JP2021508496A - 一価及び多価サブユニット予防ワクチン製造のために最適化した、酵母クルイベロマイセス・ラクティスベースの宿主/ベクターシステム - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、1以上の異種タンパク質を高度に効率良く発現させるために適しており、病原体に対する防御的免疫応答の発生のためのワクチンとしての使用に適した、組換えクルイベロマイセス・ラクティス(K.ラクティス)酵母に関する。本発明は特に、K.ラクティス株の酵母ゲノム内へ、異種抗原をコードする核酸の標的クローニングをするための該ラクティス株であって、KlLAC4遺伝子座の代わりに又は追加して、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び/若しくはKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを有することを特徴とする。本発明は更に又、組み込み型発現ベクター、及び本発明のK.ラクティス株を生成するための方法、並びにワクチンとしてのその使用、に関する。
ワクチンは、疾患の防御(予防ワクチン)又は罹患した疾患の治療(免疫治療ワクチン)のために使用される。過去100年間位、予防ワクチン接種プログラムは感染症の減少に大きく貢献してきた。ただ、例えばウイルス、細菌又は寄生虫による持続感染又は発がん性疾患に対する免疫治療ワクチンはまだ、約20年間しか開発・使用されていない。ワクチン接種の目標は、細胞性(即ち、本質的にT細胞及びNK細胞が仲介する)免疫応答の誘発、及び/又は体液性(即ち、本質的にB細胞/抗体が仲介する)免疫応答の誘発、並びに病原体若しくは悪性(腫瘍形成性)細胞の抗原性成分に対する免疫学的記憶の誘発である。
以上より、本発明の目的は、先行技術の欠点を克服することができる新規なK.ラクティスワクチン株を提供することである。特に、提供されるのは、ゲノム内の特定の部位に組み込まれた、限定されたコピー数のKIGAL4-1遺伝子を含む、組換えK.ラクティス株である。更に、提供されるのは、非誘導条件下では異種タンパク質をわずかに又は全く発現しないことを可能とし、酵母内で、抗原の複数のコピーの発現又は複数の抗原の発現を可能とし、より培養に適しており、病原体に対する予防ワクチン接種のために、より有効に使用できる株である。同時に、免疫調節的に活性なタンパク質(抗原)をコードする異種遺伝子は、K.ラクティスゲノムの特定の部位へ組み込まれる必要がある。異種遺伝子の組み込みを有する探索対象のクローンを選択する場合、耐性遺伝子を選択マーカーとして使用するべきではない。更に、原栄養性株は、栄養要求性株から、最も単純かつ可能な方法で作り出されるべきである。これは又、(栄養)補充されていない合成培地で作製された、酵母ワクチン株の単純化された発酵を可能にするだろう。
(i)ラクトース誘導可能な転写アクチベーター濃度の増加、
(ii)LAC4プロモーターの標的とする改変、及び/又は
(iii)抗原をコードする異種遺伝子の遺伝子投与量の段階的な上昇、
によって達成された。
(iv)複数の抗原を同時に発現させるため、酵母ゲノム中の異種遺伝子エンコーディングカセットのための、複数の、新規な組み込み部位を確立すること、
からなる。
(寄生虫由来の異種タンパク質)
アメリカ鉤虫;十二指腸鉤虫(ズビニ鉤虫):ASPタンパク質、ヘモグロビン分解プロテアーゼ、
リーシュマニア属:gp63、46kD前鞭毛抗原、LACK、
プラスモジウム属(マラリア原虫):CSPタンパク質、CSA-1、CSA-3、EXP1、SSP2、STARP、SALSA、MSP1、MSP2、MSP3、AMA-1、GLURP、Pfs25、Pfs28、Pvs25、Pvs28、Pfs48/45、Pfs230、
シストソーマ属(住血吸虫):TP1、Sm23、ShGSTs26及び28、パラミオシン、寄生虫ミオシン、Sm14。
結核菌:Ag85A、Hsp65、R8307、19kD、45kD、10.4、
ヘリオバクターピロリ菌(Heliobacter pylori):VacA、LagA、NAP、hsp、ウレアーゼ、カタラーゼ、
A群レンサ球菌:M、SCPAペプチダーゼ、外毒素SPEA及びSPEC、フィブロネクチン結合タンパク質、
レンサ球菌肺炎:PspA、PsaA、BHV3、BHV4、
ネズミチフス菌:Vi抗原、
赤痢菌:LPS、
コレラ菌:CTB、
大腸菌ETEC:LT、LT-ST、CTB、
ペスト菌:F1、V。
CEA、
5T4、
MUC1、
MART1、
HER-2。
カリシウイルス科(Norwalk、HEV):NV 60kD;HEV ORF2、
レオウイルス科(Rota):VP7、VP4、
レトロウイルス科(HIV):Gag、Pol、Nef、Env、gp160、gp120、gp140、gp41、
フラビウイルス科(フラビウイルス属:WNV、Dengue、YF、TBE、JEV):preM-Env、NS3、NS4、NS5、
フラビウイルス科(ペスチウイルス属BVDV、CSFV、BDV;ヘパシウイルス属HCV):E1、E2、ERNS(ペスチ)、C、NS3、NS4、NS5、
ヘパドナウイルス科(HBV):HBS抗原、
パラミクソウイルス科(パラミクソウイルス亜科:PIV-1、PIV-2、流行性耳下腺炎、センダイ、PIV-2、PIV-4、モルビリ):M、HN、N、F、
パラミクソウイルス科(ニューモウイルス亜科:RSV):F、G、SH、M、
ラブドウイルス科(狂犬病):G、
ヘルペスウイルス科(EBV、HSV2):gp350/220(EBV)、gB2、gD2(HSV)、
コロナウイルス科(SARS):CoV、N、M、S、
オルソミクソウイルス科(インフルエンザA、B):HA、NA、M1、M2、NP、
パピローマウイルス科:L2、E6、E7。
VAK952(受託番号:DSM32705)、
VAK1111(受託番号:DSM32696)、
VAK1118(受託番号:DSM32701)、
VAK1131(受託番号:DSM32700)、
VAK1171(受託番号:DSM32699)、
VAK1243(受託番号:DSM32702)、
VAK1283(受託番号:DSM32697)、
VAK1395(受託番号:DSM32706)、
VAK1400(受託番号:DSM32698)。
(i)目的とする抗原をコードする核酸配列をKIpURA3ベクター又はKIpMET5ベクター内に挿入するステップ、
(ii)K.ラクティス培養体を、改変され、かつ予め酵素的に消化されたベクター構築物で形質転換するステップ、
(iii)ウラシル及び/又はメチオニンを含まない固形培地を利用して、形質転換したK.ラクティス細胞を選択するステップ、並びに
(iv)任意で原栄養性を回復するステップ、
を含む、前記方法を提供する。
a) 本発明の組換え型酵母を培養及び増殖するステップ、
b) 酵母を収穫し不活化するステップ、
c) 特定の免疫化スキームに従い組換え型酵母を投与するステップ、
d) 形成された抗体の力価を決定するステップ、及び/又は
e) 免疫化を検出するステップ。
K.ラクティスプラットフォーム内の前記改良は、数多くの利点を生じた。
a) 酵母ベースでの「サブユニットワクチン」菌株の構築において、優れた単純化(即時使用可能なツールボックス/キット)と高い再現性が可能になった。それらは今や、特定の短い時間内に生産することができる。
b) 酵母ワクチンは1以上の抗原を含有できる。それらは柔軟にカスタマイズでき、異なる量で生産できる。
c) 更に、原栄養性酵母の効率的な発酵が可能になった。
d) 組換えタンパク質産生の厳密な誘導性が可能になった。後者は、CPEを引き起こすかもしれないタンパク質において特に重要である。
e) 目的とする、異種遺伝子のゲノムの安定した組み込み、及び、前記株の関連遺伝子の安定性は、生産プロセスが再現性良く進行する利点を提供する。これは、GMP生産のために特に重要である。
f) 酵母ワクチンの防御性は、異種遺伝子コピーの増加及び/又はKlGAL4濃度の上昇の結果として達成される、組換え抗原産生の上昇により改良される。
g) 更に、投与されるワクチン用量は、異種遺伝子コピーの増加及び/又はKlGAL4濃度の上昇の結果として達成される、組換え抗原産生の上昇により、低減できる。そのため、酵母生産はより費用対効果が高くなり、ワクチン接種者へのワクチン適合性が改善される。
h) 多価酵母ワクチンは、同じ病原体の異なる複数の変種に対する、又は異なる複数の病原体に対する予防のために、交差防御的又は多価防御的な方法で使用できる。不活化、並びに適切なアジュバント及び/又は適切な液体量との混合以外は、ワクチンとして使用する酵母の、更なる後処理の必要は無い。
C:グルコース(YPD)又はラクトース(YPLac)での10倍段階希釈(開始-OD1)による滴下試験。インキュベーションはそれぞれ30℃及び37℃で行った。天然遺伝子座にKlGAL4コピーを有する酵母株(VAK1139)、異所的な遺伝子座にKlGAL4コピーを有し、天然遺伝子座のKlGAL4は欠損している酵母株(VAK1110)、KlGAL4コピーを有さない酵母株(ΔKlgal4;VAK964)、又は2個のKlGAL4コピーを有する酵母株(VAK1168)の増殖を比較した。示されたのは、更なるKlGAL4遺伝子の特定された組み込みのみが、生産力がほとんどない増殖欠陥をもたらすことである。前記欠陥は、37℃で誘導条件下でのみ視認できる。より明確なのは、KlGAL4を完全に欠損した場合の増殖欠陥である。
(実施例1:互いに結合していない複数の遺伝子座へ安定に組み込まれた二個のKlGAL4遺伝子コピーを有する宿主株の作製)
選択マーカー無しに第二のKlGAL4遺伝子コピーを、異なる遺伝子座へ(異所的に)挿入した。シークエンシングにより、KlAVT3遺伝子(KLLA0E13795g)内への挿入位置を位置決めすることが可能である(Klavt3::KlGAL4-1、配列番号:1)(図1)。得られた株は、VAK1111と名付けた。染色体E(異所性コピー)及びD(ゲノム本来のコピー)上にある2個のKlGAL4コピーのそれぞれ独立的な減数分裂的分離を、交叉実験して確認した。更に、同じ実験で、このゲノム内のKlGAL4-1遺伝子コピー数が正確に2個であると確立された。VAK1111を、VAK367-D4と同様に、LAC4遺伝子座への発現カセットの標的組み込みに使用するために、一段階処理が可能なlac4::ScURA3破壊を導入し、ラクトース増殖に対する選択下で、マーカー無しでKIpベクター技術を使用して目的とする異種遺伝子をLAC4プロモーター及びLAC4リーディングフレームの間へ組み込むことができた(Krijgerら(2012))。得られた株VAK1123は、第2の異所的なKlGAL4遺伝子コピーを有する点でのみ、VAK367-D4とは異なる。
一の例示的な実施態様では、IBDV-oVP2T2S(Arnoldら(2012))遺伝子が、株VAK1123のLAC4遺伝子座へ挿入された(作製された株はVAK1130)。1個のKlGAL4コピーのみを有する以外は遺伝的背景が同質の株(VAK910)と比較して、IBDV-VP2の増加した生産を確立することができた。比較のために、KlGAL4遺伝子は1個のみだが2個のCDS VP2IBDVコピーを有する株VAK1118(下記参照)を追加的に示す(図2)。
微生物内での異種タンパク質の産生は、これが細胞変性効果(CPE)につながる場合に問題がある。従って、直面する課題は、抗原産生フェースを生物量蓄積フェースから切り離す方法を見つけることである。誘導可能なLAC4プロモーターのおかげで、これは流加培養発酵プロセスによって部分的に可能だが、非誘導条件下ではプロモーターPLAC4-12が完全に不活化されないために、全体として妨げられている。非常に強力なCPEを有する抗原の場合、増殖率の低下、及び細胞性ストレス応答の誘発が発生し、抗原産生へ悪影響を及ぼす。この問題は、KlGAL4遺伝子投与量の2倍化及び/又は抗原をコードする配列数の増加によって悪化する(下記参照)。解決策は、-1065及び-1540間のプロモーターPLAC4-12(図3A)の基本制御領域(BCR)(Mehlgartenら(2015))を削除することである(LR2欠損;PLAC4-12-LR2’;配列番号:2)。前記欠損は、出発株VAK367(1個のKlGAL4コピー)及びVAK1111(2個のKlGAL4コピー)のゲノム本来のLAC4遺伝子座へ、lac4::ScURA3破壊と共に導入された。得られた株VAK1109及びVAK1124は、CPEを有する抗原の発現に適している。プロモーターPLAC4-12LR2’も又、組み込み型ベクターKIpURA3-Et及びKIpMET5-Etへ挿入された(下記参照)。
1個のタンデムIBDV-VP2発現カセットがVAK1124へ組み込まれた(作製された酵母株:VAK1131;用語「タンデム発現カセット」説明のために下記及び図7参照)後、LAC4-12プロモーター内のLR2欠損は、非誘導条件下でVP2タンパク質産生の強力な低下へ導くことを示すことができた(図3B)。インフルエンザA抗原ヘマグルチニン(赤血球凝集素)を発現する株(プロモーター内にLR2欠損の無いVAK952、プロモーター内にLR2欠損を有するVAK1243)により、LR2欠損の結果、インフルエンザA HA抗原の細胞変性効果が抑制され、非誘導条件下での増殖が改善されることを示すことができた(図3C)。
前記VAK367-D4(Krijgerら(2012)、国際公開番号第20101054649号)のように、酵母株VAK367は、本明細書に記載する全てのK.ラクティス菌株の遺伝子的背景を形成する。この株の背景は、ウラシル及びメチオニンを要求するものであり(ウラシル及びメチオニン栄養要求性)、それは2個の遺伝子KlURA3(KLLA0E22771g)及びKlMET5(KLLA0B03938g)内の突然変異、Klura3-20(+345位の塩基対欠失)及びKlmet5-1(G2555A及びA3682T)と称される対立遺伝子(この対立遺伝子は、機能欠損遺伝子変種である。)があるためである。
突然変異誘発による組み込み部位、及び代替的な成長物質のための栄養要求性選択によって、更に複数の遺伝子座を、同様に開発することができる。
組み込み型発現ベクターKIpURA3(配列番号:3)及びKIpMET5(配列番号:4)を、Klura3-20及びKlmet5-1対立遺伝子それぞれの機能の標的とする回復を可能とする適切な遺伝子断片(KlMET5/KlURA3標的配列)によって、構築した。
KIpURA3発現ベクターは、LAC4-12プロモーター(PLAC4-12又はその変種)、発現される抗原をコードする核酸配列、及びAgTEF1ターミネーターからなる発現カセットを含み、それは、関連するプロモーターを有するKLLAOE22749gの下流に隣接し、下流KlURA3断片を有するKlURA3プロモーターの上流に隣接する(図4B、C)。
PLAC4-12プロモーター制御の下で、異種遺伝子は、LAC4、KlURA3及びKlMET5遺伝子座へ組み込まれた後に、ラクトースによりほとんど同程度に強力に誘導される。大腸菌(E.coli)由来の、熱に不安定で無毒のエンテロトキシンサブユニットB(Etx.B)及びC末端の(HA)3エピトープ(Etx.B-HA)を、ベクターシステム評価のための試験タンパク質として使用した。コード配列をベクターKIpMET5、KIpURA3及びKIp3-MCSにクローニングし、遺伝子座KlMET5(VAK1251)、KlURA3(VAK1235)及びLAC4(VAK899)に組み込んだ(図4D)。ウエスタンブロット法で示されるように、3個の株すべてのEtx.B-HAタンパク質の濃度は非常に似ている(図4D)。従って、ゲノム内の発現カセットの組込み部位に依存して、組換えタンパク質産生の量に対する位置的効果を確立することはできなかった。
新規なベクターシステムにより、同一酵母株内でPLAC4-12プロモーター制御の下での異なる異種タンパク質を産生する可能性を、KlURA3遺伝子座にEtx.B-HA発現カセット、及びLAC4遺伝子座にタンデムとして存在する2個のVP2IBDVコピーを有する発現カセットを有する酵母株の構築により示すことができた(VAK1234;図5、タンデムカセット説明は下記及び図7参照)。それぞれゲノム内に発現カセットが1個だけ存在する酵母菌株(VAK1235又はVAK1171)と比較して、VAK1234の場合のEtx.B-HA又はVP2IBDVのタンパク質濃度の低下は確認できなかった。
抗原の免疫原性効果は、しばしば非化学量論比での複数のタンパク質の集合(assembling)に基づく。これを酵母ベースワクチンで可能にするために、ラクトース又はガラクトースにより異なって誘導できるPLAC4-12LR2’プロモーターの変種を作製した(図6A)。それらは、アクチベーターKlGal4(U1、U2、U4、U5;Godeckeら(1991))の結合部位数と、基本制御領域BCRの有無によって特徴づけられる。KIpURA3ベクターに挿入された図3Aに示される構築物に加えて、更なる結合部位の挿入によりプロモーター強度が上昇したプロモーター変種を作製することも可能であった。その結果は、このベクターシステムを拡張できるラクトース誘導可能な合成プロモーターであり、同じ誘導条件下で異なるタンパク質産生又は遺伝子発現率の実現が可能である。
4個のLAC4-12プロモーター変種の制御下でのEtx.B-HAの発現。試験したのは、転写アクチベーターKlGal4の結合部位の数が異なり、非誘導条件下での基本的発現の制御領域(基本制御領域BCR;図6A;配列番号:14)の有無が異なる4個のLAC4プロモーター変種である。前記プロモーター変種を使用して、KIpURA3-Etベクター変種KIpURA3-PL412-Et、KIpURA3-PL412LR2-Et、KIpURA3-PL4-Et及びKIpURA3-PL4LR2を作製し、それぞれEtx.B-HAタンパク質を試験GOIとして挿入した。前記のとおり、代替のGOIの挿入は、制限部位AscI及びNotIで可能である。発現カセットをKlURA3遺伝子座へ組み込み、Etx.B-HAのタンパク質濃度をウェスタンブロット法で定量化した(図6B)。示されたのは、同一の誘導条件下で(ラクトース含有完全培地で4時間)、LAC4及びLAC12遺伝子間に完全な遺伝子間領域を含み、4個のKlGal4-結合部位(U1、U2、U4、U5)(Godeckeら(1991))を含む最長のプロモーター変種PLAC4-12は、最高のタンパク質濃度をもたらすことである。LAC4の近位にある2個のU1及びU2結合部位(-1064〜-10)だけが存在する場合、BCR(-1540〜-1065)の追加的な欠損は同様に、誘導条件下でのタンパク質減少効果を有する。
従って、前記のベクターシステムは、迅速に効率良く複数の遺伝子コピーを連続して結合するため、及びこの発現カセットを3個の遺伝子座の一か所へ一段階で導入するために、改変された(図7A)。
LAC4遺伝子座で組み込み可能なタンデム発現カセットを作製するために、3個のPCR増幅断片を、目的とする任意のKIp3(-MCS)-GOIテンプレートにより、一段階で融合した(in-fusionクローニング):(1及び2) PLAC4-LR2及びTTEF(プライマー:VK30及びVK31、及び、VK32及びVK33)、並びに(3)LAC4標的配列(VK34及びVK35))を含む発現カセット。例えばHpaIを使用して制限(処理)後、タンデム発現カセットを、記載されたようにlac4::URA3遺伝子座に組み込むことができる(図7)。発現カセット組み込み成功後、最初の異種遺伝子コピーは、出発株に応じてPLAC4-12又はPLAC4-12-LR2のいずれかによって調節され、第二の遺伝子コピーはPLAC4-LR2によって調節される。その代わりに、2個の発現カセット間の選択マーカーを制限部位SmiI、MluI又はPmeIに挿入し、KpnIでLAC4標的配列を除去すると、KpnIを介してLAC4標的配列を除去すると、NHEJを介して無向的にゲノム内に組み込まれるタンデムカセットが作製される。MreI及びAvaIを使用して発現カセットを切り出した場合、適合性のある末端がライゲートされて、それにより長く、複数の発現カセットを作製することができる。MreIとAvaIを使用して制限を繰り返すことにより、発現カセットがタンデム(ヘッドツーテール)に配置された断片が、ライゲーションミックス内に富化する。それらは形質転換され、マーカー選択条件下で無向的に組み込まれる。
この戦略は、抗原としてのIBDV-VP2及び、2個のIBDV-VP2をコードする配列(CDS-VP2IBDV)をタンデムで含有するKIp3由来の発現カセットを使用することにより確認した。KIp3ベクター(プラスミドKIp3-タンデム-oVP2T2S、配列番号:21)内のタンデムIBDV-VP2発現カセット(図7A)は、KIp3-MCS-oVP2T2S(Arnoldら、(2012))からの、VP2IBDV(CDS-VP2IBDV)のための2個のLAC4プロモーター制御されたコード配列からなる。プロモーター配列は、最初のコピー用のLAC4プロモーター領域-1123〜-10、及び第二のコピー用の-1099〜-10からなる。両方のCDS-VP2IBDVは、3’末端でAgTEF1ターミネーターと隣接している。プラスミドKIp3-タンデム-oVP2T2Sを、HpaIを使用して切断し、制限材料を株VAK367-D4内に形質転換した。このようにして作製した酵母株VAK1118は、LAC4遺伝子座に組み込まれたタンデム発現カセットを含む。ウェスタンブロット法で示されるように、遺伝的背景が同質で、1個のコピーしか持たない株と比べて、前記株内ではより高いIBDV-VP2タンパク質濃度を示す(図7B)。タンデム発現カセットは、遺伝子的に高度に安定しており、誘導性媒体(YNB+ラクトース)中で78世代を超えて増殖した後、PCR試験した100コロニーで、発現カセットの遺伝子的変化を示したものは一つも無かった(データは示さない)。
行われた研究では、ウラシル栄養要求性酵母菌株は、完全培地ではウラシル原栄養菌株よりも、より成長が貧弱であり、これは、ウラシルの添加によって部分的にだが中和される効果であることが明らかになった。ワクチン株の発酵を単純化するために、生産プロセスの確立を促進し、それらをより費用対効率の高いものにし、メチオニン及び/又はウラシルの不十分な取り込みによる増殖効果を回避するために、発見が求められるものは、目的とする株構築に必要なこれら栄養要求性の中和を、迅速に再現性良く達成する方法である。Klura3-20からKlURA3を再構成するために、プライマーVK67及びVK69、並びにテンプレートとして野生型KlURA3遺伝子を使用して、PCRによりDNA断片を作製した(図8A)。Klmet5-1対立遺伝子を修復するために、プライマーVK74及びVK75、並びにテンプレートとして野生型対立遺伝子KlMET5を用いて、PCR断片を同様に作製した(図8B)。PCR断片を対応する変異株に(個別又は一緒に)形質転換し、メチオニン無し及び/又はウラシル無しの培地で選択すると、野生型対立遺伝子が高い効率で再構成される。このプロセスは、とりわけ、株VAK1171及びVAK1400を作製するために実施された(上記参照)。
実施例1〜5で行われたK.ラクティスワクチンのプラットフォームの改変及び最適化は、様々なワクチン接種研究で検証された。
VAK1127株は、タンデムIBDV-VP2発現カセット(配列番号:21)、2個のKlGAL4コピー及びLAC4プロモーター内のLR2欠損を含む。酵母菌株の免疫原性の特性決定のため、標的生物であるニワトリで免疫化実験を行った。チャレンジ実験では、Eterradossi及び同僚(1997)によって良く特徴づけられた高度に強毒性の(vv)IBDV株89163/7.3(AFSSA、Ploufragan、フランス)に対する、SPFニワトリの完全な防御が達成された(表1及び2)。この目的のために、独立して行われた2個の実験では、1mgの凍結乾燥され、熱不活化された(2時間、90℃)酵母(VAK1127)を、不完全フロイントアジュバント(IFA)と共に、2回(図9A及びB)皮下投与した(プライムブースト)。投与は、孵化後2週間及び4週間で行い、ウイルス曝露(チャレンジ)を孵化後6週間で行った。19日後、VAK1127ワクチン接種した動物では、抗IBDV-VP2抗体の高い力価が既に測定可能だった。コントロールでは、抗IBDV-VP2抗体の力価は、vvIBDVチャレンジ後にのみ発生した(図9)。両方の実験で、VAK1127ワクチン接種された動物の、vvIBDVでのチャレンジに対する完全な防御(0%罹患率、0%死亡率)が観察された(表1及び2)。これらの実験では、古典的プライマー-ブーストワクチン接種方法でサブユニットワクチンを使用して、vvIBDVに対する防御を観察することができた。
「単回接種」ワクチン接種、即ち、一回のワクチン投与によるワクチン接種は、通常、サブユニットワクチンでは免疫原性がないため効果的ではない。しかし、プライム/ブースト法で最適化した株VAK1127を使用して得られた抗体力価の研究データ(図9)は、単回接種アプローチでも保護が得られる可能性を示す。これは、原栄養性酵母菌株VAK1171を使って単回接種でワクチン接種を行うことにより確認された(図11;表3)。この目標を達成するために、目的とする高い投与量で(10mg)、酵母を1回だけ投与し、その後4週間間隔でチャレンジを行った。VAK1171では、vvIBDVに対する完全な防御が(罹患率0%、死亡率0%)、「単回接種」を使用して実際に達成できることが明らかになった(表3)。この結果は、ワクチン接種後約20日の高い防御的抗体力価の成果に起因させることができる(図11)。単回接種のワクチン接種スキームが、高い防御性でvvIBDVに対して防御するという事実は、使用されたワクチンの強力な免疫原性の可能性を示し、最適化したワクチンプラットフォームの素晴らしい検証を提供する。
A型インフルエンザウイルスに対するワクチン接種を行うために、3個の異なるワクチン株を作製した。最初に、インフルエンザA株(プエルトリコ/8/1934;PR8/34)の主要抗原、HA(ヘマグルチニン)遺伝子を発現するVAK952(DSM32705)を作製した。VAK952では、Krijgerら(2012)及びArnoldら(2012)が記載したように、遺伝子はゲノムのLAC4遺伝子座に組み込まれている。二番目に、VAK1283(DSM32697)を作製した。ここでは、LAC4遺伝子座のPR8/34からのHA遺伝子に加えて、M1遺伝子が更にURA3遺伝子座に組み込まれている。M1遺伝子は、HAよりも明らかに保存されている、更に重要なインフルエンザA抗原をコードしている。既に出版されている報告では、両方の抗原を組み合わせると、インフルエンザAに対するワクチンの免疫原性を高め、かつ異なるインフルエンザウイルスに対する交差防御性を達成できることが、示されている。この態様を二価酵母ワクチンで検証するために、URA3遺伝子座にM1遺伝子を同様に含み、PR8/34からのHA遺伝子がインフルエンザウイルス(カリフォルニア/4/2009)のHA遺伝子で置き換わっている、株(VAK1395;DSM32706)を更に作製した。それぞれの株でのHAの同等の発現とM1の追加的発現が確認された。また、これら株は同等の増殖を示し、VAK1283はVAK952よりもわずかに優れていることが示された(図12)。マウスモデルで、異なる酵母濃度のプライムブーストスキーム及び単回接種スキームがそれぞれのケースで使用されたワクチン接種研究では、VAK952とVAK1283がそれぞれ同等のウイルス中和抗体の力価を誘発することが示された(図13)。しかし、チャレンジ実験では、二価VAK1283ワクチンがプライムブーストスキーマと単回接種スキーマの両方で最大の防御を可能にすることが明らかになり、これは一価VAK952ワクチンの場合とは異なる。更に、使用した酵母材料の半分での単回接種実験で、ワクチンVAK1283を使用すると、プライムブーストアプローチのVAK952と同様の防御的効果が達成された(図14及び表3)。VAK1395をワクチンとして使用した実験では、インフルエンザPR8/34に対する防御を確立することも可能だった。従って、異なるインフルエンザ変種に対する交差防御は、二価酵母ワクチンを使用して達成された。
(a)孵化後2週間のニワトリへ、1mg酵母(又はPBS)及びアジュバントとしてIFAを、皮下へワクチン接種した。ワクチン接種の2週間後、同様にブーストした。更に2週間後にウイルス曝露試験を、104 EID vvIBDV(高度に強毒性89163/7.3)を用いて眼鼻経路を介して行った。不活化した株VAK1127酵母全体をワクチン酵母として使用し、PBS及びIFAのみでワクチン接種した群を感染コントロールとして使用した。抗原を含まない野生型酵母(VAK367)を投与した群は、酵母効果のみのコントロールとして使った。
(a)孵化後2週間のニワトリへ、1mg酵母(又はPBS)及びアジュバントとしてIFAを、皮下へワクチン接種した。ワクチン接種の2週間後、同様にブーストした。更に2週間後にウイルス曝露試験を、104 EID vvIBDV(高度に強毒性89163/7.3)を用いて眼鼻経路を介して行った。不活化した株VAK1127酵母全体をワクチン酵母として使用し、PBS及びIFAのみでワクチン接種した群を感染コントロールとして使った。
(a)孵化後2週間のニワトリへ、10mg酵母(又はPBS)及びアジュバントとしてIFAを、皮下へワクチン接種した。4週間後にウイルス曝露試験を、104 EID vvIBDV(高度に強毒性89163/7.3)を用いて、眼鼻経路を介して行った。不活化した株VAK1171酵母全体を1回酵母ワクチンとして使用した。使用した感染コントロールは、第一はPBS及びMF59のみでワクチン接種した群で、第二は野生型酵母及びMF59を最初のワクチン接種後2週間でワクチン接種した群であり、両者とも同量の酵母又はPBSを含有するブーストを投与した。
本特許出願は、下記配列を記載の一部として含む。
Claims (30)
- クルイベロマイセス・ラクティス(K.ラクティス)株の酵母ゲノム内へ、異種抗原をコードする核酸の標的クローニングをするための該ラクティス株であって、KlLAC4遺伝子座の代わりに又は追加して、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び/若しくはKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを有することを特徴とする、前記K.ラクティス株。
- 前記発現カセットは、K.ラクティスLAC4-12プロモーター(PLAC4-12)又は該プロモーターの変種であってLAC12及びLAC4の間の遺伝子間領域も含むもの、前記抗原をコードする領域、及びAgTEF1ターミネーターを有することを特徴とする、請求項1記載のK.ラクティス株。
- 異種抗原をコードする核酸の複数のコピーが、得られるK.ラクティス株のKlLAC4遺伝子座、若しくはKlURA3-20遺伝子座、若しくはKlMET5-1遺伝子座に、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して挿入されていることを特徴とする、請求項1又は2記載のK.ラクティス株。
- 前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に、タンデム発現カセットの形で存在することを特徴とする、請求項1〜3いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 異なる異種抗原をコードする核酸の1以上のコピーが、KlLAC4遺伝子座、及び/若しくは、KlURA3-20遺伝子座、及び/若しくは、KlMET5-1遺伝子座に、シングル発現カセット、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して挿入されていることを特徴とする、請求項1〜3いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))及びインフルエンザA M1(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))をコードする遺伝子が、前記K.ラクティス株のKlLAC4及びKlURA3-20遺伝子座に挿入されて、発現することを特徴とする、請求項1〜3及び5いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 前記K.ラクティス株は、前記ゲノム本来のKIGAL4遺伝子に加えて、追加で該KIGAL4遺伝子の第二の異所性コピーを含むことを特徴とする、請求項1〜6いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 前記KIGAL4遺伝子の異所性コピーは、KIGAL4プロモーター及びKIGAL4ターミネーターに隣接し、前記K.ラクティス株内の遺伝子座KLLA0E13795g(Klavt3::KlGAL4-1、配列番号:1)で組み込まれることを特徴とする、請求項7記載のK.ラクティス株。
- 前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子は、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在することを特徴とする、請求項1〜8いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 前記K.ラクティス株は、非誘導条件下では異種タンパク質をわずかに又は全く発現しない、LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有する、請求項1〜9いずれか1項記載のK.ラクティス株であって、-1065及び-1540の間のプロモーターPLAC4-12の基本制御領域(BCR)(LR2欠損;PLAC4-12-LR2’;配列番号:2)は削除されていることを特徴とする、前記K.ラクティス株。
- 前記異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在することを特徴とする、請求項10記載のK.ラクティス株。
- 異種タンパク質発現の調節を可能にする、前記LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有する前記K.ラクティス株であって、該プロモーターのアクチベーターKlGal4(「上流活性化配列」1、2及び4、5)のための結合部位数が変動し、1、2、3又は4個のKlGal4結合部位が存在することを特徴とする、請求項1〜11いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4で挿入されることを特徴とする、請求項1〜12いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 前記対立遺伝子Kllac4、Klura3-20及びKlmet5-1の遺伝子機能が回復され、前記K.ラクティス株は原栄養性であることを特徴とする、請求項1〜13いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 前記異種抗原BVDV E2外部ドメイン(1型、CP7)、BVDV E2外部ドメイン(2型、ニューヨーク93)及びBVDV Npro-NS3(1型、CP7)の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4、KlURA3-20、及びKlMet5-1に挿入されることを特徴とする、請求項1〜14いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 下記株から選択される、K.ラクティス株:
VAK952(受託番号:DSM32705)、
VAK1111(受託番号:DSM32696)、
VAK1118(受託番号:DSM32701)、
VAK1131(受託番号:DSM32700)、
VAK1171(受託番号:DSM32699)、
VAK1243(受託番号:DSM32702)、
VAK1283(受託番号:DSM32697)、
VAK1395(受託番号:DSM32706)、及び
VAK1400(受託番号:DSM32698)。 - KIpURA3(配列番号:3)又はKIpMET5(配列番号:4)から選択される、組み込み型発現ベクター。
- KIpMET5-PL4-12-Et、KIpMET5-PL4-12-LR2-Et、KIpMET5-PL4-Et、KIpMET5-PL4-LR2-Etから、並びにKIpURA3-PL4-12-Et、KIpURA3-PL4-12-LR2-Et、KIpURA3-PL4-Et及びKIpURA3-PL4-LR2-Et(配列番号:5、6、7又は8と組み合わされた配列番号No.3、4) から選択される、組み込み型発現ベクター。
- 請求項1〜16いずれか1項記載のK.ラクティス株を作製する方法であって、下記ステップ:
(i)目的とする抗原の遺伝子配列をKIpURA3ベクター及び/又はKIpMET5ベクター内に挿入するステップ、
(ii)K.ラクティス培養体を、改変され、かつ予め酵素的に消化されたベクター構築物で形質転換するステップ、
(iii)ウラシル及び/又はメチオニンを含まない固形培地を利用して、形質転換したK.ラクティス細胞を選択するステップ、並びに
(iv)任意で原栄養性を回復するステップ、
を含む、前記方法。 - 前記複数の抗原の遺伝子配列が、異所的に同時に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、請求項19記載の方法。
- 1の病原体の異なる複数の変種の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、請求項20記載の方法。
- 異なる複数の病原体の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、請求項20記載の方法。
- 請求項1〜16いずれか1項記載のK.ラクティス株を含む、医薬組成物。
- ワクチン接種に使用するための、請求項1〜16いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 予防ワクチン接種に使用するための、請求項1〜16いずれか1項記載のK.ラクティス株。
- 請求項1〜16いずれか1項記載のK.ラクティス株を、対象へ、該対象内で1以上の異種抗原に対する防御的免疫応答を引き起こすために充分な量で投与することを含む、ワクチン接種方法。
- 前記K.ラクティス株は、皮下、筋肉内、又は、口/粘膜を通して投与されることを特徴とする、請求項24若しくは25記載のK.ラクティス株、又は請求項26記載の方法。
- 前記K.ラクティス株は、病原体に対する防御的免疫応答を、1回適用/免疫化(「単回接種」)又は2回適用/免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、請求項24若しくは25記載のK.ラクティス株、又は請求項26若しくは27記載の方法。
- 前記K.ラクティス株は、1の病原体の異なる複数の変種に対する交差防御的免疫応答を、1回使用/免疫化(「単回接種」)又は2回適用/免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、請求項24若しくは25記載のK.ラクティス株、又は請求項26若しくは27記載の方法。
- 前記K.ラクティス株は、異なる複数の病原体に対する防御的免疫応答を、1回使用/免疫化(「単回接種」)又は2回適用/免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、請求項24若しくは25記載のK.ラクティス株、又は請求項26若しくは27記載の方法。
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