con PBS estéril (pasos de centrifugación a 4 °C durante 10 minutos a 350 x g). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio RPMI1640, que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en la estufa de incubación hasta que comenzara el ensayo.
El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó utilizando el kit II de aislamiento de linfocitos Pan T (Miltenyi Biotec n.° 130-091-156), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sedimentos celulares se diluyeron en 40 pl de tampón frío por 10 millones de células (PBS con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM, filtrado estéril) y se incubaron con 10 pl de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 millones de células durante 10 minutos a 4 °C. Se añadieron 30 pl de tampón frío y 20 pl de perlas magnéticas anti-biotina por cada 10 millones de células, y la mezcla se incubó durante otros 15 minutos a 4 °C. Las células se lavaron añadiendo 10-20 veces el volumen actual y con un paso de centrifugación posterior a 300 x g durante 10 minutos. Se resuspendieron hasta 100 millones de células en un tampón de 500 pl. La separación magnética de linfocitos pan T humanos no marcados se realizó utilizando columnas LS (Miltenyi Biotec n.° 130-042-401) según las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio AIM-V a 37 °C, CO2 al 5 % en la estufa de incubación hasta el inicio del ensayo (no más de 24 h).
Aislamiento de linfocitos T primarios humanos indiferenciados a partir de PBMC
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad Histopaque a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidos (capas leucocitarias) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre nueva de donantes humanos sanos. El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T CD8+ indiferenciados de Miltenyi Biotec (n.° 130-093-244), según las instrucciones del fabricante, pero omitiendo el último paso de aislamiento de linfocitos T CD8+ (véase también la descripción para el aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios).
Líneas celulares de mieloma humano BCMA positivas
Se utilizaron líneas celulares de mieloma humano BCMA positivas (NCI-H929, RPMI-8226, U266B1 y L-363). Se cultivaron células NCI-H929 ((H929) ATCC® CRL-9068™) en RPMI 1640 al 80-90 % con FCS inactivado por calor al 10-20 % y podían contener L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y mercaptoetanol 50 pM. Las células RPMI-8226 ((RpMl) ATCC® CCL-155™) se cultivaron en un medio que contenía RPMI 1640 al 90 % y FCS al 10 % inactivado por calor. Las células U266B1 ((U266) ATCC® TIB-196™) se cultivaron en medio RPMI-1640 modificado para contener L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 4500 mg/l de glucosa y 1500 mg/l de bicarbonato de sodio y FCS inactivado por calor al 15%. La línea celular L-363 (Instituto Leibniz DSMZ - German collection of microorganisms and cell cultures; DSMZ N.° ACC 49) se cultivó en RPMI 1640 al 85 % y FCS al 15 % inactivado por calor.
Ejemplos
Ejemplo 1: Medición optimizada de la expresión de BCMA en células de mieloma de pacientes
Ejemplo 1.1: Medición cualitativa de la expresión de BCMA en células de mieloma de pacientes detectada mediante citometría de flujo (intensidad de fluorescencia media)
Se obtuvieron aspirados de sangre y médula ósea de pacientes con mieloma múltiple después de dar su consentimiento informado, según las directrices del comité ético local y la Declaración de Helsinki. La expresión cualitativa de BCMA se midió en la superficie celular de células de mieloma de los pacientes a partir de aspirados de médula ósea mediante citometría de flujo. Se utilizó anticuerpo contra BCMA-1 bivalente conjugado con APC, que tiene una afinidad por BCMA humano de 10,9 ± 2,7 nM detectada por resonancia de plasmón superficial, para determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI).
Para determinar la expresión del receptor de BCMA en las células de mieloma de la médula ósea de los pacientes, los análisis inmunofenotípicos se realizaron utilizando aspirados de médula ósea recién aislados. Se utilizaron muestras de médula ósea completa anticoagulada con K3-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) con eritrocitos lisados para los análisis inmunofenotípicos. Se tiñó un total de 2*106 células por tubo mediante una técnica de inmunofluorescencia directa y tinción multicolor, cuyo objetivo fue la identificación específica y caracterización inmunofenotípica de células plasmáticas malignas identificadas como CD138+ CD38+ CD45+ CD56+ CD19'. A continuación, las células de la médula ósea se tiñeron utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo que incluía al menos CD138-APCC750/CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/BCMA-APC durante 20 a 30 minutos en hielo, protegidas de la luz. Los anticuerpos marcados con fluorocromo utilizados se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA) y Caltag Laboratories (San Francisco CA). En los análisis inmunofenotípicos se utilizó el anticuerpo anti-BCMA-1 humano bivalente conjugado con APC. La adquisición se realizó utilizando un citómetro de flujo multicolor y un programa informático instalado (por ejemplo, un dispositivo CantoII que ejecuta el programa informático FACS Diva o un citómetro de flujo FACS Calibur que utiliza el programa informático CellQUEST). Para el análisis de los datos se utilizó el programa Paint-A-Gate PRO (BD Biosciences). La expresión de BCMA se midió seleccionando la población de células plasmáticas malignas y se determinaron y compararon los valores intensidad de fluorescencia media entre los pacientes con mieloma. Los valores de MFI relativa de la expresión de BCMA en células de mieloma se calcularon restando el valor de MFI absoluta de un anticuerpo de control de isótopo conjugado con APC seleccionado en células de mieloma CD138+ CD38+ CD45+ CD56' CD19' o de un anticuerpo de BCMA-1 conjugado con APC seleccionado en linfocitos T CD3+ (que se sabe que son BCMA negativos) a partir del valor de MFI absoluta de un anticuerpo de BCMA-1 conjugado con APC seleccionado en células de mieloma. La figura 1 muestra los gráficos de histograma FACS representativos de (A) expresión de BCMA media-alta, (B) expresión BCMA moderada (mod) y (C) expresión BCMA baja (lo) en células de mieloma del paciente detectadas por citometría de flujo (MFI). Como se muestra en la figura 1, existe un claro desplazamiento hacia la derecha correspondiente a la expresión positiva de BCMA en las células de mieloma de los pacientes en comparación con el control negativo (anticuerpo de BCMA-1 conjugado con APC seleccionado en linfocitos T). Basándose en los valores de MFI relativa, todos pacientes con mieloma expresan BCMA en sus células plasmáticas malignas, pero la expresión de BCMA varía desde una expresión baja (valores de MFI relativa <103) a expresión moderada (103- 0,3 * 104) a expresión media-alta (0,3 * 104 - 104). La expresión de BCMA con valores de MFI relativa > 104 no se observó entre las muestras de médula ósea de los pacientes investigados. La tabla 3 resume los valores de MFI relativa de BCMA expresado en células de mieloma de médula ósea de los pacientes.
Tabla 3: Expresión de BCMA en células de mieloma de los pacientes en la médula ósea: intensidad de fluorescencia media relativa
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Ejemplo 1.2: Medición cuantitativa de BCMA en células de mieloma de los pacientes detectadas mediante citometría de flujo (capacidad de unión a antígeno específica)
La expresión cuantitativa de BCMA, es decir, la capacidad de unión a antígeno específica (SABC, por sus siglas en inglés) de BCMA, también se midió en la superficie celular de las células de mieloma de los pacientes mediante citometría de flujo. Se utilizó el método Qifikit (Dako) para cuantificar el número de copias del antígeno de BCMA o la capacidad de unión a antígeno específica en la superficie celular de las células de mieloma de médula ósea de los pacientes en comparación con la línea celular de mieloma humano H929. Se recogieron aspirados de médula ósea y las células se lavaron con tampón FACS (100 pl/pocillo; 350 x g durante 5 min) y se ajustó a 1 millón de células/ml. Se transfirieron 50 pl (= 0,5 millones de células) de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Después, se añadieron 50 pl de IgG de ratón anti-BCMA humano (BioLegend n.° 357502) o un control de isotipo IgG2a de ratón (BioLegend n.° 401501) diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,1 %) hasta una concentración final de 25 pg/ml (o en concentraciones de saturación) y se realizó la tinción durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. A continuación, se añadieron 100 pl de las perlas de configuración o calibración en pocillos separados y las células, así como las perlas se lavaron dos veces con tampón FACS. Las células y las perlas se resuspendieron en 25 pl de tampón FACS, que contenía anticuerpo secundario antirratón conjugado con fluoresceína (en concentraciones de saturación), proporcionado en el Qifikit. Las células y las perlas se tiñeron durante 45 minutos a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavaron una vez y todas las muestras se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS. La muestras se analizaron en un citómetro de flujo multicolor y un programa informático instalado (por ejemplo, un dispositivo CantolI que ejecuta el programa informático FACS Diva o un citómetro de flujo FACS Calibur que utiliza el programa informático CellQUEST). Para el análisis de los datos se utilizó el programa Paint-A-Gate PRO (BD Biosciences). La tabla 4 resume la expresión cuantitativa de BCMA en las células de mieloma de médula ósea de los pacientes medida por la capacidad de unión a antígeno específica (SABC).
Tabla 4: Expresión de BCMA en células de mieloma de los pacientes en la médula ósea: capacidad de unión a antí eno es ecífica
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Ejemplo 1.3: La potencia letal de BCMA-TCB está influenciada por la expresión de BCMA en la superficie de las células diana: Células de mieloma H929 que expresan BCMAhi frente a U266 que expresan BCMAmed/l° frente a L363 que expresan BCMAmed/l° frente a RPMI-8226 que expresan BCMA^
La potencia de los anticuerpos BCMA-TCB puede verse influenciada por el nivel de expresión de BCMA en la superficie celular de las células de mieloma. La potencia letal de BCMA-TCB se midió en un ensayo de citotoxicidad redirigida de linfocitos T utilizando diferentes líneas celulares de mieloma humano como células diana, es decir, células de mieloma H929 que expresan BCMAhi frente a U266 que expresan BCMAmed/l°
Brevemente, se recogieron células de mieloma múltiple diana H929 que expresan BCMAhi o U266 que expresan BCMAmed/b humanas con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Aproximadamente, se sembraron 30.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la dilución correspondiente de las construcciones de TCB para obtener una concentración final deseada (por triplicado); oscilando las concentraciones finales de BCMA-TCB entre 0,1 pM y 10 nM. Para una comparación apropiada, todas las construcciones y controles de TCB se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron PBMC humanas (efectoras) a los pocillos para obtener una relación E:T final de 10:1. Los grupos de control negativo estuvieron representados únicamente por células efectoras o diana. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 1 pg/ml de PHA (Sigma n.° L8902). Para la normalización, se determinó la lisis máxima de las células de mieloma múltiple diana H929 que expresan BCMAhi o U266 que expresan BCMAmed/b (= 100 %) mediante incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, induciendo la muerte celular. La lisis mínima (= 0 %) se representó mediante células diana incubadas en conjunto únicamente con células efectoras, es decir, sin ningún anticuerpo biespecífico de linfocitos T. Después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió, a continuación, la liberación de LDH a partir de células de mieloma múltiple diana H929 que expresan BCMAhi o U266 que expresan BCMAmed/b apoptóticas/necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. El porcentaje de liberación de LDH se representó frente a las concentraciones de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T anti-BCMA/anti-CD3 en curvas de concentración-respuesta. Los valores de CE50 se midieron utilizando el programa informático Prism (GraphPad) y se determinaron como la concentración de anticuerpos TCB que da como resultado el 50 % de la liberación máxima de LDH. Como se muestra en la figura 2, BCMA-2- TCB indujo la destrucción de células de mieloma H929 que expresan BCMAhi con una CE50 de 115 pM y una destrucción máxima del 60 %, mientras que el mismo anticuerpo BCMA-TCB solo pudo destruir células de mieloma diana U266 que expresan BCM A™ ^ con una CE50 de 370 pM y una destrucción máxima del 18 % cuando se realiza una comparación directa. La tabla 5 resume los valores de CE50 y la destrucción máxima de BCMA-2-TCB para destruir células de mieloma diana H929 que expresan BCMAhi o U266 que expresan BCMA^
La potencia de otro anticuerpo BCMA-TCB, BCMA-1-TCB, para inducir la destrucción de líneas celulares de mieloma que expresan BCMA (células MM H929 que expresan BCMAhi, L363 que expresan BCM A™ ^ y RPMI-8226 que expresan BCMA^) también se probó utilizando condiciones experimentales similares. Como se muestra en la figura 2,1, BCMA-1-TCB indujo la destrucción de (A) células de mieloma H929 que expresan BCMAhi con una CE50 de 8,49 pM y una destrucción máxima del 82,8 %, mientras que el mismo anticuerpo BCMA-1-TCB solo pudo destruir (B) células de mieloma diana L363 que expresan BCMAmed/b con una CE50 de 12,6 pM y una destrucción máxima del 67,1 % o (C) RPMI-8226 que expresan BCMA^ con una CE50 de 229,3 pM y una destrucción máxima del 28,1 % cuando se realiza una comparación directa. La tabla 5.1 resume los valores de CE50 y la destrucción máxima de BCMA-1-TCB para destruir células de mieloma diana H929 que expresan BCMAhi, L363 que expresan BCMAmed/b o RPMI-8226 que expresan BCMA^.
Tabla 5: La potencia de BCMA-2-TCB para destruir líneas celulares de mieloma que expresan BCMA está infl n i r l x r i n B MA n l l l ^ i n
Tabla 5.1: La potencia de BCMA-1-TCB para destruir líneas celulares de mieloma que expresan BCMA está infl n i r l x r i n B MA n l l l i n
Ejemplo 2: Medición de la relación de células efectoras a células tumorales (E:T) en aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma
La potencia de los anticuerpos de BCMA puede verse influenciada por el nivel de expresión de BCMA en la superficie celular de las células de mieloma. Sin embargo, para los anticuerpos BCMA-TCB, la potencia de destrucción incluso de las células que expresan altos niveles de BCMA en la superficie también puede verse influenciada por las relaciones E:T, que pueden variar significativamente como se observa en pacientes con mieloma múltiple.
Ejemplo 2.1: Determinación de la relación de linfocitos T CD3+ a células de mieloma CD138+ CD38+ (E:T) en aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma mediante citometría de flujo
Ejemplo 2.1.1: Medición de células de mieloma en aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma
Para determinar el porcentaje y los recuentos absolutos de células plasmáticas malignas que se infiltran en la médula ósea en pacientes con mieloma, los análisis inmunofenotípicos se realizaron utilizando aspirados de médula ósea recién aislados. Se utilizaron muestras de médula ósea completa anticoagulada con K3-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) con eritrocitos lisados para los análisis inmunofenotípicos. Se tiñó un total de 2*10® células por tubo mediante una técnica de inmunofluorescencia directa y tinción multicolor, cuyo objetivo fue la identificación específica y caracterización inmunofenotípica de células plasmáticas malignas identificadas como CD138+ CD38+ CD45+ CD56+ CD19'. Después, las células de médula ósea se tiñeron utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo que incluía al menos CD138-APCC750/CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450 durante 20 a 30 minutos en hielo, protegidas de la luz. Los anticuerpos marcados con fluorocromo utilizados se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA) y Caltag Laboratories (San Francisco CA). La adquisición se realizó utilizando un citómetro de flujo multicolor y un programa informático instalado (por ejemplo, un dispositivo CantolI que ejecuta el programa informático FACS Diva o un citómetro de flujo FACS Calibur que utiliza el programa informático CelQUEST). Para el análisis de los datos se utilizó el programa Paint-A-Gate PRO (BD Biosciences). El porcentaje de células plasmáticas malignas se determinó mediante la selección de la población CD138+ CD38+ CD45+ CD56+ CD19'. Para calcular los recuentos absolutos de células plasmáticas malignas, el porcentaje de células plasmáticas malignas se multiplicó por el volumen de la muestra de aspirado de médula ósea medido por ejemplo con un analizador de<hematología (Advia® 120, Siemens). En algunos experimentos, se utilizaron tubos Truco™>(B<d Biosciences, San José>CA, EE. UU.) para determinar los recuentos absolutos de leucocitos en sangre.
Ejemplo 2.1.2: Medición de linfocitos T y subconjuntos de linfocitos T en aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma
Para BCMA-TCB, las células efectoras son principalmente linfocitos T, incluidos muchos subconjuntos de linfocitos T. Para determinar el porcentaje y los recuentos absolutos de linfocitos T y subconjuntos de linfocitos T, los análisis inmunofenotípicos se realizaron utilizando aspirados de médula ósea recién aislados. Se utilizaron muestras de médula ósea completa anticoagulada con K3-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) con eritrocitos lisados para los análisis inmunofenotípicos. Se tiñó un total de 2*10® células por tubo mediante una técnica de inmunofluorescencia directa y tinción multicolor, cuyo objetivo era la identificación específica y caracterización inmunofenotípica de los linfocitos T que se pueden identificar como CD45+ CD3+ CD5®' o CD3+ o CD45+ CD19' CD56- Después, las células de médula ósea se tiñeron utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo que incluía CD138-APCC750/CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450 durante 20 a 30 minutos en hielo, protegidas de la luz. Los anticuerpos marcados con fluorocromo utilizados se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA) y Caltag Laboratories (San Francisco CA). La adquisición se realizó utilizando un citómetro de flujo multicolor y un programa informático instalado (por ejemplo, un dispositivo CantolI que ejecuta el programa informático FACS Diva o un citómetro de flujo FACS Calibur que utiliza el programa informático CellQUEST). Para el análisis de los datos se utilizó el programa Paint-A-Gate PRO (BD Biosciences). El porcentaje de linfocitos T que se infiltran en la médula ósea se<determinó mediante la selección de población CD45.+ CD19' c>D5®<'>.<Para calcular los recuentos absolutos de linfocitos>T, el porcentaje de linfocitos T se multiplicó por el volumen de la muestra de aspirado de médula ósea.
Las células efectoras que representan linfocitos T totales o subconjuntos de linfocitos T también se miden mediante la tinción de células de médula ósea de pacientes con mieloma con anticuerpos conjugados con fluorocromo: linfocitos T CD3+, linfocitos T auxiliares CD3+ CD4+, linfocitos T citotóxicos CD3+ CD8+, linfocitos T indiferenciados CD3+ CD45RA+ CD197', linfocitos T CD4 indiferenciados CD3+ CD45RA+ CD197' CD4+, linfocitos T CD8 indiferenciados CD3+ CD45RA+ CD197' CD8+, linfocitos T de memoria CD3+ CD45RA', linfocitos T CD4 de memoria CD3+ CD45RA' CD4+, linfocitos T CD8 de memoria CD3+ CD45RA' CD8+, linfocitos T de memoria central CD3+ CD45RA' CD197+, linfocitos T CD4 de memoria central CD3+ CD45RA' CD197+ CD4+, linfocitos T CD8 de memoria central CD3+ CD45RA' CD197+ CD8+, linfocitos T de memoria efectora CD3+ CD45RA-CD197-, linfocitos T CD4 de memoria efectora CD3+ CD45RA- CD197- CD4+; linfocitos T CD8 de memoria efectora CD3+ CD45RA- CD197- CD8+, linfocitos T efectores CD3+ CD45RA+ CD197-, linfocitos T CD4 efectores CD3+ CD45RA+ CD197- CD4+, linfocitos T CD8 efectores CD3+ CD45RA+ CD197- CD8+, linfocitos T reguladores CD3+ CD4+ CD25hi CD127'°, linfocitos T no agotadas CD3+ PD-1-, linfocitos T no agotados CD3+ PD-1- Tim-3-. Para calcular los recuentos absolutos de los subconjuntos de linfocitos T, el porcentaje de ese subconjunto de linfocitos T se multiplica por el volumen de la muestra de aspirado de médula ósea.
Debido a que los linfocitos T circulantes pueden infiltrarse en la médula ósea y, por lo tanto, influir en la relación E:T, también se miden el porcentaje y los recuentos absolutos de linfocitos T circulantes. La sangre se extrae de los pacientes mediante un tubo heparinizado o que contiene citrato de sodio. Después, se tiñe la sangre completa con anticuerpo conjugado con fluorocromo dirigido a CD3 en hielo durante 20 minutos, protegida de la luz. Después se lisan los glóbulos rojos con tampón de lisis (BD Bioscience) y las células se lavan dos veces con tampón de lavado. La adquisición se realiza utilizando un citómetro de flujo multicolor y un programa informático instalado (por ejemplo, un dispositivo CantoII que ejecuta el programa informático FACS Diva o un citómetro de flujo FACS Calibur que utiliza el programa informático CellQUEST). Para el análisis de datos se utiliza el programa Paint-A-Gate PRO (BD Biosciences). El porcentaje de linfocitos T circulantes se determina mediante la selección de población CD3+. Para calcular los recuentos absolutos de linfocitos T, el porcentaje de linfocitos T se multiplica por el volumen de muestra de sangre.
Con los porcentajes de células de mieloma/plasmáticas malignas infiltrantes (es decir, células tumorales) y linfocitos T (por ejemplo, células efectoras) medidos en los aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma, se podrían determinar así las relaciones E:T. Como se representa en la tabla 6, las relaciones E:T (linfocitos T a células de mieloma) pueden variar considerablemente en pacientes con mieloma múltiple.
También se midió la evaluación de los subconjuntos de linfocitos T CD4+ y CD8+. La suspensión celular se recogió del cultivo de aspirado de médula ósea sin tratar (24 h o menos) y se tiñó con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD4 humano y CD8 humano (BD Bioscience, San José CA). La tabla 6.1. muestra las relaciones E:T (linfocitos T CD4+ a células de mieloma) en pacientes con mieloma múltiple y la tabla 6.2. muestra las relaciones E:T (linfocitos T CD8+ a células de mieloma) en pacientes con mieloma múltiple.
La relación E:T con linfocitos T CD4+ y CD8+ no agotados también se evaluaron midiendo el porcentaje de subconjunto de linfocitos T CD4 o CD8 que expresan PD-1 o TIM-3 en la superficie celular. La suspensión celular se recogió del cultivo de aspirado de médula ósea sin tratar y se tiñó con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra PD-1 humano y TIM-3 humano (BD Bioscience, San José CA). La tabla 6.3. muestra las relaciones E:T (linfocitos T CD4+ PD-1' a células de mieloma) en pacientes con mieloma múltiple y la tabla 6.4. muestra las relaciones E:T (linfocitos T CD8+ PD-1- a células de mieloma) en pacientes con mieloma múltiple. La tabla 6.5. muestra las relaciones E:T (linfocitos T CD4+ TIM-3- a células de mieloma) en pacientes con mieloma múltiple y la tabla 6.6. muestra las relaciones E:T (linfocitos T CD8+ TIM-3- a células de mieloma) en pacientes con mieloma múltiple.
Tabla 6: Relaciones de células efectoras (linfocitos T) a células tumorales (E:T) en pacientes con mieloma múlti le sin tratar
continuación
Tabla 6.1: Relaciones de células efectoras (linfocitos T CD4+) a células tumorales (E:T) en aspirados de m l i n n mi l m m li l in r r
Tabla 6.2: Relaciones de células efectoras (linfocitos T CD8+) a células tumorales (E:T) en aspirados de m l i n n mi l m m li l in r r
Tabla 6.3: Relaciones de células efectoras (linfocitos T CD4+ PD-1-) a células tumorales (E:T) en aspirados de m l i n n mi l m m li l in r r
Tabla 6.4: Relaciones de células efectoras (linfocitos T CD8+ PD-1-) a células tumorales (E:T) en aspirados de m l i n n mi l m m li l in r r
Tabla 6.5: Relaciones de células efectoras (linfocitos T CD4+ TIM-3-) a células tumorales (E:T) en aspirados m l i n n mi l m m l i l in r r
Tabla 6.6: Relaciones de células efectoras (linfocitos T CD8+ TIM-3-) a células tumorales (E:T) en aspirados m l i n n mi l m m l i l in r r
Ejemplo 2.2: La potencia letal de BCMA-TCB está influenciada por la relación E:T a pesar de la alta expresión de BCMA detectada en la superficie de las células de mieloma diana H929
La potencia letal de BCMA-1-TCB se midió en un ensayo de citotoxicidad redirigida de linfocitos T utilizando diferentes relaciones E:T y líneas celulares de mieloma humanas con niveles de expresión de BCMA en la superficie celular altos frente a bajos.
Ejemplo 2.2.1: Medición cualitativa de BCMA en líneas celulares de mieloma humanas detectada mediante citometría de flujo (intensidad de fluorescencia media)
La expresión cualitativa de BCMA se midió por primera vez en la superficie celular de las células de mieloma diana H929 y U266 mediante citometría de flujo. Brevemente, las células se recogieron, se lavaron, se contaron para determinar la viabilidad, se resuspendieron a 50.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con anticuerpo anti-BCMA humano (Abcam, n.° ab54834, IgG1 de ratón) a 10 pg/ml durante 30 minutos a 4 °C (para evitar la internalización). Se usó una IgG1 de ratón como control de isotipo (BD Biosciences, n.° 554121). Después, las células se centrifugaron (5 min a 350 x g), se lavaron dos veces y se incubaron con el anticuerpo secundario antirratón conjugado con FITC durante 30 min a 4 °C. Al final del periodo de incubación, las células se centrifugaron (5 min a 350 x g), se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron en 100 ul de tampón FACS y se analizaron en un dispositivo CantolI que ejecuta el programa informático FACS Diva. La figura 3 representa la expresión de BCMA en células de mieloma H929 y U266. Hubo un claro desplazamiento hacia la derecha en comparación con el control negativo para ambas líneas celulares de mieloma humanas, siendo las células H929 células que expresan BCMAhi y siendo las U266 células que expresan BCMAmed/l°
Ejemplo 2.2.2: Medición cuantitativa de BCMA en líneas celulares de mieloma humanas detectado mediante citometría de flujo (capacidad de unión a antígeno específica SABC)
La expresión cuantitativa de BCMA, es decir, la capacidad de unión a antígeno específica (SABC) de BCMA, también se midió en la superficie celular de líneas células de mieloma humanas mediante citometría de flujo. Se utilizó el método Qifikit (Dako, n.° K0078) para cuantificar el número de copias del antígeno BCMA en la superficie celular de las líneas celulares de mieloma humanas H929 (ATCC® CRL-9068™) y U266 (ATCC® TIB-196™). Las células se lavaron una vez con tampón FACS (100 pl/pocillo; 350 x g durante 5 min) y se ajustó a 1 millón de células/ml. Se transfieren 50 pl (= 0,5 millones de células) de la suspensión celular a cada pocilio de una placa de 96 pocillos de fondo redondo, como se indica. Después, se añaden 50 pl de IgG de ratón anti-BCMA humano (BioLegend n.° 357502) o un control de isotipo IgG2a de ratón (BioLegend n.° 401501) diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,1 %) hasta una concentración final de 25 pg/ml (o en concentraciones de saturación) y se realiza la tinción durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. A continuación, se añaden 100 |jl de las perlas de configuración o calibración en pocilios separados y las células, así como las perlas se lavan dos veces con tampón FACS. Las células y perlas se resuspenden en 25 j l de tampón FACS. que contiene anticuerpo secundario antirratón conjugado con fluoresceína (en concentraciones de saturación), proporcionado por el Qifikit. Las células y las perlas se tiñen durante 45 minutos a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavan una vez y todas las muestras se resuspenden en 100 j l de tampón FACS. La muestras se analizan en un citómetro de flujo multicolor y un programa informático instalado (por ejemplo, un dispositivo CantolI que ejecuta el programa informático FACS Diva o un citómetro de flujo FACSCalibur que utiliza el programa informático CellQUEST). Tal como se muestra en la tabla 7, las células H929 expresaron BCMA humano con la mayor densidad, hasta 5-6 veces más alto que otras líneas celulares de mieloma y se definieron como células de mieloma H929 que expresan BCMAhi a diferencia de las U266 que se definen como células de mieloma que expresan BCMAmed/l° La expresión cuantitativa de BCMA (SABC) se correlacionó bien con la expresión cualitativa de BCMA (MFI relativa).
Tabla 7: Medición cuantitativa de la expresión de BCMA en líneas celulares de mieloma humanas detectada m i n i m rí fl i ni n n í n ífi AB
Tabla 7.1: Medición cuantitativa de la expresión de BCMA en líneas celulares de mieloma humanas detectada m i n i m rí fl i ni n n í n ífi AB
Ejemplo 2.3: La potencia de BCMA-TCB en el ensayo de citotoxicidad redirigida de linfocitos T está influenciada por la relación E:T.
Se analizó la influencia de la relación E:T sobre la potencia letal de los anticuerpos BCMA-TCB. Brevemente, se recogieron células de mieloma múltiple diana H929 que expresan BCMAhi y U266 que expresan BCMAmed/b humanas con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Aproximadamente, se sembraron 30.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la dilución correspondiente de las construcciones para obtener una concentración final deseada (por triplicado); variando las concentraciones finales de 0,1 pM a 100 nM. Para una comparación apropiada, todas las construcciones y controles de TCB se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron linfocitos T (efectores) humanos totales a los pocillos para obtener una relación E:T final de 5:1. Se usaron PBMC humanas como células efectoras a diferentes relaciones E:T, incluidas 10:1, 2,5:1, 1:1. Los grupos de control negativo estuvieron representados únicamente por células efectoras o diana. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 1 jg/m l de PHA-M (Sigma n.° L8902). Para la normalización, la lisis máxima de las células MM diana H929 (= 100 %) se determinó mediante la incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, induciendo la muerte celular. La lisis mínima (= 0 %) se representó mediante células diana incubadas en conjunto únicamente con células efectoras, es decir, sin ningún anticuerpo biespecífico de linfocitos T. Después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de las células de mieloma diana apoptóticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. El porcentaje de liberación de LDH se representó frente a las concentraciones de anticuerpos BCMA-TCB en curvas de concentración-respuesta. Los valores de CE50 se midieron utilizando el programa informático Prism (GraphPad) y se determinaron como la concentración de anticuerpos TCB que da como resultado el 50 % de la liberación máxima de LDH. Tal como se muestra en la tabla 8, la potencia de BCMA-1-TCB para destruir células H929 que expresan BCMAhi y células U266 que expresan BCM A™ ^ estaba influenciada, es decir, la potencia letal de BCMA-1-TCB se redujo a medida que disminuía la relación E:T. La reducción en la potencia letal (es decir, el aumento de los valores de CE50) fue más pronunciada en las líneas celulares U266 que expresan BCM A™ ^ y la capacidad de destrucción de BCMA-1-TCB se perdió cuando la relación E:T se redujo de 10:1 a 2,5:1 y 1:1.
Según los resultados de que 1) las relaciones E:T pueden variar considerablemente entre pacientes con mieloma múltiple y 2) la potencia letal de BCMA-TCB puede verse influenciada por la relación E:T, se necesita un método de estratificación de pacientes que incluya la medición de la relación E:T antes del tratamiento con BCMA-TCB, ya que los pacientes con mieloma con una relación E:T alta tendrían más posibilidades de responder a la terapia con BCMA-TCB y los pacientes con una relación E:T baja podrían tener menos posibilidades de responder a la terapia con BCMA-TCB.
Tabla 8: La potencia de BCMA-1-TCB (valores de CE50) para destruir líneas celulares de mieloma que expresan BCMA está influenciada por diferentes relaciones E:T y por la expresión de BCMA en las células diana
Ejemplo 3: Detección de BCMA soluble en suero/plasma y aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma mediante métodos basados en ELISA
Se pueden encontrar niveles elevados de BCMA soluble en el suero de pacientes con mieloma múltiple sin tratar en comparación con individuos sanos, con niveles solubles que aumentan hasta 120 ng/ml en algunos pacientes (Sánchezet al.Brit J Haematol 2012). Como los anticuerpos biespecíficos de linfocitos T son moléculas muy potentes con eficacia femtomolar a picomolar en análisis en células aisladasin vitro,se espera que se administren dosis clínicas eficaces en dosis muy bajas en pacientes (Bargouet al.Science 2008; 321 (5891); 974-7) y dicho BCMA soluble en pacientes con mieloma puede afectar la potencia de los anticuerpos BCMA-TCB al unirse a ellos e impedir que se unan a BCMA en la superficie celular de las células de mieloma y se impida entonces la destrucción redirigida de células plasmáticas por linfocitos T.
Ejemplo 3.1: Medición de BCMA soluble en suero/plasma y aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma
La sangre periférica y los aspirados de médula ósea se recogen de pacientes con mieloma múltiple después de que se otorgue el consentimiento informado, según las directrices del comité ético local y la Declaración de Helsinki. Se aísla suero a partir de un tubo separador de suero Corvac™ (Becton Dickinson) mediante centrifugación y se almacena a -80 °C hasta su uso. Los aspirados de médula ósea o sangre se recogen en tubos heparinizados, se centrifugan y el sobrenadante se recoge y se almacena a -80 °C hasta su uso. En algunos experimentos, los aspirados de médula ósea del paciente se cultivan durante un máximo de 48 h antes de analizarlos para determinar la medición de BCMA soluble. Las muestras de suero, plasma y sobrenadante se analizan mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) BCMA (R&D Systems, número de catálogo DY193E). Las muestras de suero/plasma/médula ósea se diluyen 1:50 y se realiza el ensayo ELISA de BCMA según el protocolo del fabricante. Las placas de ELISA se analizan utilizando un lector de placas ajustado a 450 nm. Los valores representan la media de muestras por triplicado en cada espécimen. De forma notable, este kit ELISA de BCMA específico no reacciona de forma cruzada con APRIL o BAFF humanos recombinantes, TACI/Fc humano recombinante o BCMA/Fc de ratón recombinante o BCMA de ratón. Los patrones de antígeno BCMA o suero/plasma/médula ósea (diluidos 1:50) de pacientes con mieloma se incuban utilizando un anticuerpo monoclonal murino anti-BCMA humano (n.° de catálogo WH0000608M1; Sigma-Aldrich) o el anticuerpo de captura policlonal proporcionado en el ELISA de BCMA. A continuación, las muestras se analizan según el protocolo de ELISA de BCMA. La tabla 8.1 resume los niveles de BCMA soluble medidos en el sobrenadante de aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma sin tratar en cultivo (aproximadamente 48 h).
Ejemplo 3.2: Verificación de si los anticuerpos BCMA-TCB se unen o no a BCMA soluble en suero/plasma y aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma
Las muestras de suero/plasma y sobrenadante de aspirado de médula ósea de pacientes con mieloma que contienen BCMA soluble previamente recogidas y almacenadas a -80 °C se analizan para determinar su unión a anticuerpos BCMA-TCB utilizando un método ELISA sándwich de captura con un anticuerpo policlonal de BCMA contra DEC de BCMA humano utilizado como anticuerpo de captura y como anticuerpo de detección un anticuerpo BCMA que representa el aglutinante de BCMA del anticuerpo biespecífico BCMA-TCB. Brevemente, se inmoviliza un anticuerpo BCMA de captura policlonal en una placa de microtitulación de PVC a una concentración de 1 - 10 pg/ml en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9,6). Después se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante la noche a 4 °C. A continuación se retira la solución de recubrimiento y se lava la placa dos veces llenando los pocillos con 200 pl de PBS. Las soluciones o lavados se eliminan sacudiendo la placa sobre un fregadero. Las gotas restantes se eliminan dando palmaditas en la placa sobre una toalla de papel. Los sitios de unión a proteínas restantes en los pocillos recubiertos se bloquean añadiendo 200 pl de tampón de bloqueo, leche en polvo desnatada/PBS al 5 %, por pocillo. Después se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante al menos 1 o 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Se añaden a cada pocillo, por duplicado, 100 pl de muestras diluidas adecuadamente de las muestras de suero/plasma de pacientes con mieloma que contienen BCMA soluble y de sobrenadante de aspirado de médula ósea. Se procesan los patrones y el blanco con cada placa. Después, la microplaca se incuba durante 90 minutos a 37 °C. Después se retiran las muestras y la placa se lava dos veces llenando los pocillos con 200 pl de PBS. Se añaden a cada pocillo 100 pl de anticuerpo de detección conjugado con biotina diluido que consiste en el anticuerpo BCMA que representa el aglutinante de BCMA del anticuerpo biespecífico BCMA-TCB. Después se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lava cuatro veces con PBS. Después del lavado, se añaden a los pocillos 100 pl de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) o fosfatasa alcalina (ALP, por sus siglas en inglés). La estreptavidina conjugada con HRP o ALP se diluye a la concentración óptima en un tampón de bloqueo inmediatamente antes de su uso. Después se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Después se lava la placa cuatro veces con PBS. Se utiliza pNPP (p-nitrofenil-fosfato) como sustrato de ALP y se añade a los pocillos y se incuba a temperatura ambiente durante 15-30 min. Después se detiene la reacción añadiendo un volumen igual de NaOH 0,75 M. Después se mide la placa a 405 nm usando un lector de placas. Para sustrato de HRP, se utiliza peróxido de hidrógeno y la densidad óptima se lee a 450 nm. Después se prepara una curva patrón a partir de los datos producidos a partir de las diluciones en serie con la concentración en el eje x (escala logarítmica) frente a la absorbancia en el eje Y (lineal).
Ejemplo 4: Detección de APRIL o BAFF soluble en suero/plasma y médula ósea de pacientes con mieloma
En determinadas neoplasias hematológicas como el mieloma múltiple, el nivel de ligandos de BCMA circulantes APRIL y BAFF puede ser elevado (Moreauxet al.2004; Blood 103(8): 3148-3157). Por tanto, los presentes inventores reconocen que niveles elevados de ligandos en el suero/plasma pueden interferir con la unión de los anticuerpos BCMA-TCB al receptor de BCMA en las células tumorales. En comparación con los donantes sanos, los niveles de APRIL circulante (el ligando de alta afinidad por BCMA) en la sangre de pacientes con mieloma múltiple son ~100 ng/ml frente a ~10 ng/ml. Para BAFF (el ligando de baja afinidad por BCMA), los niveles pueden fluctuar entre 1-1000 ng/ml en comparación con ~3 ng/ml en donantes sanos. Cerca de las células tumorales, es decir, en el microambiente de la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (la médula ósea es un órgano constitutivamente rico en APRIL), es muy posible que las concentraciones de APRIL/BAFF sean más altas que los niveles medidos en el suero. Y lo que es más importante, APRIL se expresa constitutivamente en el microambiente de la médula ósea, siendo un importante factor de supervivencia para las células de mieloma maligno y siendo producido y secretado también principalmente por células precursoras mieloides de la médula ósea (Mattheset al.Sangre 2011; 118 (7): 1838-1844). Por tanto, las concentraciones de APRIL en la médula ósea de pacientes con mieloma, que se espera que sean de mayor magnitud, hasta 1000 ng/ml o incluso más, son de gran relevancia en este contexto. En determinadas enfermedades autoinmunitarias como el lupus eritematoso sistémico, los niveles de APRIL circulante también son elevados con aproximadamente 85 ng/ml (Koyama).et al.2005; Ann Rheum Dis 64: 1065-1067).
Para los anticuerpos BCMA-TCB que compiten con APRIL soluble (el ligando de BCMA con alta afinidad) para unirse al receptor de BCMA, los altos niveles de APRIL soluble pueden afectar su potencia, especialmente cuando se espera que las concentraciones clínicamente eficaces de anticuerpos BCMA-TCB sean bajas, ya que son moléculas potentes. Por tanto, existe la necesidad de medir APRIL soluble en muestras de sangre/suero/plasma o aspirado de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.
Ejemplo 4.1: Se pueden medir diversos niveles de APRIL soluble en suero/plasma o aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma mediante un método basado en ELISA
La sangre periférica y los aspirados de médula ósea se recogen de pacientes con mieloma múltiple después de que se otorgue el consentimiento informado, según las directrices del comité ético local y la Declaración de Helsinki. Se aísla suero a partir de un tubo separador de suero Corvac™ (Becton Dickinson) mediante centrifugación y se almacena a -80 °C hasta su uso. Los aspirados de médula ósea y la sangre se recogen en tubos heparinizados, se centrifugan y el sobrenadante se recoge y se almacena a -80 °C hasta su uso. En algunos experimentos, los aspirados de médula ósea del paciente se cultivan durante un máximo de 48 h antes de analizarlos para determinar la medición de APRIL soluble. Las muestras de sobrenadante de suero, plasma y médula ósea se analizan mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) APRIL (R&D Systems, número de catálogo DY884B). Las muestras de suero se diluyen 1:50 y el ensayo ELISA de APRIL se realiza según el protocolo del fabricante. Las placas de ELISA se analizan utilizando un lector de placas ajustado a 450 nm. Los valores representan la media de muestras por duplicado y por triplicado en cada espécimen. Los patrones de antígeno APRIL o el sobrenadante de suero/plasma o aspirado de médula ósea (diluido 1:50) de pacientes con mieloma se incuban utilizando un anticuerpo de captura proporcionado en el kit ELISA de APRIL. A continuación, las muestras se analizan según el protocolo de ELISA de APRIL.
Ejemplo 4.2: APRIL soluble influye en la potencia del anticuerpo BCMA-TCB bloqueantes/competidores de APRIL para destruir células diana de mieloma BCMA positivas
Para verificar si la potencia letal de los anticuerpos BCMA-TCB que bloqueantes/competidores de APRIL se vería afectada por APRIL soluble, se analizaron anticuerpos BCMA-TCB bloqueantes/competidores de APRIL para determinar su potencial para inducir la destrucción mediada por linfocitos T de células de mieloma diana BCMA positivas tras la reticulación de la construcción mediante la unión de los restos de unión a antígeno a BCMA en las células en presencia de concentraciones elevadas de APRIL soluble encontradas en pacientes con mieloma múltiple (es decir, de 100 ng/ml a 1000 ng/ml). Debido a que APRIL se une a BCMA humano con una afinidad hasta 1000 veces mayor con la que BAFF se une al receptor, las altas concentraciones de APRIL soluble son más relevantes en este contexto que las de BAFF soluble. Los niveles elevados de APRIL soluble probablemente influirían en la eficacia de los anticuerpos TCB, especialmente cuando el agente terapéutico se administra en dosis muy bajas en pacientes (Bargouet al.Science 2008; 321 (5891); 974-7). Por tanto, se realizaron los siguientes experimentos.
Ejemplo 4.2.1: El anticuerpo J6M0-TCB bloqueante/competidor de APRIL bloquea la activación de NF-kB dependiente de APRIL detectada por NF-kB fosforilado intracelular (citometría de flujo)
Estaba previsto probar el efecto de APRIL soluble sobre la potencia letal de J6M0-TCB, un anticuerpo biespecífico BCMA-TCB elaborado con J6M0 que compite con APRIL/bAf F (Tai YTet al.Blood 2014 123(29): 3128-28), como aglutinante de BCMA en el ensayo de destrucción redirigida por linfocitos T, pero antes de ello, se realizaron experimentos para confirmar que J6M0-TCB efectivamente bloquea y compite con APRIL. Se analizó que J6M0-TCB bloquea la activación de NF-kB dependiente de APRIL. La detección de NF-kB fosforilado intracelular se midió mediante citometría de flujo, como se describe en Lafargeet al.BMC Molecular Biol 2007; 8:64. El método de citometría de fosfoflujo es una alternativa a la detección de la activación de NF-<k>B mediante un ensayo de luminiscencia basado en ELISA que puede no ser lo suficientemente sensible y contiene pasos laboriosos (Pérez y Nolan. Nat Biotechnol 2002; 20(2):155-62). Se evaluó si la unión de J6M0-TCB a células de mieloma H929 BC<m>A positivas bloquea la activación de NF-<k>B dependiente de APRIL, una vía de señalización de factores nucleares conocida posterior al receptor de BCMA. Brevemente, las células H929 se privaron de alimento en RPMI1640 sin FCS durante 24 h a 37 °C en una estufa de incubación de células. Al final del tiempo de inanición, las células se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular utilizando ViCell. Las células viables se ajustaron a 1 * 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se dividieron en alícuotas adicionales de 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con 25 pl del anticuerpo J6M0-TCB o anticuerpos de control de isotipo a una concentración de saturación de 400 nM (77 pg/ml) durante 20 min a 37 °C seguido de incubación directa de 100 ng/ml o 1 pg/ml de A-APRIL de ratón recombinante (R&D Systems Europe) durante 15 minutos adicionales a 37 °C. Como controles negativos, las células se dejaron sin tratar o se incubaron con los correspondientes anticuerpos de controles de isotipo IgG 400 nM (77 pg/ml) durante un total de 45 minutos a 37 °C. Como controles positivos, las células se incubaron con 100 ng/ml o 1 pg/ml de A-APRIL de ratón recombinante solo (R&D Systems Europe) durante 15 minutos a 37 °C. Al final de la estimulación, las células se centrifugaron (360 x g, 4 min), el sedimento celular se fijó inmediatamente en tampón Cytofix precalentado (BD Biosciences, n.° 554655) y se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. Después las células se centrifugaron, se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se rompió mediante agitación en vórtice. Después, las células se permeabilizaron en Phosflow Perm Buffer III enfriado con hielo (BD Biosciences, n.° 558050) durante 30 minutos en hielo. Después las células se centrifugaron, se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se rompió mediante agitación en vórtice. Las células se resuspendieron en 100 pl de Phosflow Perm Buffer III y las células permeabilizadas se tiñeron con anticuerpo anti-NF-KB p65 (pS529) (BD Biosciences, n.° 558423) o con un anticuerpo de control de isotipo (IgG2b de ratón, K, BD Biosciences n.° 555058) durante 60 min a temperatura ambiente protegidas de la luz. Después del período de tinción, las células se lavaron con PBS BSA al 0,1 % en PBS BSA al 0,1 % antes del análisis de citometría de flujo. Se midió la intensidad de fluorescencia media relativa obtenida de células H929 tratadas como se describe anteriormente. La señal de intensidad de fluorescencia media (MFI) obtenida tras la unión de A-APRIL en presencia del control de isotipo se ajustó a uno; las otras señales se normalizaron con respecto a este. Como se representa en la figura 4, el efecto del anticuerpo J6M0-TCB con un grupo de unión a BCMA que compite con APRIL se analizó en una activación de NF-<k>B mediada por APRIL de 1000 ng/ml en células H929. La adición de APRIL soluble a las células H929 indujo la activación de NF-kB. Cuando las células H929 se expusieron al grupo de unión a BCMA competidor de APRIL, J6M0-TCB, hubo al menos una disminución del 79,3 % en la señal de activación de NF-kB medida mediante citometría de fosfoflujo. Se ha informado que el anticuerpo anti-BCMA J6M0 (documento WO2012163805) bloquea la activación de NF-xB inducida por APRIL. Los resultados actuales confirman que J6M0 es un anticuerpo anti-BCMA que compite con APRIL por la unión a BCMA y que bloquea la señalización posterior de APRIL.
Ejemplo 4.2.2: Los altos niveles de APRIL soluble influyen en la potencia del anticuerpo BCMA-TCB que compite con APRIL para destruir las células de mieloma H929 que expresan BCMA (ensayo colorimétrico de liberación de LDH)
Se analizó entonces el efecto de APRIL soluble sobre la potencia letal de J6M0-TCB, un anticuerpo biespecífico BCMA-TCB elaborado con J6M0 que compite con APRIL/Ba FF (Tai YTet al.Blood 2014 123(29): 3128-28) como aglutinante de BCMA en el ensayo de destrucción redirigida por linfocitos T. Brevemente, se recogieron células diana de mieloma múltiple H929 BCMA positivas humanas con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Aproximadamente, se sembraron 30.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la dilución correspondiente de las construcciones de TCB para obtener una concentración final deseada (por triplicado); oscilando las concentraciones finales de anticuerpo J6M0-TCB entre 0,1 pM y 10 nM, en presencia o ausencia de APRIL a una concentración final de 100 ng/ml o 1000 ng/ml. Para una comparación apropiada, todas las construcciones y controles de TCB se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron PBM<c>humanas (efectoras) a los pocillos para obtener una relación E:T final de 10:1. Los grupos de control negativo estuvieron representados únicamente por células efectoras o diana. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 1 pg/ml de PHA (Sigma n.° L8902). Para la normalización, la lisis máxima de las células MM diana H929 (= 100 %) se determinó mediante la incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, induciendo la muerte celular. La lisis mínima (= 0 %) se representó mediante células diana incubadas en conjunto únicamente con células efectoras, es decir, sin ningún anticuerpo biespecífico de linfocitos T. Después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió entonces la liberación de l Dh a partir de las células de mieloma diana H929 apoptóticas/necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. El porcentaje de liberación de LDH se representó frente a las concentraciones de anticuerpo J6M0-TCB en curvas de concentración-respuesta. Los valores de CE50 se midieron utilizando el programa informático Prism (GraphPad) y se determinaron como la concentración de anticuerpos TCB que da como resultado el 50 % de la liberación máxima de LDH. Como se muestra en la figura 5, El anticuerpo J6M0-TCB indujo la destrucción de células de mieloma H929 BCMA positivas en presencia o ausencia de APRIL soluble exógeno. Como se representa en la figura 5, El bloqueo/competencia de APRIL con J6M0-TCB indujo una destrucción dependiente de la concentración del mieloma H929 BCMA positivo con una potencia picomolar baja (CE50april0= 5,8 pM) en ausencia de APRIL exógeno. Cuando se añadieron 100 ng/ml de APRIL al cultivo, dicha concentración de ligando solo afectó mínimamente la potencia de destrucción mediada por J6M0-TCB como se muestra con un aumento de 2,4 veces en la CE50 (CE50<april>100= 14,2 pM). Sin embargo, cuando se añadieron 1000 ng/ml de APRIL al cultivo, la potencia de destrucción mediada por J6M0-TCB se redujo considerablemente, como se refleja en un aumento en la CE50 de 84,3 veces (CE50april1000= 488,9 pM). La tabla 9 resume los valores de CE50 de J6M0-TCB bloqueante/competidor de APRIL en ausencia y presencia de APRIL exógeno.
Los resultados sugieren que los anticuerpos BCMA-TCB bloqueantes/competidores de APRIL podrían verse influenciados por altas concentraciones de APRIL soluble que bien podrían estar presentes en el microambiente de la médula ósea o en la sangre de pacientes con mieloma múltiple. Traducir estas observaciones a la situación clínica significa que a una dosis terapéutica baja dada de un BCMA-TCB tal como J6M0-TCB en pacientes con niveles elevados de APRIL en la médula ósea o en la sangre, es posible que las células de mieloma no se destruyan y el efecto antitumoral en pacientes con niveles elevados de APRIL soluble podría perderse.
Tabla 9: La potencia (CE50) para destruir células de mieloma H929 mediante BCMA-TCB que compite con APRIL BAFF r r l l niv l APRIL l l
Ejemplo 4.3: APRIL soluble influye en la potencia del anticuerpo BCMA-TCB competidor/bloqueante de APRIL para inducir la activación de linfocitos T
El efecto de APRIL soluble sobre la potencia de J6M0-TCB competidor/bloqueante de APRIL para inducir la activación de linfocitos T también se analizó mediante citometría de flujo. La activación de los linfocitos T se midió evaluando la expresión superficial del marcador de activación temprana CD69 o el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD4+ y c D8+ en presencia o ausencia de células MM humanas que expresan BCMA. Brevemente, se recogieron células H929 BCMA positivas con tampón de disociación celular, se contaron y se comprobaron para determinar su viabilidad. Las células se ajustaron a 0,3 * 106 células (viables) por ml en medio RPMI-1640 modificado, se pipetearon 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (como se indica). Se añadieron 50 pl del anticuerpo J6M0-TCB (diluido) competidor/bloqueante de APRIL a los pocillos que contenían células para obtener una concentración final de 0,3 pM - 30 nM. Se aislaron células efectoras PBMC humanas de sangre nueva de un donante sano y se ajustaron a 6 * 106 células (viables) por ml en medio RPMI-1640 modificado. Se añadieron 50 pl de esta suspensión celular por pocillo de la placa de ensayo para obtener una relación E:T final de PBMC a células tumorales de mieloma de 10:1. Para analizar si el anticuerpo J6M0-TCB competidor/bloqueante de APRIL era capaz de activar los linfocitos T específicamente en presencia de células diana que expresan BCMA humano, se incluyeron pocilios que contenían 3 nM de anticuerpo J6M0-TCB, así como PBMC, pero no células diana. Después de la incubación durante 15-28 h (CD69), o 24-48 h (C<d>25) a 37 °C, CO2 al 5 %, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g) y se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. La tinción de superficie para CD4 (IgGl,K de ratón; clon RPA-T4), CD8 (IgGl,K de ratón; clon HIT8a; BD n.° 555635), CD69 (IgGl de ratón; clon L78; B<d>n.° 340560) y CD25 (IgGl, K de ratón; clon M-A251; BD n.° 555434) se realizó a 4 °C durante 30 min, según las instrucciones del proveedor. Las células se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % y se fijaron durante 15 minutos a 4 °C, usando 100 pl/pocillo de tampón de fijación (BD n.° 554655). Después de la centrifugación, las muestras se resuspendieron en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron utilizando una máquina FACS CantolI (programa informático FACS Diva). La figura 6 representa el nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 (B, D) y el marcador de activación tardía CD25 (A, C) en linfocitos T CD4+ y CD8+ después de 48 horas de incubación (resultados representativos de dos experimentos independientes). El bloqueo/competencia de APRIL con J6M0-TCB indujo un aumento de los marcadores de activación CD69 y CD25 de una manera específica y dependiente de la concentración en presencia de células diana BCMA positivas en ausencia de APRIL soluble exógeno (recuadros). Cuando se añadieron 100 ng/ml de APRIL soluble al cultivo, se observó un ligero desplazamiento hacia la derecha de las curvas de concentración-respuesta para ambos marcadores de activación CD69 y CD25 en linfocitos T CD4.+ y CD8+. Cuando se añadieron 1000 ng/ml de APRIL soluble al cultivo, hubo una clara reducción de la activación de los linfocitos T tanto en linfocitos T CD4+ como CD8+. NO se observó activación de linfocitos T CD4+ y CD8+ cuando se trataron PBMC humanas con el anticuerpo de control DP47-TCB, lo que sugiere que a pesar de unirse a CD3 en los linfocitos T, la activación de los linfocitos T no se produce cuando el anticuerpo TCB no se une a las células diana BCMA positivas (datos no mostrados). Los resultados sugieren claramente que los niveles elevados de APRIL soluble reducen la potencia de los anticuerpos BCMA-TCB para inducir la activación de los linfocitos T al unirse a la diana tumoral y a los linfocitos T, especialmente cuando el BCMA-TCB compite con APRIL.
Ejemplo 5: La potencia del anticuerpo BCMA-1-TCB para destruir células plasmáticas malignas de pacientes con mieloma es más pronunciada en muestras de médula ósea de pacientes con mayor relación E:T y mayor expresión de BCMA (MFI relativa) en células plasmáticas malignas.
Los aspirados de médula ósea se recogen de pacientes con mieloma múltiple después de que se haya otorgado el consentimiento informado, según las directrices del comité ético local y la Declaración de Helsinki. Para evaluar la potencia del anticuerpo BCMA-1-TCB para inducir la destrucción redirigida por linfocitos T de células plasmáticas malignas que se infiltran en la médula ósea por parte de linfocitos T autólogos que se infiltran en la médula ósea, se recogieron muestras de médula ósea completa de pacientes con mieloma y se añadió anticuerpo BCMA-1-TCB directamente a las muestras de médula ósea completa. Brevemente, se transfirieron 200 pl de la muestra de médula ósea completa a placas de 96 pocillos profundos. Se prepararon diluciones de anticuerpo BCMA-1-TCB y anticuerpo de control en PBS estéril y la preparación se añadió a los pocillos correspondientes para alcanzar concentraciones finales que oscilaban entre 0,03 pM y 30 nM. Se mezcló la suspensión de anticuerpos y médula ósea completa mediante agitación suave y luego se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 h, sellada con película de parafina. Después del período de incubación, las muestras de suspensión celular tenían eritrocitos lisados con K3-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y las muestras celulares se prepararon para los análisis inmunofenotípicos. Se añadieron 20 pl de una solución de anticuerpos FACS correspondiente preparada basándose en un panel de anticuerpos que incluye CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/BCMA-APC/Anexina-V-PerCP-Cy5.5 a una placa de 96 pocillos con fondo en U. Los anticuerpos marcados con fluorocromo se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA) y Caltag Laboratories (San Francisco CA) y se utilizó un anticuerpo anti-BCMA humano conjugado con APC interno. Después, las muestras se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente y se adquirieron y analizaron utilizando un citómetro de flujo multiláser. La destrucción de las células de mieloma se determinó mediante la evaluación de la expresión positiva de anexina-V seleccionada en la población de células plasmáticas malignas CD138+ CD38+ CD45+ CD19' CD56+. Después se determinaron los porcentajes de destrucción de células de mieloma en cada concentración de anticuerpo biespecífico BCMA-1-TCB. Como se representa en la figura 7, BCMA-1-TCB indujo una destrucción específica dependiente de la concentración de células plasmáticas malignas tanto del paciente C1 (A) como del paciente C8 (B) tras solamente 24 horas de incubación. Sin embargo, la destrucción de las células de mieloma fue más pronunciada en las muestras de médula ósea del paciente C1 que en las muestras de médula ósea del paciente C8. Esto podría atribuirse a una relación E:T más favorable de 11:1 y a una expresión de BCMA (es decir, un valor de MFI relativa de 2636) en muestras de médula ósea del paciente C1 que en muestras de médula ósea del paciente C8 con una relación E:T desfavorable de 0,5: 1 y una expresión de BCMa más débil en células de mieloma (es decir, valor de MFI relativa de 1489). Los resultados sugieren que la medición de la expresión de BCMA en células plasmáticas malignas en combinación con una medición de la relación E:T en la médula ósea del paciente puede predecir con mayor precisión si los pacientes con mieloma pueden responder al tratamiento con BCMA-TCB.
Ejemplo 6: Parámetros biológicos de los pacientes (expresión relativa de BCMA en células de mieloma, relaciones E:T, APRIL soluble y BCMA soluble) en relación con la capacidad de respuesta de las muestras de médula ósea de los pacientes a BCMA-1-TCB
Las muestras con una MFI relativa moderada (que oscila entre 1000 y 5000) responden al fármaco en un 71,4 % (5/7), y las muestras con baja expresión de BCMA (MFI relativa <1000) responden al fármaco en un 33,3% (1/3). Las muestras de pacientes con una relación E:T favorable (E:T >1) responden al fármaco en un 66,7%(4/6). Las muestras de pacientes con una relación E:T desfavorable < 1 responden al fármaco en un 60 % (3/5). Se evaluó la combinación de al menos dos parámetros biológicos. Se encontró una correlación del 75 % (3/4) cuando se utilizaron juntas la expresión favorable de BCMA en las células de mieloma y la relación E:T favorable para predecir la respuesta al fármaco.
Tabla 10: Parámetros biológicos de los pacientes (expresión relativa de BCMA en células de mieloma, relaciones E:T, APRIL soluble y BCMA soluble) en relación con la capacidad de respuesta de las muestras m l l i n B MA-1-T B
Claims (15)
1. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA humano y CD3e humano, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece mieloma múltiple, en donde la relación de linfocitos T (células efectoras) a células diana (relación E:T) en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 0,5:1 o superior, en donde las células diana expresan BCMA en su superficie.
2. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 1, en donde la relación E:T es 1:1 o superior.
3. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la relación E:T es 5:1 o superior, preferentemente 10:1 o superior.
4. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la relación E:T es de 0,5:1 a 22:1.
5. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde los linfocitos T son linfocitos T CD3+, preferentemente en donde los linfocitos T son linfocitos T citotóxicos CD3+ CD8+.
6. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las células diana son células plasmáticas, células CD138+ CD38+ o células CD138+ CD38+ CD19- CD56+.
7. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la muestra aislada de fluido corporal es una muestra de sangre o un aspirado de médula ósea aislados.
8. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la cantidad de BCMA soluble en una muestra aislada de fluido corporal del paciente es 2,5 ng/ml o inferior.
9. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 8, en donde la cantidad de BCMA soluble se mide mediante un ensayo ELISA.
10. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la cantidad de APRIL soluble en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es 100 ng/ml o menos, preferentemente 20 ng/ml o menos, opcionalmente en donde la cantidad de APRIL soluble se mide mediante un ensayo ELISA.
11. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la cantidad de APRIL soluble en una muestra aislada de fluido corporal de dicho paciente es superior a 100 ng/ml, y en donde la unión del anticuerpo biespecífico no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más del 20 % medida en un ensayo ELISA en comparación con la unión del anticuerpo biespecífico a BCMA humano sin APRIL, opcionalmente en donde la cantidad de APRIL soluble se mide mediante un ensayo ELISA.
12. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la muestra aislada de fluido corporal comprende células CD138+ CD38+ y la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+ células es 80 o más por encima del valor inicial, en donde la expresión de BCMA se determina como la intensidad de fluorescencia media (MFI) o media relativa usando un anticuerpo anti-BCMA con un marcador fluoróforo unido y que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA con un valor de Kd que es de 0,70 a 1,3 veces el valor de Kd de la parte del anticuerpo anti-BCMA del anticuerpo biespecífico, y en donde el valor inicial es la MFI de un linfocito T medida usando el anticuerpo anti-BCMA utilizando un aparato FACs .
13. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 12, en donde la expresión de BCMA en dichas células CD138+ CD38+ está 100 o más por encima del valor inicial, 200 o más por encima del valor inicial o 300 o más por encima del valor inicial.
14. El anticuerpo biespecífico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende:
(i) una CDRL1 de SEQ ID NO: 2, una CDRL2 de SEQ ID NO: 3, una CDRL3 de SEQ ID NO: 4, una CDRH1 de SEQ ID NO: 6, una CDRH2 de SEQ ID NO: 7 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 8; y
(ii) una CDRL3 de SEQ ID NO: 12 y una CDRH3 de SEQ ID NO: 16.
15. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 12 o 13 o la reivindicación 14 cuando depende de la reivindicación 12 o 13, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende como CDR de su cadena pesada y ligera, CDR de las mismas secuencias de aminoácidos que dicho anticuerpo anti-BCMA.
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