BR112020013245A2

BR112020013245A2 - sistema hospedeiro/vetor otimizado para a produção de vacinas de subunidades mono- e multivalentes protetoras à base da levedura kluyveromyces lactis

Info

Publication number: BR112020013245A2
Application number: BR112020013245-4A
Authority: BR
Inventors: Hans Caspar Hührlimann; Martina Behrens; Mandy Gebauer; Karin Breunig; Sven-Erik Behrens
Original assignee: Verovaccines Gmbh
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-12-01
Also published as: CN111801422A; US20240102031A1; US20210230612A1; EA202091435A1; EP3732293A2; US11905517B2; CN111801422B; DE102017012109A1; WO2019129321A3; KR102704217B1; WO2019129321A2; JP2021508496A; DE112018006647A5; KR20200104367A; JP2023166412A; EP3732293B1; CA3086598A1; MX2020006846A; ZA202003553B; DK3732293T3

Abstract

A presente invenção refere-se a leveduras de Kluyveromyces lactis (K. lactis) recombinantes, que são capazes para a expressão altamente eficiente de uma ou mais proteínas estranhas e são adequadas para o uso como vacina para a geração de uma resposta imune protetora contra patógenos. A invenção fornece, em particular, cepas de K. lactis para a clonagem direcionada de ácidos nucleicos codificadores de antígenos estranhos no genoma da levedura da cepa de K. lactis, que é caracterizada pelo fato de que a cepa K. lactis, de forma alternativa ou adicional ao locus KILAC4 no locus KIURA3-20 (KLLA0E22771g) e/ou no locus KIMET5-l (KLLA0B3938g), apresenta cassetes de expressão integrados para antígenos estranhos. A invenção refere-se, além disso, a vetores de expressão integrativos e a processos para a produção das cepas K. lactis da invenção, assim como seu uso como vacinas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMA HOSPEDEIRO/VETOR OTIMIZADO PARA A PRODUÇÃO DE VACINAS DE SUBUNIDADES MONO- E MULTIVALENTES

PROTETORAS À BASE DA LEVEDURA KLUYVEROMYCES LACTIS". Campo da Invenção

[0001] Ainvenção refere-se a leveduras de Kluyveromyces lactis (K. lactis) recombinantes, que são capazes para a expressão altamente eficiente de uma ou mais proteínas estranhas e para o uso como vacina para a geração de uma resposta imune protetora contra patógenos. A invenção fornece, em particular, cepas K. lactis para a clonagem direcionada de ácidos nucleicos codificadores de antígenos estranhos no genoma da levedura da cepa K. lactis, que é caracterizada pelo fato de que a cepa K. lactis, de forma alternativa ou adicional, ao locus Kilac4 no locus KIURA3-20 (KLLAOE22771g9) elou no locus KIMETS-I (KLLAOB2928g), apresenta cassetes de expressão integrados para antígenos estranhos. A invenção se refere, além disso, a vetores de expressão integrativos e a processos para a produção das cepas K. lactis da invenção, assim como seu uso como vacinas. Antecedentes da Invenção

[0002] As vacinas são usadas para prevenir doenças (vacinas preventivas) ou para tratar doenças estabelecidas (vacinas imunoterapêuticas) Os programas de vacinação preventiva contribuíram nos últimos cerca de 100 anos essencialmente para a redução de doenças infecciosas. As vacinas imunoterapêuticas são desenvolvidas e usadas apenas há cerca de 20 anos, por exemplo, contra infecções persistentes com vírus, bactérias ou parasitas ou contra doenças carcinogênicas. O objetivo da vacinação é a indução de uma resposta imune celular (isto é, essencialmente mediada pela célula T e célula NK) e/ou humoral (isto é, essencialmente mediada por anticorpos da célula B), assim como de uma memória imunológica (“memory”) contra componentes antigênicos de patógenos ou células malignas (tumorais).

[0003] As vacinas clássicas contêm todo o patógeno em forma atenuada (inativada) ou morta, inclusive seu material genético, isto é, ácidos nucleicos em forma de DNA ou RNA. Essas vacinas clássicas necessitam, para a produção, na maioria das vezes precauções de segurança particulares e/ou o uso de organismos infectantes e/ou de culturas celulares; além disso, essas vacinas devem ser armazenadas e transportadas muitas vezes de forma dispendiosa e usando cadeias de refrigeração. Além do mais, o uso de vacinas clássicas acarreta o risco, de que substâncias a partir da produção (por exemplo, a partir do animal de laboratório ou da cultura celular) produzem efeitos colaterais no indivíduo vacinado ou que ocorrem reativações indesejadas do patógeno. Os problemas existem também no diagnóstico: assim, por exemplo, no caso da vacinação de animais úteis, os animais vacinados com patógenos completos não podem ser distinguidos de animais naturalmente infectados, de modo que não podem ser usados sistemas de alerta precoce, que se baseiam na detecção de novas infecções. Por conseguinte, foram desenvolvidas “vacinas de subunidade”, que vacinam apenas com componentes definidos do patógeno. A condição prévia para seu uso é que sejam conhecidos “antígenos principais" do respectivo agente patogênico. Os antígenos principais são, na maioria das vezes, componentes superficiais do patógeno, que podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico, por exemplo, proteínas de um envelope viral ou de uma cápside viral. Esses antígenos principais, também na ausência de uma partícula viral completa, podem induzir uma resposta imune humoral e/ou celular e uma memória imunológica no hospedeiro contra o vírus. Visto que na “vacinação de subunidade” faltam outros componentes do patógeno, os indivíduos vacinados podem ser distinguidos de indivíduos naturalmente infectados através de um diagnóstico diferencial (Differentiating Infected from Vaccinated Animals (DIVA)); de modo correspondente, fala-se também de uma vacina com marcador de subunidade”. As desvantagens de muitas vacinas de subunidades são uma produção muitas vezes dispendiosa e uma imunogenicidade muitas vezes insuficiente: enquanto os próprios agentes patogênicos podem ser cultivados de forma eficiente (com as limitações acima citadas), seus antígenos principais devem ser produzidos geneticamente através de processos de custos intensos e na maioria das vezes ineficientes e purificados de forma dispendiosa. No caso das vacinas de subunidades assim obtidas, trata-se de forma correspondente de material biológico, que tem uma baixa durabilidade e muitas vezes deve ser armazenado e transportado refrigerado. Por esses motivos, uma grande parte das vacinas em massa, no caso de animais úteis, baseia-se ainda no princípio clássico, de usar o agente patogênico completo.

[0004] A doença aviária bursite infecciosa (IBD) amplamente propagada é causada, por exemplo, pelo vírus da bursite infecciosa (IBDV), um vírus não envelopado com um genoma de RNA segmentado, de filamento duplo da família Birnaviridae. A maioria das vacinas contra IBD são à base de vírus atenuado (enfraquecido) ou inativado. Aqui, contudo, apresenta-se o problema, de que os “vírus vivos” muito atenuados e não inativados e também os vírus inativados oferecem, de fato, proteção contra vírus IBD meio patogênicos, no entanto, este não é o caso das cepas de vírus IBD altamente virulentos (very virulent) (vvIBDV). Até há pouco tempo, os vírus atenuados, muito virulentos (intermediate hot strains) eram protetores contra vvIBDV — essas cepas de vacina, no entanto, têm efeitos colaterais na forma, de que pode ocorrer uma imunossupressão através de danos transientes das células B na Bursa fabricii, um órgão linfático (Rautenschlein et al

(2005)). Contra cepas vIBDV recentemente descobertas, no entanto, também essas vacinas intermediate hot não oferecem qualquer proteção total (Negash et al (2012); Kasanga et al (2007). Um problema da vacinação com vírus vivos muito atenuados é, além disso, que os anticorpos maternais impedem a replicação do vírus e, com isso, a indução de uma resposta imune. Uma vacinação eficaz com essas vacinas, por conseguinte, é possível somente três semanas após a eclosão (Kumar et al (2000); Rautenschlein et al (2005)).

[0005] Os vírus da Influenza-A pertencem, por exemplo, aos patógenos de vírus mundialmente mais importantes (Short et al (2015); Silva et al (2012). Os vírus da Influenza pertencem à família dos Orthomyxoviridae; são vírus envelopados com RNA segmentado, de filamento único como genoma. Tal com a maioria dos vírus de RNA, os vírus da Influenza também estão sujeitos a uma alta taxa de mutação. Em particular, através da reclassificação de segmentos de RNA virais, surgem descendentes de vírus com novas propriedades genéticas e biológicas (Short et al (2015)) Devido à rápida evolução, nas vacinações contra vírus da Influenza, apresenta-se, em particular, o problema, de que as vacinas existentes não “pegam” nas variantes de vírus recentemente surgidas. Consequentemente, há muito tempo já se tenta desenvolver vacinas, que apresentem uma proteção cruzada e, com isso, também a longo prazo contra diversas variantes de Influenza (Steel et al (2010); Krammer and Palese (2013); Kirchenbaum and Ross (2014); Berthoud et a/ (2011).

[0006] O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um patógeno largamente propagado de artiodátilos. No caso da BVDV trata-se de um membro do gênero Pestivirus da família Flaviviridae. O genoma de RNA de filamento único desses vírus está sujeito, do mesmo modo, a uma alta taxa de mutação. Além disso, nos animais prenhes pode ocorrer uma infecção do feto e devido à tolerância imunológica, nascem, então,

animais persistentemente infectados (PI). Esses animais PI continuam a propagar o vírus e pela mutação do vírus 100% podem morrer da chamada mucosal disease. Também aqui já se tenta há muito tempo desenvolver vacinas, que apresentem uma proteção cruzada e a longo prazo contra diversas variantes do vírus BVD (Ridpath (2015)).

[0007] Vacinas de subunidades eficazes podem abordar ou resolver esses problemas. As subunidades, na maioria dos casos, são componentes de proteínas de agentes patogênicos; esses podem ser produzidos geneticamente em diversas células hospedeiras. Além da bactéria intestinal Escherichia coli, células de mamíferos ou células de insetos, que podem se multiplicar em culturas celulares, células de plantas e diversos fungos, são estabelecidos como sistemas hospedeiros para a expressão heteróloga de proteínas. Sistemas microbianos, tais como bactérias e fungos, podem ser cultivados de modo particularmente econômico em grande escala.

[0008] Células de levedura dos gêneros de levedura Saccharomyces, Pichia e Kuyveromyces já são usadas há décadas de modo rotineiro para a expressão de proteínas estranhas. As células de levedura têm, em comparação com as bactérias, a vantagem, de que se trata de eucariotos, isto é, em muitos aspectos elas são iguais às células animais e proteínas eucarióticas, isto é, proteínas, que são formadas em células animais e/ou devem ser funcionais, podem ser produzidas economicamente nas leveduras em forma nativa ou quase nativa (Bathurst (1994); Gellissen & Hollenberg (1997)). Inicialmente, as leveduras foram usadas apenas para produzir as proteínas estranhas; após a expressão, as proteínas foram purificadas a partir das células de levedura e usadas como vacinas de subunidades. Somente há pouco tempo, tenta-se administrar apenas as leveduras ou frações de células de leveduras como vacinas. “Vacinas à base de leveduras” são respectivamente partículas de leveduras, que contêm componentes imunologicamente eficazes de agentes patogênicos (antígenos) e que, após aplicação (por exemplo, subcutânea, intramuscular ou oral/mucosal), podem produzir no organismo hospedeiro uma resposta imune específica contra esses antígenos e, com isso, também contra o patógeno, a partir do qual se originam esses antígenos. No caso desejado, uma “memory” imunológica é induzida nos organismos hospedeiros que, no caso de uma subsequente infecção (“challenge”), impede a reprodução e/ou propagação dos agentes patogênicos correspondentes e/ou atenua os efeitos patológicos da infecção. Tal como já foi abordado acima, os antígenos são, na maioria das vezes, proteínas estruturais do agente patogênico, cujas sequências codificadoras de ácido nucleico (gene codificador de antígenos) são introduzidas em células de levedura com métodos genéticos e permitem a expressão de uma ou várias dessas proteínas estruturais. As leveduras recombinantes assim produzidas em forma viva (células de levedura), depois da morte e secagem em forma de pó (partículas de levedura) ou depois da desintegração celular e homogeneização (lisado de leveduras), representam vacinas à base de levedura. Após a aplicação das vacinas, os antígenos são reconhecidos pelo sistema imune e provocam uma defesa imune humoral e/ou celular.

[0009] A vacinação à base de levedura é conhecida pelo especialista a partir do estado da técnica. Uma série de pedidos de patentes e patentes norte-americanas, assim, por exemplo, US 20090304741 A1, US 5830463 A, US 7465454 B2 e US 20070166323 A1, descrevem o uso de cepas de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), que contêm pelo menos um antígeno recombinante, na imunoterapia. Foi mostrado, que essas leveduras são eficazes para estimular uma reação imune, em particular, uma reação imune mediada por células.

[0010] O documento WO 2006044923 publica leveduras (S.

cerevisiae), que exprime diversas proteínas do vírus da hepatite C (HCV) de forma recombinante e que pode provocar uma reação imune, principalmente uma resposta da célula T, contra essas proteínas da HCV e que deve ser usada como vacina contra a hepatite C crônica.

[0011] O documento WO 2007092792 descreve o possível uso de leveduras de S. cerevisiae recombinantes contra infecções do vírus da Influenza, sendo utilizada uma combinação de diversas cepas de leveduras, cuja aplicação leva a uma indução da célula T, portanto, a uma resposta imune celular.

[0012] Os documentos WO 20101054649 e WO 2013107436 descrevem o uso de cepas da espécie Kluyveromyces lactis que contêm os antígenos definidos, para a geração de uma resposta imune humoral protetora após aplicação oral/mucosal ou subcutânea de células de levedura mortas inteiras. As patentes mencionadas por último contêm exemplos de aplicação, nos quais as cepas de K. lactis recombinantes, que foram desviadas da cepa de partida VAK367-DA4, foram usadas com êxito para a vacinação.

[0013] A possibilidade da aplicação de leveduras de Kluyveromyces lactis recombinantes para a vacinação é conhecida pelo especialista a partir do estado da técnica: (Arnold et a/ (2012)); documentos WO 20101054649 e WO 2013107436). Nos exemplos de aplicação foi possível mostrar, que através da administração subcutânea da levedura K. lactis, que exprime a proteína cápside VP2 do vírus da bursite infecciosa (IBDV) intracelularmente através de um cassete de expressão controlado pelo promotor LAC4, é provocada uma resposta imune humoral, que confere uma proteção eficaz contra a infecção por vírus. Isto pôde ser mostrado para um vírus IBD de média patogenicidade, contudo, até agora não contra IBDV very virulent (vvIBDV). Os dados anteriores mostraram, que a eficácia de uma vacina de levedura pode aumentar através do aumento da concentração intracelular do antígeno viral (Arnold et a/ (2012)). Uma variante técnica, para obter um aumento da concentração do antígeno, consiste em introduzir uma cópia adicional do gene ativador de transcrição KIGAL4- 1 (aliás, LAC9-1) por meio da integração do plasmídeo pL1-1 (Krijger et al (2012) e WO 2013107436) na cepa que exprime IBDV-VP2. (cepas DSM 25406 e DSM 25407 depositadas). A geração de tais cepas de vacina K. lactis baseou-se, portanto, até agora, em duas intervenções genéticas: em primeiro lugar, na integração do gene KIGAL4-1. Na forma praticada até agora, o último levou, contudo, regularmente também à integração de repetições tandem do plasmídeo, o que não tem apenas efeitos citotóxicos devido à forte superexpressão do ativador (Breunig 1989), mas sim, também leva a diferentes números de cópias para os genes KIGAL4-1 e ScURA3 em cepas de vacinas geradas dessa maneira.

[0014] A estratégia descrita nos exemplos de aplicação mencionados acima (Arnold et al (2012); WO 20101054649 e WO 2013107436), de efetuar a expressão do gene estranho através de um promotor LAC-4 não modificado, tem o efeito colateral, de que também em condições não indutoras, ocorre uma expressão mínima do gene estranho, isto é, o promotor é permeável em uma certa parte. Ao aumentar a dose do gene KIGAL4-1, esse efeito, mais uma vez, é significativamente mais pronunciado. De modo correspondente com as proteínas, que na expressão heteróloga têm um efeito prejudicial às células (efeito citopático, CPE) sobre a célula da levedura, a formação de biomassa no cultivo, por exemplo, durante um processo de fermentação fed-batch, pode ser maciçamente limitada. Especialmente para esses casos devem ser encontrados meios alternativos, para manter a expressão gênica a mais baixa possível em condições não indutoras.

[0015] Diversas vacinas de subunidades só são efetivamente eficazes, quando usadas não apenas uma, mas sim, várias subunidades de um patógeno para a vacinação. Através do uso de várias subunidades de antígenos na vacinação, além disso, a proteção cruzada contra várias variantes de um patógeno pode aumentar maciçamente. A coexpressão de antígenos iguais ou diferentes também pode ser utilizada para aumentar novamente a concentração do antígeno na célula de levedura ou para produzir uma vacina, que protege contra diversos patógenos.

[0016] As cepas anteriormente discutidas são, via de regra, cepas auxotróficas, que no meio completo crescem frequentemente pior do que as cepas prototróficas. De modo correspondente, uma transformação de cepas de leveduras auxotróficas, que pode ser realizada mais rapidamente para uma forma prototrófica, pode levar a melhores propriedades de crescimento. Descrição da Invenção

[0017] A tarefa da invenção consistiu, agora, em pôr novas cepas de vacina K. lactis à disposição, com as quais as desvantagens do estado da técnica podem ser superadas. Em particular, devem ser disponibilizadas cepas de K. lactis recombinantes, que contêm um número limitado de cópias do gene KIGAL4-1, integrado a um ponto definido no genoma. Além disso, devem ser disponibilizadas cepas, que em condições não induzidas não permitem ou permitem apenas uma baixa expressão de proteínas estranhas, permitem a expressão de várias cópias de um antígeno ou a expressão de vários antígenos em uma célula de levedura, que são melhor adequados para o cultivo e que podem ser usados de maneira eficaz para a vacinação protetora contra patógenos. Neste caso, os genes heterólogos, que codificam as proteínas com eficácia imunomoduladora (antígenos), deveriam ser integrados a sítios definidos do genoma K. lactis. Na seleção de clones procurados com integração do gene estranho, não deveriam ser usados quaisquer genes resistentes como marcadores de seleção. Além disso, as cepas prototróficas deveriam ser geradas a partir de cepas auxotróficas através de um processo o mais simples possível. Isso deveria permitir também a fermentação simplificada das cepas de vacina de levedura produzidas em meio sintético, não suplementado.

[0018] Essas tarefas foram resolvidas através do fornecimento de um sistema modular, que contém novos vetores e novas variantes geneticamente modificadas da levedura K. lactis e que permite a geração de cepas de vacina, que são otimizadas em propriedades específicas dos antígenos de proteínas. Através de uma troca do tipo de elementos de composição de elementos de DNA entre os vetores, obteve-se, neste caso, uma clonagem rotineira eficiente de sítios codificadores de antígenos estranhos no genoma da levedura, independentemente do gene estranho a ser expresso. Através da integração genômica direcionada dos genes estranhos relevantes, as cepas de leveduras são estáveis durante muitas gerações e geneticamente são definidas com precisão. Devido a essas propriedades, os processos de fermentação podem ser reproduzidos em condições não seletivas e ser padronizados. A otimização das leveduras K. lactis de acordo com a invenção consistiu, neste caso, em controlar a taxa de produção de proteínas de modo que essa seja a maior possível, contudo, de tal modo, que essa se situe abaixo de um limiar, no qual os efeitos citopáticos dos antígenos perturbem maciçamente o processo de fermentação eficiente. Isso foi obtido através de uma intervenção genética ou através de uma combinação de várias intervenções genéticas:

[0019] i. o aumento da concentração do ativador de transcrição induzível pela lactose,

[0020] ii. a mudança direcionada do promotor LAC4 e/ou

[0021] ilii.o aumento gradual da dose do gênica para o gene estranho que codifica o antígeno.

[0022] A otimização das leveduras K. lactis de acordo com a invenção consistiu, além disso, em:

[0023] iv. estabelecer vários novos sítios de integração para cassetes codificadores de genes estranhos no genoma da levedura para, ao mesmo tempo, poder expressar vários antígenos.

[0024] Em uma forma de concretização preferida, a tarefa da invenção é resolvida através do fornecimento de uma cepa de K. lactis para a clonagem direcionada de ácidos nucleicos codificadores de antígenos estranhos no genoma da levedura da cepa de K. lactis, caracterizada pelo fato de que a cepa de K. lactis, de forma alternativa ou adicional ao locus KILAC4 no locus KIURA3-20 (KLLAOE227719g) e/ou no locus KIMET5-1 (KLLAOBO3938g), apresenta cassetes de expressão integrados para antígenos estranhos. É particularmente preferível, se a cepa de K. lactis apresentar adicionalmente ao locus KILACA4 no locus KIURA3-20 (KLLAOE22771g) e/ou no locus KIMET5-1 (KLLAOBO3938g), cassetes de expressão integrados para antígenos estranhos. De modo muito particular é preferível, se a cepa de K. lactis apresentar adicionalmente ao locus KILAC4 no locus KIURAS-20 (KLLAOE22771g) e no locus KIMET5-1 (KLLAOBO3938g9), cassetes de expressão integrados para antígenos estranhos. Cepas de K. lactis tão modificadas têm a vantagem, de que os genes para a expressão de genes estranhos são integrados em loci definidos estabelecidos no genoma de K. lactis e o número de cópias dos genes estranhos pode ser controlado. Além disso, essas cepas de K. lactis permitem a integração de diversos genes para a expressão de diversos antígenos estranhos em loci definidos no genoma de K. lactis.

[0025] Com “antígenos estranhos” ou “proteínas estranhas” no sentido desta invenção são entendidos todos os peptídeos, polipeptídeos e proteínas, que são adequados para gerar uma resposta imune, preferivelmente uma resposta imune protetora, no homem ou em um animal contra um patógeno ou células cancerígenas degeneradas. As proteínas estranhas podem ser provenientes de agentes patogênicos ou tumores de qualquer tipo, para os quais foram caracterizados antígenos, que por si só são capazes de induzir uma resposta imune, preferivelmente uma resposta imune protetora.

[0026] Em uma forma de concretização preferida, as proteínas estranhas são provenientes de agentes patogênicos (vírus, bactérias, parasitas), para os quais foram caracterizados antígenos, que por si só são capazes de induzir uma resposta imune, preferivelmente uma resposta imune humoral protetora. Essas são, por exemplo: Proteínas estranhas, que são provenientes de parasitas

[0027] Necator americanus; Ancylostoma duodenale: proteína ASP, proteases degradadoras de hemoglobina

[0028] Leishmania: gp63, 46 kD antígeno promastigot, LACK

[0029] plasmódio: proteína CSP, CSA-1, CSA-3, EXP1, SSP2, STARP, SALSA, MSP1, MSP2, MSP3, AMA-1, GLURP, Pfís 25, Pfs 28, Pvs 25, Pvs 28, Pfs 48/45, Pfs 230

[0030] Schistosoma: TP1, Sm23, ShGSTs 26 e 28, paramiosina, miosina de parasitas, SM14

[0031] Proteínas estranhas, que são provenientes de bactérias

[0032] Mycobakterium tuberculosis: Ag85A, Hsp65, R8307, 19 kD, 45 KkD, 10.4

[0033] Heliobacter pylori: VacA, LagA, NAP, hsp, urease, catalase

[0034] Grupo A Streptococcus: M, SCPA peptidase, exotoxina SPEA e SPEC,

[0035] Fibronectin binding protein

[0036] Streptococcus pneumonia: PspA, PsaA, BHV 3, BHV 4

[0037] Salmonella typhimurium: antígeno Vi

[0038] Shigella: LPS

[0039] Vibrio cholera: CTB

[0040] Escherichia coli ETEC: LT, LT-ST, CTB

[0041] Yersinia pestis: F1, V

[0042] Proteínas estranhas, que são provenientes de células tumorais/tumores (antígenos associados a tumores, TAA)

[0043] CEA

[0044] 5T4

[0045] MUC1

[0046] MART1

[0047] HER-2

[0048] Em particular, são preferidas as proteínas estranhas, que são provenentes de vírus

[0049] Caliciviridae (Norwalk, HEV): NV 60 kD; HEV ORF2

[0050] Reoviridae (Rota): VP7, VP4

[0051] Retroviridae (HIV): Gag, Pol, Nef, Env, gp 160, gp120, gp140, gp41

[0052] Flaviviridae (gênero Flavivirus: WNV, dengue, YF, TBE, JEV): preM-Env, NS3, NS4, NS5

[0053] Flaviviridae (gênero Pestivirus BVDV, CSFV, BDV, gênero Hepacivirus HCV): E1, E2, ERINS (Pesti), C, NS3, NS4, NS5

[0054] Hepadnaviridae (HBV): antígeno HBS

[0055] Paramyxoviridae (Paramyxovirinae: PIV-1, PIV-2, cachumba, Sendai, PIV-2, PIV-4, Morbilli): M, HN, N, F

[0056] Paramyxoviridae (Pneumovirinae: RSV): F, G, SH, M

[0057] Rhabdoviridae (Rabies): G

[0058] Herpesviridae (EBV, HSV2): gp350/220 (EBV), gB2, gD2 (HSV)

[0059] Coronaviridae (SARS): CoV, N, M, S

[0060] Orthomyxoviridae (Influenza A, B): HA, NA, M1, M2, NP

[0061] Papillomaviridae: L2, E6, E7

[0062] Em uma outra forma de concretização da invenção, as cepas de K. lactis modificadas são caracterizadas pelo fato de que os cassetes de expressão contêm o promotor K. lactis LAC4-12 (PLAC4-12) ou variantes deste promotor, o ORF do antígeno a ser expresso e o terminador AgQTEF-1. Essa forma de concretização tem a vantagem, de que a expressão de genes estranhos são induzidos com o controle do promotor Prac4-12 após a integração no locus LAC4 e/ou KIURA3 elou KIMETS, aproximadamente na mesma intensidade pela lactose.

[0063] Tal como descrito acima, há uma correlação positiva entre a concentração do antígeno em cepas de vacinas e o efeito imunogênico da vacina de levedura no organismo alvo. Para evitar um CPE em uma superexpressão muito forte, por exemplo, através da integração de um gene KILAC4 adicional, o sistema de vetor descrito acima pode ser alternativamente modificado, para ligar de forma rápida e eficiente sucessivamente várias cópias de genes e introduzir esse cassete de expressão em uma etapa em um dos três loci gênicos (veja o exemplo e aFigura 7a).

[0064] Em um desenvolvimento vantajoso da invenção, as cepas de K. lactis modificadas no locus KILAC4 ou no locus KIURA3-20 ou no locus KIMET5-1, contêm várias cópias de uma sequência de ácido nucleico codificadora de antígenos estranhos, que são inseridos através de cassetes de expressão tandem ou múltiplo Esses cassetes de expressão compreendem várias cópias das respectivas regiões (genes) codificadoras de antígenos flanqueadas pelo promotor LAC4-12 (Praca 12) ou variantes deste promotor e do terminador AgTEF1. Através da multiplicação das cópias de genes do antígeno efetuada desse modo, sua expressão pode ser significativamente aumentada através de um respectivo loci de genes.

[0065] Em uma forma de concretização preferida da invenção, no locus KILAC4 da cepa de K. lactis, o gene do antígeno estranho IBDV-

VP? está presente em forma de um cassete de expressão tandem. Essa cepa de K. lactis tem, em comparação com cópias simples do gene, que codifica para o antígeno estranho IBDV-VP2, a vantagem, de que o antígeno estranho IBDV-VP2 é expresso com maior quantidade. Em particular, de acordo com essa forma de concretização da invenção, é preferida a cepa VAK1118 (DSM 32701), que apresenta o gene do antígeno estranho IBDV-VP2 em forma de um cassete de expressão tandem no locus KILACA4.

[0066] Além disso, é preferível, se no locus KILAC4 e/ou no locus KIURAS3-20 e/ou no locus KIMETS5-1 das cepas K. lactis de acordo com a invenção, uma ou várias cópias de diversos ácidos nucleicos codificadores de antígenos estranhos são inseridos através de cassetes de expressão simples, tandem ou múltiplos. Com isso, por um lado, diversos antígenos estranhos e, por outro lado, esses diversos antígenos estranhos podem ser expressos em diferentes concentrações na célula de levedura. Em particular, de acordo com essa forma de concretização, é preferida uma cepa de K. lactis, na qual nos loci KILAC4 e KIURA3-20 da cepa de K. lactis, são inseridas e expressas as sequências de ácidos nucleicos codificadoras dos antígenos estranhos Influenza A HA (A/Puerto Rico/8/1934 (HIN1) e Influenza A M1 (A/Puerto Rico/8/1934/H1N1). Em particular, de acordo com essa forma de concretização da invenção, é preferida a cepa VAK 1283 (DSM 32697), na qual nos loci KILAC4 e KIURA3-20 da cepa de K. lactis, são inseridas as sequências de ácidos nucleicos codificadoras dos antígenos estranhos Influenza A HA (A/Puerto Rico/8/1934 (HIN1) e Influenza A M1 (A/Puerto Rico/8/1934/H1N1).

[0067] Tal como citado, sabe-se que o aumento da dose do gene KIGAL4 pode levar ao aumento da produção de antígeno (Krijger et a/ 2012 e WO 2013107436). As desvantagens para obter isso através da integração do plasmídeo pLlI-1 que expressa KIGAL4 em um processo de duas etapas, são citadas acima. Estas desvantagens foram superadas, de acordo com a invenção, pelo fato de ser fornecida uma cepa de partida estável para a integração de genes estranhos, que contém uma segunda cópia do gene KIGAL4. Com isso, é garantido, que todas as cepas derivadas possuem a mesma base genética e nessas cepas está presente exatamente uma cópia adicional do gene KIGALA. Isso reduz a citotoxicidade, que foi observada na expressão de cópias múltiplas e reduz as etapas na produção de cepas de vacinas para meramente uma etapa. Além disso, a estabilidade genética aumenta, visto que não se realiza a integração/excisão reversível do plasmídeo. A produção de uma tal cepa pode ocorrer, por exemplo, tal como descrito no exemplo 1.

[0068] Em uma outra forma de concretização vantajosa da invenção, dessa maneira é fornecida uma cepa de K. lactis, que adicionalmente ao gene KIGAL4 genômico, contém ainda uma segunda cópia ectópica do gene KIGAL4. Nesta cepa, a expressão do ativador de transcrição KIGAL4 pode ser aumentada no máximo para o dobro e a expressão dos genes estranhos inseridos no locus KILAC4 e/ou no locus KIURA3-20 elou no locus KIMETS5-1 pode ser aumentada de forma definida através do promotor LAC4-12 ou através das variantes deste promotor descritas abaixo. Na prática convencional, os plasmídeos, que codificam KIGALA4, foram introduzidos na célula de forma transiente e em um múltiplo número de cópias descontroladas. Com isso, o antígeno estranho foi expresso muitas vezes em uma concentração tão alta, que isso levou a efeitos citotóxicos. Os efeitos citotóxicos nas cepas de K. lactis dessa forma de concretização da invenção podem ser reduzidos ou evitados com alta eficácia. Outros loci de genes, que são incluídos no futuro para a mesma finalidade (inserção de um cassete de expressão controlado por LAC4), também podem ser controlados dessa maneira. Foi provado como sendo vantajoso, se a cópia ectópica do gene KIGALA4, que é flanqueada pelo promotor KIGAL4 e terminador KIGALA, for integrada na cepa K. lactis no sítio do gene KLLAOE13795g (Klavt3::K/IGALA4, SEQ ID nº: 1). Em particular, de acordo com essa forma de concretização da invenção, é preferida a cepa VAK1111 (DSM 32696), que apresenta essas propriedades.

[0069] Em uma outra forma de concretização preferida, a invenção fornece uma cepa de K. lactis, na qual, no locus KILACA4, está presente a sequência de ácidos nucleicos codificadora do antígeno estranho IBD- VP2. Em particular, de acordo com essa forma de concretização, é preferida a cepa VAK1171 (DSM 32699). Esta cepa contém adicionalmente uma cópia ectópica do gene KIGAL4, no qual, do mesmo modo, está presente a sequência codificadora de ácidos nucleicos do antígeno estranho IBDV-VP2. Essa cepa mostra expressão aumentada do antígeno estranho IBDV-VP2 em comparação com cepas sem cópia ectópica adicional do gene KIGALA4.

[0070] A produção de proteína heteróloga em microrganismos é problemática, quando essa leva a um efeito citopático (CPE). À invenção fornece, por conseguinte, um meio para desacoplar a fase de produção do antígeno da fase de acumulação da biomassa. Através do promotor LAC4 induzível, isso é parcialmente possível, por exemplo, através de um processo de fermentação Fed-Batch, mas é dificultado, visto que o promotor Praca12 não está completamente parado nas condições não indutoras (isto é, permeável em um certo grau). Nos antígenos com CPE muito forte, ocorre, com isso, uma redução da taxa de crescimento e uma indução da resposta de estresse celular, com efeitos desvantajosos para a produção do antígeno. Devido à duplicação da dose do gene KIGAL4 e/ou ao aumento do número de sequências codificadoras de antígeno (vide acima), esse problema é intensificado.

[0071] Um desenvolvimento vantajoso das cepas de K. lactis de acordo com a invenção, consiste, por conseguinte, em que as cepas de K. lactis apresentam uma estrutura de promotor modificada do promotor LAC4-12, que em condições não indutoras, não permite ou permite apenas uma baixa expressão da proteína estranha. A estrutura do promotor LAC4-12 é, em particular, caracterizada pelo fato de que que a basal control region (BCR) do promotor Praca-12 está deletada entre as posições-1065 e -1540 (exclusão LR2; Praca-12-.r2; SEQ ID nº: 2) (vide para esse fim também o exemplo 2). Tal como já foi descrito acima, essa forma de concretização da invenção apresenta a vantagem, em comparação com a prática convencional, de que os efeitos citotóxicos, que convencionalmente puderam ser provocados através de expressão muito forte dos antígenos estranhos, são reduzidos ou evitados com alta eficácia. São preferidas, de acordo com essa forma de concretização, as cepas de K. lactis, nas quais, no locus KILACA4, está presente a sequência codificadora de ácidos nucleicos do antígeno estranho Influenza A HA (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1). Em particular, de acordo com essa forma de concretização, é preferida a cepa VAK1243 (DSM 32702). Essa cepa contém uma exclusão LR2 no promotor LAC4-12.

[0072] A cepa de K. lactis pode apresentar também uma estrutura modificada do promotor LAC4-12, que permite uma modulação da expressão da proteína estranha, sendo que o número de sítios de ligação para o ativador KIGal4 do promotor (“upstream activating sequences" 1,2 e 4, 5) varia e ou estão presentes 1, 2, 3 ou 4 sítios de ligação KIGal4. Dessa maneira, diversas proteínas estranhas em diferente concentração (quality by design) podem ser expressas em uma célula de levedura. As variantes encurtadas do promotor são, entre outras, importantes para a modularidade do sistema para, por exemplo, expressar proteínas na mesma cepa em razões estequiométricas ideais, por exemplo, para a formação de vírus-like particles (VLPs) altamente imunogênicas. É preferível, de acordo com essa forma de concretização da invenção, se no locus KILAC4 da cepa K. lactis for inserida a sequência codificadora de ácidos nucleicos do antígeno estranho IBDV-VP2. Em particular, de acordo com essa forma de concretização da invenção, é preferida a cepa VAK1131 (DSM 32700). Essa cepa contém uma exclusão LR2 e uma exclusão das upstream activating sequences 4 e 5 no promotor LAC4-12.

[0073] Uma parte da tarefa da invenção consistiu em fornecer cepas de K. lactis, que são adequadas para o cultivo. Esse problema é resolvido pelo fato de que nas cepas de K. lactis de acordo com a invenção, a função gênica dos alelos Kllac4, Klura3-20 e KImet5-1 é restabelecida. As cepas de K. lactis daí resultantes são prototróficas (exemplo 6, Figura 8). A fermentação das cepas de vacina é, assim, simplificada, o estabelecimento dos processos de produção é facilitado e tornado mais eficiente quanto aos custos. Preferidas, de acordo com essa forma de concretização da invenção, são as cepas de K. lactis, nas quais, nos loci KILAC4, KIURA3-20 e KIMet5-1 da cepa de K. lactis, são inseridas as sequências codificadoras de ácidos nucleicos dos antígenos estranhos BVDV E2 ectodomain (tipo 1, CP7), BVDV E2 ectodomain (tipo 2, Nova York 93) e BVDV Npro-NS3 (tipo 1, CP7). Em particular, de acordo com essa forma de concretização da invenção, é preferida a cepa VAK1400 (DSM 32698). Essa cepa é prototrófica.

[0074] Em uma forma de concretização particularmente preferida, a invenção se refere a uma cepa de K. lactis, que é selecionada a partir das cepas

[0075] VAK952 DSM 32705

[0076] VAK1I111 DSM 32696;

[0077] VAK1118 DSM 32701;

[0078] VAK1131 DSM 32700;

[0079] VAK 1171 DSM 32699;

[0080] VAK 1243 DSM 32702;

[0081] VAK 1283 DSM 32697;

[0082] VAK 1395 DSM 32706;

[0083] VAK 1400 DSM 32698

[0084] Essas cepas foram depositadas em 24.11.2017 ou

01.12.2017 (DSM 32705, DSM 32706) na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha, de acordo com o Contrato de Budapest sob os números indicados acima.

[0085] Em um outro aspecto, a invenção fornece vetores de expressão integrativos, com cujo auxílio é possível produzir as cepas de K. lactis da invenção.

[0086] Em uma forma de concretização preferida, a invenção fornece os vetores de expressão integrativos KURA3 (SEQ ID nº: 3) e KIpDpMETS5 (SEQ ID nº: 4). Estes vetores contêm o promotor LAC4-12 (Praca-12) ou variantes deste promotor (tal como descrito acima para as cepas de K. lactis) inclusive do ORF do antígeno a ser expresso, além disso, a sequência do terminador AgTEF1, assim como targeting sequences, que permitem um restabelecimento direcionado da funcionalidade dos alelos KURA3-20 ou KlImet5-1 após a integração. À sequência codificadora do antígeno é clonada através de sítios de clivagem de restrição definidos entre a sequência do promotor e do terminador do cassete de expressão. Por meio desses vetores ocorre a integração de cassetes que expressam o gene estranho no genoma de K. lactis de forma estável, sem marcador e sem aplicação de resistências a antibióticos. As forças desse sistema de vetor estão respectivamente em que os genes estranhos podem ser trocados simplesmente entre os diversos vetores, assim como promotores e terminadores dos cassetes de expressão podem ser substituídos por outros. O cassete de expressão consiste no promotor Prac412 E NO terminador AgTEF1, assim como no gene estranho intermediário. O gene estranho pode ser trocado através dos sítios de clivagem de restrição Ascl e Notl. O promotor Praca-12 pode ser substituído nos dois vetores através dos sítios de clivagem de restrição Smal e Ascl, o terminador no KIpURA3 através de Notl e Boxl (ou Mlul) e no KIPpMETS5 através de Notl e Ecl136Il (ou Sac/). Cassetes de expressão alternativos são clonados em KIpURAS3 entre os sítios de clivagem de restrição Smal e Boxl (ou Mlul), no KIDMETS5, entre Smal e Ecl1361Il (ou Sacl). Com as enzimas de restrição, os cassetes de expressão também são trocados entre os vetores KIpMET5 e KIpuURA3 ou são introduzidos cassetes de expressão adicionais. Uma melhora em comparação com os vetores Klp3 e KIp3-MCS (WO 20101054649) está em que nas condições não indutoras (sem lactose) é selecionado, o que leva a maiores taxas de transformação nas proteínas com CPE e impede um possível enriquecimento de transformantes com expressão reduzida de gene estranho. Vide, para esse fim, também os exemplos 3.1 e 3.2.

[0087] Em uma forma de concretização particularmente preferida da invenção, é fornecido um vetor de expressão integrativo, que é selecionado a partir de KIDMET5-Praca-12-Et, KIDMET5-Praca121R2-Et, KIPMET5-PracaEt, KIDpMET5-Pracaire, assim como a partir de KIPpURAS-Praca12Et, KIPDURAS-PracaenirzEt, KIDURAS-PracsEt e KIpURA3-PracaLr2 (SEQ ID No.: 3 ou SEQ ID No. 4 em combinação com a SEQ ID No.: 5, 6,7 ou 8).

[0088] Os vetores KIDURA3-PLACA4-12-Et, KIDURA3S-PLACA4-12- LR2-Et, KIURA3-PLAC4-ET e KIpDURA3-PLACA4-LR2 são variantes do vetor KIDURAS-Et, nos quais respectivamente a sequência codificadora de ácidos nucleicos é inserida para a proteína Etx.B-HA. Os vetores KIpuRA3-PLACA4-LR2-Et, — KIpDURA3S-PLACA4-12-LR2-Et, — KIURA3- PLAC4-ET e KIpuURA3S-PLACA4-LR2, apresentam diferenças no promotor em comparação com o vetor KIDURA3-Et.

[0089] Os vetores KIDMET5-PLACA4-12-Et, KIDMET5-PLAC-12-

LR2-Et, KIDpMET5-PLACA4-Et, KIDpMET5-PLACA4-LR2, são variantes do vetor KIDMETS5, nos quais respectivamente a sequência codificadora de ácidos nucleicos é inserida para a proteína Etx.B-HA. Os vetores KIPDMET5-PLACA4-12-Et, KIpMET5-PLAC-12-LR2-Et, KIpMET5-PLACA4- Et, KIDMET5-PLACA4-LR2, apresentam diferenças no promotor em comparação com o vetor KIDMETS5.

[0090] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de uma cepa de K. lactis de acordo com a invenção, compreendendo as etapas:

[0091] (i)inserção da sequência codificadora de ácidos nucleicos do antígeno desejado no vetor KIDURA3 ou KIDMETS5,

[0092] (i)transformação de uma cultura de K. lactis com a construção do vetor modificado e antes enzimaticamente digerido,

[0093] (ilii)seleção de células de K. lactis transformadas com auxílio de um meio sólido, que não contém uracila e/ou metionina e

[0094] (iv)opcionalmente: restabelecimento da prototrofia.

[0095] De acordo com uma forma de concretização do processo de acordo com a invenção, as sequências de genes podem ser ectopicamente inseridas ao mesmo tempo por vários antígenos e expressas de maneira regulada. É preferível, se diferentes sequências de genes forem ectopicamente inseridas e expressas de maneira regulada, que codificam para antígenos de diversas variantes de um patógeno. Além disso, é preferível, se diferentes sequências de genes forem ectopicamente inseridas e expressas de maneira regulada, que codificam para antígenos de diversos patógenos.

[0096] Em um outro aspecto, a invenção fornece composições farmacêuticas ou veterinárias para a administração parenteral, enteral, intramuscular, através da mucosa ou oral, que contêm uma cepa de K. lactis de acordo com a invenção, opcionalmente em combinação com veículos e/ou substâncias auxiliares comuns. Em particular, a invenção se refere a composições farmacêuticas ou veterinárias, que são adequadas para a vacinação.

[0097] Preferivelmente, a composição farmacêutica ou veterinária compreende pelo menos um veículo, diluente, adjuvante e/ou substância auxiliar fisiologicamente compatível. As cepas de K. lactis de acordo com a presente invenção podem estar contidas em um veículo farmaceuticamente — compatível, por exemplo, em um meio convencional, tal como em um meio salino aquoso ou em uma solução tampão como composição farmacêutica para a injeção. Um tal meio pode conter também substâncias farmacêuticas, tais como, por exemplo, sais farmaceuticamente compatíveis, para ajustar a pressão osmótica, tampão, conservante e similares. Os meios preferidos incluem a solução fisiológica de cloreto de sódio e soro humano. Um meio particularmente preferido é solução de cloreto de sódio tamponada como PBS.

[0098] Outros veículos farmaceuticamente compatíveis adequados são conhecidos pelo especialista, por exemplo, a partir de Remington's Practice of Pharmacy, 13a edição e J. of. Pharmaceutical Science & Technology, Vol. 52, No 5, setembro-outubro, páginas 238-311.

[0099] Um outro aspecto da invenção se refere ao uso das leveduras de K. lactis recombinantes de acordo com a invenção, para a vacinação, tal como, por exemplo, para a geração de uma imunização protetora, em particular, de uma imunização protetora, que é voltada contra um patógeno.

[0100] Um processo correspondente para a geração de uma imunização protetora compreende, por exemplo, as seguintes etapas:

[0101] a)cultivo e reprodução das leveduras recombinantes de acordo com a invenção,

[0102] b)colheita e inativação das leveduras,

[0103] c)aplicação das leveduras recombinantes de acordo com um esquema de imunização a ser estabelecido,

[0104] d)determinação do título dos anticorpos formados e/ou

[0105] e)detecção da imunização.

[0106] O cultivo e reprodução das recombinantes de acordo com a invenção, pode ocorrer com processos convencionalmente disponíveis. Particularmente preferido neste caso, são processos, que levam economicamente a altos rendimentos celulares. Nesses são incluídos processos de fermentação, em particular, processos da fermentação de alta densidade celular. Como particularmente vantajosa foi provada a realização da fermentação aplicando um protocolo de fermentação Fed- Batch.

[0107] Em uma forma de concretização preferida, a imunização protetora foi obtida pelo fato de que as leveduras recombinantes são aplicadas por via oral/na mucosa, intramuscular ou subcutânea.

[0108] As células de levedura recombinantes devem ser usadas inativadas/mortas no processo de acordo com a invenção. Para esse fim, as leveduras, após o cultivo e expressão dos genes estranhos, são secadas e, em seguida, inativadas. A inativação pode ser realizada com qualquer processo convencionalmente disponível. Particularmente adequada para a aplicação no processo de acordo com a invenção, são a inativação por calor (por exemplo, inativação por calor durante 2 horas a 90ºC) ou a irradiação y (por exemplo, com 25 ou 50 kGy).

[0109] A invenção se refere também a um processo para a vacinação, compreendendo a administração de uma cepa de K. lactis de acordo com a invenção em um indivíduo, por exemplo, um animal ou um ser humano, preferivelmente um animal, em uma quantidade, que é suficiente para provocar no indivíduo uma resposta imune, preferivelmente uma resposta imune protetora contra um ou mais antígenos estranhos.

[0110] Uma vantagem particular é que com as cepas de K. lactis de acordo com a invenção, já após uma única aplicação/imunização (“one schot”) ou após uma aplicação/imunização dupla (“prime-boost”), é provocada uma resposta imune protetora contra um patógeno. Como outra vantagem, foi verificado, que com as cepas de K. lactis de acordo com a invenção, após uma única aplicação/imunização (“one shot”) ou após uma aplicação/imunização dupla (“prime-boost”), pode ser provocada uma resposta imune de proteção cruzada contra diversas variantes de um patógeno. Se as cepas de K. lactis de acordo com a invenção portarem e expressarem diversos genes estranhos contra antígenos de diversos patógenos, é até mesmo possível, após uma única —aplicação/imunização (“one shol") ou após uma aplicação/imunização dupla (“prime-boost”), provocar uma resposta imune protetora contra diversos patógenos. Sumário das vantagens da Invenção

[0111] As melhorias descritas da plataforma K. lactis resultam em inúmeras vantagens:

[0112] a.é possível uma grande simplificação (ready to use toolbox/kit) e uma alta capacidade de reprodução na construção da cepa de “vacinas de subunidades” à base de levedura. Essas podem ser produzidas agora em um período de tempo curto definido.

[0113] b.As vacinas de levedura podem conter um ou mais antígenos; esses podem, ajustados de maneira flexível, ser produzidos em diferentes quantidades.

[0114] c.Além disso, é possível uma fermentação eficiente das leveduras prototróficas.

[0115] d.É possível uma capacidade de indução rigorosa da produção de proteínas recombinantes. A última é particularmente importante para proteínas, que podem provocar um CPE.

[0116] e.A integração genômica estável obtida dos genes estranhos e a estabilidade genética associada das cepas, oferece a vantagem, de que os processos de produção decorrem de maneira reproduzível. Isso é particularmente importante para a produção com GMP.

[0117] fCom o aumento obtido da produção de antígenos recombinantes através do aumento das cópias de genes estranhos e/ou da concentração de KIGALA, a proteção da vacina de levedura melhora.

[0118] g.Com o aumento obtido da produção de antígenos recombinantes através do aumento das cópias de genes estranhos e/ou da concentração de KIGALA4, além disso, a dose de vacina a ser aplicada pode ser reduzida. Com isso, a produção de levedura torna-se mais eficiente quanto aos custos e a compatibilidade da vacinação para o indivíduo vacinado melhora.

[0119] h.Vacinas de levedura multivalentes de proteção cruzada ou de proteção multivalente podem ser usadas para a profilaxia contra diversas variantes do mesmo patógeno ou contra diferentes patógenos. Apesar da inativação e da mistura com um adjuvante adequado ou com um volume de líquido adequado, não é necessário qualquer outro downstream processing das leveduras para o uso como vacina.

[0120] A invenção é esclarecida em detalhes, a seguir, com base nos desenhos e exemplos de execução.

[0121] A Figura 1 mostra a caracterização de uma cepa de base K. lactis recentemente gerada com duas cópias de KIGALA4. A presença de duas cópias de KIGALA4 ectópicas no sítio de integração identificado foi verificada e analisado o efeito da integração sobre o crescimento da levedura. A: Esquema da espécie de integração da cópia de KIGAL4 ectópica. O sítio de integração é denominado e os nomes dos genes são dados. B: gel de agarose de fragmentos do locus KIAVT3 amplificados “por PCR com os primers VK183 (5- GAGCCCACCACCTGCTCCTG-3') (SEQ ID No.: 9) e VK184 (5- CTGATGTATTGCGCTCCTTACTAAC-3') (SEQ ID No.: 10) de uma cepa de levedura com (VAK1110) e sem (VAK367) do gene KIGAK4 ectópico, adicionalmente integrado. Os tamanhos dos fragmentos esperados para o respectivo caso são indicados no esquema à direita. C: teste da gota com diluições déctuplas em série (Start-OD 1) na glicose (YPD) ou lactose (YPLac) A incubação ocorreu respectivamente a 30ºC e 37ºC. O crescimento de cepas de levedura com uma cópia de KIGAL4 no locus do gene nativo (VAK1139), no locus do gene ectópico e KIGAL4 deletado no locus do gene nativo (VAK1110) foi comparado com nenhuma cópia de KIGAL4 (AKigal4; VAK964) ou com duas cópias de KIGAL4 (VAK1168). Mostra-se, que a integração definida de um outro gene KIGAL4 leva meramente a defeitos de crescimento marginais: esses são visíveis meramente a 37ºC e em condições indutoras. O defeito de crescimento é mais evidente na exclusão completa de KIGAL4.

[0122] A Figura 2 mostra a análise de Westernblot com proteínas de uma cepa de K. lactis que produz uma IBDV-VP2 com cópia de KIGAL4 ectópica adicional. O efeito de uma cópia de KIGAL4 adicional sobre a produção de proteína recombinante dependente do promotor LAC4-12 foi analisado por meio de Westernblot. Como cepa de teste serviu uma cepa de levedura com um cassete de expressão IBDV-VP?2, que foi comparado com outras cepas de levedura IBDV-VP2. A presença (+) ou ausência (-) de uma cópia de KIGAL4 ectópica e de um cassete de expressão tanden-IBDV-VP?2 (vide acima) são especificadas acima. Na cepa VAK911, a cópia ectópica foi introduzida através da linearização do plasmídeo pLI-1 por meio de BstEll (Krijger et al 2002 e WO 2013107436), na cepa VAK1130 a cópia de KIGAL4 ectópica estava no locus KIAVTS3 (vide Figura 1). A cepa de levedura VAK367 foi levada como controle de tipo selvagem sem gene estranho. O cultivo das cepas de levedura ocorreu após pré-cultura em YPD, durante 15 horas em YPLac. Respectivamente 20 um do extrato de proteína foram analisados por cepa de levedura por meio de SDS-PAGE. O imunoblot ocorreu com soro de coelho anti-|IBDV (1:8000) e anticorpo anti-coelho de cabra (1:10.000). INDV-VP2 multímero (agg.) e monomérico (mon.) são designados à direita com setas, bandas inespecíficas com estrelinhas. É mostrado, que a expressão ectópica de um gene KIGAL4 adicional, do mesmo modo como a presença de um cassete de expressão tandem (vide também abaixo), leva a um aumento maciço da concentração de antígeno estranho.

[0123] A Figura 3 ilustra o efeito da exclusão de LR2 no promotor LAC-12 sobre a produção de proteína recombinante não induzida e o crescimento da levedura sobre a glicose. O promotor LAC4-12 não modificado mostra também em condições não indutoras, uma expressão basal do GOI (gene of interest). Isso é problemático particularmente em antígenos estranhos de efeito citotóxico. Com esses experimentos foi testado, se através de uma exclusão na região BC (exclusão LR2) do promotor LAC4-12, a produção de proteína recombinante em condições não indutoras pode ser reduzida ou mesmo completamente suprimida. A: Esquema de um promotor LAC4-12 (Prac- 12). A basal control region (BCR), a exclusão LR2 e os quatro sítios de ligação KIGal4 (upstream activating sequence: U1, U2, U4, US), assim como a sequência codificadora de ácidos nucleicos do gene estranho (GOI) são desenhados. B: Westernblot de cepas de levedura IBDV-VP2, com (VAK1131) e exclusão LR2 sem (VAK1130), após o cultivo em condições não indutoras (YP 3% de EtOH). O VAK1111 serviu como controle de tipo selvagem sem gene estranho. Para cada cepa de levedura foram carregados 50 ug de extrato de proteína em um gel SDS de 12%. O imunoblot ocorreu com soro de coelho anti-|IBDV (1:5000) e anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com HRP (1:10.000). O controle de carga KINop1 foi detectado com anticorpo anti-Nop1 de camundongo (1:5000) e anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com HRP (1:10:000). C: teste da gota com diluições déctuplas em série

(Start-OD 1) em YPD, YPD com 0,5% de glicose e YPLac. A incubação ocorreu respectivamente a 30ºC e 37ºC. O crescimento das cepas de levedura, que portam um gene estranho HA da Influenza A no locus LAC4, foi comparado com (VAK1243) e sem exclusão de LR2 (VAK952). Como controles de tipo selvagem sem gene estranho serviu a cepa de levedura VAK367. É mostrado, que a exclusão LR2 impede a expressão da proteína estranha basal indesejada. Além disso, é mostrado, que a exclusão de LR2 melhora o crescimento de uma cepa de levedura, que expressa uma proteína citotóxica (Influenza hemaglutinina, HA), tanto em condições não indutoras, quanto também em indutoras. Isso é particularmente evidente a 37ºC.

[0124] A Figura 4 mostra os vetores Klp, que podem ser utilizados para a integração de cassetes de expressão de proteínas em diversos loci do genoma K. lactis. Enquanto a utilização do locus LAC4 (sistema de vetor KIp3) já é descrita (WO 20101054649 e WO 2013107436), a utilização dos loci KIURA3 e KIMETS5 é nova. A: esquema dos diferentes vetores Klp com seu respectivo sítio de integração no genoma. B & C: cassetes de expressão e extremidades flanqueadoras nos vetores KIURA3 (B) e KIMETS5 (C) recentemente descritos aqui. São designados as diferentes clivagens de sequências de DNA e os sítios de clivagem de restrição relevantes. GOI: gene estranho (gene of interest). D: análise de Westernblot da expressão de proteína estranha em cepas de leveduras construídas com auxílio dos vetores Klp (A, B & C). O gene estranho aqui é o Etx.B-HA. A levedura da proteína “house keeping' KINop1 (KLLAOCO04389g) foi detectada como sendo controle de carga. As cepas de levedura foram cultivadas após pré-cultura em YPD (+), 4 horas em YPLac (+U). Para cada cepa de levedura foram carregados ug de extrato de proteína em um SDS-PAGE de 12%. O imunoblot ocorreu com anticorpos de camundongo monoclonal anti-HA (1:5000) e anti-KINop1 (1:5000; Santa Cruz, Texas, EUA), assim como com anticorpos anti-camundongo conjugado com HRP de cabra (1:10.000; Jackson ImmunoResearch, PA, EUA). É mostrado, que ambos os loci KIURA3 e KIMETS, de maneira semelhante ao locus LAC4 (WO 20101054649 e WO 2013107436), são úteis para a expressão de gene heterólogo.

[0125] A Figura 5 mostra a produção de diferentes proteínas recombinantes na mesma cepa de levedura. Essa cepa de levedura (VAK1243) foi construída com os vetores KIDURA3 e KIp-MCS. A análise de Westernblot com proteínas de uma cepa de levedura que expressa tandem-IBDV VP2 (vide acima), na qual, com auxílio do vetor KIpURAS, foi introduzido um cassete de expressão adicional, com Etx.B- HA como gene estranho (VAK1243). Como controle serviram cepas de levedura, que portam no genoma apenas o cassete de expressão com Etx.B-HA no LAC4 (VAK899) ou locus KJURA3 (VAK1235) ou apenas o cassete de expressão tandem-IBDV VP2 no locus LAC4 (VAK1I171). Após a pré-cultura em YPD, as cepas de levedura foram cultivadas durante 6 horas em YPLac. Para cada cepa de levedura foram carregados 30 um de extrato de proteína em SDS-PAGE de 12%. À detecção das proteínas no imunoblot ocorreu para Etx.B-HA com anticorpo anti-HA de camundongo (1:5000; Santa Cruz, Texas, EUA) e anticorpos anti-camundongo conjugados com HRP de cabra (1:10.000) e para IBDV-VP2 com antissoro anti-|lBDV de coelho (1:5000; Granzow et al (1997)) e anticorpos anti-coelho conjugado com HRP de cabra (1:10.000; Jackson ImmunoResearch, PA, EUA). É mostrado, que ambas as proteínas estranhas são expressas na mesma célula de levedura. De maneira surpreendente, o nível de expressão de um antígeno não é limitado na expressão Ko de um outro antígeno. Isso é evidente na comparação do nível de expressão em cepas mono- e bivalentes (vide também a Figura 12).

[0126] A Figura 6 mostra as variantes do promotor LAC-12 diferentemente fortemente induzidas para cassetes de expressão em vetores Klp. Os cassetes de expressão dos vetores Klp foram providos com diferentes variantes do promotor LAC-12. O efeito das variantes do promotor sobre a força da indução da síntese da proteína foi testado com base na análise de cepas de levedura, que contêm os cassetes de expressão correspondentes com Etx.B-HA como gene estranho. A: representação esquemática da variante do promotor, os vetores KIpuURAS3 associados com Etx.B-HA como gene estranho e as cepas de levedura criadas a partir do mesmo. BCR: região de ligação dos ativadores de transcrição KICat8 e KISip4, ativadores de transcrição em condições não indutoras; U1, U2, U4, UB5: regiões de ligação para o ativador de transcrição KIGal4 (upstream activating sequence). B: análise de Westernblot para a caracterização das variantes do promotor LAC-12 nas cepas de levedura (A) criadas com o vetor KIDURA3. As cepas de levedura foram cultivadas após a pré-cultura em YPD, durante 4 horas em YPLac. Para cada cepa de levedura foram carregados 30 um de extrato de proteína em SDS-PAGE de 12%. O imunoblot ocorreu com anticorpo anti-HA (1:5000) e anti-Nop1 (1:5000) de camundongo, assim como com anticorpo anti-camundongo conjugado com HRP de cabra (1:10.000). É mostrado, que a taxa de expressão do gene estranho é diferentemente alta dependendo do tipo do promotor usado.

[0127] A Figura 7 mostra o efeito da duplicação do número de cópias do gene estranho por meio de um cassete de expressão tandem sobre a produção de proteína recombinante. O efeito sobre a produção de proteína recombinante (IBDV-VP2) através do aumento do número de cópias do gene estranho foi analisado por meio de um cassete de expressão tandem. A: representação esquemática do cassete de expressão tandem. São designados recortes de DNA e sítios de clivagem de restrição relevantes. GOI: gene estranho (gene of interest). B: A construção tandem derivada de (A) para a integração casual com auxílio de um marcador de seleção ScURA3, está representada. C: análise de Westernblot para a comparação da produção de proteína IBDV-VP2 em uma cepa de levedura (VAK1118) com um cassete de expressão tandem (A) e com uma cepa de levedura (VAK910) com um cassete de expressão com apenas uma cópia do gene estranho. As cepas de levedura foram cultivadas após a pré-cultura em YPD, 3 horas ou 6 horas em YPLac. Para cada cepa de levedura foram carregados 60 um de extrato de proteína em um SDS-PAGE de 12%. O imunoblot ocorreu com soro de coelho anti-|IBDV (1:10.000) e anticorpo anti-coelho conjugado com HRP de cabra (1:10.000). IBDV-VP2 agregado (agg) e monomérico (mon.) são designados à direita com setas, as bandas inespecíficas com estrelinhas. D: análise Western de cepas de levedura com cassete de expressão (B) tandem-IBDV-VP2 casualmente integrado em comparação com uma cepa de levedura produzida com KIp3-MCS com um cassete de expressão (VAK910), assim como as cópias de KIGAL4-1 adicionais (pLlI-1) derivadas da mesma. As cepas de levedura foram cultivadas após a pré-cultura em YPD, 8 horas em YPLac. O imunoblot ocorreu tal como descrito em (b). É mostrado, que o uso de um cassete de expressão tandem aumenta significativamente a taxa de expressão da proteína estranha.

[0128] A Figura 8 mostra os fragmentos de genes para O restabelecimento da função gênica dos alelos Klura3-20 e KImet5-1 (A). Esquematicamente, estão representados os loci gênicos e os fragmentos de genes amplificados com os primers especificados para KIURAS (A) e KImet5 (B). As mutações dos alelos Klura3-20 (A) e KlImet5-1 (B) reconstituídos através da recombinação com esses fragmentos de genes, são mostrados como estrelinhas abaixo dos genes. Os sítios de clivagem de restrição, com os quais os fragmentos subclonados são recortados, são desenhados. Esse esquema esclarece a estratégia de geração de cepas de levedura expressas com gene estranho prototrófico no locus URA3 ou METS.

[0129] A Figura 9 ilustra, em combinação com a tabela 1 e tabela 2, a imunização protetora de galinhas contra vvIBDV em um esquema de vacinação prime-boost clássico. Em dois experimentos (A e B), grupos de pelo menos 16 galinhas SPF são vacinadas por via subcutânea por um processo prime-boost com células de levedura liofilizadas e inativadas por calor da cepa de levedura K. lactis VAKI127 tandem-IBDV-VP2 geneticamente otimizada. A primeira vacinação ocorreu duas semanas após a eclosão (prime), a segunda (boost) duas semanas depois. Duas semanas após o boost ocorreu um challenge do vírus com uma cepa IBDV altamente virulenta (vv) (very virulent 89163/7.3). Um grupo de cobaias, que serviu como controle de infecção, submeteu-se a um tratamento de imitação (simulação), no qual foi aplicado apenas PBS ou adjuvante. No experimento 1 (A), aplicou-se como controle também a levedura de tipo selvagem (VAK367). Pelo menos sete galinhas por grupo serviram como controle sem o challenge do vírus; pelo menos cinco no experimento 2 (B). Os soros foram obtidos pouco antes da primeira aplicação, antes e depois do challenge ou então em dez dias. A força da soroconversão foi determinada por meio de ELISA (ProFLOK IBD Plus, Synbiotics). Os títulos convertidos são mostrados de acordo com as especificações do Kit. A: o experimento 2 ocorreu tal como o experimento 1 (A). O valor médio do título ELISA de 12 aminais é mostrado com desvios padrão. Ambos os experimentos mostram um desenvolvimento maciço de títulos de anticorpos anti-|lBDV VP2 nos animais vacinados com VAK1127. As tabelas associadas resumem os resultados da proteção dos animais vacinados contra o challenge com o vIBDV: nos dois experimentos de vacinação foi possível obter uma proteção total contra a infecção viral.

[0130] A Figura 10 mostra o efeito das modificações genéticas para o restabelecimento da prototrofia sobre a quantidade de produção de proteína recombinante e imunogenicidade de uma cepa de levedura tandem-IBDV-VP2. A cepa de levedura tandem-IBDV-VP2 VAK1127 auxótrófica e a cepa de levedura VAK1171 prototrófica derivada foram comparadas com respeito à eficiência da produção de proteína recombinante e imunogenicidade.

A: análise de Westernblot para a determinação do teor de IBDV-VP2 em material de levedura recentemente colhido.

As cepas de levedura foram cultivadas após a pré-cultura em YPD durante 8 horas em YPLac. 40 um de extrato de proteína para cada cepa de levedura foram carregados em SDS-PAGE de 12%. O imunoblot ocorreu com antissoro anti-|lBDV de coelho (1:10.000) e anticorpo anti-coelho conjugado com HRP de cabra (1:10.000). IBDV-VP2 agregado (agg.) e monomérico (mon.) são designados à direita com setas, as bandas inespecíficas com estrelinhas.

B: análise de Westernblot para a determinação do teor de IBDV-VP2 em material de levedura liofilizado, inativado com calor, que foi usado, em seguida, em um estudo de imunização em camundongos BALB/c (C). Após a pré-cultura em YPD, as cepas de levedura foram cultivadas durante 15 horas em YPLac. 10 ug de extrato de proteína para cada cepa de levedura foram carregados em um SDS-PAGE de 12% ou então o imunoblot ocorreu tal como acima (A) e as bandas são designadas de modo correspondente.

C: teste da imunogenicidade das duas cepas de levedura VAK1127 e VAK1I171 no experimento de imunização em camundongos BALB/c.

Grupos de respectivamente cinco camundongos foram vacinados três vezes por via subcutânea com 0,1 mg (peso seco) do material de levedura acima analisado (B). Como controle serviu uma cepa de tipo selvagem (VAK367) sem antígeno.

À primeira aplicação ocorreu com CFA (complete Freund's adjuvant) como adjuvante, as outras duas, em intervalos de duas semanas, com IFA (incomplete Freund's adjuvant) como adjuvante.

Uma semana após a terceira aplicação, os camundongos foram submetidos à eutanásia e sangrados. Os soros foram analisados por meio de IBDV-VP2-ELISA (IDEXX). A absorção a 650 nm, correlacionada com o título do anticorpo IBDV-VP2, é mostrado com erro padrão. Como controle positivo para o ELISA serviu um anticorpo anti-|BDV-VP2 monoclonal (pos. mab64), como controle negativo foi usado ou um tampão de amostra (neg. 1) ou um anticorpo inespecífico (neg. 2). É mostrado, que ambas as cepas apresentam uma expressão de proteína estranha semelhante e um potencial imunogênico.

[0131] A Figura 11 mostra, em combinação com a tabela 3, a imunização protetora de galinhas SPF contra vIBDV através de aplicação subcutânea única com leveduras de vacinação IBDV-VP2 otimizadas. Grupos de pelo menos 18 galinhas SPF foram vacinadas duas semanas após a eclosão uma vez por via subcutânea com 10 mg de células inativadas por calor da cepa de levedura K. /actis tandem- IBDV-VP2 VAK1171 geneticamente otimizada. Como controles serviram animais vacinados com PBS ou 10 mg de VAK367. Esses foram vacinados duas vezes, duas, ou quatro semanas após a eclosão. O challenge com vvIBDV ocorreu em todos os animais seis semanas após a eclosão. Os soros foram analisados, tal como descrito acima, por meio de ELISA (ProFLOK IBD Plus, Synbiotics). São mostrados os títulos dos anticorpos determinados. Os pontos individuais representam títulos de anticorpos individuais das doze galinhas analisadas por grupo, a barra mostra o valor médio com desvio padrão. Nos controles, após o challenge, foram determinados apenas os títulos dos anticorpos das galinhas sobreviventes. É mostrado, que já através da vacinação “one Sshot' com a levedura de subunidade VAK 1171, é obtida uma proteção total contra uma carga subsequente com vvIBDV.

[0132] A Figura 12 mostra a caracterização das cepas VAK952 e VAK1283. (A) As cepas de levedura VAK952 (HA monovalente) e VAK 1283 (HA bivalente, M1) foram pré-incubadas em YPD no balão agitador e, em seguida, induzidas em YPL durante 6 horas. A densidade óptica foi medida a 600 nm e colhidas 30 unidades de OD da cultura, o pellet foi desintegrado com pérolas de vidro e a fração de proteína solúvel (LF), assim como a insolúvel (P, pellet) foi examinada no imunoblot. Como anticorpos primários foram usados o a-HA1 ou a-M1 e como anticorpos secundários, o a-mouse-IR-Dye800CW. O sinal foi gerado através de um sistema de imagem infravermelho (LI-COR Biosciences). (B, C) As cepas de levedura foram pré-incubadas no balão agitador e, em seguida, induzidas em YPL durante um período de 24 horas. Nos períodos especificados, determinou-se a densidade óptica e colhidas 30 unidades OD. (B) Os pellets de VAK1283 foram desintegrados com pérolas de vidro e analisadas no imunoblot. (C) Os valores medidos para a densidade óptica de VAK952 e VAK1283 foram resumidos dependendo do tempo como curva de crescimento e divididos a partir de pelo menos dois ensaios independentes um do outro. (D) para o teste de pontos, as cepas de levedura foram cultivadas em placas de agar nutritivo contendo YPD durante 48 horas a 30ºC. Iniciando com 1 unidade de OD, as leveduras foram diluídas em série e, em seguida, gotejadas em placas de ágar nutritivo contendo YPD ou YPL. As placas foram cultivadas durante 48 horas a 30ºC e, em seguida, fotografadas. Ponceau S: coloração da proteína total da levedura da respectiva fração, controle de carga. É mostrado, que o VAK952 (HA monovalente) e o VAK1I283 (bivalente (HA, M1), expressam a proteína HA em quantidades comparáveis. Além disso, é mostrado, que o VAK1283 e VAK952 apresentam propriedades de crescimento comparáveis, com leves vantagens do VAK1283.

[0133] A Figura 13 ilustra os títulos dos anticorpos no soro de camundongos BALB/c após imunização com VAK952 (HA monovalente), assim como VAK1283 (HA bivalente, M1) antes e após a infecção oportunista. Ambas as cepas de levedura foram pré-incubadas no balão agitador com YPD e, em seguida, induzidas em YPL durante 12 horas (VAK952) ou 6 horas (VAK1283). Em seguida, as culturas foram colhidas, liofilizadas e o material de levedura foi inativado a 90ºC durante 2 horas. Para a imunização, camundongos BALB/c fêmeas, com 9 semanas de vida, foram imunizadas por via subcutânea no intervalo de três semanas, duas vezes (prime-boost) ou uma vez (one shot) com 2 mg de levedura (VAK952, VAK1283) ou com 1 mg de VAK1283 ou duas vezes com PBS (sem adjuvante). Como adjuvante foi usado AddaVax. Três ou seis semanas após a última aplicação, os aminais foram infectados por via nasal com o 5x MLDso do vírus da Influenza A/PR/8/84 (HIN1I). Como controle de infecção serviram animais com infecção simulada (simulação), aos quais foi aplicado apenas PBS sem vírus. Três ou seis semanas após a última aplicação, assim como durante a infecção oportunista, obteve-se o soro dos animais e esse foi examinado no VNT para anticorpos neutralizantes (nAK). Títuloso nAK: diluição do soro, que reduz o número de plaquetas ainda em torno de 50%, em comparação com o controle livre de vírus. É especificado o log2 da diluição correspondente do soro. Com base na plotagem logarítmica, atribuíram-se às amostras de soro sem anticorpos detectáveis o valor: log2(2)=1. mAK: Controle do sistema de teste (a-H1 (H37-66)). É mostrado, que ambos os esquemas de imunização levam a uma indução significativa do Ak neutralizante. Além disso, é evidente, que os títulos dos anticorpos anti-HA neutralizantes obtidos nos experimentos de vacinação prime-boost realizados, como também nos one shot realizados com VAK952 e VAK1283, não se diferenciam de forma significativa.

[0134] A Figura 14 mostra a infecção oportunista com Influenza A/PR/8/34 (HIN1) após imunização com VAK952 (HA monovalente) assim como VAK1283 (HA bivalente, M1). Três a seis semanas após a última aplicação (esquema de imunização, vide Figura 13) os camundongos BALB/c foram infectados por via nasal com o 5x MLDso do vírus da Influenza A/PR/8/34 (H1IN1). Como controle de infecção serviram animais com infecção simulada (simulação), aos quais foi aplicado apenas PBS sem vírus. Em seguida, a sobrevivência (A), o peso (B), assim como os sintomas clínicos (C) dos animais foram examinados várias vezes ao dia durante um período de 14 dias. Para os sintomas clínicos foi estabelecido um escore de 0-4, que foi dividido para cada grupo (0: sem anormalidades; 1: pelo levemente desgrenhado; 2: pelo desgrenhado, atividade reduzida, 3: pelo desgrenhado, perda de peso corporal de 15%; 4: pelo desgrenhado, perda de peso corporal de >20%). É mostrado, que o processo de imunização prime-boost com VAK952 não protege de forma ideal contra uma carga de vírus, enquanto esse é o caso no VAK1283. O esquema one shot com as duas vacinas produz uma ótima proteção com 2 mg da vacina administrada. Com 1 mg administrada com VAK1283 obtém-se uma taxa de proteção semelhante aos 2 mg de VAK952 no processo prime-boost. Exemplos de execução Exemplo 1:Produção de uma cepa hospedeira com duas cópias de genes KIGALA4, integradas de forma estável, em sítios de genes não acoplados

[0135] Uma segunda cópia de genes KIGAL4 sem marcador de seleção foi inserida em um outro locus (ectópico). A inserção pôde ser localizada através de sequenciação no gene KIAVT3 (KLLAOE13795g) (Klavt3::KIGAL4-1, SEQ ID nº: 1) (Figura 1). A cepa resultante chama- se VAK1111. Através de um experimento de cruzamento, foi confirmada a segregação meiótica independente das duas cópias de KIGAL4, que se situam no cromossoma E (cópia ectópica) e D (cópia genômica). No mesmo experimento foi verificado, além disso, o número de exatamente duas cópias de genes KIGAL4-1 no genoma.

[0136] Para usar o VAK1111 para a integração direcionada de um cassete de expressão no locus LAC4 de maneira análoga ao VAK367- DA, introduziu-se a interrupção do /ac4::ScURA3, que permite em uma etapa, selecionando o crescimento da lactose, integrar o gene estranho desejado por meio da tecnologia do vetor Klp livre de marca entre o promotor LAC4 e a fase de leitura LAC4 (Krijger et al (2012)). A cepa resultante VAK1123 diferencia-se da VAK367-D4 meramente pela segunda cópia de genes KIGAL4 ectópica. Exemplo 1.1:Produtividade melhorada de uma cepa de vacina de levedura com gene KIGAL4 integrado

[0137] Em um exemplo de aplicação, o gene IBDV-oVP2712s (Arnold et al (2012)) foi inserido no locus LAC4 da cepa VAK1123 (cepa resultante VAK1130). Foi possível verificar uma produção aumentada de IBDV-VP2 em comparação com a cepa normalmente isogênica com apenas uma cópia de KIGAL4 (VAK910). Como comparação, é mostrada, além disso, a cepa VAK1118, que porta apenas um gene KIGALA4, mas duas cópias de CDS VP2igpv (vide abaixo) (Figura 2). Exemplo 2:Promotor Prac412-.r2' com atividade basal reduzida para a otimização da expressão de antígenos com efeito citopático.

[0138] A produção de proteínas heterólogas em microrganismos é problemática, se essa levar a um efeito citopático (CPE). Por conseguinte, a tarefa foi a de encontrar um meio para desacoplar a fase de produção de antígenos da fase de acumulação de biomassa. Através do promotor LAC4 induzível, isso é parcialmente possível através de um processo de fermentação Fed-batch, mas é dificultado, visto que o promotor Prac4-12 não é totalmente parado em condições não indutoras. Nos antígenos com CPE muito forte ocorre uma redução da taxa de crescimento e uma indução da resposta de estresse celular, com efeitos desvantajosos sobre a produção de antígenos. Através da duplicação da dose do gene KIGAL4 e/ou aumento do número de genes que codificam antígenos (vide acima), esse problema é intensificado. Para a resolução, a basal control region (BCN) do promotor Praca-r2 (Figura 3A) (Mehlgarten et al (2015)) é excluida entre -1065 e -1540 (eliminação LR2; Pracan2-1r82; SEQ ID nº: 2). Essa eliminação foi introduzida nas cepas de partida VAK367 (uma cópia de KIGAL4) e VAK1111 (duas cópias de KIGAL4) no locus LAC4 genômico juntamente com a interrupção de /ac4::ScURA3. As cepas VAK1109 e VAK1124 resultantes são adequadas para a expressão de antígenos com CPE. O promotor Praca121r2 também foi usado nos vetores integrativos KIpURAS3-Et e KIDMETS5-Et (vide acima). Exemplo 2.1:Inibição da expressão de antígenos basal (não induzida) através de promotores modificados.

[0139] Após a integração de um cassete de expressão tandem- IBDV-VP2 em VAK1124 (cepa de levedura restante: VAK1131; para o esclarecimento do termo “cassete de expressão tandem', vide abaixo e Figura 7), foi possível mostar, que como consequência da eliminação de LR2 no promotor LAC4-12, a produção da proteína VP2 é maciçamente reduzida em condições não indutoras (Figura 3B). Com cepas, que expressam o antígeno de Influenza A hemaglutinina (VAK952 sem eliminação, VAK1I243 com eliminação de LR2 no promotor), pode ser mostrado, que o efeito citopático do antígeno A-HA da Influenza é suprimido e o crescimento em condições não indutoras melhora através da eliminação de LR2 (Figura 3C). Exemplo 3:Sistema de vetor versátil para a integração direcionada de múltiplos cassetes de expressão no genoma K. lactis

[0140] A cepa de levedura VAK367 forma, tal como já acima para VAK367-DA4 (Krijger et a/ (2012), WO 20101054649), a base genética de todas as cepas de K. lactis aqui descritas. Essa base da cepa apresenta, através de mutações em dois genes, KIURA3 (KLLAOE22771g9) e KIMET5 (KLLAOBO3S938g), que são designados como alelos Klura3-20 (par de bases ausente na posição +345) e KlImet5-1 (G2555A; e A3682T), uma necssidade de uracila e metionina (auxotrofia); os alelos são, portanto, variantes de genes não funcionais.

[0141] Esses alelos mutados foram usados para, além do sítio de integração LAC4 já fechado com o KIp3/KIp3-MCS (Krijger et al (2012)), utilizar outros loci para a integração direcionada e, com isso, gerar cepas de vacina multivalentes (Figura 4A). A seleção ocorre através do restabelecimento da função gênica desses genes mutados sem inserção adicional de um marcador de seleção. Para isso, foram criados outros vetores de integração. Nesses vetores, os cassetes de expressão (respectivamente com o controle do promotor LAC4-12 ou de suas variantes) são flanqueados através de seções do gene, que permitem a integração a montante do gene KIURA3 ou a jusante do gene KIMET5 através de recombinação homóloga e, neste caso, restabelecem as sequência de tipo selvagem desses genes. Através de mutagênese e seleção para auxotrofia para substâncias de crescimento alternativas, outros loci podem ser incluídos de maneira análogo como sítios de integração.

Exemplo 3.1:Vetores KIDURA3 e KIpMETS5 para a integração direcionada de cassetes de expressão (com promotor LAC4-12 induzível) nos loci KIURA3 (KLLAOE22771g9) elou KIMETS (KLLAOBO03938g) de cepas de K. lactis com o alelo Klura3-20 ou KiImet5-1.

[0142] Por meio de fragmentos de genes adequados (KMETS/KURA3 targeting sequences) que permitem um restabelecimento direcionado da funcionalidade dos alelos Klura3-20 ou KlImet5-1, foram construídos os vetores de expressão integrativos KIpuRA3 (SEQ ID No.: 3) e KIDMET5 (SEQ ID No.: 4).

[0143] O vetor de expressão KIDMET5 contém o cassete de expressão, que consiste no promotor LAC4-12 (Praca12 OU SUas variantes), na sequência codificadora de aminoácidos do antígeno a ser expresso, assim como no terminador AgTEF1; essa é flanqueada a montante do fragmento genômico KIMET5 com teminador ScCYC1 introduzido e a jusante pelo promotor KIAIMI18 com gene KIAIM1I8 conectado a jusante.

[0144] O vetor de expressão KIpDURA3 contém o cassete de expressão, que consiste no promotor LAC4-12 (Praca12 OU SUas variantes), na sequência codificadora de aminoácidos do antígeno a ser expresso, assim como no terminador AgTEF1; essa é flanqueada a montante pelo KLLAOE22749g com respectivo promotor e a jusante pelo promotor KIUURA3 com fragmento de KIURA3 ligado a jusante (Figura 4B, C).

[0145] A sequência codificadora do antígeno é clonada respectivamente através de pontos de interseção Ascl e Notl entre o promotor e o terminador. Através da restrição com Eco911 ou Kpnl do plasmídeo resultante, todo o cassete de expressão da coluna vertebral do vetor KIpURA3, com Hindlll ou Boxl é separado do KPpMET5 e a preparação de restrição em cepas hospedeiras de K. lactis é transformada com alelo de Klura3-30 e/ou KImet5-1. O cassete de expressão integrado dessa maneira em Klura3-20 e/ou KImet5-1 com gene estranho corresponde, portanto, exatamente àquele, que também pode ser integrado em VAK367-D4 com o vetor KIp3-MCS em LAC4 (WO 20101054649). A verificação dos transformantes prototróficos uracila ou metionina ocorre de forma padronizada através da colônia PCR com os primers MAB6 e VK211 para KIpMETS5 ou os primers MAB6 e VK71 para KIpURAS. Na integração do cassete de expressão no sítio alvo correto entre KIURA3 ou KIMETS e o gene respectivamente adjacente, resultam produtos com o tamanho de 1652 pb para transformantes KIDMET5 ou 1307 pb para transformantes KIpURA3. Não foram obtidas quaisquer referências de que a funcionalidade dos genes adjacentes é prejudicada através da inserção. Primer: MABEB6: 5-CCCAGATGCGAAGTTAAGTG-3"' (SEQ ID No.: 11) VK71: 5-TACAACAGATCACGTGATCTTTTTGTAAG-3' (SEQ ID No:: 12) VK211: 5-GATTTCGTAACCCTATTGTTCATGAATG-3' (SEQ ID No:: 13) Exemplo 3.2:Expressão de um antígeno estranho após a integração do cassete do gene codificador no locus KIURA3 ou KIMETS.

[0146] Um gene estranho com o controle do promotor Praca-12, após a integração no locus LAC4, KIURA3 e KIMETS, é induzido aproximadamente com a mesma força através da lactose. A subunidade B não tóxica, instável ao calor da enteroxina (Etx.B) de E. coli e um epítopo (HA); no terminal C (Etx.B-HA), serviu como proteína de teste para a avaliação do sistema de vetor. A sequência codificadora foi clonada nos vetores KIDMETS5, KIpURA3 e KIp3-MCS e integrada aos loci dos genes KMET5 (VAK1I251), KIURA3 (VAK1235) e LAC4 (VAK899) (Figura 4D). Tal como foi mostrado no Western Blotting, a concentração da proteína Etx.B-HA em todas as três cepas é muito semelhante (Figura 4D). Portanto, não foi possível identificar qualquer efeito de posição, dependendo do sítio de integração do cassete de expressão no genoma, sobre a quantidade de produção de proteína recombinante. Exemplo 3.3:Expressão Ko de dois antígenos estranhos na mesma célula de levedura.

[0147] A possibilidade de produzir, através do novo sistema de vetor, diversas proteínas heterólogas com o controle do promotor Praca 12 Na Mesma cepa de levedura, pôde ser mostrado através da construção de uma cepa de levedura com um cassete de expressão

Etx.B-HA no locus KIURA3 e em um cassete de expressão no locus LACA4 com duas cópias de VP2i8nDv, que estavam presentes como tandem (VAK1234; Figura 5; para esclarecimento do cassete tandem, vide abaixo e na Figura 7). Em comparação com as cepas de leveduras, nas quais respectivamente apenas um dos cassetes de expressão estava presente no genoma (VAK1235 ou VAK1171), no VAK1234 não foi verificada qualquer redução da concentração de proteína de Etx.B- HA ou VP2BDv. Exemplo 4:Variantes do promotor LACA4 para a modulação da síntese de proteína recombinante em condições de indução semelhantes

[0148] O efeito imunogênico de antígenos baseia-se muitas vezes na montagem de diversas proteínas em razão não estequiométrica. Para possibilitar isso em vacinas à base de levedura, foram geradas variantes do promotor Praca-12.r2(Figura 6A), que podem ser induzidas com diferente força pela lactose ou galactose. Essas são caracterizadas pelo número de sítios de ligação para o ativador KIGal4 (U1, U2, U4, U5; Gôódecke et al. (1991)) e pela presença ou ausência da região de controle basal BCR. Adicionalmente às construções mostradas na Figura 3A, que foram usadas no vetor KIDURA3, é possível produzir outras variantes de promotores com força aumentada do promotor, através da inserção de outros sítios de ligação. Com isso, resultam promotores sintéticos, que podem ser induzidos pela lactose, para ampliar o sistema de vetor e podem ser realizadas diferentes taxas de produção de proteína ou de expressão gênica nas mesmas condições de indução. Exemplo 4.1:Expressão de um antígeno estranho com o controle de diversas variantes do promotor LAC4

[0149] Expressão de Etx.B-HA com o controle de quatro variantes do promotor LAC4. São testadas quatro variantes do promotor LACA4,

que se diferenciam pelo número dos sítios de ligação para o ativador de transcrição KIGal4, assim como pela presença/ausência de uma região de controle para a expressão basal em condições não indutoras (basal control region, BCR; Figura 6A, SEQ ID nº: 14). Com essas foram geradas as variantes do vetor KIpDURA3 KIPDURA3-PL412-Et, KIpDURA3- PL412LR2-Et, KIDURA3-PL4-Et e KIPDURA3S-PLA4LR?2 e a proteína Etx.B- HA foi respectivamente inserida como GOI de teste. A inserção de GOI alternativo, tal como descrito acima, é possível através das interseções Ascl e Notl. Os cassetes de expressão foram integrados no locus KIURA3 e a concentração de proteína de Tx.B-HA foi quantificada através de Western-Blotting (Figura 6B). É mostrado, que em condições de indução idênticas (4 horas em meio total com lactose), a variante do promotor Praca-12 mais longa, que compreende toda a região intergênica entre LAC4 e LAC12 e contém quatro sítios de ligação KIGal4 (U1, U2, U4, U5) (Gódecke et al (1991)), leva à maior concentração de proteína. Quando estão presentes apenas os dois sítios de ligação LAC4 proximais U1 e U2 (-1064 até -10), a eliminação adicional do BCR (- 1540 até -1065) age também em condições indutoras reduzindo a proteína.

Exemplo 5:Aumento da produção de antígeno através do aumento do número de cópias do gene codificador de antígeno.

[0150] Por conseguinte, o sistema de vetor descrito acima foi modificado, para ligar de forma rápida e eficiente várias cópias de genes sucessivamente e introduzir esse cassete de expressão em uma etapa em um dos três loci de genes (Figura 7A). Para produzir um cassete de expressão tandem, que pode ser integrado a um locus LACA4, três fragmentos amplificados por PCR são fusionados em uma etapa por uma matriz KIp3(-MCS)-GO! aleatória (In-Fusion Cloning): (1 e 2) cassete de expressão com Pracair2 E TrerF (primer: VKSO0&VK31 ou VK32&VK33) e (3) LAC4 targeting sequence (VK34&VK35)). Apos a restrição, por exemplo, com Hpal, o cassete de expressão tandem, tal como descrito, pode ser integrado ao locus /lac4::URA3 (Figura 7). Após a integração bem sucedida do cassete de expressão, a primeira cópia do gene estranho é regulada, dependendo da cepa de partida, ou através de Praca12 OU Praca121R2 E a segunda através de PracaLra. Alternativamente, através da inserção de um marcador de seleção entre os dois cassetes de expressão nas interseções Smil, Mlul ou Pmel e separação do LAC4 targeting sequence através de Kpnl/, resulta um cassete tandem, que pode ser integrado sem direção no genoma através de NHEJ. Se o cassete de expressão é recortado com Mrel e Aval, as extremidades compatíveis podem ser ligadas e, com isso, gerados cassetes de expressão múltiplos longos. Através de restrição repetida com Mrel e Aval, os fragmentos na mistura de ligação são enriquecidos, nos quais os cassetes de expressão estão dispostos em tandem (cabeça na cauda). Esses são transformados e, com seleção, são integrados sem direção no marcador. Primer: VK30: 5-

TATAGGGCGAATTGGAGCTCCGCCGGCGGAAGAGGTAACGCCTT TTGTTAAC-3' (SEQ ID No.: 15) VK31: 5- CTAAACGGAACTCGCATTTAAATCTCGTTTTCGACACTGGATGG-3' (SEQ ID No.: 16) VK32: 5º

GCGAGTTCCGTTTAGACGCGTTTAAACTTGTTTAATTATTATGGGG CAGGCGAGA-3' (SEQ ID No:: 17) VK33: 5- CGGGGAATGCGCTGCTTTTCEGACACTGGATGGCGGCGTTA-3'

(SEQ ID No.: 18) VK34: 5- GCAGCGCATTCCCCGGGTACOGCTCTCGACTAGGTGATTAGCG-3'" (SEQ ID No.: 19) VK35: 5-

AAAAGCTGGGTACCGGGCCCACTAGTCGAGAGTTAACCGTGACTA CAGCTA-3' (SEQ ID No.: 20) Exemplo 5.1:Aplicação bem sucedida da estratégia de múltiplas cópias

[0151] A estratégia foi confirmada com IBDV-VP2 como antígeno e um cassete de expressão derivado de KIp3, que contém duas sequências codificadoras de INDV-VP2 (CDS-VP2epyv) em tandem. O cassete de expressão tandem-IBDV-VP2 (Figura 7A) no vetor Klp3 (plasmídeo Klp3-tandem-oVP212s,SEQ ID nº: 21) consiste em duas sequências codificadoras reguladas pelo promotor LAC4 para VP2e8Dv (CDS-VP2BDvy) de KIp3-MCS-oVP212s (Arnold et al (2012)) As sequências dos promotores consistem na região -1123 até -10 do promotor LAC4 para a primeira cópia e -1099 até -10 para a segunda cópia. Ambos os CDS- VP2iepyv são flanqueados na extremidade 3' por um terminador AgTEF1. O plasmídio KLp3-tandem-oVP2r72s foi cortado com Hpal e a preparação de restrição foi transformada na cepa VAK367- DA4. A cepa de levedura VAK1118 assim produzida contém o cassete de expressão tandem integrado ao locus LAC4. Tal como mostrado pelo Western-Blotting, uma maior concentração de proteína IBDV-VP2 está presente nessa cepa em comparação com a cepa isogênica com apenas uma cópia (Figura 7B). O cassete de expressão tandem é geneticamente muito estável: após o crescimento durante 78 gerações em meio indutor (YNB + lactose), menos de 100 colônias testadas por PCR não mostraram qualquer modificação genética do cassete de expressão dados.

Exemplo 6:Ferramentas para a produção de uma prototrofia em cepas de K. lactis para a fermentação simplificada em meio sintético e meio total.

[0152] Em estudos realizados, foi mostrado, que cepas de leveduras auxotróficas para uracila crescem menos em meio total do que cepas prototróficas para uracila, um efeito que só poderia ser parcialmente suprimido pela adição de uracila. Para simplificar a fermentação das cepas de vacina, facilitar o estabelecimento dos processos de produção e tornar a mesma mais eficiente quanto aos custos e evitar efeitos do crescimento através da absorção insuficiente de metionina e/ou uracila, deveriam, por conseguinte, ser encontrados meios, para obter a anulação dessas auxotrofias necessárias para a construção das cepas de modo rápido e reproduzível. Para a reconstituição de KIURA3 a partir de Klura3-20, é gerado um fragmento de DNA através de PCR com auxílio dos primers VK67 e VK69 e com o tipo selvagem do gene KIURAS3 como matriz (Figura 8A). Para reparar o alelo KImet5-1, é gerado de maneira análoga, um fragmento de PCR com auxílio dos primers VK74 e VK75 e com o alelo do tipo selvagem KlImet5 como modelo (Figura 8B). A transformação dos fragmentos de PCR nas cepas mutadas correspondentes (individualmente ou em conjunto) e seleção em meio sem metionina e/ou sem uracila, leva à reconstituição altamente eficiente dos alelos de tipo selvagem. Esse processo foi realizado, entre outros, para gerar as cepas VAKI171 e VAK1400 (vide acima). Primer VK67: 5-GACATCACTGTCTCTTCCCCTTAATGATC-3' (SEQ ID No.: 22) VK69: 5-TCAGCAAGCATCAATAATCCCCTTGGTTC-3' (SEQ ID No.:: 23) VK74: 5-GAMAGAAAGACGTTGGTCTCTACGCTTG-3' (SEQ ID No::

24) VK75: 5-AGATTATAAGTTCCTGGGGCTTTACCCAC-3' (SEQ ID No.: 25) Exemplo 7: Imunização protetora através de leveduras de vacinas inativadas otimizadas

[0153] As modificações e otimizações da plataforma de vacina de K. lactis ocorridas de acordo com os exemplos 1 a 5 foram validadas em diversos estudos de vacinação. Exemplo 7.1:Imunogenicidade de uma plataforma de vacina de K. lactis otimizada, no exemplo de uma cepa de levedura IBDV-VP2 (VAK1127).

[0154] A cepa VAK1127 contém um cassete de expressão tandem IBDV-VP2 (SEQ ID nº: 21), duas cópias de KIGAL4 e a eliminação LR2 no promotor LAC4. Para a caracterização da imunogenicidade da cepa de levedura foram realizados ensaios de imunização no organismo alvo galinha. Em experimentos challenge obteve-se uma proteção total de galinhas SPF contra a cepa IBDV 89163/7.3 altamente virulenta (vv), bem caracterizada por Eterradossi e Colegas (1997) (AFSSA, Ploufragan, França) (tabela 1 e 2). Nos dois ensaios realizados de forma independente, aplicou-se, para esse fim, duas vezes (Figura 9A e B), por via subcutânea, 1 mg de levedura liofilizada, inativada por calor (2 horas, 90ºC) (VAK1127) com adjuvante de Freund incompleto (IFA) (prime-boost). As aplicações ocorreram duas semanas e quatro semanas após a eclosão, a carga viral (challenge) seis semanas após a eclosão. Depois de 19 dias, já podem ser medidos nos animais vacinados com VAK1127 altos títulos de anticorpos anti-|BDV-VP2. Nos controles, aparecem títulos de anticorpos anti-|BDV-VP2 apenas após o challenge com vIBDV (Figura 9). Nos dois experimentos foi observada uma proteção total (0% de morbidade, 0% de mortalidade) dos animais vacinados com VAK1127 contra o challenge com vvIBDV (tabela 1 e 2).

Com esses experimentos em um processo de vacinação prime-boost foi possível observar uma proteção contra vvIBDV com uma vacina de subunidade.

[0155] A imunogenicidade das leveduras de vacinação não é influenciada pela remutação genética para cepas de leveduras prototróficas que portam antígeno. Isso poderia ser mostrado com auxílio das formas respectivamente auxotróficas ou prototróficas de uma cepa de levedura IBDV-VP2 em um experimento de vacinação no camundongo (Figura 10C). A cepa de levedura VAK1127 (auxotrófica), tal como descrito acima (exe 6; Figura 8), foi tornada prototrófica em duas etapas com fragmentos PCR para criar a VAK1171. Ambas as formas de cepa não apresentam diferença significativa no nível de expressão da proteína recombinante (Figura 10A e B). Os camundongos foram vacinados três vezes por via subcutânea em intervalos de duas semanas com 0,1 mg de levedura inativada por calor por via subcutânea com IFA. Entre a cepa IBDV-VP2 auxotrófica (VAK1127) e o descendente prototrófico (VAK1171) não foi possível verificar qualquer diferença na força da soroconversão (Figura 10C). Exemplo 7.2:Proteção total através da vacinação em um esquema “one shot

[0156] Uma vacinação “one shot”, isto é, vacinação através de aplicação única da vacina, geralmente não é eficaz com vacinas de subunidades devido à imunogenicidade deficiente. Os dados obtidos com a cepa VAK1127 otimizada no processo prime/boost para o desenvolvimento dos títulos de anticorpos (Figura 9) apontaram, contudo, para a possibilidade, de obter uma proteção também em uma preparação one shot. Para examinar isso, foi realizada uma vacinação one shot com a cepa de levedura prototrófica VAK1171 (Figura 11; tabela 3). Para esse fim, a levedura foi aplicada apenas uma vez, para isso, em dose aumentada (10 mg) e, depois, no intervalo de 4 semanas,

foi realizada um challenge. Foi mostrado, que com VAK1171 com “one shot' pode ser obtida realmente uma proteção total contra vvIBDV (0% de morbidade 0% de mortalidade) (tabela 3). Esse resultado é atribuído ao desenvolvimento de altos títulos de anticorpos protetores, cerca de dias apos a vacinação (Figura 11). O fato, de que o esquema de vacinação one shot protege de maneira altamente protetora contra wIBDV, mostra o forte potencial imunogênico da vacina usada e valida de maneira impressionante a plataforma de vacina otimizada. Exemplo 7.3:Proteção melhorada de uma vacina de levedura bivalente em comparação com uma vacina de levedura monvalente na aplicação contra infecções do virus da Influenza A.

[0157] Para a vacinação contra o virus da Influenza do tipo A, foram geradas três diferentes cepas de vacina. Por um lado, foi gerada a VAK952 (DSM 32705), a do antígeno principal de uma cepa da Influenza A (Puerto Rico/8/1934; PR8/34) que expressa o gene HA (hemaglutinina). O gene está integrado na VAK952, da maneira descrita por Krijger et al (2012) e Arnold et al (2012), no locus LAC4 no genoma. Em segundo lugar, é gerada a VAK1I283 (DSM 32697). Aqui, adicionalmente ao gene HA de PR8.34 no locus LACA4, também o gene M1 está integrado no locus URA3. O gene M1 codifica para um outro antígeno importante da Influenza A, que é significativamente mais conservado do que o HA. Em relatos já publicados foi possível mostrar, que através da combinação dos dois antígenos, a imunogenicidade de uma vacina contra Influenza A pode ser aumentada e também é possível obter uma proteção cruzada contra diversos virus da Influenza. Para validar também este aspecto com uma vacina de levedura bivalente, foi gerada uma outra cepa (VAK1I395; DSM 32706), que contém também o gene M1 no locus URA3 e onde o gene HA de PR8/34 é substituído pelo gene HA do virus da Influenza California/4/2009. À expressão comparável de HA ou a expressão adicional de M1 das respectivas cepas foi examinada; do mesmo modo foi mostrado, que as cepas apresentam um crescimento comparável, com leves vantagens na VAK1I283 comparada com a VAK 952 (Figura 12). Em estudos de vacinação, nos quais foram aplicados respectivamente um esquema prime-boost ou one shot com diferentes concentrações de levedura no modelo de camundongo, foi mostrado, que a VAK952 e VAK 1283 induzem respectivamente títulos comparáveis de anticorpos neutralizadores de virus (Figura 13). Mas no experimento challenge, então, ficou evidente, que a vacina VAK1283 bivalente tanto no esquema prime-boost como também no esquema one shot, é possível uma proteção máxima, enquanto esse não é o caso com a vacina VAK952 monovalente.

Além disso, com a vacina VAK1I283 no experimento one shot, obteve-se um efeito protetor semelhante na metade do material de levedura usado, tal como com a VAK952 na preparação prime-boost (Figura 14 e tabela 3). Em experimentos, nos quais a VAK1395 foi usada como vacina, também foi possível verificar uma proteção contra a Influenza PR8/34. Com isso, com uma vacina de levedura bivalente, obteve-se uma proteção cruzada contra diversas variantes de Influenza.

Tabela 1 Indicações para a proteção de carga em galinhas SPF vacinadas vacinaç lesões histopatológicas da bursa Índice bu/bod (c)

0,25 1127 | um IFA 8 1 440 + 489 + 010 [o10

0,76 0,63 PBS IFA 10 |408 + /492 +|(100) [810 1,91 0,94 80)

Tabela 2 Indicações para a proteção de carga em galinhas SPF vacinadas Vacina- lesões histopatológicas da bursa Índice bu/bod (c) ção (a) avaliação cepa VP2 de quantida morbi | mortali leved | de por aduv |O 1 2 3 4 contamin | não dade | dade ura dose de | ante ado contamin | (%) (%) (e) (VAK) | vacina ado (d) 1127 |41 +|IFA 6 |- - 510 + 481 +|09(0)|09(0) 0,71 pg 0,78 1,20 PBS IFA 409 +|532 +99 |70 1,87 0,85 (100) | (78) Tabela 3 Indicações para a proteção de carga em galinhas SPF vacinadas Vacina- lesões histopatológicas da bursa Índice bu/bod (c) ção (a) avaliação cepa VP2 de quantid morbi | mortali leved | ade por | adjuv | O 1 2 3 4 contamin | não dade | dade ura dose de | ante ado contamin | (%) (%) (e) (VAK) | vacina ado (d) PBS ) nenhum | MF59 | - - - 373 + 477 +|69 69 a 1,92 1,02 (100) | (66) 10/10 VAK3 | nenhum | MF59 | - 10 |4, 09 +|360 +|(100) [910 67 a 1,58 0,89 (90) VAK1 | 35+42 |IFA [10 448 + 396 +|/010 [010 171 Jum 0,37 1,02 G) (0) Esclarecimentos para a tabela 1

[0158] (a) As galinhas foram vacinas duas semanas após a eclosão por via subcutânea com 1 mg de levedura (ou PBS) e IFA como adjuvante. Duas semanas após a vacinação elas foram submetidas, da mesma maneira, ao boost. Duas semanas mais tarde ocorreu o teste de carga viral por meio da via oculonasal com 10º EID vvIBDV (very virulent

89163/7.3). A levedura inteira, inativada da cepa VAK1127 foi usada como levedura de vacina, como controle de infecção serviu um grupo, que foi vacinado apenas com PBS e IFA. Como controle para o efeito apenas da levedura, atuou um grupo, no qual foi aplicada a levedura de tipo selvagem sem antígeno (VAK367).

[0159] (b) A avaliação das lesões histopatológicas da bursa ocorreu com uma escala de 0-4: 0: sem lesões; 1: 5-25% dos folículos atingidos; 2: 26-50% dos folículos atingidos; 3: 51-75% dos folículos atingidos; 76- 100% dano da bursa (perda de estrutura).

[0160] (c) O valor médio do índice da bursa para peso corporal (bu/bod) foi calculado com a fórmula: (peso da bursa/peso corporal)“ 1000. O grupo de controle não contaminado consistiu em pelo menos sete galinhas, o grupo contaminado, em dez. O desvio padrão é indicado.

[0161] (d) A morbidade é representada como número de galinhas mórbidas por número de galinhas de todo o grupo. O índice de porcentagem de galinhas mórbidas é mostrado entre parênteses.

[0162] (e) A mortalidade é representada como número de galinhas mortas por número de galinhas mortas de todo o grupo. O índice de porcentagem de galinhas mortas é mostrado entre parênteses. Esclarecimento para a tabela 2

[0163] (a) As galinhas foram vacinas duas semanas após a eclosão por via subcutânea com 1 mg de levedura (ou PBS) e IFA como adjuvante. Duas semanas após a vacinação elas foram submetidas, da mesma maneira, ao boost. Duas semanas mais tarde ocorreu o teste de carga viral por meio da via oculonasal com 10º EID vIBDV (very virulent 89163/7.3). A levedura inteira, inativada da cepa VAK1127 foi usada como levedura de vacina, como controle de infecção serviu um grupo, que foi vacinado apenas com PBS e IFA.

[0164] (b) A avaliação das lesões histopatológicas da bursa ocorreu com uma escala de 0-4: 0: sem lesões; 1: 5-25% dos folículos atingidos; 2: 26-50% dos folículos atingidos; 3: 51-75% dos folículos atingidos; 76- 100% dano da bursa (perda de estrutura).

[0165] (c) O valor médio do índice da bursa para peso corporal (bu/bod) foi calculado com a fórmula: (peso da bursa/peso corporal)“ 1000. O grupo de controle não contaminado consistiu em pelo menos cinco galinhas, o grupo contaminado, em nove. O desvio padrão é indicado.

[0166] (d) A morbidade é representada como número de galinhas mórbidas por número de galinhas de todo o grupo. O índice de porcentagem de galinhas mórbidas é mostrado entre parênteses.

[0167] (e) A mortalidade é representada como número de galinhas mortas por número de galinhas mortas de todo o grupo. O índice de porcentagem de galinhas mortas é mostrado entre parênteses. Esclarecimento para a tabela 3

[0168] (a) As galinhas foram vacinas duas semanas após a eclosão por via subcutânea com 10 mg de levedura (ou PBS) e IFA como adjuvante. Quatro semanas mais tarde ocorreu o teste de carga viral por meio da via oculonasal com 10º EID vvI|BDV (very virulent 89163/7.3). À levedura inteira, inativada da cepa VAK1171 foi usada uma vez como levedura de vacina. Como controle de infecção serviu, por um lado, um grupo, que foi vacinado apenas com PBS e MF59, assim como um grupo, que foi vacinado com levedura de tipo selvagem e MF59, a ambos foi administrado um boost duas semanas após a primeira vacinação com a mesma quantidade de levedura ou PBS.

[0169] (b) A avaliação das lesões histopatológicas da bursa ocorreu com uma escala de 0-4: 0: sem lesões; 1: 5-25% dos folículos atingidos; 2: 26-50% dos folículos atingidos; 3: 51-75% dos folículos atingidos; 76- 100% dano da bursa (perda de estrutura).

[0170] (c) O valor médio do índice da bursa para peso corporal

(bu/bod) foi calculado com a fórmula: (peso da bursa/peso corporal)*1000. Cada grupo consistiu em pelo menos nove galinhas. O desvio padrão é indicado.

[0171] (d) A morbidade é representada como número de galinhas mórbidas por número de galinhas de todo o grupo. O índice de porcentagem de galinhas mórbidas é mostrado entre parênteses.

[0172] (e) A mortalidade é representada como número de galinhas mortas por número de galinhas mortas de todo o grupo. O índice de porcentagem de galinhas mortas é mostrado entre parênteses. Sequências

[0173] O pedido de patente contém as seguintes sequências como componente do relatório descritivo: [ssa Ns Tamamção — E erne do promonriacta Pu | [E veses dopronanrtacataPaã E jsssenasdopimavtes

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de Kluyveromyces lactis (K. lactis) para a clonagem direcionada de ácidos nucleicos codificadores de antígeno estranho no genoma da cepa de K. lactis, caracterizada pelo fato de que a cepa de K. lactis, de forma alternativa ou adicional ao locus KILAC4 no locus KIURA3-20 — (KLLAOE227719) elou no locus KIMETS-1 (KLLa0B03938g), apresentam cassetes de expressão integrados para antígenos estranhos.

2. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os cassetes de expressão contêm o promotor de K. lactis LAC4-12 (Prac-12) ou variantes deste promotor, inclusive da região intergênica entre LAC12 e LAC4, a região codificadora de antígenos e o terminador AgTEF1.

3. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que no locus KILAC4 ou no locus KIURA3-20 ou no locus KIMET5-1 das cepas de K. lactis resultantes, são inseridas várias cópias de um ácido nucleico codificador de antígenos estranhos através de cassetes de expressão tandem ou múltiplos.

4. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que no locus KILAC4 da cepa de K. lactis o gene do antígeno estranho IBDV VP2 está presente em forma de um cassete de expressão tandem.

5. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que no locus KILAC4 e/ou no locus KIURA3-20 elou no locus KIMET5-1 são inseridas uma ou várias cópias de diversos ácidos nucleicos codificadores de antígenos estranhos através de cassetes de expressão simples, tandem ou múltiplos.

6. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 5, caracterizada pelo fato de que nos loci KILAC4 e KIURAS3-20 da cepa de K. lactis, são inseridos e são expressos os genes codificadores dos antígenos estranhos Influenza A HA ((A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) e Influenza A M1 ((A/Puerto Rico/8/1934(H1N1).

7. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa de K. lactis contém, adicionalmente ao gene KIGAL4 genômico, mais uma segunda cópia ectópica do gene KIGALA4.

8. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a cópia ectópica do gene KIGAL4, que é flanqueada pelo promotor KIGAL4 e terminador KIGALA, está integrada na cepa de K. lactis no sítio do gene KLLAOE13795g (Klavt3:: KIGAL4- 1, SEQ ID nº: 1).

9. K. lactis, de acordo com as reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que no locus KILAC4 da cepa K. lactis, está presente o gene do antígeno estranho IBDV VP2.

10. Cepa de K. lactis, de acordo com as reivindicações precedentes , em que a cepa de K. lactis apresenta uma estrutura do promotor modificada do promotor LAC4-12, que em condições não induzidas, não permite ou permite apenas uma baixa expressão da proteína estranha, caracterizada pelo fato de que a basal control region (BCR) do promotor Prac-12 é eliminada entre -1065 e -1540 (eliminação LR2; Prac-s2-.r2, SEQ ID nº: 2).

11. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que no locus KILAC4 da cepa K. lactis, está presente o gene do antígeno estranho da Influenza A HA ((A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)).

12. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a cepa de K. lactis apresenta uma estrutura do promotor modificada do promotor LAC4-12, que permite uma modulação da expressão da proteína estranha, caracterizada pelo fato de que o número dos sítios de ligação para o ativador KIGal4 do promotor (“upstream activating sequences” 1, 2 e 4, 5) varia e ou estão presentes 1, 2, 3 ou 4 sítios de ligação KIGal4.

13. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que no locus KILAC4 da cepa K. lactis está inserido o gene do antígeno estranho IBDV VP2.

14. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a função gênica dos alelos Kllac4, Klura3-20 e KImet5-1 é restabelecida e a cepa de K. lactis é prototrófica.

15. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que nos loci KILACA4, KIURA3S-20 e KIMet5-1 da cepa de K. lactis, estão inseridos os genes dos antígenos estranhos do ectodomínio BVDV E2 (tipo 1, CP7), do ectodomínio BVDV E2 (tipo 2, Nova York 93) e BVDV Npro-NS3 (tipo 1, CP7).

16. Cepa de K. lactis, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir das cepas: VAK952 DSM 32705; VAK1111 DSM 32696; VAK1118 DSM 32701; VAK1131 DSM 32700; VAK1I171 DSM 32699; VAK1243 DSM 32702; VAK1283 DSM 32697; VAK1395 DSM 32706 e VAK1400 DSM 32698.

17. Vetor de expressão integrativo, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de KIpDURA3 (SEQ ID Nº: 3) ou KIDoMET5

(SEQ ID Nº: 4).

18. Vetor de expressão integrativo, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de KIDpMET5-PL4-12-Et, KIDpMET5-PL4- 12-LR2-Et, KIDMET5-PL4-Et, KIDMET5-PL4-LR2-Et, assim como KIpURA3-PL4-12-Et, KIpDURA3S-PL4-12-LR2-Et, KIpDURA3S-PL4-Et e KIpURA3-PL4-LR2-Et (SEQ ID No. 3, 4 em combinação com SEQ ID No.: 5,6, 7 ou 8).

19. Processo para a produção de uma cepa de K. /lactis, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) inserir a sequência de genes de um antígeno desejado no vetor KIpURA3 e/ou KIpMETS5, (ii) transformar uma cultura de K. lactis com a e/ou as construção (construções) do vetor modificado e antes enzimaticamente digerido, (iii) selecionar células de K. lactis transformadas com auxílio de um meio sólido, que não contém uracila e/ou metionina e (iv) opcionalmente restabelecer a prototrofia.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as sequências de genes de vários antígenos são inseridas ao mesmo tempo ectopicamente e são expressas de maneira regulada.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que diferentes sequências de genes são inseridas ectopicamente e expressas de maneira regulada, que codificam para antígenos de diversas variantes de um patógeno.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que diferentes sequências de genes são inseridas ectopicamente e expressas de maneira regulada, que codificam para antígenos de diversos patógenos.

23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que contém uma cepa de K. lactis, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

24. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de ser para o uso na vacinação.

25. Cepa de K. lactis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de ser para o uso na vacinação protetora.

26. Processo para a vacinação, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma cepa de K. lactis, com definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em um indivíduo, em uma quantidade, que é suficiente para provocar no indivíduo uma resposta imune protetora contra um ou mais antígenos estranhos.

27. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, ou processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados pelo fato de que a cepa de K. lactis é administrada por via subcutânea, intramuscular ou oral/na mucosa.

28. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, ou processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados pelo fato de que a cepa de K. lactis, em única aplicação/imunização (“one shot”) ou em uma aplicação/imunização dupla (“prime-boost”), provoca uma resposta imune protetora contra um patógeno.

29. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, ou processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados pelo fato de que a cepa de K. lactis, em única aplicação/imunização (“one shot”) ou em uma aplicação/imunização dupla (“prime-boost”), provoca uma resposta imune protetora cruzada contra diversas variantes de um patógeno.

30. Cepa de K. lactis, de acordo com a reivindicação 24 ou

25, ou processo, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizados pelo fato de que a cepa de K. lactisó, em única aplicação/imunização (“one shot”) ou em uma aplicação/imunização dupla (“prime-boost”), provoca uma resposta imune protetora contra diversos patógenos.