CN111443202A - 一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用 - Google Patents

一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测抗凝血杀鼠剂的ELISA方法及其试剂盒，由酶标板（包被式I华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物）、抗体工作液（含华法林药物单克隆抗体）、酶标记物工作液（含辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体）、洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度华法林标准品溶液、底物显色液、终止液组成。本发明所提供的检测试剂盒可用于食品中毒物和人血清的检测，检测猪肉、牛奶、血清中华法林检测限为5.0µg/kg，溴敌隆、氯灭鼠灵检测限为15.0µg/kg，杀鼠醚、氯敌鼠检测限为20.0µg/kg，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%，具有操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强的优点，对于食物中毒的快速检测具有重大价值。

Description

一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
技术领域
本发明属于药物残留快速检测领域，涉及一种检测抗凝血杀鼠剂的试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
华法林、溴敌隆、氯灭鼠灵、杀鼠醚、氯敌鼠是我国常用的几种抗凝血杀鼠剂，它们通过竞争性地抑制维生素K的作用，抑制肝脏产生凝血酶原及凝血因子，提高毛细血管通透性和脆性，造成鼠内出血死亡。随着此类灭鼠剂的大量施用，鼠药不可避免地残留在食物中，影响人类健康。近年来，此类灭鼠剂造成中毒的事件时有发生，严重危害人民身体健康与生命安全。
目前检测上述抗凝血杀鼠剂的检测方法主要有高效液相法和液相色谱质联用法，这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。而快速检测方法主要是化学法比色检测方法，特异性、灵敏度差，易发生误判，不能满足现场检测需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗凝血杀鼠剂酶联免疫检测试剂盒，并提供一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、适于大批量样品筛选的检测方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，由酶标板、标准品工作液、抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成。
所述酶标板由华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成。
所述华法林半抗原是华法林和羧甲基羟胺盐酸盐反应得到的，具体制备方法如下：称取53mg华法林用9.0 mL吡啶溶解，加入25.9mg羧甲基羟胺盐酸盐反应，加热到40℃搅拌，TLC检测反应完全后用氮气吹干吡啶，即得式I所述化合物。
Figure RE-727808DEST_PATH_IMAGE001
式I
所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲状腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。
所述华法林半抗原与载体蛋白的偶联物是指华法林半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物，具体包括如下步骤：
1）将所述华法林半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；
其中，所述华法林半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为29.4 mg：1.5 mL：38.3 mg：23.0 mg；
2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200 rpm搅拌10 min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1 M碳酸氢钠缓冲液的配比为50 mg：3.5 mL；
3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000 rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500 rpm搅拌反应24 h，得到溶液III；
4）用PBS缓冲液（0.01 M PBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述华法林包被原。
所述华法林抗体为华法林药物的特异性抗体。
所述华法林抗体工作液为将华法林的单克隆抗体用抗体稀释液稀释1000倍，获得含有华法林药物的单克隆抗体的抗体工作液。
所述抗体稀释液为含有Proclin 300、Triton X-100的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、Proclin 300和Triton X-100，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072 g/L、0.59g/L、8.5 g/L、0.4 g/L、200 μL/L和500 μL/L。
所述酶标记物工作液为将辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体用抗抗体稀释液稀释500倍获得的。
所述抗抗体稀释液为含有小牛血清、Proclin 300的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、小牛血清和Proclin 300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072 g/L、0.6 g/L、16 g/L、0.4 g/L、50 mL/L和200 μL/L。在所述试剂盒中，所述华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被于酶标板上。
在所述试剂盒中，所述华法林药物的特异性抗体为所述华法林单克隆抗体。
在所述试剂盒中，所述华法林单克隆抗体由重链和轻链组成。所述重链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列1所示。所述轻链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列2所示。
在所述试剂盒中，所述6种标准品工作液的溶剂为含有光稳定剂、牛血清白蛋白的PBS缓冲液，溶质为华法林；所述溶质在所述6种标准品工作液中的浓度分别为0 μg/L、0.15μg/L，0.45 μg/L、1.35 μg/L、4.05 μg/L、12.15 μg/L；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂和牛血清白蛋白，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L和0.1g/L，pH值为7.2。
在所述试剂盒中，所述样品稀释液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L和0.1 g/L，pH值为7.2。
在所述试剂盒中，所述样品提取液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L和0.2 g/L，pH值为7.2。
在所述试剂盒中，所述洗涤液为含有吐温20和Proclin 300的PBS缓冲液；所述洗涤液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20和Proclin 300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为23.2 g/L、2.0 g/L、64 g/L、0.036 g/L、20 mL/L和300 μL/L。
在所述试剂盒中，所述底物显色液为1.0g/L过氧化脲、5.0g/L乙酸钠、0.5g/L光稳定剂、2.5mL/L磷酸、5.0g/L四甲基联苯胺的混合水溶液，溶剂为去离子水。
在所述试剂盒中，所述终止液为0.05 mol/L的硫酸水溶液。
本发明的另一个目的是提供一种检测样品中华法林的方法，包括如下步骤：
1）对样品进行前处理获得所述样品的溶液；
2）用上述任一所述试剂盒进行检测；
3）分析检测结果。
在上述方法中，所述用试剂盒进行检测包括如下步骤：向包被有所述华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物的酶标板中加入标准品工作液或所述样品的溶液；再加入含华法林药物的特异性抗体溶液；温育后洗涤拍干，加入所述酶标记抗抗体，用底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值。
在上述方法中，所述对样品进行前处理的方法具体如下：
准确称取1±0.01 g（或mL）样本加入5 mL样本提取液，室温（25±2℃）下，高速涡动1min，4000 g离心5 min，得到样本溶液。取200 μL样本溶液加入200 μL样本稀释液，高速涡动1 min，取50 µL上清即可进行分析。
本发明试剂盒检测的原理：一种可检测华法林的间接竞争ELISA法，此法以华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被酶标板，以华法林药物单克隆抗体作为第一抗体，以标记有辣根过氧化物酶（HRP）的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体作为第二抗体，加入底物液进行显色反应，以0.05 mol/L H2SO4终止反应，测450 nm处吸光度值，以检测华法林药物。
本发明提供的检测结果分析过程为：
用所获得的每个浓度的标准品工作液的吸光度平均值（B）除以第一个标准溶液（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：百分吸光度值(%)＝(B/B0) ×100％
以华法林标准品工作液的浓度（µg/L）的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中华法林的含量。
本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。
本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5 h内即可以完成。
实验证明，本发明试剂盒可检出猪肉、牛奶、血清中的抗凝血杀鼠剂；检测猪肉、牛奶、血清中华法林检测限为5.0 µg/kg，溴敌隆、氯灭鼠灵检测限为15.0 µg/kg、杀鼠醚、氯敌鼠检测限为20.0 µg/kg，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%，稳定性好。
本发明所提供的检测试剂盒可用于食品中抗凝血杀鼠剂的检测，还可用于人血清检测，具有操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强的优点，对于食物中毒的快速检测具有重大价值。
附图说明
图1华法林标准曲线图。
图2本试剂盒与LC-MS/MS检测结果比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、制备检测华法林的酶联免疫试剂盒
该试剂盒组成如下：酶标板（包被华法林药物与载体蛋白的偶联物）、抗体工作液（含华法林药物单克隆抗体）、酶标记物工作液（含辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体）、洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度华法林标准品工作液、底物显色液、终止液。
制备方法如下：
一、酶标板的制备
1、华法林包被原的制备
（1）华法林半抗原的制备
将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，用锡箔纸将其包住，防止见光，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取华法林原料53mg，9ml吡啶溶解，搅拌，加入25.9mg羧甲基羟胺盐酸盐反应，加热到40℃，TLC检测反应完全后用氮气吹干吡啶，即得华法林半抗原（式I）。
Figure RE-909301DEST_PATH_IMAGE001
式I
（2）华法林包被原的制备
将29.4 mg华法林半抗原用1.5 mL DMF溶解，200 rpm搅拌10 min，加入EDC38.3 mg，NHS23.0 mg溶解，室温搅拌（500 rpm）活化2-3 h，得到溶液I；称取OVA50 mg溶于3.5 mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200 rpm搅拌10 min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000 rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入（1 ml/min），500 rpm搅拌反应24 h；将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10 cm），1 L 0.01 M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100 rpm）透析3 d，每天换液3次，将透析产物5000 rpm离心6 min，即得到华法林包被原。
2、酶标板的制备
用包被缓冲液将得到的华法林包被原稀释成10.0 μg/mL，每孔加入包被原100 μL，37℃温育2 h，倾去包被液，用稀释20倍的洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后每孔加入150μL封闭液，37℃温育1 h，倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原（华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物）的酶标板，用铝膜真空密封保存。
包被缓冲液：pH9.6、0.03 mol/L的碳酸钠缓冲液；
封闭液：含有50 g/L蔗糖、2.5 g/L酪蛋白、0.5%小牛血清、3‰叠氮化钠的0.2 mol/LpH7.7磷酸盐缓冲溶液。
二、抗体工作液的制备
1、华法林单克隆抗体的制备
（1）华法林免疫原的制备
将19.7 mg华法林半抗原用1.5 mL DMF溶解，200 rpm搅拌10 min，加入EDC25.7 mg，NHS15.4 mg溶解，室温搅拌（500 rpm）活化2-3 h；称取BSA 50 mg溶于3.5 mL 0.1 M碳酸氢钠溶液中，200 rpm搅拌10 min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000 rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1 mL/min），500 rpm搅拌反应24 h；将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10 cm），1 L 0.01 M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100 rpm）透析3d，每天换液3次，将透析产物5000 rpm离心6 min，即得到华法林免疫原。
（2）动物免疫
用制备出的华法林免疫原按100 μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100 μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
（3）细胞融合与克隆
按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100 μg/mL的华法林等体积混合，37℃水浴作用30 min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代华法林作对照，其余步骤同上。若经华法林阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
（4）单克隆抗体的制备及纯化
将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5 mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×105/只，7~10日后抽取小鼠腹水。收集细胞上清或腹水，采用间接ELISA 法测定其效价（测定效价时以P/N>2.1 的细胞上清或腹水最大稀释倍数表示），结果表明细胞上清的效价为1：10000，腹水的效价为1：60000。接着，用辛酸-饱和硫酸铵法对其进行纯化，取上清得到纯化的华法林药物的单克隆抗体。
利用棋盘法进行单抗效价的测定，结果表明：华法林药物单克隆抗体的效价为1：128000，半数抑制量（IC50）为0.35 μg/L。
经检测，华法林单克隆抗体的重链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列1所示，华法林单克隆抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示。
2、抗体工作液的制备
将获得的华法林药物的单克隆抗体用抗体稀释液稀释1000倍，获得含有华法林药物的单克隆抗体的抗体工作液。
所述抗体稀释液为含有Proclin 300、Triton X-100的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、Proclin 300和Triton X-100，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072 g/L、0.59g/L、8.5 g/L、0.4 g/L、200 μL/L和500 μL/L。
三、酶标记物工作液的制备
1、制备抗抗体
以获得的华法林药物的单克隆抗体为免疫原，以山羊为免疫动物，得到抗华法林药物的单克隆抗体的羊抗鼠抗抗体。
2、制备辣根过氧化物酶标记的抗抗体
采用改良的过碘酸钠法将步骤1得到的抗华法林药物的单克隆抗体的抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联，步骤如下：
取8mg辣根过氧化物酶溶解于2 mL蒸馏水中；加入现配制的100 mmol/L NaIO4溶液0.4mL，室温搅拌反应20 min；用1 mmol/L醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜；除去多余的NaIO4，同时使自身偶联的酶还原；加入40 μLPBS缓冲液（pH8.6，0.5 mol/L）和2.0 mL含有16 mg抗华法林药物的单克隆抗体的抗抗体的PBS缓冲液（pH8.6，5 mol/L），室温搅拌反应4小时；加入0.1 mL现配制的1 mol/L NaBH4水溶液，4℃反应4小时，纯化保存。
3、酶标记物工作液的制备
将步骤2获得的辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物的单克隆抗体的抗抗体用抗抗体稀释液稀释500倍，获得辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物的单克隆抗体的抗抗体的酶标记物工作液。
所述抗抗体稀释液为含有小牛血清、Proclin 300的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、小牛血清和Proclin 300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072 g/L、0.6 g/L、16 g/L、0.4 g/L、50 mL/L和200 μL /L。
四、标准品工作液的制备
在所述试剂盒中，还含有6种标准品工作液，所述6种标准品工作液的溶剂为含有光稳定剂、牛血清白蛋白的PBS缓冲液，溶质为华法林；所述溶质在所述6种标准品工作液中的浓度分别为0 μg/L、0.1 μg/L，0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂和牛血清白蛋白，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L和0.1 g/L，pH值为7.2。
五、其它试剂的制备
在所述试剂盒中，还可含有样品稀释液和/或样品提取液和/或洗涤液和/或底物显色液和/或终止液。
所述样品稀释液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L和0.1 g/L，pH值为7.2。
所述样品提取液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L和0.2 g/L，pH值为7.2。
所述洗涤液为含有吐温20和Proclin 300的PBS缓冲液；所述洗涤液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20和Proclin 300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为23.2 g/L、2.0 g/L、64 g/L、0.036 g/L、20 mL/L和300 μL/L。
所述底物显色液为1.0 g/L过氧化脲、5.0 g/L乙酸钠、0.5 g/L光稳定剂、2.5 mL/L磷酸、5.0 g/L四甲基联苯胺的混合水溶液，溶剂为去离子水。
所述终止液为0.05 mol/L的硫酸水溶液。
实施例2、实施例1试剂盒的使用方法
一、样品的前处理
1、肉样、乳品、血清样品的前处理
准确称取1±0.01 g（或mL）样本加入5 mL样本提取液，室温（25±2℃）下，高速涡动1min，4000 g离心5 min，得到样本溶液。取200 μL样本溶液加入200 μL样本稀释液，高速涡动1 min，取50 µL上清即可进行分析。
二、使用实施例1试剂盒检测
1、取酶标板插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，每个样品做3个平行，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2-8℃环境中；
2、将50 μL 各标准品工作液或样品溶液分别加入对应的标准品或样品孔中；
3、在每个板孔中加入50 μL抗体工作液；
4、盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温（25±2℃）避光反应30 min；
5、揭开盖板膜，倒掉板孔中液体，每孔加入260 μL洗涤工作液（洗涤液用去离子水稀释20倍），充分洗涤3-4次，每次浸泡15~30 s；；
6、倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
7、在各板孔中加入100 μL酶标记物工作液；盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温下（25± 2℃），避光反应30 min；
8、重复步骤5-6；
9、立即在每孔中加入100 μL底物显色液A、B混合液（底物显色液A、底物显色液B按体积1:1混合），盖好盖板膜，避光反应15 min；
10、揭开盖板膜，在各板孔中加入50 μL 终止液，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀；
11、终止后5 min内用酶标仪在双波长405 nm、630 nm读取酶标板吸光度值。
三、分析检测结果
1、计算百分吸光度值
各标准品（或待测样品）的平均吸光度值，除以零标（浓度为0 μg/L的标准品）吸光度值，乘以100%，可以得到各标准品（或待测样品）对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值。
吸光度百分比=B/B0×100%
其中：B-标准品（或样品）的平均吸光度值；B0-浓度为0 ppb的标准品的平均吸光度值。
2、制作标准曲线
以各标准品的百分吸光度值为纵坐标，以各标准品工作液中华法林浓度（μg/L）为横坐标绘制标准曲线图，用origin8.0 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA)做非线性拟合分析，形成四参数拟合曲线：
y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D
其中，y为吸光度百分比；x为待测物浓度；A，B，C和D是标准曲线的四个参数。
通过测试数据，华法林的标准曲线方程为：Y=-0.04+(2.343+0.04)(1+(x0.863)^0.952)，线性相关性R2为0.995。
标准曲线图如附图2所示。
3、计算样品中华法林的含量
将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线，可得出待测样品对应的残留浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，可得待测原样品中华法林的实际含量。
实施例3、实施例1试剂盒的特异性、准确度、精密度检测
一、试剂盒的特异性试验：
华法林酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的。
将华法林及常用鼠药（华法林、溴敌隆、氯灭鼠灵、杀鼠醚、氯敌鼠、克灭鼠、杀鼠酮、大隆、氟鼠灵）分别做系列稀释，分别按照实施例2进行操作，以华法林及其类似物的系列稀释液替代其中的“华法林标准品工作液”，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50%抑制浓度（IC50），具体方法如下：得到纵坐标数值等于50%对应的华法林浓度（μg/L），即IC50值。用下式计算试剂盒对华法林和各常用鼠药的交叉反应率：
交叉反应率（%）＝（引起50%抑制的华法林浓度/引起50%抑制的华法林类似物浓度）×100％。
结果如表1所示。
表1试剂盒的特异性
名称 交叉反应率（%）
华法林 100.0
溴敌隆 42
氯灭鼠灵 37
杀鼠醚 29
氯敌鼠 28
克灭鼠 <2.5
杀鼠酮 <1
大隆 <1
氟鼠灵 <1
实验表明，本发明试剂盒对华法林、溴敌隆、氯灭鼠灵、杀鼠醚、氯敌鼠有交叉反应，即本发明试剂盒可以检测抗凝血鼠药华法林、溴敌隆、氯灭鼠灵、杀鼠醚、氯敌鼠。
二、试剂盒的检测限测定
取猪肉、牛奶、血清空白样品（LC-MS/MS 检测阴性），按照实施例2方法进行检测，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限（LOD）。结果见表2-6。
表2 华法林空白样品测定结果 （µg/kg）
Figure 127061DEST_PATH_960433DEST_PATH_IMAGE002
表3 溴敌隆空白样品测定结果 （µg/kg）
Figure 650446DEST_PATH_885664DEST_PATH_IMAGE003
表4 氯灭鼠灵空白样品测定结果 （µg/kg）
Figure 80290DEST_PATH_296923DEST_PATH_IMAGE004
表5 杀鼠醚空白样品测定结果 （µg/kg）
Figure 321916DEST_PATH_296103DEST_PATH_IMAGE005
表6 氯敌鼠空白样品测定结果 （µg/kg）
Figure 534722DEST_PATH_268869DEST_PATH_IMAGE006
结果表明，为防止假阳性的出现，本试剂盒对应猪肉、牛奶、血清中华法林检测限可定为5.0 µg/kg、溴敌隆、氯灭鼠灵检测限可定为15.0 µg/kg、杀鼠醚、氯敌鼠检测限可定为20.0 µg/kg。
三、试剂盒的准确度和精密度试验
准确度是指测定值与真实值的符合程度，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。取猪肉、牛奶、血清空白样品（LC-MS/MS 检测阴性）分别按照实施例2步骤一中所述方法进行前处理，然后添加华法林、溴敌隆、氯灭鼠灵、杀鼠醚、氯敌鼠标准品至所需浓度（表3），得到检测样本溶液。
表7 空白样品添加浓度
Figure 178193DEST_PATH_619079DEST_PATH_IMAGE007
用3个不同批次的试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表8-。
批内变异系数的计算方法：批内变异系数=同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数的计算方法：批间变异系数=同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。
表8 华法林准确度和精密度
Figure 513360DEST_PATH_834028DEST_PATH_IMAGE008
表9 溴敌隆准确度和精密度
Figure 242281DEST_PATH_953294DEST_PATH_IMAGE009
表10 氯灭鼠灵准确度和精密度
Figure 321096DEST_PATH_142967DEST_PATH_IMAGE010
表11杀鼠醚灵准确度和精密度
Figure 819073DEST_PATH_728276DEST_PATH_IMAGE011
表12 氯敌鼠灵准确度和精密度
Figure 528403DEST_PATH_232069DEST_PATH_IMAGE012
结果表明，所有样品各添加浓度的回收率均在80～120%之间。各添加浓度的批内变异系数均低于10%、批间变异系数均低于15%。
四、本试剂盒检测与LC-MS/MS检测结果比较
用实施例2的方法对猪肉、牛奶、血清样本进行检测，分别于LC-MS/MS的检测结果进行确证比较。
以本试剂盒所测得华法林的浓度为X轴，LC-MS/MS所测得华法林浓度为Y轴，绘制散点图。对两种方法的测定结果进行线性分析，结果如图2所示，回归方程为：Y=1.053x-0.049，说明本发明建立的方法与LC-MS/MS检测结果具有良好的一致性。
五、试剂盒的保存期试验
实施例1试剂盒的保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度（零标准）、50%抑制浓度、华法林添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃条件下放置8天，进行加速老化试验，结果表明该试剂盒的上述步骤一至四的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒在-20℃条件下放置8天，上述步骤一至四的各项指标完全符合要求。从以上结果可以得出，实施例1的试剂盒可以在2-8℃至少保存12个月。
序列表
<110> 北京维德维康生物技术有限公司
<120> 一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ala Thr Ala Gly Val Trp Gly Cys Thr Gly Lys Thr Trp Gly Phe
1 5 10 15
Ser Glu Val Val Leu Gln Gly Val Leu His Phe Trp Leu Tyr Leu Leu
20 25 30
Val Ala Val Gly Lys Thr Glu Ala Trp Thr Gly Ser Gly Val His Asp
35 40 45
Ser Lys Trp Gly Leu Ile Lys Trp Leu Phe Gly Val Ser Gln Lys Val
50 55 60
Cys Gln Gly His Ile Asp Cys Arg Leu Ile Val Gln His Ser His Met
65 70 75 80
Ser Leu Leu Leu Thr Gly Phe Gly Gln Ile Gln Ser Leu Cys Gly Cys
85 90 95
Asn Trp Asp Gly Val Tyr Leu Asp His Leu Gly Pro Arg Gly His Arg
100 105 110
Leu Leu
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Asp Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Thr Val Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Arg Ser Lys Ser Gly Gln Ser Gly Ser Leu His
20 25 30
Val Asp Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Ser Leu Pro Pro Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Lys Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Arg
50 55 60
Pro Asp Phe Ser Gly Gly Ser Thr Ser Gly Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Thr Val Val Glu Asp Ser Gln Leu Lys Ile Tyr Phe Cys Pro
85 90 95
Ala Glu Cys Arg Phe Gly Ala Lys Thr Phe Thr Lys Gly Leu Glu Leu
100 105 110

Claims (10)

1.一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，包括：华法林检测酶标板、华法林系列标准品工作液、华法林抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成，其特征在于：所述华法林酶标板由式I所示华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成：
Figure RE-241523DEST_PATH_IMAGE001
式I
所述华法林抗体为华法林药物的特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林半抗原的制备方法包括如下步骤：称取53mg华法林用9.0 mL吡啶溶解，加入25.9mg羧甲基羟胺盐酸盐反应，加热到40℃搅拌，TLC检测反应完全后用氮气吹干吡啶，即得式I所述化合物。
3.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林药物的特异性抗体为所述华法林单克隆抗体，所述华法林单克隆抗体由重链和轻链组成，所述重链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列1所示，所述轻链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列2所示。
4.根据权利要求1或3所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林抗体工作液为将华法林的单克隆抗体用抗体稀释液稀释1000倍，获得含有华法林药物的单克隆抗体的抗体工作液；
所述抗体稀释液为含有Proclin 300、Triton X-100的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、Proclin300和Triton X-100，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072 g/L、0.59 g/L、8.5g/L、0.4 g/L、200 μL/L和500 μL/L。
5.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标记物工作液为将辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体用抗抗体稀释液稀释500倍获得的；
所述抗抗体稀释液为含有小牛血清、Proclin 300的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、小牛血清和Proclin 300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072 g/L、0.6 g/L、16 g/L、0.4g/L、50 mL/L和200 μL/L。
6.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林系列标准品工作液为6种华法林标准品工作液，所述溶液的溶剂为含有光稳定剂、牛血清白蛋白的PBS缓冲液，溶质为华法林；所述溶质在所述6种标准品工作液中的浓度分别为0 μg/L、0.15 μg/L，0.45 μg/L、1.35 μg/L、4.05 μg/L、12.15 μg/L；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂和牛血清白蛋白，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L和0.1 g/L，pH值为7.2。
7.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液和终止液；
所述样品稀释液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L和0.1 g/L，pH值为7.2；
所述样品提取液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68 g/L、0.1 g/L、4 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L和0.2 g/L，pH值为7.2；
所述洗涤液为含有吐温20和Proclin 300的PBS缓冲液；所述洗涤液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20和Proclin 300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为23.2 g/L、2.0 g/L、64 g/L、0.036 g/L、20 mL/L和300 μL/L；
所述底物显色液为1.0 g/L过氧化脲、5.0 g/L乙酸钠、0.5 g/L光稳定剂、2.5 mL/L磷酸、5.0 g/L四甲基联苯胺的混合水溶液，溶剂为去离子水；
所述终止液为0.05 mol/L的硫酸水溶液。
8.一种检测样品中抗凝血杀鼠剂残留的方法，包括如下步骤：
1）对样品进行前处理；
2）用权利要求1所述试剂盒进行检测；
3）分析检测结果。
9.根据权利要求8所述的检测样品中抗凝血杀鼠剂残留的方法，其特征在于：所述用试剂盒进行检测包括如下步骤：向包被有所述华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物的酶标板中加入标准品工作液或所述样品的溶液；再加入华法林药物的特异性抗体；温育后洗涤拍干，加入所述酶标记抗抗体，先用碱性磷酸酶的底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值；再用辣根过氧化物酶的底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值。
10.根据权利要求8所述的检测样品中抗凝血杀鼠剂残留的方法，其特征在于：用所述试剂盒可检出猪肉、牛奶、血清中的抗凝血杀鼠剂；检测猪肉、牛奶、血清中华法林检测限为5.0 µg/kg，溴敌隆、氯灭鼠灵检测限为15.0 µg/kg，杀鼠醚、氯敌鼠检测限为20.0 µg/kg，，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%。
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