CN111801422B - 基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优化的宿主/载体系统 - Google Patents

基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优化的宿主/载体系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高效表达一或多个外源蛋白并且适用作针对病原体产生保护性免疫应答的疫苗的重组乳酸克鲁维酵母。本发明特别提供了乳酸克鲁维酵母株将外源抗原编码核酸靶向克隆至乳酸克鲁维酵母株的酵母基因组中，其特征在于所述乳酸克鲁维酵母株作为KlLAC4基因座的替代，在KlURA3‑20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5‑1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒，或除KlLAC4基因座之外，还在KlURA3‑20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5‑1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。本发明进一步涉及用于产生本发明所述乳酸克鲁维酵母株的整合表达载体和方法以及其作为疫苗的用途。

Description

基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优 化的宿主/载体系统
发明领域
本发明涉及重组乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K.lactis)，其适合于高效表达一种或多种外源蛋白质及适合用作疫苗以产生针对病原体的保护性免疫应答。本发明特别提供了乳酸克鲁维酵母菌株用于将外源抗原编码核酸靶向克隆进乳酸克鲁维酵母菌株的酵母基因组中，其特征在于乳酸克鲁维酵母菌株作为KlLAC4基因座的替换或除了KlLAC4基因座之外，在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。本发明还涉及产生本发明乳酸克鲁维酵母菌株的整合表达载体和方法以及其作为疫苗的应用。
发明背景
疫苗用于预防疾病(预防性疫苗)或治疗已确定的疾病(免疫治疗性疫苗)。在过去的100年左右，预防接种计划为减少感染病做出了巨大贡献。诸如针对病毒、细菌或寄生物的持续感染或针对致癌性疾病的免疫治疗疫苗仅开发和使用了大约20年。免疫接种的目标是诱导细胞免疫应答(即基本上是T细胞和NK细胞介导的)和/或体液免疫应答(即基本上是B细胞/抗体介导的)以及诱导针对病原体或恶性(致瘤)细胞的抗原成分的免疫记忆。
传统疫苗包含减毒(灭活)或杀死形式的完整病原体，包括其遗传物质，即DNA或RNA形式的核酸。为了生产，所述传统疫苗通常需要特殊的安全防范和/或使用可感染的生物体和/或细胞培养物；此外，所述疫苗通常需要复杂且涉及使用冷链的储存和运输。另外，传统疫苗的使用涉及来自生产过程(例如来自测试动物或来自细胞培养物)的物质导致在接种个体出现不良反应或者病原体意外被再激活的危险。诊断中也存在问题：例如，在用完整病原体接种有用动物的情况中，无法将免疫接种的动物与自然感染的动物区分开，这意味着基于检测新感染的早期预警系统无法使用。因此，开发了所谓的“亚单位疫苗”，其仅用病原体的指定成分进行免疫接种。使用其的前提条件是已知在讨论的病原体的“主要抗原”。主要抗原通常是可以被免疫系统识别的病原体的表面成分，例如病毒外壳或病毒衣壳的蛋白质。在没有完整病毒颗粒的情况中，所述主要抗原也可以在宿主中诱导针对病毒的体液和/或细胞免疫应答和免疫记忆。由于在“亚单位免疫接种”中缺少病原体的其它成分，因此可以通过鉴别诊断将免疫接种的个体与自然感染的个体区分(区分感染的动物与免疫接种的动物(DIVA))；因此，还提及了“亚单位标志物疫苗”。许多亚单位疫苗的缺点是生产过程往往很复杂，免疫原性常常不足：虽然病原体本身可以有效地培养(具有上述局限性)，但其主要抗原必须通过基因技术以成本密集的方式及通常效率低下的方法生产且以复杂的方式纯化。因此，由此获得的亚单位疫苗是具有短保存期限的生物材料且必须经常在冷却状态下存储和运输。由于这些原因，有用动物的大多数大规模疫苗仍基于使用完整病原体的传统原理。
例如，普遍的家禽疾病传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的，该病毒是具有来自双RNA病毒科(Birnaviridae)的双链节段RNA基因组的非包膜病毒。大多数针对IBD的疫苗均基于减毒(弱化)或灭活的病毒。但是，这里出现的问题是，尽管高度减毒的非灭活的“活病毒”以及灭活的病毒也可提供针对平均致病性的IBD病毒的保护作用，但对于毒性极强的IBD病毒株(vvIBDV)却并非如此。直到最近，极强力的减毒病毒(中间热毒株)仍针对vvIBDV起保护作用，但是这些疫苗株由于对法氏囊(Bursa Fabricii，一种淋巴器官)中B细胞的短暂破坏而具有可能发生免疫抑制形式的不良反应(Rautenschlein et al.(2005))。但是，即使是所述中间热疫苗针对最近发现的vvIBDV株也未提供完全保护作用(Negash et al.(2012)；Kasanga et al.(2007))。此外，用高度减毒的活病毒进行免疫接种的问题是亲本抗体阻止病毒复制，因此阻止了免疫反应的诱导。因此，仅可以在孵化后三周使用这些疫苗进行有效的免疫接种(Kumar et al.(2000)；Rautenschlein et al.(2005))。
例如，甲型流感病毒是全球最重要的病毒病原体之一(Short et al.(2015)；Silva et al.(2012))。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)；其是具有单链节段RNA作为基因组的包膜病毒。与大多数RNA病毒一样，流感病毒也具有很高的突变率。尤其是病毒RNA片段的重配产生了具有新的遗传和生物学性质的病毒后代(Short et al.(2015))。由于快速的进化，特别是在针对流感病毒的免疫接种中出现的问题是在新出现的病毒变体的情况中，现有疫苗不能“抓住”。因此，长期以来一直在尝试开发具有交叉保护作用及因此也针对不同流感病毒变体具有长期保护的疫苗(Steel et al.(2010)；Krammerand Palese(2013)；Kirchenbaum and Ross(2014)；Berthoud et al.(2011))。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是偶蹄目动物的普遍病原体。BVDV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属成员。这些病毒的单链RNA基因组同样处于高突变率。此外，对于怀孕动物，胎儿可能会被感染，然后由于免疫耐受而生出持续感染(PI)的动物。所述PI动物进一步传播病毒且在100％病毒突变的情况中，死于所谓的粘膜病。在这里，也已经进行了很长时间的尝试来开发针对不同BVD病毒变体具有交叉保护和长期保护作用的疫苗(Ridpath(2015))。
有效的亚单位疫苗可以解决这些问题。在大多数情况中，亚单位是病原体的蛋白质成分；其可以通过基因技术在各种宿主细胞中产生。除了肠道细菌大肠杆菌(Escherichia coli)外，已经建立了可以在细胞培养物中繁殖的哺乳动物细胞或昆虫细胞、植物细胞和各种真菌作为异源蛋白表达的宿主系统。微生物系统如细菌和真菌可以特别经济高效地大规模培养。
酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母细胞已常规使用数十年以表达外源蛋白质。与细菌相比，酵母细胞的优势在于其是真核生物(即其在许多方面都类似于动物细胞)和真核蛋白(即在动物细胞中形成和/或必须具有功能的蛋白质，可以在酵母中以天然或几乎天然的形式成本有效地生产)(Bathurst(1994)；Gellissen&Hollenberg(1997))。酵母最初仅用于产生外源蛋白质；在表达后，从酵母细胞纯化蛋白质并用作亚单位疫苗。直到最近才尝试将酵母本身或酵母的细胞部分作为疫苗施用。因此，“基于酵母的疫苗”是酵母颗粒，其包含病原体(抗原)的免疫学有效成分并且在施用后(例如皮下、肌内或口服/粘膜)，可在宿主生物体中引起针对所述抗原及因此也针对所述抗原起源的病原体的特异性免疫应答。期望的是在接种的生物体中诱导免疫学“记忆”，其在随后的感染(“攻击”)事件中防止相应病原体的繁殖和/或传播和/或降低感染的病理学作用。如上所述，抗原通常是病原体的结构蛋白，使用基因技术方法将其编码核酸序列(抗原编码基因)导入酵母细胞中及表达一种或多种这种结构蛋白。由此产生的活体形式(酵母细胞)、在杀灭和干燥后的粉末形式(酵母颗粒)或者在细胞破碎和均质化后的粉末形式(酵母裂解物)的重组酵母是基于酵母的疫苗。在施用疫苗后，抗原被免疫系统识别及引起体液和/或细胞免疫防御。
基于酵母的免疫接种为本领域技术人员从现有技术中已知。一系列美国专利申请和专利例如US 20090304741 A1、US 5830463 A、US 7465454 B2和US 20070166323 A1描述了含有至少一种重组抗原的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株在免疫治疗中的用途。示出这些酵母可有效刺激免疫反应，尤其是细胞介导的免疫反应。
WO 2006044923揭示了酵母(酿酒酵母)，其重组表达丙型肝炎病毒(HCV)的各种蛋白质及可以引起针对所述HCV蛋白质的免疫反应，特别是T细胞应答，且打算用作针对慢性丙型肝炎的疫苗。
WO 2007092792描述了重组酿酒酵母针对流感病毒感染的可能用途，包括使用各种酵母株的组合，施用其导致诱导T细胞，即细胞免疫应答。
WO 20101054649和WO 2013107436描述了使用含有指定抗原的乳酸克鲁维酵母菌种的菌株在经口服/粘膜或皮下施用完整的被杀灭的酵母细胞后产生保护性体液免疫应答。最后提到的专利包含应用实施例，其中衍生自起始菌株VAK367-D4的重组乳酸克鲁维酵母菌株已成功用于免疫接种。
本领域技术人员从现有技术中已知使用重组乳酸克鲁维酵母进行免疫接种的可能性(Arnold et al.(2012))；WO 20101054649和WO 2013107436)。应用实施例能示出皮下施用表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2衣壳蛋白的乳酸克鲁维酵母在细胞内通过由LAC4启动子控制的表达盒可引起体液免疫反应，从而提供抗病毒感染的有效保护。可以针对平均致病性的IBD病毒示出这种作用，但迄今为止，尚未针对极其毒性IBDV(vvIBDV)示出此作用。较早的数据表明，通过提高病毒抗原的细胞内浓度可以提高酵母疫苗的效力(Arnoldet al.(2012))。用于实现抗原浓度增加的技术变化方式包括通过整合pLI-1质粒将转录激活物基因KlGAL4-1(别名LAC9-1)的额外拷贝导入IBDV-VP2-表达株(保藏株DSM 25406和DSM 25407)(Krijger et al.(2012)和WO 2013107436)。因此，迄今为止基于两种遗传干预产生这种乳酸克鲁维酵母疫苗株：第一种是基于编码抗原的外源基因的整合，第二种基于KlGAL4-1基因的整合。然而，在迄今为止的实践形式中，后者也经常引起质粒的串联重复整合，导致不仅由于激活物的强力过表达所致细胞毒性作用(Breunig 1989)，而且导致在以此方式产生的疫苗株中KlGAL4-1和ScURA3基因的拷贝数不同。
如上述应用实施例(Arnold et al.(2012)；WO 20101054649和WO 2013107436)所述，通过未修饰的LAC4启动子进行外源基因表达的策略具有继发效应，甚至在非诱导条件下也发生外源基因的最低表达，即启动子在一定程度上是开放的。当增加KlGAL4-1基因剂量时，这种效应再一次更加明显。因此，在异源表达的情况中，在蛋白质对酵母细胞具有致细胞病变作用(CPE)的情况中，可以严格限制在培养期间例如分批补料发酵过程中生物质的形成。特别针对这些情况，必须找到在非诱导条件下使基因表达最小化的替代方法。
多种亚单位疫苗仅在使用不是一个而且将多个病原体亚单位用于免疫接种时才有效。此外，在免疫接种中使用多个抗原亚单位可以大大提高针对病原体不同变体的交叉保护性。相同或不同抗原的共表达也可以用于再增加酵母细胞中的抗原浓度或者产生针对不同病原体产生保护作用的疫苗。
以上讨论的菌株通常是营养缺陷型菌株，其在完全培养基中的生长通常比原养型菌株差。因此，将营养缺陷型酵母株快速转化为原养型形式可以导致生长性质改善。
发明描述
因此，本发明的目的是提供可以克服现有技术缺点的新的乳酸克鲁维酵母疫苗株。特别地，应提供整合在基因组指定位点的含有受限拷贝数的KlGAL4-1基因的重组乳酸克鲁维酵母菌株。此外，应提供这样的菌株，其仅允许外源蛋白在非诱导条件下仅少量表达或不表达，允许在酵母中表达多个拷贝的抗原或表达多个抗原，其更适合于培养及可更有效地用于针对病原体的保护性免疫接种。同时，应将编码免疫调节活性蛋白(抗原)的异源基因整合在乳酸克鲁维酵母基因组的指定位点。在选择具有整合外源基因的搜索克隆的情况中，不应将抗性基因用作选择标记。此外，应通过最简单的方法从营养缺陷型菌株产生原养型菌株。这也应允许产生的酵母疫苗株在无补充的合成培养基中简易发酵。
这些目标通过提供一种模块系统实现，所述模块系统包含新的载体和新的遗传修饰的酵母乳酸克鲁维酵母变体，可以产生针对蛋白质抗原的特定性质优化的疫苗株。通过载体之间DNA元件的结构块类型交换，实现外源抗原编码区的有效常规克隆进酵母基因组中，而不依赖于待表达的外源基因。由于相关外源基因的靶向基因组整合，酵母株在经过很多世代都是稳定的且在基因上精确定义。由于这些性质，发酵过程在非选择性条件下可重复进行并且可以标准化。根据本发明的乳酸克鲁维酵母的优化包括控制蛋白质产生速率，使得其尽可能高，但是要使其低于严重干扰有效发酵过程的抗原致细胞病变效应的阈值。这是通过遗传干预或多种遗传干预的组合来实现的：
i.增加乳糖可诱导转录激活物的浓度，
ii.靶向修饰LAC4启动子，和/或
iii.逐步增加编码抗原的外源基因的基因剂量。
此外，根据本发明的乳酸克鲁维酵母的优化包括：
iv.确定酵母基因组中外源基因编码盒的多个新整合位点，以便能够同时表达多个抗原。
在一个优选实施方案中，本发明的目的是通过提供一种乳酸克鲁维酵母菌株将外源基因编码核酸靶向克隆到乳酸克鲁维酵母菌株的酵母基因组中而实现，其特征在于所述乳酸克鲁维酵母菌株作为KlLAC4基因座的替代，在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒，或除KlLAC4基因座之外，还在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。特别优选的是乳酸克鲁维酵母菌株在KlLAC4基因座之外在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。极其特别优选的是乳酸克鲁维酵母菌株在KlLAC4基因座之外在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。这种修饰的乳酸克鲁维酵母菌株的优点在于用于表达外源基因的基因被整合进乳酸克鲁维酵母基因组中特别指定的基因座，以及外源基因的拷贝数是可控制的。此外，所述乳酸克鲁维酵母菌株允许表达不同外源抗原的不同基因整合在乳酸克鲁维酵母基因组中指定的基因座。
在本发明的上下文中，“外源抗原”或“外源蛋白”是指适于在人或动物中针对病原体或致癌变性细胞产生免疫应答、优选保护性免疫应答的所有肽、多肽和蛋白质。外源蛋白可源自任何种类的病原体或肿瘤，已经鉴定了仅能诱导保护性免疫应答、优选保护性免疫应答的抗原。
在一个优选实施方案中，所述外源蛋白源自病原体(病毒，细菌，寄生物)，已经鉴定了仅能够诱导保护性免疫应答、优选地保护性体液免疫应答的抗原。
例如，这些外源蛋白是：
源自寄生物的外源蛋白
美洲板口线虫(Necator americanus)；十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)：ASP蛋白，血红蛋白降解蛋白酶
利什曼原虫(Leishmania)：gp63，46kD前鞭毛体抗原(promastigote antigen)，LACK
疟原虫(Plasmodium)：CSP蛋白，CSA-1，CSA-3，EXP1，SSP2，STARP，SALSA，MSP1，MSP2，MSP3，AMA-1，GLURP，Pfs25，Pfs 28，Pvs25，Pvs 28，Pfs 48/45，Pfs 230
血吸虫(Schistosoma)：TP1，Sm23，ShGSTs 26和28，副肌球蛋白，寄生物肌球蛋白，Sm14
源自细菌的外源蛋白
结核分支杆菌(Mycobakterium tuberculosis)：Ag85A，Hsp65，R8307，19kD，45kD，10.4
Heliobacter pylori：VacA，LagA，NAP，hsp，脲酶，过氧化氢酶
A族链球菌(Group A Strepptococcus)：M，SCPA肽酶，外毒素SPEA和SPEC，纤连蛋白结合蛋白
肺炎链球菌(Strepptococcus pneumonia)：PspA，PsaA，BHV 3，BHV 4
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)：Vi抗原
志贺氏菌(Shigella)：LPS
霍乱弧菌(Vibrio cholera)：CTB
大肠杆菌ETEC：LT，LT-ST，CTB
鼠疫杆菌(Yersinia pestis)：F1，V
源自肿瘤细胞/肿瘤的外源蛋白(肿瘤相关抗原，TAA)
CEA
5T4
MUC1
MART1
HER-2
特别优选源自病毒的外源蛋白
杯状病毒科(Caliciviridae)(Norwalk，HEV)：NV 60kD；HEV ORF2
呼肠病毒科(Reoviridae)(Rota)：VP7，VP4
逆转录病毒科(Retroviridae)(HIV)：Gag，Pol，Nef，Env，gp160，gp120，gp140，gp41
黄病毒科(黄病毒属：WNV，登革，YF，TBE，JEV)：preM-Env，NS3，NS4，NS5
黄病毒科(瘟疫病毒属BVDV，CSFV，BDV；肝炎病毒属HCV)：E1，E2，ERNS(Pesti)，C，NS3，NS4，NS5
嗜肝病毒种(Hepadnaviridae)(HBV)：HBS抗原
副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)：PIV-1，PIV-2，腮腺炎病毒，仙台病毒，PIV-2，PIV-4，麻疹病毒):M，HN，N，F
副黏液病毒科(肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)：RSV):F，G，SH，M
弹状病毒科(Rhabdoviridae)(狂犬病病毒)：G
疱疹病毒科(Herpesviridae)(EBV，HSV2)：gp350/220(EBV)，gB2，gD2(HSV)
冠状病毒科(Coronaviridae)(SARS)：CoV，N，M，S
正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(甲型、乙型流感)：HA，NA，M1，M2，NP
乳头状瘤病毒科(Papillomaviridae)：L2，E6，E7
在本发明的另一个实施方案中，经修饰的乳酸克鲁维酵母菌株的特征在于表达盒包含乳酸克鲁维酵母LAC4-12启动子(PLAC4-12)或所述启动子的变体，待表达抗原的ORF和AgTEF1终止子。所述实施方案的优点在于在LAC4和/或KlURA3和/或KlMET5基因座整合后，外源基因在PLAC4-12启动子控制下的表达被乳糖近似等同强力地诱导。
如上所述，疫苗株中的抗原浓度与酵母疫苗在靶生物体中的免疫原性作用之间存在正相关。为了防止在过度强过表达的情况中发生CPE，例如由于额外的KlGAL4基因的整合，可以对上述载体系统进行修饰以快速有效地串联多个基因拷贝以及一步将这个表达盒导入在所述三个基因座之一(参见实施例5和图7A)。
在本发明的有利的进一步揭示中，经修饰的乳酸克鲁维酵母菌株因此在KlLAC4基因座或在KlURA3-20基因座或在KlMET5-1基因座处含有多个拷贝的外源抗原编码核酸序列，其通过串联表达盒或多重表达盒插入。所述表达盒包含抗原编码区(基因)的多个拷贝，在每种情况中其两侧是LAC4-12启动子(PLAC4-12)或所述启动子的变体和AgTEF1终止子。以这种方式进行的抗原基因拷贝的复制可以通过相应基因座之一显著增加其表达。
在本发明的一个优选实施方案中，外源抗原IBDV-VP2的基因以串联表达盒的形式存在于乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4。与具有单个拷贝的编码外源抗原IBDV-VP2的基因的菌株相比，所述乳酸克鲁维酵母菌株具有外源抗原IBDV-VP2表达量增加的优点。根据本发明这个实施方案的特别优选菌株VAK1118(DSM 32701)，其在KlLAC4基因座具有串联表达盒形式的外源抗原IBDV-VP2的基因。
进一步优选的是，不同的外源抗原编码核酸的一个或多个拷贝通过单个表达盒、串联表达盒或多重表达盒插入在本发明的乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4基因座和/或KlURA3-20基因座和/或KlMET5-1基因座。结果，有可能首先表达不同的外源抗原，及其次所述不同的外源抗原在酵母细胞中浓度不同。根据这个实施方案特别优选其中外源抗原甲型流感HA(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))和甲型流感M1(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))的编码核酸序列插入在乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4和KlURA3-20基因座并表达的乳酸克鲁维酵母菌株。根据本发明这个实施方案特别优选菌株VAK1283(DSM 32697)，其中外源抗原甲型流感HA (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))和甲型流感M1(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))的编码核酸序列插入乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4和KlURA3-20基因座。
如所提及的，已知KlGAL4基因剂量的增加可导致抗原产生的增加(Krijger etal.2012和WO 2013107436)。上文阐明了通过两步法整合表达KlGAL4的pLI-1质粒实现这一目标的缺点。根据本发明，通过提供稳定的起始菌株以整合包含KlGAL4基因的第二个拷贝的外源基因，克服了上述缺点。这样确保了所有衍生的菌株具有相同的遗传背景，且在所述菌株中正好存在一个额外的KlGAL4基因拷贝。这样降低了在多拷贝表达的情况中观察到的细胞毒性，以及将疫苗株生产步骤减少到仅一步。另外，由于省略了质粒的可逆整合/切割，因此提高了遗传稳定性。例如可以如实施例1中所述产生这种菌株。
在本发明的另一个有利的实施方案中，因此提供了一种乳酸克鲁维酵母菌株，其除了基因组KlGAL4基因外还包含KlGAL4基因的第二个异位拷贝。在所述菌株中，KlGAL4转录激活物的表达可以最大程度地增加两倍，插入到KlLAC4基因座和/或KlURA3-20基因座和/或KlMET5-1基因座的外源基因的表达可以以指定方式通过LAC4-12启动子或下文描述的所述启动子的变体增加。在常规实践中，将编码KlGAL4的质粒瞬时且以多个不受控制的拷贝数导入细胞中。结果，外源抗原通常以如此高的浓度表达，从而导致细胞毒性作用。在本发明这个实施方案的乳酸克鲁维酵母菌株的情况中，可以高度有效地降低或避免细胞毒性作用。也可以以这种方式控制将来出于相同目的而开发的其它基因基因座(插入LAC4控制的表达盒)。已发现侧翼为KlGAL4启动子和KlGAL4终止子的KlGAL4基因的异位拷贝整合进乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KLLA0E13795g(Klavt3::KlGAL4-1,SEQ ID No:1)时是有利的。根据本发明的这个实施方案特别优选具有这些性质的菌株VAK1111(DSM 32696)。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了乳酸克鲁维酵母菌株，其中外源抗原IBDV-VP2的编码核酸序列存在于基因座KlLAC4。根据本发明的这个实施方案特别优选菌株VAK1171(DSM 32699)。所述菌株还含有KIGAL4基因的第二个异位拷贝，在该拷贝处同样存在外源抗原IBDV-VP2的编码核酸序列。与没有额外的KIGAL4基因异位拷贝的菌株相比，所述菌株表现出外源抗原IBDV-VP2的表达增加。
微生物中异源蛋白产生在当导致细胞病变效应(CPE)时成为问题。因此，本发明提供了一种将抗原生产阶段与生物质积累阶段分离的方法。由于可诱导LAC4启动子，例如通过分批补料发酵过程是部分可能的，但是由于启动子PLAC4-12在非诱导条件下是不完全关闭的)(即在一定程度上是开放的)而受到阻碍。在具有极强CPE的抗原的情况中，结果发生的是生长速率的降低和细胞应激反应的诱导，这对抗原产生是不利的。KlGAL4基因剂量加倍和/或抗原编码序列数目增加使这个问题更加严重(见下文)。
因此，进一步开发本发明的乳酸克鲁维酵母菌株的优势包括具有LAC4-12启动子的修饰的启动子结构的乳酸克鲁维酵母菌株，其允许在非诱导条件下仅少量外源蛋白表达或不表达。LAC4-12启动子的修饰结构的特征特别在于启动子PLAC4-12在1065和1540位之间的基础控制区(BCR)缺失(LR2缺失；PLAC4-12-LR2；SEQ ID No:2)(也见实施例2)。如上所述，本发明的这个实施方案与常规实践相比具有以下优点：高效地降低或避免了通常由于外源基因的过强表达引起的细胞毒性作用。根据这个实施方案，优选其中外源抗原甲型流感HA(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))的编码核酸序列存在于基因座KlLAC4的乳酸克鲁维酵母菌株。根据本发明的这个实施方案，特别优选菌株VAK1243(DSM 32702)。所述菌株在LAC4-12启动子中包含LR2缺失。
乳酸克鲁维酵母菌株也可以具有修饰的LAC4-12启动子结构，其可以调节外源蛋白表达，其中启动子的激活物KlGal4的结合位点数目(“上游激活序列”1、2和4、5)是变化的且存在1、2、3或4个KlGal4结合位点。以这种方式，有可能在酵母细胞中以不同浓度(质量设计)表达不同的外源蛋白质。缩短的启动子变体对于系统的模块性是重要的，以例如以最佳化学计量比在同一菌株中表达蛋白质，例如用于形成高度免疫原性病毒样颗粒(VLP)。根据本发明的这个实施方案，当将外源抗原IBDV-VP2的编码核酸序列插入乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4时是优选的。根据本发明的这个实施方案，特别优选菌株VAK1131(DSM32700)。所述菌株在LAC4-12启动子包含LR2缺失和上游激活序列4和5的缺失。
本发明的部分目标是提供更适合培养的乳酸克鲁维酵母菌株。这个问题通过在根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株中恢复等位基因Kllac4、Klura3-20和Klmet5-1的基因功能来解决。所得乳酸克鲁维酵母菌株是原养型(实施例6，图8)。因此简化了疫苗菌株的发酵，并促进了生产过程的确立及使其更具成本效益。根据本发明的这个实施方案，优选其中外源抗原BVDV E2胞外域(1型，CP7)、BVDV E2胞外域(2型，New York 93)和BVDV Npro-NS3(1型，CP7)的编码核酸序列插入乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4、KlURA3-20和KlMet5-1中的乳酸克鲁维酵母菌株。根据本发明的这个实施方案，特别优选菌株VAK1400(DSM 32698)。所述菌株是原养型。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了选自如下菌株的乳酸克鲁维酵母菌株：
所述菌株于2017年11月24日或2017年12月1日(DSM 32705，DSM 32706)根据布达佩斯条约以上述编号保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，DSMZ,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany。
在另一方面，本发明提供了整合表达载体，借助于其可产生本发明的乳酸克鲁维酵母菌株。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了整合表达载体KIpURA3(SEQ ID No:3)和KIpMET5(SEQ ID No:4)。所述载体包含LAC4-12启动子(PLAC4-12)或所述启动子的变体(如上文关于乳酸克鲁维酵母菌株所述)，其包括待表达抗原的ORF，另外还包括AgTEF1终止子序列和允许在整合后靶向恢复Klura3-20和Klmet5-1等位基因的功能性的靶向序列。经由指定的限制位点将抗原编码序列克隆在表达盒的启动子序列和终止子序列之间。通过所述载体，表达外源基因的盒以稳定方式整合进乳酸克鲁维酵母基因组中，而无需标记物且不使用抗生素抗性。因此，这个载体系统的优势是外源基因可以容易地在不同的载体之间互换，并且表达盒的启动子和终止子可以被其它置换。表达盒由PLAC4-12启动子和AgTEF1终止子以及两者之间的外源基因组成。外源基因可以通过限制位点AscI和NotI交换。PLAC4-12启动子可以通过两个载体中的限制位点SmaI和AscI置换，终止子可以通过KIpURA3中的NotI和BoxI(或MluI)以及KIpMET5中的NotI和Ecl136II(或SacI)置换。将替代表达盒克隆在KIpURA3的限制位点SmaI和BoxI(或MluI)之间，以及KIpMET5的SmaI和Ecl136II(或SacI)之间。使用所述限制性酶，表达盒也可在KIpMET5和KIpURA3载体之间交换，或导入额外的表达盒。对KIp3和KIp3-MCS载体的改进(WO 20101054649)是在非诱导条件下(无乳糖)进行选择，这样在具有CPE的蛋白质的情况中会导致更高的转化率并阻止可能的具有降低的外源基因表达的转化体富集。也见于实施例3.1和3.2。
在本发明特别优选的实施方案中，提供了选自如下的整合表达载体：KIpMET5-PLAC4-12-Et，KIpMET5-PLAC4-12-LR2-Et，KIpMET5-PLAC4-Et，KIpMET5-PLAC4-LR2及KIpURA3-PLAC4-12-Et，KIpURA3-PLAC4-12-LR2-Et，KIpURA3-PLAC4-Et和KIpURA3-PLAC4-LR2(SEQ ID No:3或SEQ IDNo:4组合SEQ ID No:5、6、7或8)。
载体KIpURA3-PLAC4-12-Et、KIpURA3-PLAC4-12-LR2-Et、KIpURA3-PLAC4-Et和KIpURA3-PLAC4-LR2是载体KIpURA3-Et的变体，其中在每种情况中插入Etx.B-HA蛋白的编码核酸序列。载体KIpURA3-PLAC4-12-Et、KIpURA3-PLAC4-12-LR2-Et、KIpURA3-PLAC4-Et和KIpURA3-PLAC4-LR2与载体KIpURA3-Et相比在启动子方面有所不同。
载体KIpMET5-PLAC4-12-Et、KIpMET5-PLAC4-12-LR2-Et、KIpMET5-PLAC4-Et、KIpMET5-PLAC4-LR2是载KIpMET5体的变体，其中在每种情况中插入了Etx.B-HA蛋白的编码核酸序列。载体KIpMET5-PLAC4-12-Et、KIpMET5-PLAC4-12-LR2-Et、KIpMET5-PLAC4-Et、KIpMET5-PLAC4-LR2与载体KIpMET5相比在启动子方面有所不同。
在另一方面，本发明提供了一种用于生产根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株的方法，所述方法包括步骤：
(i)将希望的抗原的编码核酸序列插入KIpURA3或KIpMET5载体中，
(ii)用修饰的和预先经酶促消化的载体构建体转化乳酸克鲁维酵母培养物，
(iii)借助于不含尿嘧啶或/和甲硫氨酸的固体培养基选择转化的乳酸克鲁维酵母细胞，及
(iv)任选地，恢复原养型。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，多个抗原的基因序列可以同时异位插入并以调节方式表达。优选编码病原体不同变体的抗原的不同基因序列异位插入并以调节方式表达。此外，优选编码不同病原体的抗原的不同基因序列异位插入并以调节方式表达。
在另一方面，本发明提供了用于肠胃外、肠内、肌内、粘膜或口服施用的药物或兽药组合物，其包含根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株，任选地，组合常规运载体和/或赋形剂。特别地，本发明提供了适合于免疫接种的药物或兽药组合物。
优选地，药物或兽药组合物包含至少一种生理上相容的运载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂。根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株可以包含在药学上相容的运载体中，例如包含在常规介质如盐水溶液介质或缓冲溶液作为注射用药物组合物。这种介质还可以包含常规药学物质，例如用于设定渗透压的药学相容的盐、缓冲剂、防腐剂等。优选的介质包括生理盐水溶液和人血清。特别优选的介质是PBS缓冲盐水溶液。
进一步合适的药学相容的运载体为本领域技术人员已知，例如从Remington'sPractice of Pharmacy,13th edition和J.of Pharmaceutical Science&Technology,Vol.52,No.5,Sept-Oct,pages 238-311中获知。
本发明的另一方面提供了根据本发明的重组乳酸克鲁维酵母在免疫接种中的应用，例如用于产生保护性免疫作用，特别是针对病原体的保护性免疫作用。
产生保护性免疫作用的相应方法包括例如以下步骤：
a)培养和繁殖根据本发明的重组酵母，
b)收获并灭活所述酵母，
c)根据待定义的免疫方案施用所述重组酵母，
d)确定形成的抗体的效价，和/或
e)检测免疫作用。
根据本发明的重组酵母的培养和繁殖可以使用任何常规可用方法来实现。特别优选以成本有效方式导致高细胞产率的方法。这些包括发酵方法，尤其是高细胞密度发酵方法。已经发现使用分批补料发酵方案进行发酵是特别有利的。
在一个优选实施方案中，通过口服/粘膜、肌内或皮下施用所述重组酵母实现所述保护性免疫作用。
在根据本发明的方法中，重组酵母细胞应以灭活/杀死状态使用。为此，将酵母在培养和表达外源基因及随后灭活后进行干燥。可以使用任何常规可用方法进行灭活。特别适合用于本发明方法的是热灭活(例如在90℃热灭活2小时)或γ-照射(例如以25或50kGy照射)。
本发明还提供了一种免疫接种方法，包括给对象、例如动物或人、优选动物施用本发明的乳酸克鲁维酵母菌株，施用的量足以在对象内引起针对一或多种外源抗原的免疫应答、优选保护性免疫应答。
一个特别的优点是，使用根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株，在单次应用/免疫(“单次”)或两次应用/免疫(“初免-加强”)之后仅引起针对一种病原体的保护性免疫应答。已经发现的另一个优点是，使用根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株，在单次应用/免疫(“单次”)或在两次应用/免疫后(“初免-加强”)后可以引起针对病原体不同变体的交叉保护性免疫应答。如果根据本发明的乳酸克鲁维酵母菌株携带并表达针对不同病原体的抗原的不同外源基因，则甚至有可能在单次施用/免疫(“单次”)或在两次应用/免疫(“初免-加强”)后引起针对不同病原体的保护性免疫应答。
发明优点概括
乳酸克鲁维酵母平台中的所述改良获得如下多个优点：
a.可以十分简便(即用型工具箱/试剂盒)及高再现性构建基于酵母的“亚单位疫苗”菌株。其现在可以在指定的短时间跨度内产生。
b.酵母疫苗可以包含一种或多种抗原；其可以以灵活方式定制及以不同数量生产。
c.此外，可以进行有效的原养型酵母发酵。
d.重组蛋白生产的严格可诱导性是可能的。后者对于可引起CPE的蛋白质特别重要。
e.外源基因的靶向的、稳定的基因组整合以及菌株的相关遗传稳定性提供了生产过程可再现进行的优势。这对于GMP生产特别重要。
f.酵母疫苗的保护性随着由于外源基因拷贝和/或KlGAL4浓度增加所致的重组抗原产生的增加而提高。
g.此外，由于外源基因拷贝和/或KlGAL4浓度的增加而实现的重组抗原产生的增加可以减少要施用的疫苗剂量。酵母生产因此更具成本效益以及疫苗与疫苗接受者的相容性得到改善。
h.多价酵母疫苗可以以交叉保护性或多价保护性方式用于预防相同病原体的不同变体或不同病原体。除了灭活及与适当佐剂和/或适当液体量混合外，不需要进一步下游加工酵母以用作疫苗。
本发明基于附图和示例的实施方案得以更特别阐明。
图1示出具有两个KlGAL4拷贝的新产生的乳酸克鲁维酵母背景菌株的鉴定。检测在鉴别的整合位点第二个异位KlGAL4拷贝的存在并分析整合对酵母生长的影响。A：异位KlGAL4拷贝的整合位点图示。图中示出整合位点并给出基因名称。B：有(VAK1110)和没有(VAK367)额外整合的异位KlGAL4基因的酵母株的KlAVT3基因座的PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图，使用引物VK183(5'-GAGCCCACCACCTGCTCCTG-3')(SEQ ID No:9)和VK184(5'-CTGATGTATTGCGCTCCTTACTAAC-3')(SEQ ID No:10)进行。图右侧示出分别预期的片段大小。C：在葡萄糖(YPD)或乳糖(YPLac)上用连续十倍稀释液(起始OD 1)进行滴落测试(Tropfentest)。在每种情况中在30℃和37℃温育。对比在天然基因座(VAK1139)、在异位基因座和在天然基因座缺失KlGAL4(VAK1110)、不具有KlGAL4拷贝(ΔKlgal4；VAK964)或具有两个KlGAL4拷贝(VAK1168)的酵母菌株的生长。所显示的是指定的进一步KlGAL4基因的整合仅导致边缘生长缺陷：所述缺陷仅在37℃和诱导条件下可见。更清楚的是在KlGAL4完全缺失的情况中的生长缺陷。
图2示出具有额外的异位KlGAL4拷贝的产生IBDV-VP2的乳酸克鲁维酵母菌株的Western印迹分析。通过Western印迹分析了额外的KlGAL4拷贝对LAC4-12启动子依赖性重组蛋白生产的影响。使用的测试菌株是具有IBDV-VP2表达盒的酵母菌株，将该酵母菌株与其它IBDV-VP2酵母菌株进行比较。上面示出了异位KlGAL4拷贝和串联IBDV-VP2表达盒(见下文)的存在(+)或不存在(-)。在菌株VAK911中，通过BstEII将质粒pLI-1线性化而导入异位拷贝(Krijger et al.2012和WO 2013107436)，在菌株VAK1130中，异位KlGAL4拷贝位于KlAVT3基因座(见图1)。酵母菌株VAK367作为没有外源基因的野生型对照。在YPD中初步培养后，将酵母菌株在YPLac中培养15小时。在每种情况中，通过SDS-PAGE对每种酵母菌株分析20μg蛋白质提取物。使用抗IBDV兔血清(1:8000)和来自山羊的HRP缀合的抗兔抗体(1:10,000)进行免疫印迹。在右侧用箭头表示多聚体(agg.)和单体(mon.)IBDV-VP2，星号表示非特异性条带。图中示出额外的KlGAL4基因的异位表达导致外源抗原浓度的强力增加，串联表达盒的存在也如此(也参见下文)。
图3示例了LAC4-12启动子中LR2缺失对未诱导的重组蛋白产生及对在葡萄糖上酵母生长的影响。未修饰的LAC4-12启动子在非诱导条件下也呈现出GOI(感兴趣基因)的基础表达。在具有细胞毒性作用的外源抗原的情况中，这尤其成问题。用这些实验测试的是，在非诱导条件下LAC4-12启动子的BC区域的缺失(LR2缺失)是否可以降低或者甚至完全抑制重组蛋白产生。A：LAC4-12启动子(PLAC4-12)的示意图。图中示出了基础控制区(BCR)、LR2缺失和四个KlGal4结合位点(上游激活序列：U1，U2，U4，U5)以及外源基因(GOI)的编码核酸序列。B：在非诱导条件(YP 3％EtOH)下培养后，具有(VAK1131)和没有(VAK1130)LR2缺失的IBDV-VP2酵母菌株的Western印迹。VAK1111用作没有外源基因的野生型对照。对于每个酵母菌株，将50μg蛋白质提取物加样于12％SDS凝胶上。使用抗IBDV兔血清(1:5000)和来自山羊的HRP缀合的抗兔抗体(1:10,000)进行免疫印迹。使用小鼠抗Nop1抗体(1:5000)和来自山羊的HRP缀合的抗小鼠抗体(1:10,000)检测加样的对照KlNop1。C：在YPD、含有0.5％葡萄糖的YPD和YPLac上用连续十倍稀释液(起始OD 1)的滴落测试。在每种情况中在30℃和37℃进行温育。对比具有(VAK1243)和不具有(VAK952)LR2缺失的、在LAC4基因座携带甲型流感HA外源基因的酵母菌株的生长。酵母菌株VAK367用作没有外源基因的野生型对照。图中示出LR2缺失阻止了不希望的基础外源蛋白质表达。此外，示出LR2缺失在非诱导条件下和诱导条件下均改善了表达细胞毒性蛋白(流感血凝素，HA)的酵母菌株的生长。在37℃尤其明显。
图4示出可用于将蛋白质表达盒整合进乳酸克鲁维酵母基因组不同基因座的KIp载体。尽管已经描述了LAC4基因座(KIp3载体系统)的使用(WO 20101054649和WO2013107436)，但是KlURA3和KlMET5基因座的使用是新的。A：不同的KIp载体在基因组中的其各自的整合位点的示意图。B和C：本文新描述的KIpURA3(B)和KIpMET5(C)载体中的表达盒和侧翼末端。示出了不同的DNA序列节段和相关限制位点。GOI：外源基因(感兴趣基因)。D：借助KIp载体(A，B和C)构建的酵母菌株中外源蛋白表达的Western印迹分析。在此，外源基因是Etx.B-HA。酵母“管家”KlNop1蛋白(KLLA0C04389g)被检测作为加样对照。在YPD(+U)中初步培养后，将酵母菌株在YPLac(+U)中培养4h。对于每种酵母菌株，将30μg蛋白质提取物加样于12％SDS-PAGE。使用单克隆小鼠抗HA(1:5000)和抗KlNop1(1:5000；SantaCruz,TX,USA)抗体以及来自山羊的HRP缀合的抗小鼠抗体(1:10000；JacksonImmunoResearch,PA,USA)进行免疫印迹。图中示出，类似于LAC4基因座(WO 20101054649和WO 2013107436)，KlURA3和KlMET5基因座均可用于异源基因表达。
图5示出在同一酵母菌株中不同重组蛋白的产生。使用KIpURA3和KIp3-MCS载体构建所述酵母菌株(VAK1234)。对表达串联IBDV VP2的酵母株(见下文)的蛋白质进行Western印迹分析，所述酵母株中借助于KIpURA3载体(VAK1234)导入了额外的表达盒，Etx.B-HA作为外源基因。所用对照组是这样的酵母株，即在基因组中仅携带在LAC4(VAK899)或KlURA3基因座(VAK1235)具有Etx.B-HA的表达盒，或者在LAC4基因座(VAK1171)仅是串联IBDV-VP2表达盒。在YPD中初步培养后，将酵母菌株在YPLac中培养6小时。对于每种酵母菌株，将30μg蛋白质提取物加样于12％SDS-PAGE上。对于Etx.B-HA使用小鼠抗HA抗体(1:5000；SantaCruz,TX,USA)和来自山羊的HRP缀合的抗小鼠抗体(1:10,000)，对于IBDV-VP2使用兔抗IBDV抗血清(1:5000；Granzow et al.(1997))和来自山羊的HRP缀合的抗兔抗体(1:10,000；Jackson ImmunoResearch，PA，USA)，在免疫印迹中进行蛋白质检测。结果表明，这两种外源蛋白均在同一酵母细胞中表达。令人惊讶地，一种抗原的表达水平不受另一种抗原共表达的限制。在单价和二价菌株中的表达水平的比较中这是明显的(另见图12)。
图6示出对于KIp载体中表达盒的不同诱导的LAC4-12启动子变体。KIp载体的表达盒具有LAC4-12启动子的不同变体。基于分析包含带有Etx.B-HA作为外源基因的相应表达盒的酵母菌株，测试启动子变体对蛋白质合成的诱导强度的影响。A：启动子变体、具有Etx.B-HA作为外源基因的相关KIpURA3载体和由此产生的酵母菌株的示意图。BCR：转录激活物KlCat8和KlSip4的结合区，在非诱导条件下的转录激活物；U1，U2，U4，U5：转录激活物KlGal4的结合区(上游激活序列)。B：鉴定使用KIpURA3载体(A)产生的酵母菌株中LAC4-12启动子变体的Western印迹分析。在YPD中初步培养后，将酵母菌株在YPLac中培养4小时。对于每种酵母菌株，将30μg蛋白质提取物加样于12％SDS PAGE上。使用单克隆小鼠抗-HA(1:5000)和抗-Nop1(1:5000)抗体以及来自山羊的HRP缀合的抗小鼠抗体(1:10,000)进行免疫印迹。结果表明，外源基因的表达率依赖于所用启动子的性质而变化。
图7示出通过串联表达盒使外源基因拷贝数加倍对重组蛋白产生的影响。检测通过串联表达盒增加外源基因拷贝数对重组蛋白生产(IBDV-VP2)的影响。A：串联表达盒的示意图。示出DNA节段和相关限制位点。GOI：外源基因(感兴趣基因)。B：描述了衍生自(A)的串联构建体借助于ScURA3选择标记用于随机整合。C：Western印迹分析用于比较在具有串联表达盒(A)的酵母菌株(VAK1118)和具有仅包含一个外源基因拷贝的表达盒的酵母菌株(VAK910)中的IBDV-VP2蛋白产生。在YPD中初步培养后，将酵母菌株在YPLac中培养3小时或6小时。对于每种酵母菌株，将60μg蛋白质提取物加样于12％SDS-PAGE上。使用抗IBDV兔血清(1:10000)和来自山羊的HRP缀合的抗兔抗体(1:10000)进行免疫印迹。聚集的(agg.)和单体的(mon.)IBDV-VP2在右边用箭头指示，非特异性条带用星号指示。D：具有随机整合的串联IBDV-VP2表达盒(B)的酵母菌株与具有一个表达盒(VAK910)的KIp3-MCS产生的酵母菌株以及衍生自其中具有额外的KlGAL4-1拷贝(pLI-1)的酵母菌株比较的Western分析。在YPD中初步培养后，将酵母菌株在YPLac中培养8小时。如(b)所述进行免疫印迹。结果表明，使用串联表达盒显著提高外源蛋白表达率。
图8示出恢复等位基因Klura3-20和Klmet5-1(A)的基因功能的基因片段。图中示意性示出使用指定引物扩增的KlURA3(A)和KlMET5(B)的基因座和基因片段。使用这些基因片段通过同源重组重构的等位基因Klura3-20(A)和Klmet5-1(B)的突变在该基因下方用星号标示。图中示出切下亚克隆片段的限制位点。这个图示例了在URA3或MET5基因座产生表达原养型外源基因的酵母菌株的策略。
图9组合表1和表2示出在传统初免-加强接种方案中针对vvIBDV对鸡的保护性免疫作用。在两个实验(A和B)中，根据初免-加强方法，对一组至少16只SPF鸡经皮下接种遗传优化的串联IBDV-VP2乳酸克鲁维酵母株VAK1127的冻干和热灭活酵母细胞。第一次接种在孵化两周后进行(初免)，第二次(加强)是在初免后两周。在加强之后两周，用vvIBDV毒株(极毒毒株89163/7.3)进行病毒攻击。对作为感染对照的一个对象组进行模拟处理，其中仅施用PBS或佐剂。在实验1(A)中，还施用野生型酵母(VAK367)作为对照。每组至少七只鸡作为无病毒攻击的对照，在实验2(B)中至少有五只。在初次施用之前、在攻击之前和之后以及以十天间隔的其它时间点获得血清。通过ELISA(ProFLOK IBD Plus，Synbiotics)测定血清转化强度。图中示出根据试剂盒信息转化的效价。A：以与实验1(A)相同方式进行实验2。图中示出来自12只动物的ELISA效价的平均值及标准偏差。在接种了VAK1127的动物中，这两个实验均示出抗IBDV VP2抗体效价的强劲发展。相关表概括了接种的动物对于vvIBDV攻击的保护作用结果：在两个接种实验中，有可能实现针对病毒感染的完全保护作用。
图10示出恢复原养型的遗传修饰对串联IBDV-VP2酵母菌株的重组蛋白产生量和免疫原性的影响。对比营养缺陷型串联IBDV-VP2酵母菌株VAK1127和由此衍生的原养型酵母菌株VAK1171的重组蛋白生产的效力和免疫原性。A：Western印迹分析以确定新鲜收获的酵母材料中IBDV-VP2含量。在YPD中初步培养后，将酵母菌株在YPLac中培养8小时。将每个酵母菌株的40μg蛋白质提取物加样于12％SDS-PAGE上。使用抗IBDV兔抗血清(1:10,000)和来自山羊的HRP缀合的抗兔抗体(1:10,000)进行免疫印迹。聚集的(agg.)和单体的(mon.)IBDV-VP2在右边用箭头指示，非特异性条带用星号指示。B：Western印迹分析以确定冻干的、热灭活的酵母材料中的IBDV-VP2含量，其随后用于在BALB/c小鼠中免疫研究(C)。在YPD中初步预培养后，将酵母菌株在YPLac中培养15小时。对于每个酵母菌株，将10μg蛋白质提取物加样于12％SDS-PAGE上，如上述(A)进行免疫印迹并相应标出条带。C：在对BALB/c小鼠进行的免疫实验中检测两种酵母菌株VAK1127和VAK1171的免疫原性。用0.1mg(干重)上述分析的(B)酵母材料为每组五只小鼠经皮下接种三次。使用的对照是没有抗原的野生型菌株(VAK367)。第一次施用使用CFA(完全弗氏佐剂)作为佐剂进行，间隔两周另外两次使用IFA(不完全弗氏佐剂)作为佐剂。在第三次施用后一周，对小鼠安乐死并放血。通过IBDV-VP2 ELISA(IDEXX)分析血清。图中示出与抗IBDV-VP2抗体效价相关的在650nm的吸光度及标准误差。单克隆抗IBDV-VP2抗体(pos.mab64)用作ELISA的阳性对照，样品缓冲液(neg.1)或非特异性抗体(neg.2)用作阴性对照。图中示出这两种菌株呈现相似水平的外源蛋白表达及呈现出免疫原性潜力。
图11组合表3示出了通过单次皮下施用遗传优化的IBDV-VP2疫苗酵母，SPF鸡针对vvIBDV的保护性免疫作用。孵化后两周，将至少18只SPF鸡的组经皮下逐一接种10mg经遗传优化的串联IBDV-VP2乳酸克鲁维酵母菌株VAK1171的热灭活细胞。使用的对照是用PBS或10mg VAK367接种的动物。将其在孵化后两周和四周接种两次。在孵化后六周，所有动物用vvIBDV攻击。如上所述通过ELISA(ProFLOK IBD Plus，Synbiotics)分析血清。示出确定的抗体效价。各个点代表每组分析的十二只鸡的各个抗体效价，条形代表具有标准偏差的平均值。在对照的情况中，在攻击后仅确定存活的鸡的抗体效价。结果表明，仅用酵母亚单位疫苗VAK 1171进行“单次”免疫接种即可实现针对随后暴露于vvIBDV的完全保护作用。
图12示出了菌株VAK952和VAK1283的鉴定。(A)将酵母菌株VAK952(单价HA)和VAK1283(二价HA，M1)在摇瓶中于YPD中预温育，然后在YPL中诱导6小时。测量600nm的光密度，收获30OD单位的培养物，使用玻璃珠破坏沉淀，在免疫印迹中检查可溶蛋白质级分(LF)和不溶蛋白质级分(P，沉淀)。使用的一抗是α-HA1或α-M1，使用的二抗是α-小鼠-IR-Dye800CW。通过红外成像系统(LI-COR Biosciences)产生信号。(B，C)将酵母菌株在摇瓶中于YPD中预温育，随后在YPL中诱导24小时。在指定的时间点，确定酵母培养物的光密度，收获30OD单位。(B)使用玻璃珠破坏VAK1283的沉淀并在免疫印迹中分析。(C)组合VAK952和VAK1283的光密度的测量值成为随时间变化的生长曲线，并从至少两个单独实验中取平均值。(D)对于斑点试验，将酵母菌株在含有YPD的营养琼脂平板上在30℃培养48小时。从1OD单位开始，将酵母连续稀释，然后点滴在含YPD或YPL的营养琼脂平板上。将平板在30℃培养48小时，然后拍照。丽春红S：各级分的总酵母蛋白质染色，加样对照。图中示出VAK952(单价HA)和VAK1283(二价HA，M1)以可比量表达HA蛋白。此外，示出VAK1283和VAK952具有可比的生长性质，而VAK1283略具优势。
图13示出在暴露感染前后用VAK952(单价HA)和VAK1283(二价HA，M1)免疫接种后，BALB/c小鼠血清中的抗体效价。将这两种酵母菌株在装有YPD的摇瓶中预温育，然后在YPL中诱导12小时(VAK952)或6小时(VAK1283)。之后，收获培养物，冷冻干燥，并将酵母材料在90℃灭活2小时。为进行免疫接种，将9周龄雌性BALB/c小鼠间隔3周皮下接种两次(初免-加强)或一次(单次)2mg酵母(VAK952，VAK1283)或者1mg VAK1283或者两次PBS(无佐剂)。使用的佐剂是AddaVax。最后一次施用之后三或六周，将动物经鼻内感染5×MLD50的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。使用的感染对照是模拟感染的动物(Mock)，仅鼻内施用不含病毒的PBS。最后一次施用之后三或六周以及在暴露感染期间，获得动物血清并测试其在VNT中的中和抗体(nAb)。nAb titer50：与无病毒对照相比，使噬菌斑数目减少50％的血清稀释度。指定了相应血清稀释度的log2。由于对数坐标图，将值log2(2)＝1指派给没有可检测抗体的血清样品。mAb：测试系统对照(α-H1(H37-66))。图中示出，两种免疫方案均导致中和抗体的明显诱导。此外，显然在初免-加强接种实验和单次接种实验中获得的中和性抗HA抗体效价对于VAK952和VAK1283没有明显差异。
图14示出在用VAK952(一价HA)和VAK1283(二价HA，M1)免疫后，用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的暴露感染。最后一次施用后三或六周(免疫方案见图13)，用5×MLD50的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)鼻内感染BALB/c小鼠。使用的感染对照是模拟感染的动物(Mock)，其仅鼻内施用不含病毒的PBS。之后，在14天的时间内每天多次检测动物的存活(A)、体重(B)和临床症状(C)。在临床症状的情况中，定义0-4分值，这是每组的平均值(0：无异常；1：略微皮毛粗糙；2：皮毛粗糙，活动减少；3：皮毛粗糙，体重减轻15％；4：皮毛粗糙，体重减轻>20％)。图中示出，使用VAK952的初免-加强免疫方法不能针对病毒暴露提供最佳的保护作用，而VAK1283也是这种情况。对于这两种疫苗，施用2mg疫苗的单次免疫方案产生最佳保护作用。当施用1mg时，VAK1283与在初免-加强方法中施用2mg VAK952获得相似的保护率。
示例实施方案
实施例1:产生具有稳定整合在非偶联基因座的两个KlGAL4基因拷贝的宿主株
将没有选择标记的第二KlGAL4基因拷贝插入一个不同的基因座(异位)。可以通过测序定位插入在KlAVT3基因(KLLA0E13795g)中(Klavt3::KlGAL4-1,SEQ ID No:1)(图1)。所得菌株称为VAK1111。通过杂交实验证实在染色体E(异位拷贝)和D(基因组拷贝)上的两个KlGAL4拷贝的独立减数分裂隔离。此外，在同一实验中，确定在基因组中恰好两个KlGAL4-1基因拷贝的数目。
类似于VAK367-D4，为了使用VAK1111将表达盒靶向整合在LAC4基因座，导入lac4::ScURA3破坏，这使得在乳糖生长选择下通过在一个步骤中即可将希望的外源基因通过KIp载体技术不使用标记而整合在LAC4启动子和LAC4读框之间(Krijger et al.(2012))。所得菌株VAK1123与VAK367-D4的区别仅在于第二个异位KlGAL4基因拷贝。
实施例1.1:具有另外整合的KlGAL4基因的酵母疫苗株的改良的生产力
在一个示例实施方案中，将IBDV-oVP2T2S基因(Arnold et al.(2012))插入菌株VAK1123的LAC4基因座中(所得菌株VAK1130)。与仅具有一个KlGAL4拷贝(VAK910)的其它同基因菌株相比，可以确定增加的IBDV-VP2产生。作为比较，另外示出仅带有一个KlGAL4基因但带有两个CDS VP2IBDV拷贝的VAK1118菌株(参见下文)(图2)。
实施例2:基础活性降低的PLAC4-12LR2’启动子用于优化具有致细胞病变作用的抗原的表达
微生物中异源蛋白质生产在其导致致细胞病变作用(CPE)时会成问题。因此，面临的任务是找到一种将抗原生产阶段与生物质积累阶段分离的方法。由于可诱导LAC4启动子，这可以通过分批补料发酵过程部分实现，但是由于启动子PLAC4-12在非诱导条件下并未完全关闭而受到阻碍。在具有非常强CPE的抗原的情况中，发生的是生长速率的降低和细胞应激反应的诱导，这对抗原产生具有不利影响。KlGAL4基因剂量加倍和/或抗原编码序列数目的增加使这个问题更加严重(见下文)。解决办法是在-1065至-1540之间缺失启动子PLAC4-12的基础控制区(BCR)(图3A)(Mehlgarten et al.(2015))(LR2缺失；PLAC4-12-LR2’；SEQID No:2)。将所述缺失连同lac4::ScURA3破坏一起导入起始菌株VAK367(一个KlGAL4拷贝)和VAK1111(两个KlGAL4拷贝)的基因组LAC4基因座。所得菌株VAK1109和VAK1124适于表达具有CPE的抗原。启动子PLAC4-12LR2’也被插入整合载体KIpURA3-Et和KIpMET5-Et(见下文)。
实施例2.1:通过修饰的启动子抑制抗原的基础(非诱导)表达
在将串联IBDV-VP2表达盒整合进VAK1124之后(所得酵母菌株：VAK1131；关于术语“串联表达盒”的解释参见下文和图7)，可以显示LAC4-12启动子的LR2缺失导致在非诱导条件下VP2蛋白产生明显降低(图3B)。对于表达甲型流感抗原血凝素的菌株(VAK952在启动子中没有LR2缺失，VAK1243在启动子中具有LR2缺失)，可以显示由于LR2缺失，甲型流感HA抗原的致细胞病变作用被抑制且在非诱导条件下的生长得到改善(图3C)。
实施例3:将多个表达盒整合进乳酸克鲁维酵母基因组的通用载体系统
如以前关于VAK367-D4(Krijger et al.(2012),WO 20101054649)所述，酵母菌株VAK367形成了本文所述所有乳酸克鲁维酵母菌株的遗传背景。由于两个基因KlURA3(KLLA0E22771g)和KlMET5(KLLA0B03938g)的突变，这个菌株背景需要尿嘧啶和甲硫氨酸(尿嘧啶和甲硫氨酸营养缺陷型)，所述两个基因被称为等位基因Klura3-20(在+345位置缺少碱基对)和Klmet5-1(G2555A；和A3682T)；所述等位基因因此是无功能基因变体。
使用这些突变等位基因以使用除了已经用KIp3/KIp3-MCS(Krijger et al.(2012))开发的整合位点LAC4之外的进一步基因座进行靶向整合，从而产生多价疫苗株(图4A)。通过恢复这些突变基因的基因功能来实现选择，而无需另外插入选择标记。为此，产生新的整合载体。在所述载体中，表达盒(在每种情况中在LAC4-12启动子或其变体的控制下)的两侧是基因节段，所述基因片段允许通过同源重组进行KlURA3基因的上游整合和KlMET5基因的下游整合，同时恢复这些基因的野生型序列。
通过诱变和选择用于替代生长物质的营养缺陷型，可以将其他基因座类似地开发为整合位点。
实施例3.1:将表达盒(具有可诱导LAC4-12启动子)靶向整合在具有Klura3-20和/或Klmet5-1等位基因的乳酸克鲁维酵母菌株的KlURA3(KLLA0E22771g)和/或KlMET5(KLLA0B03938g)基因座的载体KIpURA3和KIpMET5
整合表达载体KIpURA3(SEQ ID No:3)和KIpMET5(SEQ ID No:4)通过合适基因片段(KlMET5/KlURA3靶向序列)构建，所述基因片段允许分别靶向恢复Klura3-20和Klmet5-1等位基因的功能性。
KIpMET5表达载体包含由LAC4-12启动子(PLAC4-12或其变体)、待表达抗原的编码核酸序列和AgTEF1终止子组成的表达盒；其上游侧翼是具有导入的ScCYC1终止子的基因组KlMET5片段，下游侧翼是具有下游KlAIM18基因的KlAIM18启动子。
KIpURA3表达载体包含由LAC4-12启动子(PLAC4-12或其变体)、待表达抗原的编码核酸序列和AgTEF1终止子组成的表达盒；其上游侧翼是具有相关启动子的KLLAOE22749g，下游侧翼是具有下游KlURA3片段的KlURA3启动子(图4B，C)。
在每种情况中，通过AscI和NotI限制位点将抗原编码序列克隆在启动子和终止子之间。通过对所得质粒用Eco91I或KpnI限制，将整个表达盒与KIpURA3载体主链分离，以及通过对所得质粒用HindIII或BoxI限制，将整个表达盒与KIpMET5载体主链分离，及将限制材料转化进具有Klura3-30和/或Klmet5-1等位基因的乳酸克鲁维酵母宿主菌株中。因此，以这种方式整合进KlURA3-20或KlMET5-1中的含有外源基因的表达盒精确地对应于用KIp3-MCS载体中也整合进VAK367-D4中LAC4的表达盒(WO 20101054649)。以标准方式通过菌落PCR检测尿嘧啶原养型和/或甲硫氨酸原养型转化体，对于KIpMET5转化体使用引物MAB6和VK211，对于KIpURA3转化体使用引物MAB6和VK71。表达盒整合在KlURA3或KlMET5与相应相邻基因之间的正确靶位点处产生这样的产物，对于KIpMET5转化体产生大小为1652bp的产物，对于KIpURA3转化体产生大小为1307bp的产物。没有迹象表明邻近基因的功能性会因插入而受损。
引物:
MAB6:5’-CCCAGATGCGAAGTTAAGTG-3’(SEQ ID No:11)
VK71:5’-TACAACAGATCACGTGATCTTTTTGTAAG-3’(SEQ ID No:12)
VK211:5’-GATTTCGTAACCCTATTGTTCATGAATG-3’(SEQ ID No:13)
实施例3.2:在KlURA3或KlMET5基因座整合编码基因盒之后外源抗原的表达
在整合在LAC4、KlURA3和KlMET5基因座之后，在PLAC4-12启动子控制下的外源基因被乳糖几乎同等力度地诱导。来自大肠杆菌的不耐热无毒的肠毒素亚基B(Etx.B)和在C端的(HA)3表位(Etx.B-HA)被用作测试蛋白以评估载体系统。将编码序列克隆进载体KIpMET5、KIpURA3和KIp3-MCS并整合在基因座KlMET5(VAK1251)、KlURA3(VAK1235)和LAC4(VAK899)(图4D)。如western印迹所示，在所有三个菌株中Etx.B-HA蛋白的浓度非常相似(图4D)。因此，根据基因组中表达盒的整合位点、根据重组蛋白产生量，不能确定任何位置效应。
实施例3.3:两个外源抗原在相同酵母细胞中的共表达
通过新载体系统在相同酵母株中在PLAC4-12启动子控制下产生不同异源蛋白质的可能性可以通过构建具有在KlURA3基因座的Etx.B-HA表达盒及在LAC4基因座具有串联的两个VP2IBDV拷贝的表达盒的酵母菌株示出(VAK1234；图5；关于串联盒的解释参见下文和图7)。与在每种情况中基因组中仅存在一个表达盒的酵母菌株(VAK1235或VAK1171)相比，不能确定在VAK1234情况中Etx.B-HA或VP2IBDV的蛋白质浓度的任何降低。
实施例4:在相似诱导条件下调节重组蛋白合成的LAC4启动子变体
抗原的免疫原性作用通常基于非化学计量比的多个蛋白质的装配。为了在基于酵母的疫苗中做到这一点，产生PLAC4-12LR2’启动子的变体(图6A)，其可以被乳糖或半乳糖不同地诱导。其特征在于激活物KlGal4的结合位点数目(U1，U2，U4，U5；et al.(1991))和基础控制区BCR的存在/不存在。除了插入到KIpURA3载体中如图3A所示的构建体之外，还可以通过插入进一步的结合位点产生具有增加的启动子强度的启动子变体。这个结果是合成的、乳糖可诱导的启动子以扩展载体系统，且可以在相同诱导条件下实现不同的蛋白质生产或基因表达速率。
实施例4.1:外源抗体在各种LAC4启动子变体控制下的表达
Etx.B-HA在四个LAC4-12启动子变体控制下的表达。测试了四个LAC4启动子变体，其区别在于在转录激活物KlGal4的结合位点数以及在非诱导条件下基础表达控制区的存在/不存在(基础控制区，即BCR；图6A；SEQ ID No:14)。使用所述启动子变体，产生KIpURA3-Et载体变体KIpURA3-PL412-Et、KIpURA3-PL412LR2-Et、KIpURA3-PL4-Et和KIpURA3-PL4LR2，及在每种情况中插入Etx.B-HA蛋白作为测试GOI。如上所述，可通过限制位点AscI和NotI插入替代GOI。将表达盒整合到KlURA3基因座并通过western印迹定量Etx.B-HA的蛋白浓度(图6B)。结果表明，在相同诱导条件下(在含乳糖的完全培养基中4小时)，最长的启动子变体PLAC4-12导致最高的蛋白质浓度，所述启动子变体包含在LAC4和LAC12基因之间的整个基因间区域并包含四个KlGal4结合位点(U1，U2，U4，U5)(et al.(1991))。如果仅存在LAC4近侧的两个U1和U2结合位点(-1064至-10)，则另外缺失BCR(-1540至-1065)在诱导条件下也具有减少蛋白质作用。
实施例5:通过增加抗原编码基因的拷贝数提高抗原生产
因此，对上述载体系统进行了修饰，以快速有效地串联连接多个基因拷贝并将这个表达盒一步导入所述三个基因座之一(图7A)。
为了产生可整合在LAC4基因座的串联表达盒，将三个PCR扩增片段通过任何希望的KIp3(-MCS)-GOI模板在一个步骤中融合(融合克隆)：(1和2)表达盒含有PLAC4-LR2和TTEF(引物：VK30&VK31，及VK32&VK33)及(3)LAC4靶向序列(VK34&VK35)。在例如使用HpaI限制后，可以如所述将串联表达盒整合进lac4::URA3基因座(图7)。在成功整合表达盒后，第一个外源基因拷贝取决于起始菌株由PLAC4-12或PLAC4-12-LR2调节，第二个由PLAC4-LR2调节。或者，在两个表达盒之间将选择标记插入限制位点SmiI、MluI或PmeI并通过KpnI去除LAC4靶向序列，产生串联盒，其可以通过NHEJ以非定向方式整合到基因组中。如果使用MreI和AvaI切去表达盒，则可以连接相容性末端，从而可以产生长的多个表达盒。通过使用MreI和AvaI重复限制，在连接混合物中富集了其中表达盒串联排列(从头到尾)的片段。其在标记选择的情况中以非定向方式转化和整合。
引物:
VK30:
5’-TATAGGGCGAATTGGAGCTCCGCCGGCGGAAGAGGTAACGCCTTTTGTTAAC-3’(SEQ ID No:15)
VK31:
5’-CTAAACGGAACTCGCATTTAAATCTCGTTTTCGACACTGGATGG-3’(SEQ ID No:16)
VK32:
5’-GCGAGTTCCGTTTAGACGCGTTTAAACTTGTTTAATTATTATGGGGCAGGCGAGA-3’(SEQ IDNo:17)
VK33:
5’-CGGGGAATGCGCTGCTTTTCGACACTGGATGGCGGCGTTA-3’(SEQ ID No:18)
VK34:
5’-GCAGCGCATTCCCCGGGTACCGCTCTCGACTAGGTGATTAGCG-3’(SEQ ID No:19)
VK35:
5’-AAAAGCTGGGTACCGGGCCCACTAGTCGAGAGTTAACCGTGACTACAGCT A-3’(SEQ ID No:20)
实施例5.1:多拷贝策略的成功应用
使用IBDV-VP2作为抗原和包含两个串联的IBDV-VP2编码序列(CDS-VP2IBDV)的KIp3衍生表达盒证实这个策略。KIp3载体中的串联IBDV-VP2表达盒(图7A)(质粒KIp3-串联-oVP2T2S，SEQ ID No:21)由两个来自KIp3-MCS-oVP2T2S的VP2IBDV(CDS-VP2IBDV)的LAC4启动子调节的编码序列组成(Arnold et al.,(2012))。第一个拷贝的启动子序列由LAC4启动子的-1123至-10区域组成，第二个拷贝的由-1099至-10区域组成。两个CDS-VP2IBDV均在3'末端侧翼为AgTEF1终止子。使用HpaI切割质粒KIp3-串联-oVP2T2S并将限制材料转化进菌株VAK367-D4。如此产生的酵母菌株VAK1118含有整合在LAC4基因座的串联表达盒。如western印迹所示，与仅具有一个拷贝的同基因菌株相比，所述菌株中IBDV-VP2蛋白浓度更高(图7B)。串联表达盒在遗传上是高度稳定的：在诱导培养基(YNB+乳糖)中生长78代后，通过PCR测试的100个菌落中没有一个呈现出表达盒的遗传变化(数据未示出)。
实施例6:在乳酸克鲁维酵母菌株中产生原养型以在合成培养基和完全培养基中简化发酵的工具
在进行的研究中，显然尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株比尿嘧啶原养型菌株在完全培养基中的生长更差，这种作用只能通过加入尿嘧啶来部分中和。为了简化疫苗菌株的发酵，促进生产过程的建立以及使其更具成本效益和避免由于甲硫氨酸和/或尿嘧啶摄取不足所致生长效应，因此应找到快速及可再现地实现中和这些为菌株构建所需的营养缺陷型的方式。为了从Klura3-20重构KlURA3，借助于引物VK67和VK69以及野生型KlURA3基因作为模板通过PCR产生DNA片段(图8A)。为了修复Klmet5-1等位基因，借助于引物VK74和VK75以及野生型等位基因KlMET5作为模板类似地产生PCR片段(图8B)。将PCR片段转化相应突变菌株(单独或一起)并在没有甲硫氨酸和/或没有尿嘧啶的培养基上进行选择，使得野生型等位基因高效重构。实施这种方法以例如产生菌株VAK1171和VAK1400(参见上文)。
引物
VK67:5’-GACATCACTGTCTCTTCCCCTTAATGATC-3’(SEQ ID No:22)
VK69:5’-TCAGCAAGCATCAATAATCCCCTTGGTTC-3’(SEQ ID No:23)
VK74:5’-GAAAGAAAGACGTTGGTCTCTACGCTTG-3’(SEQ ID No:24)
VK75:5’-AGATTATAAGTTCCTGGGGCTTTACCCAC-3’(SEQ ID No:25)
实施例7:优化的灭活的疫苗酵母的保护性免疫作用
在各种免疫接种研究中验证如实施例1-5进行的乳酸克鲁维酵母疫苗平台的修饰和优化。
实施例7.1:使用示例IBDV-VP2酵母株(VAK1127)，优化的乳酸克鲁维酵母平台的免疫原性
VAK1127菌株包含一个串联IBDV-VP2表达盒(SEQ ID No:21)，两个KlGAL4拷贝和LAC4启动子的LR2缺失。为了鉴定酵母株的免疫原性，在靶生物体鸡中进行免疫实验。在攻击实验中，实现了针对由Eterradossi及同事(1997)充分鉴定的极强毒性(vv)IBDV毒株89163/7.3(AFSSA,Ploufragan,France)的SPF鸡的完全保护作用(表1和2)。为此，在独立进行的两个实验中，皮下施用两次1mg冻干的热灭活(2h，90℃)酵母(VAK1127)和不完全弗氏佐剂(IFA)(图9A和B)(初免-加强)。在孵化后两周和四周施用，及在孵化后六周进行病毒暴露(攻击)。19天后，在接种了VAK1127的动物中已经可以测量到高效价的抗IBDV-VP2抗体。在对照中，抗IBDV-VP2抗体效价只在用vvIBDV攻击后才会发生(图9)。在这两个实验中，均观察到接种VAK1127的动物针对vvIBDV攻击的完全保护作用(患病率0％，死亡率0％)(表1和表2)。通过这些实验，可以观测到在传统初免-加强接种方法中使用亚单位疫苗的针对vvIBDV的保护作用。
疫苗酵母的免疫原性不受遗传回复突变为携带抗原的原养型酵母菌株的影响。借助于营养缺陷型或原养型IBDV-VP2酵母菌株，可以在小鼠的疫苗接种实验中证明这一点(图10C)。如上所述(实施例6；图8)，将酵母菌株VAK1127(营养缺陷型)在两个步骤中制成原养型，使用PCR片段产生VAK1171。这两种菌株形式在重组蛋白的表达水平上无显著差异(图10A和B)。小鼠皮下接种3次0.1mg热灭活的酵母株皮下接种IFA，间隔两周。在营养缺陷型IBDV-VP2菌株(VAK1127)和原养型后代(VAK1171)之间的血清转化强度没有任何差异(图10C)。
实施例7.2:在“单次”方案中免疫接种的完全保护作用
由于缺乏免疫原性，使用亚单位疫苗“单次”免疫接种，即单次施用疫苗进行免疫接种通常是无效的。但是，在初免/加强方法中使用优化的菌株VAK1127获得的抗体效价变化数据(图9)示出即使采用单次免疫方法获得保护性的可能性。通过用原养型酵母菌株VAK1171进行单次免疫接种对此进行检测(图11；表3)。为此，仅为此目的以增加剂量(10mg)单次施用酵母，然后间隔4周进行攻击。显然，使用VAK1171，“单次”免疫实际上可以获得针对vvIBDV的完全保护作用(患病率0％，死亡率0％)(表3)。这个结果可归因于在免疫接种后大约20天产生高保护性抗体效价(图11)。单次免疫接种方案提供针对vvIBDV的高度保护作用的事实表明所用疫苗的强大免疫原性潜力以及为优化的疫苗平台提供了令人印象深刻的验证。
实施例7.3:与单价酵母疫苗相比，二价酵母疫苗在针对甲型流感病毒感染时具有改良的保护作用。
为了针对甲型流感病毒进行疫苗接种，产生了三种不同的疫苗株。首先，产生VAK952(DSM 32705)，其表达甲型流感病毒株(Puerto Rico/8/1934；PR8/34)的主要抗原，即HA(血凝素)基因。在VAK952中，将基因整合进基因组LAC4基因座，如Krijger et al.(2012)和Arnold et al.(2012)所述。其次，产生VAK1283(DSM 32697)。在此，除了LAC4基因座中来自PR8/34的HA基因外，M1基因另外被整合进URA3基因座中。M1基因编码另一种重要的甲型流感抗原，其明显比HA更保守。已经发表的报告能够表明，组合这两种抗原可以提高针对甲型流感的疫苗的免疫原性，以及还实现了针对不同流感病毒的交叉保护性。为了也用二价酵母疫苗验证这一方面，产生了另一种菌株(VAK1395；DSM 32706)，其同样在URA3基因座中包含M1基因，其中PR8/34的HA基因被替换为流感病毒California/4/2009的HA基因。检查了各菌株的HA的相当表达和M1的额外表达；也示出所述菌株表现出相当的生长，其中VAK1283比VAK952略有优势(图12)。在疫苗接种研究中，在每种情况中在小鼠模型中使用了不同浓度酵母的初免-加强方案和单次方案，表明VAK952和VAK1283均诱导相当的病毒中和抗体效价(图13)。但是，在攻击实验中，很明显二价VAK1283疫苗在初免-加强方案和单次方案中均提供了最大保护，而单价VAK952疫苗则不是这种情况。此外，在单次实验中疫苗VAK1283以一半酵母材料使用时，与初免-加强方法中的VAK952达到相似的保护作用(图14和表3)。在使用VAK1395作为疫苗的实验中，也可以建立针对流感PR8/34的保护。因此，使用二价酵母疫苗实现了针对不同流感变体的交叉保护作用。
表1的注解
(a)孵化两周后，给鸡皮下接种1mg酵母(或PBS)和作为佐剂的IFA。接种后两周，其被以相同方式加强。再两周后，通过眼鼻途径用104EID vvIBDV(极毒毒株89163/7.3)进行病毒暴露测试。灭活的VAK1127酵母株的全酵母用作疫苗酵母，仅接种PBS和IFA的组用作感染对照。其中施用无抗原的野生型酵母(VAK367)的组作为单独酵母作用的对照。
(b)采用0-4评分进行组织病理学囊病变评估：0：无病变；1：5-25％的滤泡受影响；2：26-50％的滤泡受影响；3：51-75％滤泡受影响；76-100％的囊损害(结构丧失)。
(c)使用下式计算法氏囊-体重指数(bu/bod)的平均值：(囊重量/体重)*1000。未暴露的对照组由至少7只鸡组成，暴露组由10只鸡组成。给出了标准偏差
(d)患病率以病鸡数/整组鸡数表示。括号中示出病鸡的百分比。
(e)死亡率以死亡鸡数/整组鸡数表示。括号中示出死亡鸡的百分比
表2的注解
(a)孵化两周后，给鸡皮下接种1mg酵母(或PBS)和作为佐剂的IFA。接种后两周，其被以相同方式加强。再两周后，通过眼鼻途径用104EID vvIBDV(极毒毒株89163/7.3)进行病毒暴露测试。灭活的VAK1127酵母株的全酵母用作疫苗酵母，仅接种PBS和IFA的组用作感染对照。
(b)采用0-4评分进行组织病理学囊病变评估：0：无病变；1：5-25％的滤泡受影响；2：26-50％的滤泡受影响；3：51-75％滤泡受影响；76-100％的囊损害(结构丧失)。
(c)使用下式计算法氏囊-体重指数(bu/bod)的平均值：(囊重量/体重)*1000。未暴露的对照组由至少5只鸡组成，暴露组由9只鸡组成。给出了标准偏差。
(d)患病率以病鸡数/整组鸡数表示。括号中示出病鸡的百分比。
(e)死亡率以死亡鸡数/整组鸡数表示。括号中示出死亡鸡的百分比。
表3的注解
(a)孵化两周后，给鸡皮下接种10mg酵母(或PBS)和作为佐剂的IFA。四周后，通过眼鼻途径用104EID vvIBDV(极毒毒株89163/7.3)进行病毒暴露测试。单独使用灭活的VAK1171株的全酵母作为酵母疫苗。所使用的感染对照是，首先仅用PBS和MF59接种的组，及其次用野生型酵母和MF59接种的组；第一次接种之后两周，这两组均施用含有相同量的酵母或PBS的加强。
(b)采用0-4评分进行组织病理学囊病变评估：0：无病变；1：5-25％的滤泡受影响；2：26-50％的滤泡受影响；3：51-75％滤泡受影响；76-100％的囊损害(结构丧失)。
(c)使用下式计算法氏囊-体重指数(bu/bod)的平均值：(囊重量/体重)*1000。每组由至少九只鸡组成。给出了标准偏差。
(d)患病率以病鸡数/整组鸡数表示。括号中示出病鸡的百分比。
(e)死亡率以死亡鸡数/整组鸡数表示。括号中示出死亡鸡的百分比。
序列
本专利申请包含如下序列作为说明书的一部分：
SEQ ID NO 名称
1 乳酸克鲁维酵母avt3::LAC9
2 PLAC4-12-LR2
3 KIpURA3-载体
4 KIpMET5-载体
5 LAC4-12启动子变体PLAC4-12
6 LAC4-12启动子变体PLAC4-12-LR2
7 LAC4-12启动子变体PLAC4
8 LAC4-12启动子变体PLAC4-LR2
9 引物序列VK183
10 引物序列VK184
11 引物序列MAB6
12 引物序列VK71
13 引物序列VK211
14 PLAC4-12的BCR
15 引物序列VK30
16 引物序列VK31
17 引物序列VK32
18 引物序列VK33
19 引物序列VK34
20 引物序列VK35
21 KIp3-串联-oVP2T2S
22 引物序列VK67
23 引物序列VK69
24 引物序列VK74
25 引物序列VK75
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<120> 基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优化的宿主/载体系统
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<210> 1
<211> 5042
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<400> 1
atgaatatca atatcaagaa agattctgga gggaatgggt ccgatttacc tcgatggaac 60
gattctccgg tgggaagttt agggtcgttt aatgggagaa gaagatcgat gtccttctct 120
gaatcagtaa acttcgcaag aaatactcag aacccattgg atatgtcagc tcaggaaatg 180
agaggattga atgggttcag aagatctttc atcgctcata agtcgttgaa acttcatggg 240
aagacaccga actttatcac taggaatttc aacgagttct tgacgttata cggccatttc 300
gctggtgaag atttgtccga ggatgaggaa acagaaactg aggtggagac tgatgaagat 360
gaggacgaag aagctgcgct tcttcgtcat ggtattaggg gcctgcgcca cctcgacaat 420
ttcaaacgta tcagagtgct ttgccaattg ttcggcagca gtcttcatac ctcttacgat 480
ggcagggtat ggcgttacaa ggttatcagt atataggaca ccgaccttga tcttctgagg 540
cagttcagct tctctccaag gaatagggat actagtagta tcagattccc aaggcttacc 600
gtcattaatg taatgtttca taaagtaatc cagctcttca atagatcctc tacgccggac 660
gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca 720
tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg 780
gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat 840
tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg 900
agtcgcataa gggagagcgt cgatcgacct ttgacattcg ctgttcaaag ttaccacagc 960
agcaattgat ccaagctaac tcacggcacg ggcgtagcaa gtgaaccgtc gatattgagc 1020
agtgtatgaa tatgcattcg taccagtatt ttgtgtgatc acgcaggact ttacggtttc 1080
acggaccgga acagaccgta ttcctgtcct taagtgtaat gtatgggtgt gatctctgtc 1140
ctccgccttt cccatacaaa agttgctttg aaaaagaagt aactgcaaaa tcatagataa 1200
tgacactttg aataactaga aataacaact tcggaccctt gctcaattca agtaagacaa 1260
tatatagcgt acctgccgtt cttccaagtg agggtttgtt ctgttggttc agaaatccca 1320
ggatattcag agttttttaa agcttttctt agagtcaagg cactttttta caccaattgt 1380
actagtaccc aactaaacat taaaagatca gcaaccatcc aaatggttta cgatttgacc 1440
atttgaacat cacagatctg aactttactc cgactgattg tttttactat acgaaatggg 1500
tagtagggcc tccaattcgc cttctttttc aagtaaggcg gaaacgttac tgccatcgga 1560
gtataaaaag aatgcggtta agaaggaaac aatacgcaat ggcaagaaaa ggaaattgcc 1620
tgatacagaa tcctcagatc ctgagtttgc aagtcggcgt ttgatagcta atgaaactgg 1680
cactgatgcg gtgagtaatg gtaacaaaaa tgatagcaat gccaacaaca acaacaacaa 1740
caacaacaag aaatcaagtg aagtaatgca ccaggcgtgc gatgcttgca ggaagaagaa 1800
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<223> 合成的多核苷酸
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<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> 变化
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 变化
<222> (4962)..(4963)
<223> nn 是 aa, ag 或 ga
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gttgattctt gatcacttag cagacaaaac tggtaacggt acagttaaaa ttaccaccag 360
agcaactttc caattgcatg gtgttgttaa gcacaattta aagcacacta tcagagctat 420
gaattccacc ttgatggaca ctttagcggc gtgtggtgat gttaacagaa atgtcatgct 480
ttctgctttg cctgctaatg ccacggttca caaacaaatt gcagacgttg gtacatatct 540
ttctgaacgt ttcttgcctc aaacaacggc gtatcacgaa atttggttag agggtccaga 600
caaggatgat gaagatcctt cttggccaga gacctacgag aaaagacaag aaggtcctat 660
aaagaagaag aaaactcttg ttgccggtaa tgcattagtt gatgcggaac cagtctatgg 720
tccaacatac ttaccaagaa agttcaagat caatattact gttccacctt tcaatgatgt 780
cgatgtgtgg tccagtgacg ttggtttgat tgctataatt gatgaaccaa ctcaaactct 840
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atacccaaga acaggttcgt tgttcgggta tgtctccgta gcagatgtgg gagatgccat 960
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cggttgggta aaggatgaaa ctggactaaa tcatttcact gccttcattg aaaatggtag 1200
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gaagaaagat aacttcggtc acttcagatt aaccggtaac caacacgttc ttatctcaga 1320
cgttgatgac gagcatttag acgaagttaa agctatcatg aacaagtaca agctagacaa 1380
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<210> 5
<211> 2794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 5
cgtaattctg tctttaatca ttaacactga ctgaaggata taattataag acaacacaca 60
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agttgtgaaa agtgtagcgg aaatttgtgg tccgagcaac agcgtctttt tctagtagtg 1920
cggtcggtta cttggttgac attggtattt ggactttgtt gctacaccat tcactacttg 1980
aagtcgagtg tgaagggtat gatttctagt ggtgaacacc tttagttacg taatgttttc 2040
attgctgttt tacttgagat ttcgattgag aaaaaggtat ttaatagctc gaatcaatgt 2100
gagaacagag agaggatgtt cttccctaac tcgaaaggta tatgaggctt gtgtttctta 2160
ggagaattat tattcttttg ttatgttgcg cttgtagttg gaaaaggtga agagacaaaa 2220
gctggaattg tgagcggata acaagctcaa cacttgaaat ttaggaaaga gcagaatttg 2280
gcaaaaaaaa taaaaaaaaa ataaacacac atactcatcg agaagctgt 2329
<210> 7
<211> 1638
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 7
gcggggatcg actcataaaa tagtaacctt ctaatgcgta tctattgact accaaccatt 60
agtgtggttg cagaaggcgg aattctccct tcttcgaatt cagcttgctt tttcattttt 120
tattttccat ttttcagttt ttgtttgtgt cgaatttagc cagttgcttc tccaagatga 180
aaaaaacccc tgcgcagttt ctgtgctgca agatcctaat cgacttttcc accccccaca 240
aaagtaaatg ttcttttgtt acattcgcgt gggtagctag ctccccgaat cttcaaagga 300
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<211> 1081
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 8
aacttgttta attattatgg ggcaggcgag agggggagga atgtatgtgt gtgaggcggg 60
cgagacggag ccatccaggc caggtagaaa tagagaaagc cgaatgttag acaatatggc 120
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t 1081
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<212> DNA
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<223> 引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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ctgatgtatt gcgctcctta ctaac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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gatttcgtaa ccctattgtt catgaatg 28
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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<212> DNA
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<400> 16
ctaaacggaa ctcgcattta aatctcgttt tcgacactgg atgg 44
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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<400> 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 21
ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 60
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tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 240
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taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcg cgccattcgc cattcaggct 480
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ttcaattgtc ggtgcccact ataccttaca aggtaacggt aactataagt tcgatcaaat 2040
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gtccgctact gccaatatca atgacaaaat tggtaacgtc ttagtcggtg aaggtgttac 2280
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cgttagtggt ccataacctc aggttcagcc ggctcatagt cttccgaatc gtacattatt 6540
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gaaatcgatt gagtcgttcg agcacagatt gagatttgag ggtgtggaca attgttacga 7260
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gtccgattcc acttatatcg aggaccaaga tcaatggtgg ctctctggta tttacagaga 7440
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ttcttatgat cacatcaatt tcacacttta cgaacctgaa gatggatcta aagtttacga 7620
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tggcagtgtg attcaatcta ttaagcacca tgttggtttc agacaagtgg agttgaagga 7860
cggtaacatt actgttaatg gcaaagacat tctctttaga ggtgtcaaca gacatgatca 7920
ccatccaagg ttcggtagag ctgtgccatt agattttgtt gttagggact tgattctaat 7980
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cttagacaga gcttcccaac ttgtcctaag agatgtcaat catccttcga ttattatctg 8280
gtccttgggt aacgaagctt gttatggcag aaaccacaaa gccatgtaca agttaattaa 8340
acaattggat cctaccagac ttgtgcatta tgagggtgac ttgaacgctt tgagtgcaga 8400
tatctttagt ttcatgtacc caacatttga aattatggaa aggtggagga agaaccacac 8460
tgatgaaaat ggtaagtttg aaaagccttt gatcttgtgt gagtacggcc atgcaatggg 8520
taacggtcct ggctctttga aagaatatca agagttgttc tacaaggaga agttttacca 8580
aggtggcttt atctgggaat gggcaaatca cggtattgaa ttcgaagatg ttagtactgc 8640
agatggtaag ttgcataaag cttatgctta tggtggtgac tttaaggaag aggttcatga 8700
cggagtgttc atcatggatg gtttgtgtaa cagtgagcat aatcctactc cgggccttgt 8760
agagtataag aaggttattg aacccgttca tattaaaatt gcgcacggat ctgtaacaat 8820
cacaaataag cacgacttca ttacgacaga ccacttattg tttatcgaca aggacacggg 8880
aaagacaatc gacgttccat ctttaaagcc agaagaatct gttactattc cttctgatac 8940
aacttatgtt gttgccgtgt tgaaagatga tgctggtgtt ctaaaggcag gtcatgaaat 9000
tgcctggggc caagctgaac ttccattgaa ggtacccgat tttgttacag agacagcaga 9060
aaaagctgcg aagatcaacg acggtaaacg ttatgtctca gttgaatcca gtggattgca 9120
ttttatcttg gacaaattgt tgggtaaaat tgaaagccta aaggtcaagg gtaaggaaat 9180
ttccagcaag tttgagggtt cttcaatcac tttctggaga cctccaacga ataatgatga 9240
acctagggac tttaagaact ggaagaagta caatattgat ttaatgaagc aaaacatcca 9300
tggagtgagt gtcgaaaaag gttctaatgg ttctctagct gtagtcacgg ttaactctcg 9360
actagtgggc ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga gggttaattc cgagcttggc 9420
gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 9480
catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 9540
attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 9600
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 9660
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 9720
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 9780
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 9840
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 9900
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 9960
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 10020
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 10080
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 10140
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 10200
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 10260
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 10320
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 10380
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 10440
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 10500
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 10560
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 10620
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 10680
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 10740
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 10800
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 10860
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 10920
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 10980
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 11040
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 11100
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 11160
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 11220
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 11280
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 11340
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 11400
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 11460
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 11520
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 11580
tg 11582
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gacatcactg tctcttcccc ttaatgatc 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
tcagcaagca tcaataatcc ccttggttc 29
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gaaagaaaga cgttggtctc tacgcttg 28
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
agattataag ttcctggggc tttacccac 29

Claims (11)

1.一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株，用于将外源抗原编码核酸靶向克隆进乳酸克鲁维酵母菌株的酵母基因组中，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母菌株除KlLAC4基因座之外，还在KlURA3-20基因座KLLA0E22771g和/或在KlMET5-1基因座KLLA0B03938g具有整合的外源抗原和/或外源蛋白的表达盒，其中所述乳酸克鲁维酵母表达盒包含LAC4-12启动子或所述启动子的变体，包括在LAC12和LAC4之间的基因间区域，所述表达盒还包含抗原或外源蛋白编码区和AgTEF1终止子，并且其中所述LAC4-12启动子的变体选自：
具有修饰的启动子结构的LAC4-12启动子，其在非诱导条件下仅允许少量外源蛋白表达或不允许外源蛋白表达，其特征在于，缺失了SEQ ID No:14所示的在-1065和-1540之间的LAC4-12启动子的基础控制区；和
具有修饰的启动子结构的LAC4-12启动子，其允许调节外源蛋白表达，其特征在于，所述启动子的激活物KlGal4结合位点数目不同并且存在1、2、3或4个KlGal4结合位点，其中激活物KlGal4结合位点选自上游激活序列1、2、4和5。
2.权利要求1的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，通过串联表达盒或多重表达盒在所得乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4基因座或KlURA3-20基因座或KlMET5-1基因座插入外源抗原编码核酸的多个拷贝。
3.权利要求1或2的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，不同外源抗原编码核酸的一个或多个拷贝通过单个表达盒、串联表达盒或多重表达盒插入在KlLAC4基因座和/或KlURA3-20基因座和/或KlMET5-1基因座。
4.权利要求1或2的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，外源抗原A/Puerto Rico/8/1934的甲型流感HA和A/Puerto Rico/8/1934的甲型流感M1的编码基因插入在乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4和KlURA3-20基因座并被表达。
5.权利要求1或2的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母菌株除了基因组KIGAL4基因之外，额外包含KIGAL4基因的第二异位拷贝。
6.权利要求1或2的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，等位基因Kllac4、Klura3-20和Klmet5-1的基因功能被恢复且所述乳酸克鲁维酵母菌株是原养型的。
7.权利要求1或2的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，外源抗原BVDV E2胞外域1型CP7、BVDV E2胞外域2型New York 93和BVDV Npro-NS3 1型CP7的基因插入在所述乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4、KlURA3-20和KlMet5-1。
8.一种乳酸克鲁维酵母菌株，其选自：
2017年11月24日以保藏号DSM 32697保藏在德国的德国微生物和细胞培养物保藏中心的乳酸克鲁维酵母VAK1283；
2017年12月1日以保藏号DSM 32706保藏在德国的德国微生物和细胞培养物保藏中心的乳酸克鲁维酵母VAK1395和
2017年11月24日以保藏号DSM 32698保藏在德国的德国微生物和细胞培养物保藏中心的乳酸克鲁维酵母VAK1400。
9.一种药物组合物，其含有权利要求1-8任一项的乳酸克鲁维酵母菌株。
10.权利要求1-8任一项的乳酸克鲁维酵母菌株在制备用于在对象中引起针对一种或多种外源抗原的保护性免疫应答的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母菌株是皮下、肌内、口服或粘膜施用的。
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