CN106841589A - 一种适用检测辛硫磷残留分析的elisa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种适用检测辛硫磷残留分析的elisa检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种适用检测辛硫磷残留分析的ELISA检测试剂盒及检测方法，其特征在于在试剂盒内有包被辛硫磷抗原的酶标板，洗涤液、辛硫磷标准品、辛硫磷抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物显色液和反应终止液。本发明的优点是能进行水、土壤、蔬菜、中毒样品中辛硫磷残留的检测。为方便、快速检测辛硫磷的农药残留提供了有效的方法。

Description

一种适用检测辛硫磷残留分析的ELISA检测试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种蔬菜水果农药残留检测技术，特别是一种适用检测辛硫磷残留分析的ELISA检测试剂盒及检测方法，能快速测定大批量蔬菜、水、土壤、中毒等环境等样品中的辛硫磷残留。
背景技术
色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂，工作量大，仪器昂贵，并要求有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单，快速，灵敏及廉价的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。
辛硫磷作为有机磷类杀虫剂的一种, 主要作用于乙酰胆碱酯酶。适合于防治地下害虫对为害花生、小麦、水稻、棉花、玉米、果树、蔬菜、桑、茶等作物的多种鳞翅目害虫的幼虫有良好的作用效果, 对虫卵也有一定的杀伤作用, 也适于防治仓库和卫生害虫苍蝇等。辛硫磷在粮食中最高允许残留量应为0.25ppm。
目前对于辛硫磷残留的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、胆碱酯酶抑制法、荧光法等。但这些方法都存在回收率低、检测样品前处理程序繁琐、检测周期长等缺点。因此，迫切需要一种快速简便的新方法来检测辛硫磷。酶联免疫法（ELISA）是一种敏感、快速且效率极高的检测分析方法与传统的检测方法相比，其具有样品处理简单、检测速度快、方法简便等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用检测辛硫磷残留分析的ELISA检测试剂盒及检测方法，具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单快速，并能用于大批量样品快速检测。
本发明提供一种辛硫磷人工抗体的制备方法：
(1)取辛硫磷，1,3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于N,N-二甲基甲酞胺中，得到a液；
(2)取N, N-二环己基碳二亚胺溶解于DMF中，得到b液；
(3)在0℃条件下，将b液缓慢滴加至a液中，恢复室温后，继续反应20 h ；
(4)蒸除溶剂，柱层析(洗脱液:二氯甲烷/甲醇，体积比20 :1)，得到辛硫磷半抗原；免疫原制备-辛硫磷半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；
(5)取辛硫磷半抗原用DMF溶解，得到a液；
(6)取BSA 用磷酸盐缓冲液溶解，得到b液；
(7)取碳化二酰亚胺(EDC)用磷酸盐缓冲液溶解，得到工b液；
(8)将a液与b液混合，在搅拌下缓慢滴加入工b液，室温反应2小时，4℃透析二天，每天换液三次，得到免疫原；
取辛硫磷人工抗原对新西兰白兔进行免疫，免疫后取血，并测定其抗血清效价，直到其效价达到一定数值，即得到辛硫磷多克隆抗体将制备好的多克隆抗体保存于-20 ℃备用。
一种检测辛硫磷的ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗辛硫磷抗体特异性结合反应的包被抗原，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、辛硫磷标准溶液、抗辛硫磷抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。
利用辛硫磷ELISA检测试剂盒的检测方法：
取出包被有辛硫磷包被抗原酶标板，恢复到室温后备用；加入标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做2~4个重复;加入抗体，孵育；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的磷酸缓冲液(PBST)洗涤；加入酶标二抗，孵育；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用PBST洗涤；底物溶于底物溶液后，加入过氧化氢，然后每孔加入显色液，轻微振匀，孵育；加入反应终止液，混合好后，测定OD490值。
以所获得的标样和样品吸光值的平均值计算各孔的吸光值的抑制率
抑制率(%)=抑制率(%)=[ (ODmax-ODmin)-(ODx-ODmin)]/(ODmax-ODmin)×100%
其中：ODmax、为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值
计算的标样值绘成为一个对应辛硫磷浓度(mg/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.005 ~10mg/L范围内为线性，对应样品浓度可从校正曲线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，然后求出对应样品的浓度。
本发明的积极效果：检测辛硫磷残留分析具有高特异性，高灵敏度，高准确度，同时操作方法简单快速，并能适用于大批量样品快速检测。
具体实施方式
实施例1
辛硫磷半抗原制备
(1)取20mg辛硫磷，10ul，1,3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2mlN,N-二甲基甲酞胺中，得到a液;
(2)取20mg N, N-二环己基碳二亚胺溶解于0. 5m1DMF中，得到b液;
(3)在0℃条件下，将b液缓慢滴加至a液中，恢复室温后，继续反应20 h ;
(4)蒸除溶剂，柱层析(洗脱液:二氯甲烷/甲醇，体积比20 :1)，得到辛硫磷半抗原。
实施例2
辛硫磷抗原的制备
免疫原制备-辛硫磷半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。
(1)取辛硫磷半抗原5. 3mg用0. 5ml DMF溶解，得到a液;
(2)取BSA 30mg用2. 0ml, pH7. 0, 0.1mol/L磷酸盐缓冲液溶解，得到b液;
(3)取碳化二酰亚胺(EDC)10mg用0. 5m1, pH7. 0, 0.1mol/L磷酸盐缓冲液溶解，得到b液:
(4)将a液与b液混合，在搅拌下缓慢滴加入工b液，室温反应2小时，4℃透析二天，每天换液三次，得到免疫原。
实施例3
辛硫磷抗体制备
取3 mg辛硫磷人工抗原溶于1 mL生理盐水中，将稀释过后的辛硫磷人工抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，随后利用皮下多点注射方法将乳化后的辛硫磷人工抗原注射于新西兰大白兔体内，每只大白兔一次用量为0.5 mg/kg。15天后，将同样用生理盐水稀释过的辛硫磷人工抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，加强免疫，剂量为0.01 mg/kg，15天后进行第三次使用稀释过辛硫磷人工抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行加强免疫，从此次加强免疫开始，免疫7天后取血，并测定其抗血清效价，直到其效价达到一定数值，将制备好的多克隆抗体保存于-20 ℃备用。
实施例4
一种辛硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒
该试剂盒体内包括有包被辛硫磷抗原的酶标板，洗涤液、辛硫磷标准品、辛硫磷抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物显色液和反应终止液；
洗涤液：Na2HPO4·12H2O 68.8 g，NaH2PO4 6.9 g，NaCl 45 g；
底物显色液为TMB-过氧化氢脲溶液，配制步骤如下：底物液A：取无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg，加双蒸水至1000 mL，调节PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存；使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min。
反应终止液为1.25mol/L的H2SO4。
实施例5
利用试剂盒检测操作方法
（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品；
（2）在包被有辛硫磷抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的辛硫磷抗原及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（3）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（4）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化；
（5）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应；
（6）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。

Claims (4)

1.一种辛硫磷多克隆抗体的制备方法，主要包括如下步骤:
（1）取20 mg辛硫磷，10ul，1,3-丙二胺，适量的4-二甲氨基吡啶溶解于2mL N, N-二甲基甲酰胺中，得a液；
（2）取20mg N, N-二环己基碳二亚胺溶解于0. 5m1N, N-二甲基甲酰胺中，得到b液；
（3）在0℃条件下，将b液缓慢滴加至a液中，恢复室温后，继续反应20 h ；
（4）蒸除溶剂，柱层析：洗脱液为二氯甲烷/甲醇，两者体积比20 :1，得到辛硫磷半抗原；
（5）将半抗原与载体蛋白进行偶联，得到辛硫磷人工抗原；
（6）利用辛硫磷人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的多克隆抗体即为辛硫磷克隆抗体。
2.一种辛硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于：该试剂盒体内包括有包被辛硫磷抗原的酶标板，洗涤液、辛硫磷标准品、辛硫磷抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物显色液和反应终止液。
3.根据权利要求2所述的辛硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于：洗涤液：Na2HPO4·12H2O 68.8 g，NaH2PO4 6.9 g，NaCl 45 g；
底物显色液为TMB-过氧化氢脲溶液，配制步骤如下：底物液A：取无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg，加双蒸水至1000 mL，调节PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存；使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min；
反应终止液为1.25mol/L的H2SO4。
4.一种利用权利要求2或3所述试剂盒检测样品中辛硫磷残留的方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品；
（2）在包被有辛硫磷抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的辛硫磷及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（3）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；
（4）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化；
（5）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应；
（6）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。
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