KR20020060251A - 감염성 클론 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 게놈 ran(gRNA) 또는 RNA 바이러스의 완전한 길이 카피를 포함하는 DNA; 또는 (b) 하나 이상의 구조 또는 비구조 단밸질 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 암호하는, RNA 바이러스 gRNA의 하나 또는 여러개의 단편을 포함하는 DNA; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 서열과 60% 이상의 상동성을 가진 DNA를 세균 인공 염색체(BAC)내로 클로닝시키는 단계를 포함하는 DNA의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, RNA 의존적 RNA 폴리머라아제 및 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질을 암호하는 바이러스의 천연 서열과 60% 이상의 서열 상동성을 가진 코로나바이러스의 게놈 RNA(gRNA)에서 유래된 서열을 포함하는 DNA가 제공되는데, 이 DNA의 단편은 비리온내로 어셈블될 수 있는 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제로 전사될 수 있다. 또한, RNA 또는 비리온의 제조에 있어서 이들 핵산의 사용 및 이들 DNA, 바이러스 RNA 또는 비리온을 포함하는 약제들이 개시되어 있다.

Description

감염성 클론{INFECTIOUS CLONES}
재조합 DNA 기법의 진보는 생명체에서 유전자 이동(genetic transfer)의 개발을 앞당겨 왔다. 이 시점에서, 유전자 이동 기법의 사용을 통한 경제적으로, 상업적으로 관심사인 화학적, 약학적 및 생물학적 산물을 제조하고자 하는 수많은 노력들이 이루어지고 있다.
원핵 세포 및 진핵 세포에서의 유전자 조작에 있어서 가장 중요한 요소 중 하나는 벡터와 벡터-숙주 시스템의 개발이다. 일반적으로, 벡터는 숙주 세포에서 복제하거나 발현할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터-숙주 시스템은 벡터를 함유하는 숙주 세포로서 정의될 수 있고, 그것이 함유하는 유전 정보가 복제되고 발현되게 한다.
벡터는 DNA 및 RNA 게놈 둘다를 가진 바이러스로부터 개발되었다. 숙주 세포의 핵내에서 복제하는 DNA 바이러스에서 기원한 바이러스 벡터는 상기 세포의 게놈내로 삽입될 수 있다는 단점을 가지므로, 이들은 일반적으로 그다지 안전하지 않다. 대조적으로, 숙주 세포의 세포질내에서 복제하는 RNA 바이러스 기원의 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 기원의 벡터에 비해 안전한데, 그 이유는 복제가 핵 외부의 RNA를 통해 일어나기 때문이다. 따라서, 이들 벡터는 숙주 세포의 게놈내로 삽입되지 않을 것이다.
cDNA 클론은 양(+) 극성[ssRNA(+)]을 가진 단일 쇄 RNA 바이러스, 예를 들어, 피코나바이러스(Racaniello & Baltimore, 1981); 브로모바이러스(Ahlquist et al., 1984); 알파바이러스, 신드비스 바이러스를 포함하는 속; 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus (SFV)) 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(VEE)(Rice et al., 1987; Liljestrom and Garoff, 1991; Frolov et al., 1996; Smerdou and Liljestrom, 1999), 플라비바이러스 및 페스티바이러스(Rice and Strauss, 1981; Lai et al., 1991; Rice et al., 1989) 및 아스트로비리데(Astroviridae)과 바이러스(Geigen-muller et al., 1997)부터 얻어졌다. 또한, 이종 유전자의 발현을 위한 벡터는 ssRNA(+) 바이러스, 예를 들어 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 및 베네주라 말 뇌염(VEE) 바이러스(Frolov et al., 1996; Liljestrom, 1994; Pushko et al., 1997)을 비롯한 알파바이러스와 같은 ssRNA(+) 바이러스의 게놈에 상보적인 DNA 클론으로부터 개발되었다. 그러나, RNA 바이러스로부터 시작하는 재조합 바이러스의 모든 제조 방법은, 대부분의 바이러스가 세균에 독성인 서열을 포함한다는 사실에 의해 더욱 복잡해진다. 따라서, 세균내에서 cDNA의 서브클로닝 및 바이러스 RNA의 cDNA 제조는 세균 숙주내에서 DNA 서열의 재배열 또는 결실을 초래하는 경우가 많다. 이러한 목적을 위해, 통상적으로 사용되는 서브클로닝 및 발현 벡터 대부분은 재조합 RNA 바이러스 기원의 큰 DNA 단편(section)을 제조하는 데 사용될 수 없다. 그러나, (길이가) 긴 이종 DNA 서열을 운반할 수 있는 벡터를 얻는 것은 약제, 구체적으로 백신의 개발의 여러가지 측면에서 요구된다.
코로나바이러스는 길이가 약 25 내지 31 킬로베이스(kb)에 달하는, RNA 바이러스에 대하여 가장 큰, 공지의 게놈을 제공하는 ssRNA(+) 바이러스이다(Siddell, 1995; Lai & Cavanagh, 1997; Enjuanes et al., 1998). 코로나바이러스에 의해 감염되었을 때, 게놈 RNA(gRNA)가 복제되고, 양극성 및 음극성의 서브게놈 RNA(sgRNA) 일조가 합성된다(Sethna et al., 1989; Sawicki and Sawicki, 1990; van der Most & Spaan, 1995). sgDNA의 합성은 (비록 그것의 정확한 메커니즘은 아직 정확히 알려져 있지 않지만) 감염된 세포의 세포질에서 일어나는 RNA-의존적 과정이다.
일부 코로나바이러스, 예를 들어 뮤린 간염 바이러스(MHV), 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 소의 코로나바이러스(BCV)(Chang et al., 1994) 및 돼지의 위장염 바이러스(TGEV)(스페인 특허 출원 P9600620; Mendez et al., 1996; Izeta et al., 1999; Sanchez et al., 1999)의 불완전한 방해(defective interfering, DI) 게놈을 암호하는 cDNA의 작제(이들의 복제 및 전사를 위한 상보적인 바이러스의 존재를 필요로 하는 결실 돌연변이)가 기재되어 있다. 그러나, 코로나바이러스의 완전한 게놈을 암호하는 cDNA 클론의 작제는 코로나바이러스 게놈의 큰 크기와 게놈내의 독성 서열에 기인하여 불가능하였다.
요약하자면, 다수의 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 이종 핵산 서열을 복제하고 발현하기 위하여 개발되어 왔으나, 이종 유전자의 발현을 위한 대다수의 알려진 벡터는 RNA 바이러스의 서브클로닝에 적합하지 않다. 또한, 이렇게 얻어진 바이러스 벡터는 종 특이성 및 표적 장기나 조직에의 한정이 결여되어 있고, 이들의 제한된 클로닝 능력으로 인한 단점을 가지는데, 이것은 기초 및 응용 연구에서 사용될 가능성을 제한한다.
따라서, 전술한 문제점들을 극복할 수 있는 이종 유전자 발현용 신규 벡터를 개발하는 방법에 대한 필요성이 있다. 특히, 높은 수준의 안전성과 클로닝 능력을 가진 이종 유전자 발현용 큰 벡터를 가진다는 점에서 유리한데. 이것은 이의 종 특이성 및 친화성(tropism)이 조절될 수 있도록 설계될 수 있다.
본 발명은 DNA 또는 RNA의 제법, 이 방법에 의해 얻어질 수 있는 핵산, 그리고 백신으로서, 및 유전자 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1은 TGEV의 감염성 RNA를 암호하는 cDNA 클론의 작제를 도시한다. 도 1a는 문자와 숫자(1a, 1b, S, 3a, 3b, E, M, N 및 7)로 표시되는 유전자의 명칭과 함께 TGEV의 유전자 구조를 도시한다. 도 1b는 DI-C 게놈을 완성하는 것을 특징으로 하는 cDNA-클로닝 기법을 도시한다. 완전한 길이의 cDNA를 재확립하기 위해 완성된 결실부 △1, △2 및 △3이 표시되어 있다. DI-C 게놈 구조 아래에 위치하는 숫자는 상기 DI-C 게놈중에 각각의 결실부 측면에 위치하는 뉴클레오티드를 의미한다. 도 1c는, 결합시에 사용된 주요 제한 부위의 위치 및 결실부 △1을 완성하기 위해 작제된 4개의 cDNA 단편을 도시한다. 단편 △1의 삽입 결과 cDNA의 독성이 증가되었다.
도 2는 TGEV의 감염성 cDNA를 클로닝하는 데 사용되는 pBeloBAC 플라스미드(Wang et al., 1997)의 구조를 도시한다. 이 pBeloBAC 플라스미드는 에이치. 시주야 및 엠. 시몬(California Institute of Technology)에 의해 제공되며, 대장균 F 인자의 복제 기점(oriS), 세포당 플라스미드 하나의 단일 카피를 유지하는 데 필요한 유전자(parA parB, parC 및 repE), 및 클로람페니콜-내성 유전자(CMr)를 함유하는 7,507개의 염기쌍(bp)을 포함한다. T7 및 SP6 프로모터의 위치 및 특정 제한 부위가 표시되어 있다. CosN: pBAC 플라스미드의 작제를 촉진하는 람다의 cosN 자리; Lac Z: β-갈락토시다아제 유전자. 플라스미드 생성시에 사용된 서열 loxP가 표시되어 있다.
도 3은 TGEV cDNA 작제에 사용된 기본 플라스미드의 구조를 도시한다. pVAC-TcDNA△ClaI플라스미드는 5,198 bp의 ClaI-ClaI를 제외하고는 TGEV RNA의 모든 정보를 함유하고 있다. cDNA는 사이토메갈로바이러스(CMV) 직전(IE) 발현 프로모터 하에서 클로닝되며, 3' 말단에서 24개 잔기의 A, 간염 델타 바이러스(HDV)의 리보자임 및 소의 성장 호르몬(BGH)의 종결 및 폴리아데닐화 서열을 가진 폴리(A) 꼬리의 측면에 위치한다. pBAC-B+C+D5' 플라스미드는, cDNA가 완전한 길이가 될 때까지 pBAC-TcDNA△ClaI를 완성하는 데 필요한 ClaI-ClaI 단편을 함유한다. pBAC-TcDNAFL플라스미드는 TGEV의 완전한 길이 cDNA를 함유한다. SAP: 새우의 알칼리 포스파타아제.
도 4는 C11 및 TGEV PUR46-MAD(MAD) 클론의 S 유전자 뉴클레오티드 서열에서의 차이를 도시한다. 숫자는 개시 코돈의 A를 각각의 유전자의 제1 뉴클레오티드로서 간주하여, 치환된 뉴클레오티드의 위치를 표시한다. 바아(bar)내의 문자는 표시된 위치에서 상응하는 뉴클레오티드를 의미한다. 바아 아래에 위치한 문자는 표시된 위치 주변에 있는 뉴클레오티드에 의해 암호되는 아미노산(aa) 치환을 의미한다. 화살표는 S 유전자의 종결 코돈 위치를 의미한다.
도 5는 완전한 길이 TGEV cDNA로부터 감염성 TGEV를 구제하기 위한 기법을도시한다. pBAC-TcDNAFL플라스미드는 ST 세포(돼지 고환 세포)로 형질감염되었고, 형질감염 후 48시간에서의 상청액을 사용하여 새로운 ST 세포를 감염시켰다. 바이러스를 표시된 시각에서 통과시켰다. 각각의 통과시에, 각각 바이러스 적정(titration) 및 RT-PCR 분석용 RNA를 분리하기 위하여 상청액 및 세포 단일층의 분취량을 수집하였다. vgRNA: 완전한 길이의 바이러스 RNA.
도 6은 형질감염된 ST 세포내에서 TGEV cDNA에 의해 생산된 세포독성 효과(CPE)를 도시한다. 비감염된(대조) ST 세포에서 CPE의 부재(도 6a) 및 ST 세포내에서 pBAC-TcDNAFL로 형질감염된 후 14시간 및 20시간에서 관찰되는 CPE가 도시된다(각각 도 6b 및 6c).
도 7은 통과에 따른 바이러스 역가의 진화를 도시한다. pBAC-TcDNAFL로 형질감염시킨 후 상이한 통과에서 2개 시리즈의 세포 단층(1 및 2) 상청액에서의 바이러스 역가를 나타내는 그래프가 도시되어 있다. Mock 1 및 2는 비형질감염된 ST 세포를 의미한다. TcDNA 1 및 2는 pBAC-TcDNAFL로 형질감염된 ST 세포를 의미한다.
도 8은 pBAC-TcDNAFL로 ST 세포를 형질감염시킨 후 회수한 바이러스 서열의 분석 결과를 도시한다. TGEV 게놈의 구조는 도 맨위에 표시되어 있다. 또한, pBAC-TcDNAFL(TcDNA) 플라스미드에서 회수된 바이러스 및 TGEV 클론 C8과 C11의 뉴클레오티드(유전 마커) 서열상의 차이점이 표시되어 있다. 뉴클레오티드간의 상이한 위치는 바아 상에 위치한 숫자로서 표시되어 있다. TcDNA 바이러스 및 클론 C11의 cDNA 서열은 RT-PCR(역-전사 및 폴리머라아제 연쇄 반응)에 의해 얻어진 단편을 서열결정함으로써 결정되었다. 클론 C8의 서열은 공개문헌(Penzes et al., 1999)에 제공되며, 이 특허의 마지막에 포함되어 있다. TcDNA 및 C8 바이러스의 뉴클레오티드 18,997 및 20,990을 포함하는 RT-PCR에 의해 얻어진 단편의 ClaI 및 DraIII에 의한 제한 패컨이 도시되어 있다. 제한 패턴은 이들 바이러스의 cDNA에서 ClaI 및 DraIII 부위의 존재 또는 부재를 도시한다. 이 분석의 결과는, 회수된 TcDNA 바이러스가 분리물 C11에 대하여 예측된 S-유전자 서열을 가졌다는 것을 의미하였다. MWM: 마커의 분자량.
도 9는 회수된 바이러스의 RT-PCR 분석 결과를 도시한다. 바이러스 RNA는 세포내 폴리머라아제 pol II에 의해 인식되는 CMV 프로모터의 조절하에 발현되었다. 원칙적으로, 이 RNA는 세포질로의 이동시에 스플라이싱을 거질 수 있었다. 이것이 그러한 경우인지를 연구하기 위하여, 고도의 개연성을 가진 RNA 부위를, 인간 DNA의 서열에서의 스플라이싱 부위를 예측하는 프로그램(Version 2.1.5.94, 디파트먼트 오브 셀 바이올로지, 바이어 컬리지 오브 메디신)을 사용하여 결정하였다(Solovyev et al., 1994). 절단의 최대의 개연성을 가진 잠재적인 스플라이싱 부위는 nt 7,243 에서 공여자 부위를 가졌고, nt 7,570에서 수용자 부위를 가졌다(도 9a). 이러한 도메인이 스플라이싱을 거쳤는가를 연구하기 위하여, nt 7,078 및 nt 7,802의 측면에 위치한 RT-PCR 단편을 비형질감염된 배양물(대조군)의 0회 통과 및 2회 통과의 RNA로부터, 또는 역배향된 ClaI 단편을 가진 TcDNA로 형질감염된 ST 세포로부터 준비하였고, RT-PCR에서 얻어진 산물을 아가로즈 겔 상에서 분석하였다. 얻어진 결과물을 도 9c(0회 통과) 및 9d(2회 통과)에서 도시하고 있다.
도 10은 TcDNA로 형질감염된 ST 세포의 배양물 중에서 생산된 바이러스의 면역형광분석 결과를 도시하고 있다. 면역형광 염색은 TGEV PUR46-MAD 분리물 및 pBAC-TcDNAFL로 형질감염된 후 회수된 바이러스에 대하여 특이적인 항체를 사용하여 수행되었다. 이것에 있어서, 양자의 분리물과 단지 PUR46-MAD에만 결합하는 TGEV-특이적인 모노클로날 항체가 사용되었다(Sanchez et al., 1990). 결과는 TcDNA 바이러스가 예상된 항원성을 가진다는 것을 확인시켜 주었다. TGEV에 대한 특이적인 폴리클로날 항혈청은 둘다의 바이러스에 결합하지만, 감염되지 않은 배양물에 결합하지 않았고, S(ID.B12 및 6A.C3), M(3B.B3), 및 N(3B.D8) 단백질에 대하여 단지 예상된 특이적인 모노클로날 항체만이 TcDNA에 결합하였다(Sanchez et al., 1999)
도 11은 유전자간(IG) 서열의 5' 영역의 바로 측면에 위치한 상이한 전사 조절 서열(TRS) 하에서 GUS의 발현을 도시하고 있다. 미니게놈 M39는 CMV 프로모터의 조절하에서 클로닝되었다. 다중 클로닝 서열(PL1, 5'-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3'; 서열 번호 2) 및 선택된 전사 조절 서열(TRS)에 의해 형성된 전사 유닛, 다른 다중 클로닝 서열(PL2, 5'-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3'; 서열 번호 3, 또는 PL3, 5'-GTCGAC-3'; 서열 번호 4), 코작(Kz) 도메인 구조를 가진 서열, 베타-글루쿠로니다아제(GUS) 유전자, 및 다른 다중 클로닝 부위(PL4, 5'-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3'; 서열 번호 5)이 미니게놈내로 삽입되었다. 이들 서열(여기서, CTAAAC 및 CUAAAC는 본 특허의 목적에 대하여 동일한 의미를 가짐을 주의해야 한다. 전자는 DNA의 서열을 의미하고, 후자는 상응하는 RNA를 의미한다)은 3'-말단에서 미니게놈 M39의 3'-서열, HDV 리보자임, 및 BGH의 종결 및 폴리아데닐화 서열의 측면에 위치하였다. TRS는 IG 서열 (CUAAAC)의 5' 말단에서 상이한 번호(0, -3, -8, 및 -88)의 뉴클레오티드를 가졌으며, 기재한 바와 같이 N, S 또는 M 유전자에서 유래된 것이다. ST 세포를 상이한 플라스미드로 형질감염시키고, 상보적인 바이러스(PUR46-MAD)로 형질감염시킨 후, 상청액을 6회 통과시켰다. 감염된 세포에서의 GUS 활성은 이제타(Izeta et al, 1999)에 기재된 프로토콜에 의해 측정되었다. 통과 회수와 GUS 활성의 연관성에 의해 얻어진 결과는 도 11b에 표시되어 있다.
도 12는 IG 서열의 3'-측면 부위에서 상이한 TRS 하에서 GUS의 발현을 도시하고 있다(도 11a). IG 서열(CUAAAC)에 더해진 TGEV의 N 유전자의 -88 nt에 해당하는 5'-측면 부위를 가진 이러한 전사 유닛을 사용하여, 3'-측면 서열을 개질시켰다. 이들 서열은 도 12a에 도시된 바와 같이 상이한 TGEV 유전자(S, 3a, 3b, E, M, N 및 7)의 서열에 상응하였다. 2가지 경우에서, 3-서열은 제한 부위(SalI) 및 최적화된 Kozak 서열(Kz)에 의해 치환되거나, 또는 바이러스 게놈의 리더에 이어 존재하는 제1 IG 서열을 따르는 하나와 동일한 서열에 의해 치환된다. 감염된 세포내에서 GUS 활성은 전술한 프로토콜에 의해 측정되었다(Izeta et al., 1999). cL12는 TGEV 게놈의 리더 서열의 3'-말단의 것과 동일한 12 뉴클레오티드 서열을 나타내었다(맨 뒤에 표시된 바이러스 서열 참조). 이 서열은 도 12에 도시된 통과 회수와GUS 발현의 연관성에 의해 얻어졌다.
도 13은 미니게놈내에서의 발현 모듈 삽입 부위가 GUS 발현 수준에 대하여 가지는 효과를 도시한다. IG 서열(CUAAAC)의 5'말단에 위치한 N 유전자의 -88 nt, 및 3'-말단의 측면에 위치한 Kz를 함유하는 GUS 형질전환 유닛을 미니게놈 M39내의 4개의 단일 제한 부위에 삽입하여, 이들 모든 부위가 이종 유전자의 발현에 대하여 동일하게 허용가능한가의 여부를 결정하였다. ST 세포를 이들 플라스미드로 형질감염시키고, 상보적인 바이러스(PUR46-MAD)로 감염시켰다. 감염된 세포내에서 GUS 활성은 전술한 프로토콜에 따라 0회 통과에서 측정되었다(Izeta et al., 1999). 얻어진 결과는 도 13b에 정리되어 있다
발명의 상세한 설명
본 발명에 따라서,
(a) RNA 바이러스의 게놈 RNA(gRNA)의 완전한 길이 카피를 포함하는 DNA; 또는
(b) RNA 바이러스의 gRNA의 하나 또는 여러개의 단편을 포함하는 DNA로서, 이 단편은 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 암호하는 것인 DNA; 또는
(c) 서열 (a) 또는 (b)에 대하여 60% 이상의 상동성을 가진 DNA를 세균의 인공 염색체(BAC)내로 클로닝하는 단계
를 포함하는 DNA의 제조 방법이 제공된다.
본 출원에 따라서, "세균 인공 염색체"는 F 인자의 서열을 포함하는 DNA 서열이다. 소위 F 플라스미드라고 불리는, 이 서열을 함유하는 플라스미드는 300 kb 이상의 길이를 가진 이종 서열을 낮은 카피 개수(세포당 1 또는 2 카피)로 안정하게 유지할 수 있다. 각각의 BAC는 당업계에 잘 알려져 있다(Shizuya et al., 1992).
본 발명에 따라서, BAC내로 클로닝된 DNA는 RNA 바이러스의 천연 서열에 대하여 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85 내지 95%의 상동성을 가진다. 서열 상동성은 유러피안 바이오인포매틱스 인스티튜트(EBI)에서 입수가능한 클러스탈(Clustal) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따라, 본 발명은 바이러스의 구조 또는 비구조 단백질 중 하나를 제외한 모든 또는 몇가지를 암호하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체에에서, BAC내로 클로닝된 DNA는 하나 또는 여러개의 이종 유전자를 암호하는 서열을 추가로 포함한다. 본 출원에 따라, 유전자가 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제 및 구조 또는 비구조 단백질을 암호하는 유전자의 공급원으로서 사용된 바이러스에서 유래된 것이 아니라면, 유전자는 "이종 유전자"로서 규명된다. 따라서, "이종 유전자"는 한가지 유형의 바이러스로부터 유래되고 다른 형태의 바이러스에서 유래된 서열을 포함하는 벡터내에서 발현되는 유전자를 의미한다. 관심의 대상이 되는 임의의 이종 유전자는 본 발명의 핵산내로 삽입될 수 있다. 포유동물의 면역계에 의해 감염제에서 유래된 항원으로서 인식되는 하나 또는 여러개의 펩티드 또는 단백질을 암호하는 유전자의 삽입은 특히 바람직하다. 또 다르게, 본 발명의 방법은 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체 또는 감염제의 복제를 저해하는 하나 이상의 분자를 암호하는 이종 유전자를 사용하여 수행될 수 있다. 이종 서열은 면역조절제, 사이토킨, 면역증강제 및/또는 항염증성 화합물을 암호하는 서열을 함유할 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 크기를 가진 BAC 내로 클로닝하기 위해 DNA를 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 큰 서열을 사용하는 경우에, 바이러스로부터 서브클로닝된 DNA를 제조하는 기존의 방법에 비해 특장점이 있다. 따라서, BAC 내로 클로닝된 DNA는 5 Kb 이상의 길이를 포함할 수 있는데, 적어도 15, 25 또는 30 Kb의 크기를 가진 DNA가 특히 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, BAC가 BAC내로 클로닝된 DNA의 전사 조절 서열을 포함하는 방법이 제공된다. 이는 바이러스 RNA의 전사를 허용하므로, 바이러스의 발현을 가능하게 한다. DNA 또는 RNA 게놈에서 유래된 유전자를 발현시키는 서열을 비롯하여, 당업계에 공지된 임의의 전사 조절 서열은 이러한 목적에 사용될 수 있다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 직전(immediately early, IE) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.
BAC내로 클로닝된 DNA는 3'-말단에서 폴리(A) 꼬리의 측면에 위치할 수 있다. 핵산은 소의 성장 호르몬(GBH)의 종결 및/또는 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 핵산은 리보자임, 예를 들어 간염 δ바이러스(HDV)의 리보자임을 암호하는 서열을 포함할 수 있다.
바이러스의 유전자의 하나 이상이 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 추가에 의해 개질될 수 있다면 또다른 이점이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 바이러스의 친화성 조절 유전자가 변화된 친화성을 가진 바이러스를 얻도록 개질될 수 있다. 대안적으로, 바이러스의 친화성 조절 유전자는 다른 바이러스의 각각의 유전자로 치환되었다. 이 개질은 바이러스의 S, M, 및 또는 N 유전자에서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, BAC내로 클로닝된 DNA가 RNA로 전사될 수 있고, 이 RNA는 비리온으로 어셈블될 수 있는 방법이 제공된다. 이 비리온은 감염성이거나, 약화되었거나, 복제능이 결여되었거나, 또는 불활성화된 바이러스일 수 있다.
임의의 RNA 바이러스는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 바이러스는 예를 들어 피코나바이러스, 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 토로바이러스, 아르테리부르세스, 칼시바이러스, 라브도바이러스, 파라믹소바이러스, 필로바이러스, 보르나바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스 또는 레오바이러스일 수 있다. 천연적으로 플러스(plus) 쇄 게놈을 가진 바이러스를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법 중 하나에 따라 DNA를 제조하는 단계, 적합한 숙주 세포내에서 DNA를 발현하는 단계, 상기 숙주 세포로부터 바이러스 RNA 또는 비리온을 분리하는 단계를 포함하는 비리온 또는 바이러스 RNA의 제조 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 세포 배양물로부터 바이러스를 분리하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 RNA 또는 비리온의 제조 방법이 개시되어 있는데, 여기서 본 발명의 DNA는 화학적 시약, 생물학적 시약 및/또는 세포 추출물을사용하여 전사되거나 번역되고, 바이러스 RNA 또는 비리온은 차후에 분리된다. 특정 구체예에 있어서, 차후에 바이러스는 불활성화되거나 사멸된다.
본 발명은 또한 DNA, 바이러스 RNA 또는 비리온을 상기 방법 중 어느 하나에 따라 제조한 후, 약학적 허용 아쥬반트(adjuvant) 및/또는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 다수의 아쥬반트 및 담체는 선행 기술 중에 공지되어 있으며, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 약학 제제는 감염성 질병에 대하여 동물과 인간을 보호하기 위한 백신인 것이 바람직하다. 약학 제제는 유전자 요법에서 사용하기에 유리할 수 있다.
본 발명은 또한 코로나바이러스의 천연 서열과 60% 이상의 상동성을 가지고 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 암호하는 코로나바이러스의 게놈 RNA(gRNA)에서 유래된 서열을 포함하는 DNA를 처음으로 제공한다. 여기서 상기 DNA의 단편은 비리온으로 어셈블될 수 있는 RNA로 전사될 수 있다.
본 발명에 따라, "코로나바이러스에서 유래된 서열"은 코로나바이러스의 천연 서열과 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85 내지 95%의 상동성을 가진 핵산 서열을 의미한다. 서열 상동성은 유러피안 바이오인포매틱스 인스티튜트(EBI)에서 입수가능한 클러스탈 컴퓨터 시스템을 사용하여 측정될 수 있다
"코로나바이러스"는 본 발명에 따라 25 내지 33 Kb의 ssRNA의 선형, 양성 센스의 단일 분자를 가진 바이러스군을 의미한다. 이들 바이러스는 통상적으로 7 내지 10개의 구조 유전자, 즉 바이러스 구조를 결정하는 단백질을 암호하는 유전자를함유한다, 이들 유전자는 통상적으로 바이러스 게놈내에 5' 레플리카아제-(헤마글루티닌-에스테라아제)-스파이크-엔벨로프-멤브레인-뉴클레오프로테인-3'의 순서로 정렬되어 있다. 추가적으로, 이들 바이러스 게놈은 통상의 3' 말단을 가진 mRNA의 네스티드(nested) 세트를 암호하는, 주로 비실질적인 다수의 비구조 유전자를 포함할 수 있다.
"비리온내로 어셈블될 수 있는 RNA로 전사될 수 있는"이라는 용어는 DNA 서열을 규정하기 위하여 사용되는데, 일단 적합한 숙주 세포내로 도입되면, RNA 내로 전사되고 비리온을 생성하는 것을 의미한다. 비리온은 감염성 바이러스인 것이 바람직하지만, 상기 RNA를 포함하는 불활성화된, 약화된 또는 복제능이 결여된 바이러스일 수 있다. 비리온의 발현에 필요한 모든 정보는 본 발명의 DNA 서열에 의해 암호되는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산은 목적하는 하나 또는 여러개의 이종 유전자를 암호하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 유전자가 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제 및 구조 또는 비구조 단백질을 암호하는 유전자에 대한 출처로서 사용된 코로나바이러스에서 유래된 것이라면, 유전자는 "이종 유전자"로 규정된다. 따라서, "이종 유전자"는 하나의 형태의 코로나바이러스로부터 유래되고, 다른 형태의 코로나바이러스로부터 유래된 서열을 포함하는 벡터내에 발현되는 유전자를 의미한다. 목적하는 임의의 이종 유전자는 본 발명의 핵산내로 삽입될 수 있다. 포유동물의 면역계에 의해 감염제로부터의 항원으로서 인식되는 펩티드 또는 단백질을 암호하는 유전자의 삽입은 특히 바람직하다. 따라서, 이종 유전자는 감염제에 대한 면역반응을 유도하기에 적합한 하나 이상의 항원, 감염제의 복제를 방해하는 하나 이상의 분자 또는 감염제데 대한 보호를 제공하는 항체를 암호할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이종 유전자는 면역조절제, 사이토킨, 면역증강제 및/또는 항-염증성 화합물을 암호할 수 있다.
RNA로 전사되는 본 발명에 따른 DNA 단편은 25 Kb 이상의 크기를 가지는 것이 바람직하다. 30 Kb 이상의 크기를 가진 단편이 특히 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, DNA는 코로나바이러스의 구조 또는 비구조 단백질 중 하나를 제외한 전부 또는 일부를 암호하는 코로나바이러스로부터 유래된 서열을 추가로 함유한다. 대안적으로, 본 발명의 DNA는 코로나바이러스의 구조 또는 비구조 단백질 전부를 암호하는 서열을 추가로 포함한다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산은 코로나바이러스 gRNA에서 유래된 서열의 전사 조절 서열을 포함한다. DNA 또는 RNA 게놈에서 유래된 유전자를 발현시키는 서열을 비롯하여, 당업계에 공지된 임의의 전사 조절 서열은 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 직전(IE) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산은 3'-말단에서 폴리(A)꼬리의 측면에 위치할 수 있다. 핵산은 소의 성장 호르몬(BGH)의 종결 및/또는 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 핵산은 리보자임, 예를 들어 간염 δ바이러스(HDV)의 리보자임을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 임의의 코로나바이러스, 예를 들어 뮤린 간염바이러스(MHV), 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 소의 코로나바이러스(BcCV), 개의 코로나바이러스(CCoV), 고양이의 코로나바이러스(FcoV) 또는 인간 코로나바이러스 또는 돼지의 전염성 위장염 바이러스(TGEV)의 분리물에서 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 핵산은 전염성 위장염 바이러스에서 유래된 것이다.
본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 본 발명의 DNA는 플라스미드, 바람직하게는 세균 인공 염색체(BAC)의 일부이다.
또한, 본 발명은 각각의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 비리온을 제공한다. 각각의 비리온은 예를 들어 본 발명의 핵산으로 감염되거나 형질감염된 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 DNA를 숙주 세포내로 도입하는 단계, DNA를 함유하는 숙주 세포를 이의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 비리온 또는 바이러스 RNA를 회수하는 단계를 포함하는 비리온 또는 바이러스 RNA의 제조 방법을 제공한다. 또한, 비리온 또는 바이러스 RNA의 제조 방법이 제공되는데, 여기서는 본 발명의 DNA를 시험관내에서 DNA 및 비리온 또는 바이러스 RNA의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 화학적 시약, 생물학적 시약 및/또는 세포 추출물과 혼합한다. 본 발명은 또한 상기 방법 중 어느 하나에 의해 얻을 수 있는 비리온 및 바이러스 RNA를 포함한다. 이종 유전자를 보유한 RNA 및 비리온이 바람직하다. 이렇게 얻어진 바이러스는 감염성, 약화된, 복제능이 결여된 또는불활성화된 바이러스 형태일 수 있다.
바이러스는 개질된 유전자, 예를 들어 개질된 S, N 또는 M 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, S, N 또는 M 유전자의 개질 결과 변화된 친화성을 가진 바이러스 또는 약화된 바이러스가 생산된다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 비리온, 핵산 또는 숙주 세포를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 바람직한 구체예에 따르면, 약학 제제는 감염제에 의해 유발될 수 있는 질병에 대하여 동물을 보호할 수 있는 백신이다. 백신은 예를 들어 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 하나 이상의 항원 또는 상기 감염제에 대하여 보호를 제공하는 항체의 서열을 포함한다. 상기 백신은 감염제의 복제를 방해하는 하나 이상의 분자를 발현하는 DNA를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 백신은 호흡기, 장점막 또는 기타 조직에서 증식하는 기타 감염제에 대한 점막내 면역 반응 및/또는 전신적 면역 반응을 일으킬 수 있는 하나 이상의 항원을 발현하는 벡터를 포함할 수 있다. 백신은 하나 이상의 감염제에 의해 유발되는 감염에 대하여 동물을 보호할 수 있는 다가 백신일 수 있는데, 이것은 상기 감염제 각각에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 발현하는 본 발명의 핵산 하나 이상, 임의의 감염제의 복제를 방해하는 하나 기타 분자 또는 상기 감염제 중 각각의 하나에 대하여 보호를 제공하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신은 당업계에 공지된 약학적 허용담체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 코로나바이러스에서 유래된, 방해능이 결여된 게놈이 프로모터의 발현하에 BAC 벡터내로 클로닝되는 단계, 및 상기 결여된 게놈내에서 결실이 재삽입되는 단계를 포함하는 본 발명의 DNA의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 바이러스 게놈내의 독성 서열이 남아있는 게놈 DNA내로 재삽입되기 전에 동정되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 게놈내의 독성 서열이 게놈의 완성 이전에 재삽입되는 최종 서열인 것이 바람직하다. 본 발명에 따라서, 이 방법은 적어도 80 이상의 세대동안 세균내에서 안정하므로, 매우 효율적인 클로닝 벡터를 제공하는 코로나바이러스의 감염성 클론을 산출하기에 적합하다.
본 발명은 코로나바이러스에서 유래된 cDNA의 개량된 감염성 클론(Almazan et al., 2000), 및 상기 클론내로 삽입된 이종 핵산 서열을 포함하는 상기 감염성 클론으로부터 작제된 개량 벡터를 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 감염성 클론 및 벡터는 기초 및 응용 연구 모두에서 다수의 용도를 가졌고, 높은 클로닝 능력을 가졌으며, 이들의 종 특이성 및 친화성이 용이하게 조절될 수 있도록 설계될 수 있다.
이 특허는 코로나바이러스의 역사에서 처음으로 코로나바이러스의 게놈을 암호하는 완전한 길이의 감염성 cDNA 클론을 얻을 수 있는 개량된 방법에대하여 기술하고 있다(Almazna et al., 2000)
코로나바이러스의 게놈 RNA(gRNA)를 암호하는 감염성 cDNA 클론에서 생산된 코로나바이러스 기원의 이종 핵산의 신규한 발현 시스템 또는 벡터를 개발하였다. 본 발명의 한가지 특정 실시에서, 코로나바이러스는 돼지의 전염성 위장염 바이러스(TGEV)이다.
신규한 발현 시스템이 목적하는 산물(단백질, 효소, 항체 등)을 얻기 위해, 백신 벡터로서, 또는 인간 또는 동물의 유전자 요법에서와 같은 기초 또는 응용 연구에 사용될 수 있다. 감염성 cDNA 클론에서 얻어진 감염성 코로나바이러스는, 신규의 유전자가 코로나바이러스의 게놈내로 삽입될 수 있도록 그리고 이들 유전자가 조직 및 종 특이적 방식으로 발현되어 면역 반응을 일으키도록 또는 유전자 요법을 위해 통상의 유전자 조작법에 의해 조작될 수 있다. 또한, 발현은 발현 수준을 100배 이상 증가시킬 수 있는 신규의 전사 조절 서열(TRS)의 선택에 의해 최적화되었다.
코로나바이러스에서 유래된 벡터, 특히 TGEV에서 유래된 벡터는 이들 내에서 복제하지 않는 기타 발현 시스템에 대하여 점막내 면역의 유도에 있어서 다음과 같은 몇가지 이점을 제공한다: (i) TGEV는 분비 면역의 유도를 위한 최적 부위인 장 및 호흡기 점막을 감염시킨다(Eujuanes and Van der Zeijst, 1995); (ii) 이것의 친화성은 S(스파이크) 유전자의 개질에 의해 조절될 수 있다(Ballesteros et al., 1997); (iii) 보체 바이러스에 의존하는 발현 시스템의 개발을 위한 비병원성 균주가 있다(Sanchez et al., 1992); 및 (iv) 코로나바이러스는 중간 DNA 단계를 거치지 않고 복제하는 세포질 RNA 바이러스이므로(Lai and Cavanagh, 1997), 세포내 염색체로 이것을 삽입시키는 것은 거의 불가능하게 된다.
코로나바이러스의 gran를 암호하는 cDNA로부터 감염성 코로나바이러스를 회수하는 것을 가능하게 하는 방법은 하기 기법을 포함한다:
(i) 적절한 프로모터의 조절하에서 코로나바이러스의 RNA를 발현시킴;
(ii) 세균 인공 염색체(BAC)에서 코로나바이러스의 게놈을 클로닝함;
(iii) 세균에 대한 직접 또는 간접 독성이 있는 코로나바이러스의 cDNA 서열을 동정함;
(iv) 코로나바이러스의 감염성 RNA를 암호하는 cDNA의 성분(프로모터, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 리보자임 등)의 정확한 결과 순서를 동정함: 및
(v) cDNA의 감염성 코로나바이러스를 효과적으로 구제하는 방법과 기법(BAC의 성장 조건, BAC DNA의 정제 과정의 개질, 형질전환 기법 등)의 조합 군을 동정함.
프로모터는 핵 내에서 바이러스 RNA의 발현을 증가시키는 데 중요한 역할을 하는데, 여기서 이것이 합성되어 나중에 세포질로 이동된다.
BAC를 사용하는 것은 본 발명의 방법에 있어서 중요한 점 중 하나이다. 알려진 바와 같이, 세균 플라스미드에서 진핵 세포 서열의 클로닝은 때때로 세균에 대한 외인성 서열의 독성 때문에 불가능하다. 이러한 경우, 세균은 일반적으로 유도된 서열을 개질시킴으로써 독성을 제거한다. 그러나, 이 경우에 이어지는 기법으로 이들 바이러스 서열의 가능성있는 독성을 회피하기 위하여, 필수적인 클로닝을 수행하여 BAC에서 코로나바이러스의 완전한 cDNA를 얻었다. 이들 플라스미드는 세포당 단지 1 카피 또는 최대한 2카피로 나타났고, 이들 독성을 상당히 제한하면서, 플라스미드간 재조합의 가능성을 감소시킨다.
코로나바이러스의 세균독성 cDNA 서열 동정을 통해, 독성 서열을 제외한 코로나바이러스의 완전한 게놈을 암호하는 cDNA 작제가 완성될 수 있다. 여기서, 독성 서열은 완전한 게놈 작제에서의 마지막 단계, 즉 진핵 세포에서 형질 감염 직전에 첨가되어 세균에 의해 이들이 변화되는 것을 방지한다.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 코로나바이러스의 gRNA를 암호하는 감염성 이중쇄 cDNA 및 이를 얻는 방법에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 감염성 클론내로 삽입되는 이종성 핵산 서열 및 상기 감염성 클론을 포함하는 일조의 재조합 바이러스 벡터에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 숙주 세포내로 상기 감염성 클론을 도입하는 단계, 상기 감염성 클론의 복제 및 재조합 코로나바이러스의 생산을 가능하게 하는 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계, 배양물로부터 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 코로나바이러스의 생산 방법에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 숙주 세포내로 재조합 바이러스 벡터를 도입하는 단계, 바이러스 벡터가 복제되도록 하고, 개질된 제조합 코로나바이러스가 생산될 수 있는 조건하에서 상기 벡터를 배양하는 단계 및 배양물로부터 개질된 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계를 포함하는 개질된 재조합 코로나바이러스의 생산 방법에 있다. 본 발명의 또다른 목적은 이종 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 상기 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적하는 산물의 제조 방법에 있다.
전술한 바와 같은 감염성 클론 또는 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 세포는 본 발명의 또다른 목적을 구성한다.
본 발명의 또다른 목적은 감염제에 의해 유발된 감염에 대항하여 동물을 보호하는 일조의 백신에 있다. 이들 백신은 각각의 감염제에 대항하여 면역 반응을 유발하기에 적합한 하나 이상의 항원, 또는 상기 감염제에 대항하여 보호를 제공하는 하나 이상의 항체와 함께 약학적 허용 부형제를 포함한다. 이 백신은 벡터가 하나 이상의 감염제에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 하나 이상의 항원, 또 다르게는 하나 이상의 감염제에 대항하여 보호를 제공하는 하나 이상의 항체를 발현하는가 여부에 따라 1가 또는 다가 일 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 백신의 투여를 특징으로 하는 동물의 면역화 방법을 포함한다.
본 발명은 하기를 포함하는, 코로나바이러스의 감염성 RNA를 암호하는 cDNA 클론, 이하 본 발명의 감염성 클론을 제공한다: (1) 감염성 게놈 RNA(gRNA)에 대한 상보적 DNA의 1카피; 및 (2) 최적화된 전사-증진 서열을 포함하는 추가 유전자에 대한 발현 모듈.
본 발명의 특정 실시에 있어서, 코로나바이러스는 TGEV 분리물, 특히 개 또는 인간 코로나바이러스의 S 유전자 또는 클론 C11 TGEV의 S 유전자로 이 바이러스의 S 유전자를 치환함으로써 개질시킨 PUR46-MAD 분리물이다(Sanchez et al., 1990).
전사 증진 서열 또는 프로모터는 코로나바이러스의 각각의 메신저 RNA(mRNA)의 5'-말단에 위치한 RNA 서열로서, 바이러스 폴리머라아제 RNA가 이곳에 결합하여 메신저 RNA(mRNA)의 전사를 시작하게 된다. 특정의 바람직한 구체예에서, 바이러스 게놈은 CMV의 IE 프로모터를 사용하여 cDNA로부터 발현되는데, 이것은 이들 프로모터를 사용하여 얻어진 발현의 수준이 높고(Dubensky et al., 1996), 큰, 불완전한 게놈(9.7 kb 및 15 kb)은 이들이 합성된 핵으로부터 세포질로 이동하는 동안에 스플라이싱을 거치지 않았던 TGEV 코로나바이러스가 발현된 RNA로부터 유래되었음을 의미하는 우리의 실험실에서 얻어진 이전의 결과에 기인한다.
본 발명의 감염성 클론은 또한 BGH 유전자로부터 유래된 것과 같은 폴리아데닐화 시그날 및 전사 종결 서열을 포함한다. 이들 종결 서열은 3'-말단의 폴리(A)에 위치하였다. 한가지 특정 실시에서, 본 발명의 감염성 클론은 A의 24 잔기의 폴리(A) 및 HDV 리보자임 서열에 의해 폴리(A) 꼬리로부터 분리된 BGH의 폴리아데닐화 및 종결 서열을 함유한다.
바이러스의 감염성 cDNA가 삽입된 플라스미드는 복제 기점을 보유하는 DNA 분자이므로, 적합한 세포에서 복제할 가능성이 있다. 사용된 플라스미드는 세균, 예를 들어 대장균과 적합한 숙주 세포내에서 본 발명의 감염성 클론을 증폭하고 유지하기에 적합한 레플리콘(replicon)이다. 이 레플리콘은 일반적으로 이를 운반하는 세포의 선택을 허용하는 항생제(예를 들어, cat) 내성 유전자를 보유한다.
실시예 1에서, CMV의 IE 프로모터 조절하의 TGEV의 감염성 클론의 작제가 기재되어 있다. cDNA의 3'-말단은 24 nt 폴리(A) 서열, HDV 리보자임 및 bgh의 전사 종결 서열의 측면에 위치하는 것으로 나타난다.
본 발명의 감염성 클론을 얻는 방법은 코로나바이러스의 gRNA로부터 완전한 길이의 cDNA를 작제하고, 전사 조절 인자를 결합시키는 단계를 포함한다.
코로나바이러스의 감염성 gRNA를 암호하는 cDNA는 cDNA의 안정성을 증가시키기 위해 BAC내에서 적절한 프로모터의 조절하에서 cDNA로서 클로닝된 코로나바이러스 유래의 DI 게놈에서 얻어졌다. 이어서, 세균독성 서열을 동정하고, 상기 독성을 제거하기 위하여 상기 독성 서열을 제거한 후, 진핵 세포내로 형질감염시키기 직전에 완전한 게놈의 작제물의 말단에 삽입한다. 바이러스 복제를 지지하는 진핵 세포내에서 코로나바이러스 게놈을 함유하는 BAC 플라스미드의 형질감염에 의해 바이러스 개체가 제구성될 수 있다.
전사 조절 인자는 통상의 기법에 의해 결합된다(Maniatis et al., 1989).
본 발명의 감염성 클론은 얻어진 발현 벡터 중에 존재하는 프로모터의 조절하에서, 결정된 활성을 암호하는 이종 핵산 서열의 하나 이상을 삽입하는 통상의 유전자 조작 기법에 의해 조작될 수 있다.
본 발명의 감염성 클론은 다수의 용도를 제공한다; 예를 들어, 이것은 기초 연구, 예를 들어 코로나바이러스의 복제와 전사 메커니즘의 연구, 및 응용 연구, 예를 들어 목적하는 산물(단백질, 효소, 항체 등)을 발현하는 효과적인 시스템의 개발이다.
적절한 세포는 본 발명의 감염성 cDNA 클론으로부터 형질전환될 수 있고, 코로나바이러스의 완전한 게놈을 함유하는, 생성된 비리온이 회수될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 감염성 cDNA를 숙주 세포내로 도입하는 단계, 감염성 클론의 복제 및 발현을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계 및 크로나바이러스의 감염성 게놈을 함유하는 재조합 코로나바이러스로부터 얻어진 비리온을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 코로나바이러스의 제조 방법을 제공한다.본 발명이 감염성 클론은 다양한 방법으로, 예를 들어 본 발명의 감염성 클론으로부터 시험관내에서 전사된 RNA로 숙주 세포를 형질감염시키거나, 또는 본 발명의 감염성 cDNA 클론으로 숙주 세포를 감염시킴으로써 숙주 세포내로 도입된다. 본 발명의 감염성 클론을 함유하는 상기 숙주 세포는 본 발명의 또다른 목적을 구성한다.
본 발명은 또한 본 발명의 감염성 클론으로부터 유래된 재조합 바이러스 벡터, 이하 발명의 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 바이러스 벡터는 이종성 핵산이 발현되도록 하는 조건하에서 상기 감염성 클론내로 삽입되는 이종성 핵산을 포함하도록 개질된 본 발명의 감염성 cDNA 클론을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "핵산"은 유전자 또는 유전자의 단편뿐만 아니라, 일반적으로는 DNA 또는 RNA의 임의의 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용된 의미에서, 핵산에 사용된 "이종성(heterologous)"은 숙주 세포내로 이종성 핵산을 도입하는 데 사용된 벡터내에 정상적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명의 바이러스 벡터를 함유할 수 있는 이종성 핵산은 단백질, 펩티드, 에피토프 또는 목적하는 임의의 유전자 산물(예를 들어, 항체, 효소 등)를 암호하는 유전자 또는 단편일 수 있다. 이종성 핵산은 임의의 적절한 cDNA 부위, 예를 들어 ORF 다음 또는 유전자 N 및 7 사이, 개시 코돈(AUG)에 이어, 및 이 유전자를 가진 리딩 프레임중에; 또는 대안적으로 다른 ORF에 상응하는 영역에서 통상적인 유전자 조작 기법에 의해 본 발명의 감염성 클론내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터의 작제에 있어서, 이종성 핵산의 삽입은 임의의 기본적인 바이러스의 작용을 방해하지 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 하나 이상의 활성을 발현할 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 벡터는 하나 또는 여러개의 프로모터, 또는 프로모터 및 다양한 리보솜 인식 부위(IRES, 장내 리보좀 유입 부위), 또는 다양한 프로모터 및 하나의 리보좀 인식 부위가 선행하며, 발현되어야 할 활성으로서 이종성 핵산의 다수의 서열을 포함할 것이다.
따라서, 본 발명은 이종성 핵산이 발현되고, 목적하는 산물이 회수되도록 하는 조건하에서 본 발명의 바이러스 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적하는 산물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 바이러스 벡터를 함유하는 상기 숙주 세포는 본 발명의 다른 목적을 구성한다.
본 발명의 바이러스 벡터는 종 특이성 및 친화성이 용이하게 조절될 수 있도록 설계될 수 있다. 이들 특성 때문에, 본 발명의 바이러스 벡터의 가장 중요한 용도는 목적하는 유전자의 벡터로서, 또는 상이한 병원균에 대한 면역 반응을 유도하는 백신 벡터로서 유전자 치료에서 이것의 이용이다.
또한, 본 발명은 감염제에 의해 유발되는 감염에 대하여 숙주를 보호할 수 있고, (i) 상기 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체 또는 상기 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 하나 이상의 항원을 발현하는 본 발명의 하나 이상의 바이러스 벡터, 선택적으로 (ii) 약학적 허용 부형제를 포함하는 백신을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어로서 "보호를 일으키는(유발하는)"은 세포성 반응을증강시키는 물질(인터루킨, 인터페론 등), 세포 괴사 인자, 및 감염제에 의해 유발되는 감염으로부터 동물을 보호하는 유사한 물질에 의해 유도되는 것과 같은 적당한 메커니즘에 의해 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 야기된 투여받는 유기체(면역화되어야 할 동물)의 면역 반응으로서 이해되어야 한다.
"동물"이라는 용어에 포함되는 것은 임의의 종의 모든 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유류이다.
본 명세서에 사용된 용어로서 "감염제(infectious agent)"는 임의의 바이러스, 세균, 진균, 기생충 또는 동물을 감염시킬 수 있고 이것이 병을 일으킬 수 있는 기타 감염제를 포함한다.
특정 실시에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 백신은 호흡 또는 장내 점막에서 증식하는 다른 감염제에 대한 점막내의 면역 반응 및/또는 전신적 면역 반응을 일으킬 수 있는 하나 이상의 항원을 발현하는 본 발명의 바이러스 벡터를 하나 잇아 포함한다. 본 발명의 벡터는 점막 및 유즙원성(Lactogenic) 면역에서 면역을 일으키는 데 매우 적합한데, 후자는 장관내 감염에 대하여 신생아를 보호하는 데 특히 중요하다.
다른 실시에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 백신은 감염제에 대하여 보호하는 임의의 이소형태의 항체(예를 들어, IgG1, IgA 등)의 경쇄 및 중쇄를 암호하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 본 발명의 바이러스 벡터를 하나 이상 포함한다.
종 특이성은 바이러스 벡터가 상응하는 종의 세포성 수용체에 의해 인식되기에 적합한 목적하는 종(인간, 개, 고양이, 돼지 등)을 감염시키는 코로나바이러스의 엔벨로프의 S 단백질을 발현할 수 있도록 제어될 수 있다.
본 발명에 제공된 백신은, 본 발명의 바이러스 벡터가 하나 이상의 감염제에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 감염제에 대하여 보호를 제공하는 하나 이상의 항체를 발현하는가에 따라 좌우되어 1가 또는 다가일 수 있다.
본 발명의 특정 실시에 있어서, 상이한 인간, 돼지, 개 및 고양이 감염제에 대하여 인간, 돼지, 개 및 고양이를 보호할 수 있는 1가 백신이 제공되며, 친화성은 목적하는 종 특이성과 함께 코로나바이러스의 S 글리코단백질을 발현함으로써 제어된다.
돼지의 감염제에 대한 1가 백신은 본질적으로 하기 돼지 병원균의 항원으로 이루어진 군 중에서 선택되는 항원을 발현하는 벡터를 포함한다: 악티노바실러스 플레우로뉴모니아, 악티노바실러스 수이스, 헤모필러스 파라수이스, 포킨 파르보바이러스, 렙토스피라, 에스케리키아 콜리, 에리시펠로트릭스 루시오파티아, 파스테우렐라 물토키다, 보르데텔라 브론키셉티카, 클로스트리듐 에스피., 세르풀리나 하이디오센테리아, 마이코플라스마 하이오뉴모니아, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV), 돼지의 호흡기 코르나바이러스, 로타바이러스, 또는 돼지의 호흡기 및 생식기 증후군, 오제스키(Aujeszky) 질병(슈도라비스), 돼지 인플루엔자, 또는 전염성 위장염을 일으키는 병원균, 위축성 비염 및 증식성 회장염의 병인학제.개의 감염제에 대한 1가 백신은 하기 개 병원균의 항원으로 주로 구성된 군에서 선택되는 항원을 발현하는 발현 벡터를 포함할 수 있다: 개 헤르페스 바이러스, 제1형 및 제2형 개 아데노바이러스, 제1형 및 제2형 개 코로나바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 개 인플루엔자 바이러스, 디스템(distemper) 바이러스, 공수병 바이러스, 레트로바이러스 및 개 칼리시바이러스.
고양이의 감염제에 대한 1가 백신은 하기 고양이 병원균의 항원으로 주로 구성된 군에서 선택되는 항원을 발현하는 발현 벡터를 함유할 수 있다: 고양이 칼리시바이러스, 고양이 면역결핍증 바이러스, 고양이 헤르페스 바이러스, 고양이 판류코페니아(panleukopenia) 바이러스, 고양이 레오바이러스, 고양이 로타바이러스, 고양이 코로나바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 클라미디아 시티아키(Chlamydia psittaci) 및 고양이 백혈병 바이러스.
벡터는 감염제, 예를 들어 전술한 바와 같은 돼지의, 개의 또는 고양이의 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체를 발현할 수 있다. 특정 실시에 있어서, 벡터는 TGEV를 중화시키거는, 6A.C3에서 동정된 바와 같은 재조합 모노클로날 항체 또는 인간 및 돼지 로타바이러스에 대한 중화 항체를 발현한다. 상기 모노클로날 항체는 이소형태 IgG1또는 IgA(여기서, 면역글로불린의 불변부는 돼지 기원임)로 발현된다.
부형제로서, 생리학적 식염수 또는 기타 유사한 염수 용액과 같은 희석제가 사용될 수 있다. 또한, 이들 백신은 알루미늄 히드록사이드, 쿠일A, 알루미나겔의 현탁액 등과 같은 수성 백신 및 미네랄 오일, 글리세라이드, 지방산 유도체 및 이들의 화합물과 같은 유성 백신의 제제 중에 통상적으로 사용되는 것들로부터의 아쥬반트를 함유할 수 있다.
본 발명의 백신은 세포 응답-증강(CRP) 물질, 즉 헬퍼 T 세포(Th2)의 하위군, 예를 들어 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 감마-IFN(감마-인터페론), 세포 괴사 인자, 및 백신화된 동물에서 이론적으로 세포성 면역 반응을 일으킬 수 있는 유사한 물질을 증강시키는 물질이다. 이들 CRP 물질은 수성 또는 유성 아쥬반트와 함께 백신 조성물 중에 사용될 수 있다. 세포성 반응을 면역하거나 조절하는 다른 유형의 아쥬반트, 예를 들어 MDP(뮤라밀 디펩티드), ISCOM(면역자극제 복합체) 또는 리포좀이 사용될 수 있다.
본 발명은 상이한 감염제에 의해 유발될 수 있는 감염으로부터 동물을 보호하거나 예방할 수 있는 다가 백신을 제공한다. 이들 다가 백신은 상응하는 항원을 암호하는 상이한 서열이 동일한 재조합 벡터에 삽입된 본 발명의 바이러스 벡터로부터, 또는 결합(joint) 접종을 위해 나중에 혼합되는 독립적인 재조합 벡터를 작제함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 이들 다가 백신은 하나 이상의 항원을 암호하는 이종 핵산 서열 하나 이상을 함유하는 바이러스 벡터, 또 다르게는 하나 이상의 상이한 항원을 발현하는 각각의 상이한 바이러스 벡터를 포함한다.
유사하게, 다가 벡터를 포함하는 다가 백신은, 항원을 암호하는 서열 대신에 감염제에 대항하여 보호하는 항체를 암호하는 서열을 사용하여 제조된다.
본 발명의 한가지 특정 실시에 있어서, 다른 돼지, 개 및 고양이의 감염제에대하여 인간, 돼지, 개 및 고양이를 각각 면역화할 수 있는 백신이 제공된다. 이러한 목적을 위하여, 백신 중에 포함된 바이러스 벡터는 전술한 인간, 돼지, 개 또는 고양이의 병원균의 상이한 항원을 발현하여야만 한다.
본 발명의 백신은 재조합 시스템을 부형제 중에서 현탁시킴으로써 제조될 수 있고, 액체 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 상기 시스템이 동결 건조된 형태라면, 부형제 자체는 재구성 물질일 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 의해 제공되는 백신은 이들의 일부를 구성하거나, 부형제로서, 또는 동결건조된 분획으로서의 기타 통상의 백신과 함께 사용되어 기타 통상의 또는 재조합 백신으로 희석될 수 있다.
본 발명의 백신은 동물에게 경구적으로, 비강내로, 피하내로, 경피내로, 복강내로, 근육내로, 또는 에어로졸로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 또는 다양한 감염제에 대항하여 동물, 특히 돼지, 개 및 고양이를 면역화하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 의해 제공된 재조합 시스템의 면역학적으로 유효한 양을 함유하는 백신을 경구적으로, 비강내로, 피하내로, 경피내로, 복강내로, 근육내로 또는 에어로졸로 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 동물을 감염시키는 감염제에 대하여 신생아 동물을 보호하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 임신 기간 전에 또는 임신 기간 똥안 모태에 또는 이들의 자손에게 본 발명에 따라 제공된 것의 백신을 경구, 비강, 피하, 피내, 복강내, 근육내 또는 에어로졸 투여(또는 이들의 조합 투여)하는 것으로 이루어진다.
본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터의 작제 및 감염성 클론을 얻는 것에 대햐여 상세하게 기재하고 있는 하기 실시예에 의해 예시된다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌 예시하는 것으로서 해석되어야 한다. 실시예에서, 세균의 성장과 형질전환, DNA 정제, 서열 분석 및 플라스미드의 안정성을 분석하는 분석법은 후술하는 방법에 따라 수행되었다.
세균의 형질변환
모든 플라스미드를 이 콜리 DH10B 균주(깁코 BRL)내에서 전기영동시켜 전술한 프로토콜(Shizuya et al., 1992)을 약간 변화시켰다. 각각의 형질변환에 있어서, 2 ㎕의 연결(ligation) 및 50 ㎕의 적격 세균을 0.2 cm 디쉬(BioRad)에서 혼합하고, 200,Ω, 2.5 kV 및 25 μF에서 전기영동시켰다. 이어서, SOC 배지 1 ml(Maniatis et al., 1989)를 각각의 형질전환에 첨가하고, 세포를 37℃에서 45분동안 항온처리하였으며, 마지막으로 재조합 콜로니를, 클로람페니콜 12.5 ㎍/ml를 함유한 LB SOC 배지(Maniatis et al., 1989)의 플레이트 상에서 검출하였다.
세균의 성장 조건
TGEV의 불완전한 게놈이 클로닝된 원래의 플라스미드를 함유하는 세균을 37℃에서 성장시켜, 정상적인 성장 동력학을 나타내었다. 반면에, 가능한한 불안정성을 최소화하기 위하여 완전한 cDNA를 함유하는 BAC를 39℃에서 성장시켰다. 이러한 경우라도, 콜로니의 수는 감소되었고, 24시간까지의 항온처리 기간은 정상적인 콜로니 크기를 달성하는 데 필요하였다.
DNA의 정제
우 등(Woo et al., 1994)에 기재된 프로토콜을 약간 변화시켜 사용하였다. 단일 콜로니로부터 클로람페니콜(12.5 ㎍/ml)을 사용하여 4L의 LB를 접종하였다. 30℃에서 18시간동안의 항온처리 후, 6,000 G에서의 원심분리에 의해 세균을 수집하고, 제조사의 권장사항에 따라 퀴아겐 플라스미드 맥시프리페어레이션을 사용하여 정제하였다. 이 과정에 의해, 플라스미드 DNA는 세균 DNA로 오염되었다. 오염된 세균 DNA를 제거하기 위하여, 플라스미드 DNA를 CsCl 구배 상에서 16시간동안 55,000 rpm으로 원심분리함으로써 정제하였다. 얻어진 수율은 플라스미드의 크기에 따라 15 내지 30 ㎍/L였다.
서열 분석
플로오로크롬(fluorochrome)으로 마킹된 디데옥시뉴클레오티드 및 주형 저항성 폴리머라아제(퍼킨 엘머)를 사용하여 자동 서열결정기(373 DNA 서열결정기, 어플라이드 바이오시스템즈)내에서 DNA의 서열을 결정하였다. 시약은 어플라이드 바이오시스템즈 캄파니로부터 키트(ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reation Kit)에 의해 입수하였다. 서열결정 반응을 수행하기 위하여 사용된 써모사이클러는 "GeneAmpPCR System 9600"(퍼킨 엘머)였다.
서열의 결합 및 TGEV의 컨센서스 서열과 이들의 비교는 SeqMan II 및 Align (DNASTAR) 프로그램을 각각 사용하여 수행되었다. 콘센트 서열에 관련된 차이점은 검출되지 않았다.
플라스미드의 안정성
원래 글리세롤레이트로부터, 재조합 pBeloBAC11 플라스미드를 함유하는 세균을 클로람페니콜(12.5 ㎍/ml)을 가진 LB 20 ml에서 30℃ 및 37℃에서 16시간동안 성장시켰다. 이 물질은 0회 통과로서 간주되었다. 이 세균을 105배 희석시키고, 30℃ 및 37℃에서 16시간동안 성장시켰다. 8일간의 연속해서 일련의 통과를 실시하였다(각각의 통과는 약 20 세대를 나타냄). 플라스미드 DNA는 0회 통과 및 8회 통과(160 세대)에서 미니프렙에 의해 정제되었고, 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 분석되었다. TGEV 게놈의 일부를 함유하는 2개의 플라스미드는 매우 안정한 반면에, TGEV의 완전한 게놈을 함유하는 플라스미드는 40 세대(이 시점에서, 약 80%의 DNA가 정확한 제한 패턴을 나타내었음) 이후에 특정한 불안정성을 나타내었다.
발명의 개요
본 발명에 따르면, 상기 문제점은 하기 단계를 포함하는 DNA의 제조 방법에 의해 해결된다:
(a) RNA 바이러스의 게놈 RNA(gRNA)의 완전한 길이 카피(copy)를 포함하는 DNA; 또는
(b) RNA 바이러스의 gRNA의 하나 또는 여러개의 단편을 포함하는 DNA로서, 이것의 단편은 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제 및 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질을 암호하는 것인 DNA; 또는
(c) (a) 및 (b)의 서열과 60% 이상의 상동성을 가진 DNA
를 세균의 인공 염색체(BAC)내로 클로닝하는 단계.
본 발명자들은, 놀랍게도 바이러스 gRNA에서 유래된 큰 DNA 서열을 서브클로닝하고 발현하는 종래 기술의 방법상의 문제점이 클로닝 벡터로서 BAC를 사용하는 경우에 극복될 수 있다는 것을 발견하였다. BAC의 사용은, 이들 벡터가 세포당 1 또는 2 카피로 세균내에 존재한다는 특장점을 가지는데, 이는 플라스미드간 재조합의 가능성을 감소시키고 독성을 상당히 제한한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 바이러스 RNA 또는 비리온의 제조 방법을 제공한다: 즉, DNA가 상기 방법중 어느 하나에 따라 제조되는 단계, DNA가 발현되는 단계, 바이러스 RNA 또는 비리온이 분리되는 단계. 또한, DNA를 제조하는 상기 방법의 단계를 포함하는 약학 제제, 구체적으로 백신을 제조하는 방법이 개시된다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 암호하고, 코로나바이러스의 천연 서열과 60% 이상의 상동성을 가진 코로나바이러스의 게놈 RNA(gRNA)로부터 유래된 서열을 포함하는 DNA가 제공된다. 여기서, 상기 DNA의 단편은 RNA로 전사될 수 있고, 상기 RNA는 비리온으로 어셈블될 수 있다. 본 발명은 또한 각각의 DNA의 제조 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 벡터, 보다 구체적으로는 각각의 핵산을 포함하는 세균의 인공 염색체(BAC)를 제공한다. 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 DNA 또는 RNA를 포함하는 감염성의, 약화되거나 또는 불활성화된 바이러스 및 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 비리온을 포함하는 1가 또는 다가 백신과 같은 약학 제제를 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA가 전사되는 단계, 및 비리온 또는 바이러스 RNA가 회수되는 단계를 포함하는 비리온 또는 바이러스 RNA의 생산 방법 및, 이 방법에 의해 얻어질 수 있는 바이러스 RNA를 제공한다.
TGEV에서 유래된 감염성 cdan 클론계 재조합 벡터의 작제
1.1 TGEV의 감염성 cDNA의 생산
완전한 TGEV 게놈을 암호하는 cDNA를 얻기 위하여, 우리는 불완전한 DI-C 게놈을 암호하는 cDNA를 사용하여 시작하였다(Mendez et al., 1996). TGEV 게놈의 약 1/3 길이를 가진 이 DNA를 낮은 카피 pACNR1180 플라스미드내에서 클로닝하고(Ruggli et al,. 1996), 그 서열을 결정하였다. 불완전한 게놈을 암호하는 cDNA는 상보적인 바이러스의 조력하에 유효하게 구제되었다(복제되고 포장되었다)(Mendez et al., 1996; Izeta et al., 1999).
DI-C 게놈은 각각 ORF 1a, 1b 및 유전자 S 및 7사이에서 약 10, 1 및 8 킬로베이스(Kb)의 3개의 결실부(△1, △2 및 △3)를 나타내었다(도 1 참조).
감염성 TGEV 게놈을 암호하는 cDNA의 서열을 완성하기 위한 다음 기법은 새로 생성된 작제물의 세균독성을 분석하여 DI-C 게놈에서 결실된 서열을 점차적으로 통합시키는 것이었다. 이 점은 매우 중요한데, 그 이유는 RNA의 cDNA를 제공하는 재조합 플라스미드는 일반적으로 성장이 불량하고, 불안정하다는 사실이 과학 논문들에서 널리 알려져 있기 때문이다(Boyer and Haenni, 1994; Rice at al., 1989; Mandl et al., 1997).
완성되어야할 제1 결실부는 안정한 재조합 플라스미드를 생산하는 ORF 1b의 1Kb인 결실부 △2이었다. ORF 1a가 없는 서열은 레플리카아제(replicase)의 유전자에 대하여 필수적인 모든 정보가 완전한 방식으로 cDNA 단편 A, B, C 및 D를 클로닝함으로써 도입되었다(도 1)(Almazna et al., 2000). 얻어진 재조합 플라스미드는 세균 내에서 불안정하였고, 단편 B중의 결실부 및 삽입된 추가부를 가진 새로운 플라스미드를 생산하였다(Almazan et al., 2000). 재미있게도, 뉴클레오티드 4,417 내지 9,615로 이루어진 게놈 부위(Penzes et al., 1999)를 포함하는 5,198 bp ClaI-ClaI 제한 단편을 제거하는 경우에 대장균 DH10B 균주내에서 비교적 안정한 플라스미드가 얻어졌다. 이후, TGEV 게놈의 3' 말단의 구조 및 비구조 단백질에 대한 모든 유전적 정보를 클로닝함으로써 결실부 △3의 서열이 추가되었다(도 1).
TGEV cDNA의 안정성을 증가시키기 위해, pBeloBACll 플라스미드를 사용하여 BAC 내에서 이것을 서브클로닝하는 것이 밝혀졌다(Kim et al., 1992)(도 2 참조). pBeloBACll 플라스미드는 에이치. 시주야 및 엠. 시몬(캘리포니아 인스티튜트 오브테크놀러지)가 발명하였다. 7,507 bp크기의 이 플라스미드는 parB의 F 인자, parC, E. coli(oriS) 및 세포당 플라스미드의 단일 카피를 유지하는 데 필수적인 유전자(parA, 및 repE)를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 선택 마커로서 클로람페니콜(cat)에 대한 내성 유전자를 제공한다. cDNA는 이 프로모터를 사용하여 얻어진 높은 발현 수준(Dubensky et al., 1996) 및 우리의 연구실에서 이전에 얻어진 결과에 기인하여 CMV의 IE 프로모터의 조절하에 클로닝되었는데, 이것은 TGEV에서 유래된 큰(9.7 kb 및 15 kb) 불완전한 게놈은 이들이 합성되는 핵으로부터 세포질로 이동하는 동안에 스플라이싱을 거치지 않는다는 것을 의미하였다(Izeta et al., 1999; Penzes et al., 1999; Almazan et al., 2000). 생성된 TGEV cDNA(pBAC-TcDNA-△ClaI)는 결실된 5,198 bp ClaI 단편을 제외한 레플리카아제의 유전자에 대한 정보와 구조 및 비구조 유전자에 대한 모든 정보를 함유하였다. cDNA의 3'-말단은 24 nt 폴리A 서열, HDV 리보자임 및 BGH의 전사 종결 서열 측면에 위치하였다(Izeta et al., 1999). 한편, TGEV의 완전한 게놈을 생산하기 위해 필수적인 ClaI 단편을 BAC 내에서 클로닝하여, 4,310 내지 9,758의 TGEV 게놈 부위를 함유한 플라스미드 pBAC-B+C+D5'를 생산하였다(도 3 참조). 플라스미드는 둘다 대장균 DH10B내에서 성장시키고, 전체로서(in their entirety) 서열결정하였다. 얻어진 서열은, 뉴클레오티드 6,752(A => G, 사일런트) 및 18,997(T => C, 사일런트), 및 분리물 C11의 D 유전자에 의해 치환된 PUR46-MAD의 S 유전자에 있어서의 변화(이들 변화는 도 4에 제시되어 있음)를 제외하고는, 이 문서의 끝부분에 제공된 TGEV의 PUR46-MAD 분리물의 콘센트 서열(서열 번호 1)과 동일하였다.
또한, 맹독성인 TGEV를 암호하는 cDNA를 생산하기 위하여, 호흡기관(>106PFU/g 조직)에서 높은 수준 및 장관(<103PFU/ml)에서 낮은 수준으로 복제하는 PUR46-MAD 분리물의 S 유전자는 호흡기관(<106PFU/ml) 및 장관(<106PFU/ml) 둘다에서 증가된 역가를 가지고 복제하는 TGEV 클론 11(이하 C11이라 부름)의 S 유전자에 의해 완전히 치환되었다(Sanchez et al., 1999). C11의 S 유전자는 PUR46-MAD 분리물의 S 유전자와 다른 14개의 뉴클레오티드와 함께 S 유전자의 5'-말단에서 6 nt가 삽입되었다(도 4 참조)(Sanchez et al., 1999). 우리의 실험실에서 이전의 결과(Sanchez et al., 1999)는 돌연변이가 지정 재조합에 의해 생산되었고, 여기서 PUR46-MAD 분리물의 S 유전자는, 감염된 돼지의 장관내에서 거의 복제하지 않거나 전혀 복제하지 않는 TGEV의 천연 PUR46-MAD 분리물과 달리, 장 친화성 및 증가된 독성을 획득한 C11 장 분리물의 S 유전자로 치환되었음을 나타내었다.
pBAC-TcDNA-△ClaI플라스미드 내에서 5,198 bp ClaI-ClaI 단편의 클로닝에 의해, pBAC-B+C+D5' 플라스미드에서 얻은 장 분리물 C11의 S 유전자를 사용하여 TGEV의 PUR46-MAD 분리물로부터 cDNA를 작제하여, 완전한 TGEV 게놈을 암호하는 cDNA를 함유하는 pBAC-TcDNA-△ClaI플라스미드를 제조하였다(도 3).
감염성 cDNA의 클론을 작제하는 데 사용된 플라스미드(pBAC-TcDNA-△ClaI및 pBAC-ClaIF) 및 완전한 cDNA를 함유하는 플라스미드(pBAC-TcDNAFL)의 세균내 안정성은 160 세대동안 대장균 내에서 성장시킨 후 분석되었다. 안정성은 정제된 DNA의 제한 효소를 사용한 절단에 의해 분석되었다. pBAC-TcDNA-△ClaI플라스미드 및 pBAC-B+C+D5' 플라스미드의 경우에 사용된 분석 방법에 의해 검출되지 않은 미세한 변화는 배제될 수 없었지만, 결실부 또는 삽입부는 검출되지 않았다. TGEV의 완전한 게놈을 함유하는 pBAC-TcDNA 플라스미드의 경우에, 특정 불안정성은 40 세대 후(이 시점에, DNA의 약 80%가 정확한 제한 패턴을 나타내었음) 검출되었다. 하지만, 이러한 경미한 불안정성은 감염성 바이러스를 구제하는 데 방해물을 의미하지는 않는데, 그 이유는 세균 성장 20 세대(배양액 4 L)는 바이러스를 구제하는 양의 플라스미드 DNA를 생성하기에 충분하기 때문이다.
1.2 완전한 게놈을 암호하는 cDNA로부터 감염성 TGEV의 구제
ST 세포를 pBAC-TcDNAFL플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염후 48시간에서 배양물의 상청액을 수집하고, 6회 ST 세포내로 통과시켰다(도 5 참조). 감염 후 14시간, 2회째 통과부터 시작해서, 세포병적(cytopathic) 효과가 나타났고, 지속되어, 감염후 20시간에서 실질적으로 이들 세포 모두가 단층을 형성하였다(도 6 참조). 반면에, 구제된 바이러스의 역가는 통과와 함께 급속도로 증가되어, 3회째 통과에서는 108PFU/ml의 수치에 달하게 되었다(도 7 참조). 이 실험은 5회 반복되었고, 모든 경우에서 유사한 역가를 가진 감염성 바이러스를 회수하였는데 반해, ClaI-ClaI 단편이 반대 방향에서 발견된 형질감염되지 않는 ST 세포 또는 유사한 플라스미드로 형질감염된 ST 세포의 경우에는 바이러스가 회수되지 않았다.
얻어진 바이러스가 오염의 산물일 가능성을 제거하기 위하여, 주형으로서 구제된 바이러스의 게놈 RNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭시킨 cDNA 단편의 서열결정화에 의해 위치 6,752 및 18,997 부위의 서열을 결정하였다. 서열의 분석은 6,752 및 18,997 부위의 뉴클레오티드가 cDNA내에 존재하는 것인지를 결정하였다. 또한, 구제된 바이러스는, S 유전자의 cDNA에서 20,990 위치에서 제한 부위 DraIII를 나타내었는데, 이것은 C11의 S 유전자에 대하여 예상된 바와 같았다(도 8). 이들 3개의 유전 마커의 존재는 분리된 바이러스가 cDNA에서 유래된 것인가를 확인시켜 주었다.
생성된 바이러스를 보다 깊이있게 규명하는 데 있어서, pBAC-TcDNAFL플라스미드 또는 TGEV의 PUR46-MAD 분리물로 형질감염시킨 세포를 사용한 형질감염 후에 회수된 바이러스(TcDNA)를 사용한 감염 세포의 면역형광법에 의해 비교 분석을 실시하였다. 이를 위하여, C11 분리물 및 PUR46-MAD 분리물 모두, 또는 후자만을 인식하는 특이적인 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 사용하였다(도 10 참조). 얻어진 결과로서 신규한 TcDNA 바이러스에 대하여 예측된 항원성을 확인하였다. TGEV에 특이적인 폴리클로날 항체, S 단백질(ID.B12 및 6A.C3)의 예상되는 특이적인 모노클로날, 및 M(3B.B3) 및 N(3B.D8) 단백질의 특이적인 모노클로날은 TcDNA 및 PUR46-MAD 모두를 인식하였다. 얻어진 데이타는, 원래 cDNA에서 설계된 바와 같이 생성된 바이러스가 PUR46-MAD 분리물의 M 및 N 분리물 및 C11 분리물의 S 단백질을 제공한다는 것을 의미하였다.
1.3 생체내 감염성 및 맹독성
TcDNA 바이러스의 생체내 감염성을 분석하기 위하여, 5마리의 갓 태어난 돼지 군을 6번째 통과로부터 클로닝된 바이러스로 접종하고, 사망율을 분석하였다. 5마리의 접종 돼지는 접종 후 3일에서 4일 사이에 죽었는데, 이것은 TcDNA가 맹독성임을 의미하였다. 대조적으로, 바이러스의 부형제만으로 접종하고 동일한 조건하에서 유지시킨 2마리의 돼지는 변함이 없었다.
1.4 전사-조절 서열의 개질에 의한 발현 수준의 최적화
코로나바이러스내의 RNA 합성은 RNA-의존적 처리(여기서, mRNA는 음극성을 가진 주형으로부터 전사됨)에 의해 일어날 수 있다. TGEV에서, 보존된 컨센서스 서열, CUAAAC는 대부분의 유전자의 바로 앞에 위치하는 것으로 나타났다. 이들 서열은 서브게놈 mran의 전사를 위한 시그날을 의미한다. 코로나바이러스에는, 숙주 및 코로나바이러스의 유형에 따라 달라지는, 가변 크기를 가진 6개 내지 8개 유형의 mRNA가 있다. 가장 큰 것은 게놈 RNA에 해당하는데, 이것은 순차적으로 ORF 1a 및 1b에 대한 mran로서 작용한다. mRNA의 나머지는 서브게놈 mRNA에 해당한다. 이들 RNA는 감소하는 크기 순으로 1 내지 7로 명명된다. 반면에, 처음에 기술된 일조의 mRNA 이후에 발견된 일부 mRNA는 해당 mRNA의 명칭, 데쉬 및 숫자, 예를 들어 mRNA 2-1로서 명명되었다. mRNA는 게놈 RNA의 구조와 관련된 공말단(coterminal) 구조를 제시한다. 가장 작은 mRNA를 제외하고, 나머지는 구조적으로 폴리시스트론성이지만, 일반적으로는 5'에 가장 근접하여 위치한 ORF만이 번역된다.
마커 유전자(GUS) 발현의 유효성은, 최소 유전자간(IG) 서열 CUAAAC의 5' 말단 측면의 다른 서열(도 11), IG 서열의 3' 말단의 측면에 위치한 다른 서열(도 12), 및 다양한 삽입 부위(도 13)를 사용하여 연구되어 왔다. 얻어진 결과(도 11 내지 13)는, 최적의 발현은 (i) TGEV의 N 유전자에 대한 콘센트 서열의 측면에 위치한 -88 nt; (ii) IG 서열; 및 (iii) S 유전자의 IG 서열의 3'-측면 서열로 이루어진 TRS를 사용하여 달성될 수 있음을 보여주었다. 또한, 이종 유전자의 삽입시점과의 관계에서 얻어진 결과에 따라, 최대 발현 수준은 이종 유전자가 게놈의 3'-말단에 존재하였을 때 달성되었다. 기재된 것과 같은 TRS는 GUS가 106세포수 당 2 내지 8 ㎍의 수준으로 발현되게 한다.
1.5 발현 시스템의 조직 특이성
다수의 병원균은 점막을 통해 숙주에 침투한다. 이러한 유형의 감염을 방지하기 위하여, 고도의 분비 면역을 일으키게 하는 발현 시스템을 개발하는 것이 중요하다. 이는 호흡기관 및 장관과 연관된 림프절에서 항원의 투여를 통해 근본적으로 획득할 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 일반적으로 목적하는 조직에서 유전자 발현을 지시하기 위하여, TGEV의 친화성의 분자적 기초가 연구되어 왔다. 이들 연구는, TGEV의 조직 특이성은 목적하는 친화성을 가진 코로나바이러스의 S 유전자를 함유하는 재조합 바이러스의 작제에 의해 개질될 수 있다는 것을 보여주었다(Ballesteros et al., 1997; Sanchez et al., 1999). 이 정보는 호흡기 또는 장 친화성을 가진 코로나바이러스의 cDNA 게놈에 기초한 발현 시스템을 작제하는 것을 가능하게 한다.
1.6 감염 cDNA를 사용하여 PRRSV의 ORFS에 의해 암호되는 바이러스 항원의 발현
이종 유전자의 발현 수준을 최적화하기 위하여, 벡터내에 이종 유전자와 TRS의 교환을 촉진하는 클로닝 서열의 측면에 위치한 상호교환가능한 모듈의 벡터로부터 작제물을 제조하였다. 5' 말단에서 바이러스 뉴클레오티드(N)의 유전자 측면에 위치한 -88 nt 이후의 최소 IGS 컨센서스 서열(CUAAAC)의, 및 3'- 말단에서 제한 부위 SalI(GTCGAC)의 측면에 위치한 PRRSV(돼지의 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스)의 ORF 5, 및 코작 (AC)GACC와 유사한 서열을 포함하는 작제물은 최적 발현을 나타내었다(약 10 ㎍/106세포수). 원칙적으로, 이종 유전자의 이러한 발현 수준은 면역 반응을 일으키기에 충분한 것 이상이다. 이종 유전자는 바이러스의 유전자 3a 및 3b가 이미 점유하고 있는 부위로 삽입되었는데, 이것은 분산가능하다.
1.7 돼지에서 cDNA에서 유래된 바이러스 벡터로 교환된 항원에 대한 면역 반응의 유도
전술한 TRS 및 cDNA로부터 유래된 동일한 유형의 바이러스 벡터를 사용하여, 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호하는 유전자를 높은 수준으로 발현하였다(돼지의 정소, ST, 세포들에서 세포 100만개당 단백질 20 ㎍). 발현 수준은 세포 배양에서 20회 이상의 통과에서 안정하였다. 또한, 일조의 돼지를 생바이러스 벡터로 경구, 비강내 및 위내 경로를 통해 투여함으로써 면역화하였고, 강력학 체액성 면역 반응이 바이러스 벡터 및 GFP에 대하여 검출되었다. 재미있게도, 바이러스 벡터의 3회의투여량 투여후 접종된 동물에서 어떤 2차적인 효과도 관찰되지 않았다.
1.8 감염성 바이러스를 생산하지 않으면서 외부 유전자를 발현하는 안전한 바이러스 벡터의 작제
인간을 위한 벡터를 설계하기 위하여, 생물학적 안전성이 우선되었다. 이 목적을 달성하기 위하여, 3가지 유형의 안전성 가드(guard)가 벡터내에서 조작된다. 이들 중 2개는, 바이러스 복제에 필수적인, 바이러스 게놈의 상이한 부위를 맵핑하는 2가지 바이러스 성분의 결실의 기인한 것이다. 이들 성분은 패키징(packaging) 세포주에 의해 트랜스로 제공된다. 이 세포(Baby Hamster Kidney, BHK)는 바이러스의 필수적인 구조 단백질(엔벨로프 E 및 막 M 단백질)을 암호하는 결손된 TGEV 유전자를 발현한다. 3번째 안전성 가드는 바이러스 게놈의 패키징 시그날의 재위치화인데, 이것은 재조합에 의한 감염 바이러스의 회수가 방지되어 이종 유전자를 유효하게 발현하지만 심지어 가장 이웃하는 세포에조차 증식될 수 없는 자살(suicide) 벡터를 생성시킨다.
인간에서 사용하기 위한 신규한 벡터의 설계에 있어서, 우리는 인간 종내에서 증식될 수 있는 신규의 바이러스를 생산하지 못하는데, 그 이유는 이 벡터가 인간에서는 세포에서 세포로 전달될 수 없기 때문이다. 벡터는 복제능이 결여된 바이러스계이다. 바이러스의 결실을 보충하는 패키징 세포를 사용함으로써 이것은 백신 공장(factory)에서 성장될 수 있다. 이들 안전성 가드는 코로나바이러스의 공학에서 신규한 처리과정을 나타낸다. 신규한 친화성을 가진 재조합 바이러스는 적어도 고양이 세포중에서 복제 적격일 것인데, 그 이유는 이들 세포는 인간, 돼지, 개 및고양이 코로나바이러스를 복제하기 때문이다.
미생물의 기탁:
대장균 pBAC-TcDNAFL로서 동정된, 본 발명의 감염 클론을 가진 플라스미드를 운반하는, 대장균에서 유래된 세균은 1999년 11월 24일 부르자소트(발렌시아)의 스페인 기준배양물 수집소(Spanish Collection of Type Cultures, CECT)에 등록 번호 CECT 5265로 기탁되었다.
참고 문헌 목록

Claims (74)

  1. (a) RNA 바이러스의 게놈 RNA(gRNA)의 완전한 길이 카피(copy)를 포함하는 DNA; 또는
    (b) RNA 바이러스의 gRNA 단편을 하나 또는 여러개 포함하는 DNA로서, 이 단편은 RNA 의존적 RNA 폴리머라아제 및 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질을 암호하는 것인 DNA; 또는
    (c) (a) 또는 (b)의 서열과 60% 이상의 상동성을 가진 DNA
    를 세균 인공 염색체(BAC)내로 클로닝하는 단계를 포함하는 DNA의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 BAC내로 클로닝된 DNA는 바이러스의 구조 또는 비구조 단백질 중 하나를 제외한 모두 또는 일부를 암호하는 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 BAC내로 클로닝된 DNA는 하나 또는 여러개의 이종 유전자를 암호하는 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이종 유전자는 감염제(infectious agent)에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 하나 이상의 항원, 감염제의 복제를 방해하는 하나 이상의 분자, 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체, 면역 조절제, 사이토킨, 면역증강제 또는 항염증성 화합물을 암호하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAC내로 클로닝된 DNA는 5 Kb 이상의 크기를 가지는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAC내로 클로닝된 DNA는 15 Kb 이상의 크기를 가지는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAC내로 클로닝된 DNA는 25 Kb 이상의 크기를 가지는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAC는 이것내로 클로닝된 DNA의 전사 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 유전자 중 하나는 뉴클레오티드 첨가, 결실 또는 치환에 의해 개질된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스의 친화성(tropism) 조절 유전자가 개질된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스의 친화성 조절 유전자는 다른 바이러스의 각각의 유전자로 치환된 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAC내로 클로닝된 DNA는, 비리온에 어셈블될 수 있는 RNA로 전사될 수 있는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비리온은 감염성이거나, 약화되었거나, 복제능이 결여되었거나, 또는 불활성화된 바이러스인 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 천연적으로 플러스(plus) 쇄 게놈을 가지는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 피코나바이러스, 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 토로바이러스, 아르테리부르스, 칼시바이러스, 라브도바이러스, 파라믹소바이러스, 필로바이러스, 보나바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 또는 레오바이러스인 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 DNA를 제조하는 단계, 상기 DNA를적합한 숙주 세포내에서 발현시키거나, 또는 상기 DNA를 전사시키는 조건하에서 이 DNA를 화학적 시약, 생물학적 시약 및/또는 세포 추출물과 혼합하는 단계, 및 바이러스 RNA를 분리하는 단계를 포함하는 바이러스 RNA의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 DNA를 제조하는 단계, 상기 DNA를 적합한 숙주 세포내에서 발현시키거나, 또는 상기 DNA를 전사 및 번역시키는 조건하에서 이 DNA를 화학적 시약, 생물학적 시약 및/또는 세포 추출물과 혼합하는 단계, 및 비리온을 분리하는 단계를 포함하는 비리온의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 비리온은 차후에 불활성화되거나 사멸되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 DNA를 제조하는 단계, 제16항에 따라 바이러스 RNA를 제조하거나, 또는 제17항 또는 제18항에 따라 비리온을 제조하는 단계, 그리고 이어서 상기 바이러스 RNA 또는 비리온을 약학적 허용 아쥬반트 또는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 약학 조성물은 감염성 질병에 대하여 동물 또는 인간을 보호하는 백신인 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 약학 조성물은 동물 또는 인간의 유전자 요법을 위하여 사용되는 것인 방법.
  22. 바이러스의 천연 서열과 60% 이상의 상동성을 가지며, RNA 의존적 RNA 폴리머라아제 및 하나 이상의 구조 또는 비구조 단백질을 암호하는 코로나바이러스의 게놈 RNA(gRNA)로부터 유래된 서열을 포함하는 DNA로서, 상기 DNA 단편은 비리온으로 어셈블될 수 있는 RNA로 전사될 수 있는 것인 DNA.
  23. 제22항에 있어서, 이종 유전자를 암호하는 서열을 추가로 포함하는 것인 DNA.
  24. 제23항에 있어서, 상기 이종 유전자는 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 하나 이상의 항원, 감염제의 복제를 방해하는 하나 이상의 분자, 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체, 면역 조절제, 사이토킨, 면역증강제 또는 항염증성 화합물을 암호하는 것인 DNA.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편은 약 25 Kb 이상의 크기를 가지는 것인 DNA.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스의 구조 또는 비구조단백질 중 하나를 제외한 모두 또는 일부를 암호하는 코로나바이러스에서 유래된 서열을 추가로 포함하는 DNA.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스의 구조 또는 비구조 단백질 모두를 암호하는 코로나바이러스에서 유래된 서열을 추가로 포함하는 것인 DNA.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 gRNA의 전사 조절 서열을 추가로 포함하는 것인 DNA.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 gRNA의 전자 조절 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV)의 직전(immediately early; IE) 프로모터인 것인 DNA.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열은 3'-말단에서 폴리(A) 꼬리, 간염 δ바이러스(HDV)의 리보자임, 및 소 성장 호르몬(BGH)의 종결 및 폴리아데닐화 서열의 측면에 위치하는 것인 DNA.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 한에 있어서, 상기 바이러스 서열은 뮤린 간염 바이러스(MHV), 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 소의 코로나바이러스(BoCV),개의 코로나바이러스(CCoV), 고양이 바이러스(FCoV), 인간 코로나바이러스(HCoV), 토로바이러스류, 아르테리부르스류 또는 돼지의 전염성 위장염 바이러스(TGEV) 분리물에서 유래되는 것인 DNA.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비리온은 감염성, 비감염성 또는 복제능이 결여된 바이러스인 것인 DNA.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스에서 유래된 상기 구조 또는 비구조 단백질은 천연 유전자 서열의 하나 또는 여러개 뉴클레오티드를 첨가, 결실 또는 치환시킴으로써 개질된 것인 DNA.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S, N 또는 M 유전자의 서열은 개질된 것인 DNA.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스에서 유래된 S 유전자의 서열은 약화된 비리온을 얻기 위해 개질된 것인 DNA.
  36. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나바이러스에서 유래된 S 유전자의 서열은 코로나바이러스의 친화성과 상이한 친화성을 가진 비리온을 얻기 위해 개질된 것인 DNA.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 세균 인공 염색체(BAC)인 것인 벡터.
  39. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  40. 스페인 기준배양물 수집소(Spanish Collection of Type Cultures)에 CECT 5265로 기탁된 대장균.
  41. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 DNA를 숙주 세포내로 도입하는 단계, 상기 DNA의 발현을 허용하는 조건하에서 이 DNA를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 재조합 비리온 또는 바이러스 RNA를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 비리온 또는 재조합 바이러스 RNA의 제조 방법.
  42. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 DNA를 이것의 전사를 허용하는 조건하에서 화학적 시약, 생물학적 시약 및/또는 세포 추출물과 혼합하는 단계, 및 재조합 비리온 또는 바이러스 RNA를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 비리온 또는 재조합 바이러스 RNA의 제조 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 DNA는 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항의 DNA인 것인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조될 수 있는 비리온.
  45. 제44항에 있어서, 상기 비리온은 감염성이거나, 약화되었거나, 복제능이 결여되었거나, 또는 불활성화된 바이러스인 것인 비리온.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 비리온은 개질된 S, M 또는 N 유전자를 포함하는 것인 비리온.
  47. 제46항에 있어서, 상기 S 유전자의 개질로 인해 약화된 바이러스가 생산되는 것인 비리온.
  48. 제46항에 있어서, 상기 S 유전자의 개질로 인해 변화된 친화성을 가진 비리온이 생산되는 것인 비리온.
  49. 제41항 내지 제43항에 따른 방법에 의해 제조될 수 있는 바이러스 RNA.
  50. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제39항 또는 제40항에 따른 숙주 세포, 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 비리온 또는 제49항에 따른 바이러스 RNA를 포함하는 약학 제제.
  51. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제39항 또는 제40항에 따른 숙주 세포, 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 비리온 또는 제49항에 따른 바이러스 RNA를 포함하는, 감염제에 의해 유발되는 질병에 대하여 인간 또는 동물을 보호할 수 있는 백신.
  52. 제51항에 있어서, 상기 핵산은 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 하나 이상의 항원, 상기 감염제의 복제를 방해하는 하나 이상의 유전자, 또는 상기 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체를 암호하는 서열을 포함하는 것인 백신.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 비리온 벡터는 하나 이상의 복제 방해 분자, 또는 호흡기 또는 장 점막 또는 기타 조직에서 증식하는 상이한 감염제에 대하여 점막 내 면역 반응 및/또는 전신 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 발현하는 것인 백신.
  54. 하나 이상의 감염제에 의해 유발된 감염에 대하여 인간 또는 동물을 보호할수 있는 다가 백신으로서, 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산, 제39항 또는 제40항에 따른 숙주 세포, 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 비리온 또는 제49항에 따른 바이러스 RNA를 포함하며, 이들 각각은 상기 감염제 각각에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 항원, 방해 분자 또는 상기 감염제 각각에 대한 보호를 제공하는 항체를 발현하는 것인 다가 백신.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 허용 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 백신.
  56. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 DNA의 제조 방법으로서, 코로나바이러스에서 유래된, 방해능이 결여된 게놈을 프로모터의 발현하에 BAC 벡터내로 클로닝하고, 상기 게놈 내에서 결실된 서열을 재삽입하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 바이러스 게놈내에서 독성 서열이 DNA로의 재삽입 전에 동정되는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 바이러스 게놈내의 독성 서열은 게놈을 완성할 때 재삽입되어야 할 마지막 서열인 것인 방법,
  59. 전사 조절 서열하에서 클로닝된, 코로나바이러스의 게놈 RNA(gRNA)에 상보적인 DNA(cDNA)의 완전한 길이 카피를 포함하는 코로나바이러스에서 유래된 감염성 클론.
  60. 제59항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 돼지의 전염성 위장염 바이러스(TGEVTGEV분리물인 것인 감염성 클론.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV)의 직전(IE) 발현 프로모터인 것인 감염성 클론.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완전한 길이의 cDNA는 3' 말단에서 폴리(A) 꼬리, 간염 델타 바이러스(HDV)의 리보자임 및 소 성장 호르몬(BGH)의 종결 및 폴리아데닐화 서열의 측면에 위치하는 것인 감염성 클론.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염성 cDNA는 세균 인공 염색체(BAC)내에서 클로닝되는 것인 감염성 클론.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 감염성 클론의 획득 방법으로서, 코로나바이러스의 gRNA로부터 완전한 길이의 cDNA를 작제하고, 전사 조절 요소들을 어셈블하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 코로나바이러스 gRNA의 완전한 길이 cDNA의 작제가 (i) BAC내에서 발현 프로모터 하에 상기 코로나바이러스로부터 유래된 방해능이 결여된 게놈을 클로닝하는 단계; (ii) 상기 방해능이 결여된 게놈의 결실을 완성시키고, 감염성 gRNA에 있어서 결실된 서열을 재생시키는 단계; (iii) 클로닝될 세균에 대한 독성 서열을 동정하고, 독성 서열을 제거하고, 진핵 세포의 형질감염을 수행하기 직전에 상기 독성 서열을 삽입하여, 코로나바이러스의 gRNA에 상응하는 cDNA 클론을 얻는 단계를 포함하는 것인 방법.
  66. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따르거나, 또는 제58항 또는 제59항의 방법에 따라 제조될 수 있는 감염성 클론을 포함하는 재조합 바이러스 벡터로서, 이종 핵산이 발현될 수 있는 조건하에서 상기 감염성 클론내로 삽입된 이종 핵산을 함유하도록 개질된 것인 재조합 바이러스 벡터.
  67. 제60항에 있어서, 상기 이종 핵산은 목적하는 유전자 산물을 암호하는 유전자 및 유전자 단편에서 선택되는 것인 벡터.
  68. 이종 핵산이 발현되고, 목적하는 산물이 회수될 수 있는 조건하에서 제60항 또는 제61항에 따른 바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적하는 산물의 제조 방법.
  69. 제60항 또는 제61항에 따른 바이러스 벡터를 숙주 내에 도입하는 단계, 바이러스 벡터가 발현 및 복제될 수 있는 조건하에서 상기 바이러스 벡터를 함유하는 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 개질된 재조합 코로나바이러스에서 얻어진 상기 비리온을 회수하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 게놈에 상응하는 cDNA의 서열 중에 이종 핵산을 함유하는 개질된 재조합 코로나바이러스의 제조 방법.
  70. (i) 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 하나 이상의 항원, 또는 상기 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체를 발현하는 제60항 또는 제61항에 따른 하나 이상의 바이러스 벡터와, 선택적으로 (ii) 약학적 허용 부형제를 포함하는, 감염제에 의해 유발된 감염에 대하여 동물을 보호할 수 있는 백신.
  71. 제64항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 호흡기 또는 장 점막에서 증식하는 상이한 감염제에 대하여 점막내 면역 반응 및/또는 전신 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 항원을 발현하는 것인 백신.
  72. 하나 이상의 감염제에 의해 유발되는 감염증에 대하여 동물을 보호할 수 있는 다가 백신으로서, (i) 상기 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 항원 또는 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체를 발현하는 제60항 또는 제61항에 따른 바이러스 벡터와, 선택적으로 (ii) 약학적 허용 부형제를 포함하는 것인 다가 백신.
  73. 하나 이상의 감염제에 의해 유발되는 감염증에 대하여 동물울 보호할 수 있는 다가 백신으로서, (i) 각각 상기 감염제에 대한 면역 반응을 일으키기에 적합한 항원 또는 감염제에 대한 보호를 제공하는 항체를 발현하는 제60항 또는 제61항에 따른 하나 이상의 바이러스 벡터와, 선택적으로 (ii) 약학적 허용 부형제를 포함하는 것인 다가 백신.
  74. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따르거나, 또는 제64항 또는 제65항의 방법에 따라 제조될 수 있는 감염성 클론을 숙주 세포내로 도입하는 단계, 상기 감염성 클론이 발현 및 복제될 수 있는 조건하에서 감염성 클론을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 코로나바이러스의 완전한 게놈을 함유하는 재조합 코로나바이러스에서 얻어진 비리온을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 코로나바이러스의 제조 방법.
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