CN101918558B - 流感的治疗及预防 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含双链区的核酸分子，及编码其的核酸构建体，它们可用于治疗和/或预防流感。特别地，本发明涉及编码双链RNA分子的核酸构建体，其可以用于产生转基因家禽，例如鸡，从而它们至少对禽流感感染的易感性更低。还提供了包含双链区的核酸分子，其可以用作治疗剂治疗和/或预防例如家禽中的禽流感。

Description

流感的治疗及预防
发明领域
本发明涉及包含双链区的核酸分子，编码其的核酸构建体，它们可用于治疗和/或预防流感。特别地，本发明涉及编码双链RNA分子的核酸构建体，它们可用于产生转基因动物，例如鸡，从而它们至少对于禽流感感染是较不易感的。还提供了包含双链区的核酸分子，其可以作为治疗剂而治疗例如家禽中的禽流感。
发明背景
已知有三种类型流感病毒，甲型、乙型和丙型，它们属于称为正粘病毒科的单链负义有包膜RNA病毒科。病毒基因组长度大约12000-15000个核苷酸并包含8个RNA节段(丙型中为7个)，编码11种蛋白质。
甲型流感病毒感染许多动物如人、猪、马、海洋动物和鸟类(Nicholsonet al.，2005)。其天然贮库(reservoir)是在水禽中，在禽类物种中大多数流感病毒感染导致温和的呼吸道和肠道局部感染。但是病毒在家禽中可以具有高致病作用，突然爆发，导致在感染家禽群体中高死亡率。
甲型流感病毒可以基于编码病毒附着和细胞释放所需的表面糖蛋白即血凝素(HA)和神经酰胺酶(NA)的两个基因的抗原区中的等位基因差异而分成亚型。其它主要病毒蛋白包括核蛋白、核壳结构蛋白、基质蛋白(M1和M2)、聚合酶(PA、PB1和PB2)及非结构蛋白(NS1和NS2)。
在甲型流感病毒中已知至少16个HA亚型(H1至H16)和9个NA(N1至N9)抗原变体。禽类流感病毒株也可以被鉴定为低致病和高致病株。低致病株典型地在HA前体的裂解位点的-1和-3位仅具有两个碱性氨基酸，而高致病株具有多碱性裂解位点。亚型H5和H7可以导致家禽中高致病性感染，某些亚型已示出穿过物种屏障至人中。高致病性H5和H7也可以从家禽中低致病前体产生。禽流感感染症状从典型流感类型症状(发热、咳嗽、喉咙痛和肌肉疼痛)到结膜炎、肺炎、急性呼吸窘迫和其它危及生命的并发症。
需要开发控制动物中如家禽中流感病毒存活和/或复制的方法，以便不仅改善家畜业生产力和健康，也降低对人的健康威胁。
发明概述
本发明人鉴别了包含双链区的核酸分子，其能降低流感病毒在感染的动物细胞中的复制和/或产生。
因此，本发明提供了编码包含双链区的RNA分子的核酸构建体，其中当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低动物细胞中甲型流感病毒复制和/或降低在动物细胞中感染性甲型流感病毒颗粒的产生和/或降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的动物细胞中的表达。
优选地，双链区包含选自如下核苷酸的序列：
(i)SEQ ID NO：1的位置2240-2341内的核苷酸，
(ii)SEQ ID NO：2的位置2257-2341内的核苷酸，
(iii)SEQ ID NO：3的位置2087-2233内的核苷酸，
(iv)SEQ ID NO：4的位置1484-1565内的核苷酸，
(v)SEQ ID NO：6-15或52-54任一核苷酸序列，
(vi)与(i)-(v)任一序列至少90％相同的核苷酸序列，
(vii)在严格条件下与(i)-(v)任一序列杂交的核苷酸序列。
在一个实施方案中，当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低动物细胞中甲型流感病毒复制。在另一个实施方案中，当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低动物细胞中感染性甲型流感病毒颗粒的产生。在另一个实施方案中，当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的动物细胞中的表达。
优选地，甲型流感病毒是禽流感病毒。
本发明的核酸构建体可编码任何类型的包含双链区的RNA分子。优选地，所述双链区长度至少为19个碱基对。还优选所述双链区长度小于100个碱基对。
在一个特别优选的实施方案中，所编码的RNA分子是短发夹RNA。
在一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ IDNO：9的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ IDNO：12的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ IDNO：6的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，由RNA分子编码的双链区包含SEQ IDNO：15的核苷酸序列。
在一些情况中，希望的是核酸构建体编码一个以上RNA分子，例如2、3、4、5或更多个RNA分子。因此，本发明提供了编码2个或更多个RNA分子的核酸构建体。编码的RNA分子可以是不同或相同的，或者其组合。另外，编码的RNA分子可靶向相同或不同甲型流感病毒基因，或其组合。在一个实施方案中，每个RNA分子包含相应于不同甲型流感病毒基因的核苷酸序列。
本发明进一步提供了本发明的核酸构建体，其中每个RNA分子由与RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子可操纵连接的核苷酸序列编码。在一个优选的实施方案中，所述启动子是RNA聚合酶III启动子。
在一些情况中，希望的是启动子序列与来自所述核酸构建体转染/转化进其中的动物和/或细胞或其后代的天然发生的启动子序列相同。在一个实施方案中，启动子是鸡、火鸡和/或鸭启动子。
优选地，所述启动子选自U6、7SK和/或H1启动子。
在一个特别的实施方案中，U6启动子是cU6-1、cU6-2、cU6-3和/或cU6-4。
在进一步的实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：22-25任一核苷酸序列。
本发明人意外地发现包含含有引起shRNA转录所需的最小量启动子序列的U6启动子的核酸构建体与包含具有额外100bp上游序列的U6启动子的构建体在转录shRNA方面至少等效。因此，在本发明的一个实施方案中，启动子由选自SEQ ID NOs：22-25任一的核苷酸序列组成。
在另一个实施方案中，编码RNA分子的每个核苷酸序列与不同的RNA聚合酶III启动子可操纵地连接。
在一个实施方案中，RNA分子降低由SEQ ID NO：1-5任一序列编码的甲型流感病毒多肽的表达。
在一个特定的实施方案中，甲型流感病毒多肽可选自PB1、PB2、PA、NP和/或M1。优选地，所述多肽是禽流感多肽。
在一个实施方案中，禽流感是高致病株。
优选地，禽流感是H5N1。
在另一个实施方案中，构建体包含仅甲型流感病毒序列和天然发生的宿主动物序列。例如，当构建体设计用于转染进鸡时，该核酸构建体希望地由鸡序列和甲型流感病毒序列组成。因此，在一个实施方案中，本发明提供了本发明的核酸构建体，其中所述构建体由鸡核苷酸序列和甲型流感病毒核苷酸序列组成。
在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码三个包含双链区的RNA分子，其中所述双链区包含选自如下的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15，
(ii)SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，及
(iii)SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12。
在另一个优选的实施方案中，核酸构建体包含选自SEQ ID NO：16-21和61-63的核苷酸序列或其片段，或者包含与选自SEQ ID NO：16-21和61-63的核苷酸序列至少95％相同的序列。优选地，所述片段包含从所述序列的5’和/或3’末端缺失100个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失50个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失20个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失10个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的和/或外源的包含双链区的核酸分子，其中所述双链区包含选自如下的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：1的位置2240-2341内的核苷酸，
(ii)SEQ ID NO：2的位置2257-2341内的核苷酸，
(iii)SEQ ID NO：3的位置2087-2233内的核苷酸，
(iv)SEQ ID NO：4的位置1484-1565内的核苷酸，
(v)SEQ ID NO：6-15或52-54任一核苷酸序列，
(vi)与(i)-(v)任一序列至少90％相同的核苷酸序列，
(vii)在严格条件下与(i)-(v)任一序列杂交的核苷酸序列。
在一个实施方案中，当与缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述分离的和/或外源的核酸分子降低动物细胞中甲型流感病毒复制。在另一个实施方案中，当与缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述分离的和/或外源的核酸分子降低动物细胞中感染性甲型流感病毒颗粒的产生。在另一个实施方案中，当与缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述分离的和/或外源的核酸分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的动物细胞中的表达。
在另一个实施方案中，本发明的分离的和/或外源的核酸分子降低由SEQ ID NO：1-5任一序列编码的甲型流感病毒多肽的表达。
优选地，分离的和/或外源的核酸分子的双链区的长度至少为19个核苷酸。在一些实施方案中，优选所述双链区长度小于100个核苷酸。
在一个实施方案中，所述分离的和/或外源的核酸分子包含双链RNA。
优选地，所述分离的和/或外源的核酸分子是短干扰RNA或短发夹RNA。
在一个优选的实施方案中，所述分离的和/或外源的核酸分子包含选自SEQ IDNO：16-21和61-63的核苷酸序列或其片段，或者包含与选自SEQID NO：16-21和61-63的核苷酸序列至少95％相同的序列。优选地，所述片段包含从所述序列的5’和/或3’末端缺失100个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失50个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失20个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失10个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，核酸构建体和/或分离的和/或外源的核酸分子存在于细胞基因组中。
本发明进一步提供了包含本发明的核酸构建体和/或本发明的分离的和/或外源的核酸分子的载体。
本发明进一步提供了包含本发明的核酸构建体、分离的和/或外源的核酸分子和/或载体的细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述细胞是原生殖细胞，例如鸡原生殖细胞。
本发明进一步提供了包含本发明的核酸构建体、分离的和/或外源的核酸分子、载体和/或细胞的转基因非人生物。所述转基因生物可以是任何生物如动物或植物。
在一个实施方案中，转基因生物是非人动物。
在另一个实施方案中，转基因生物是禽类。在一个优选的实施方案中，转基因生物是家禽。在更优选的实施方案中，转基因生物是鸡、火鸡或鸭。
在一个实施方案中，本发明的转基因生物包含选自SEQ ID NO：16-21和61-63的核苷酸序列或其片段，或者包含与选自SEQ ID NO：16-21和61-63的核苷酸序列至少95％相同的序列，其编码至少一个包含双链区的RNA分子。与SEQ ID NO：16-21和61-63密切相关的片段和/或序列包含在这个实施方案中，因为构建体的5’和/或3’区当整合进生物体的基因组中时可能丧失，和/或许多世代细胞分裂过程中的微小突变可能导致与原始构建体相比的一或几个核苷酸差异。优选地，所述片段包含从所述序列的5’和/或3’末端缺失100个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失50个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失20个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列，更优选地从所述序列的5’和/或3’末端缺失10个核苷酸或更少个核苷酸的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，转基因生物包含两个或更多个本发明的核酸构建体。
本发明进一步提供了包含本发明核酸构建体、本发明的分离的和/或外源的核酸分子、本发明的载体、本发明的细胞和/或本发明的核酸分子的组合物。
本发明的核酸构建体、分离的和/或外源的核酸分子、载体和宿主细胞可用于治疗和/或预防对象中甲型流感病毒感染。例如，所述核酸构建体、分离的和/或外源的核酸分子、载体和宿主细胞可用于保护家禽，如但不限于鸡、火鸡或鸭免于禽流感。另外，在禽流感在鸟类群体中局部爆发事件中，希望的是保护周围区域如周围农场的鸟类免于感染以控制禽流感爆发。
因此，本发明进一步提供了治疗和/或预防对象中甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括给予对象本发明的核酸构建体、本发明的分离的和/或外源的核酸、本发明的载体和/或细胞。
在一个实施方案中，所述方法包括给予在饮用水或在气溶胶中的核酸构建体、分离的和/或外源的核酸、载体和/或细胞。
在一个特别的实施方案中，甲型流感病毒是禽流感。
优选地，禽流感是高致病株。
在一个最优选的实施方案中，禽流感是H5N1。优选地，对象是禽类，更优选地是家禽。在一个最优选的实施方案中，对象是鸡、火鸡或鸭。
本发明进一步提供了降低细胞中一或多个甲型流感病毒基因表达的方法，所述方法包括给予细胞本发明的分离的和/或外源的核酸分子。
本发明进一步提供了本发明的核酸构建体、本发明的分离的和/或外源的核酸、本发明的载体和/或本发明的细胞在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒感染的药物中的应用。
本发明进一步提供了鉴别包含本发明的核酸构建体或本发明的分离的和/或外源的核酸的动物的方法，所述方法包括：
确定得自动物的样品中本发明的核酸构建体和/或本发明的分离的和/或外源的核酸分子的存在或缺失。
在一个实施方案中，所述方法包括扩增所述核酸构建体或其片段，或所述分离的和/或外源的或者分子或其片段。
在另一个实施方案中，所述方法包括：
将得自动物的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与所述核酸构建体或所述分离的和/或外源的核酸分子杂交形成复合物，及
确定复合物的存在或缺失。
本发明进一步提供了育种流感抗性非人转基因动物的方法，所述方法包括：
(i)将本发明核酸构建体导入非人动物细胞，
(ii)选择包含所述核酸构建体的转基因非人动物细胞，
(iii)从所述转基因非人动物细胞再生转基因非人动物，
(iv)育种所述转基因非人动物以产生转基因后代，及
(v)选择抗流感的转基因后代。
本发明进一步提供了生产食品的方法，所述方法包括：
(i)将本发明核酸构建体导入动物细胞，
(ii)选择包含所述核酸构建体的转基因细胞，
(iii)从所述转基因细胞再生转基因动物，
(iv)育种所述转基因动物以产生转基因后代，及
(v)从所述转基因后代生产食品。
在一个实施方案中，所述食品选自肉和蛋。
本发明进一步提供了制备抗流感转基因非人动物的方法，所述方法包括：
(i)将包含转座子的第一核酸导入细胞中，其中所述核酸编码双链RNA分子，
(ii)将编码转座酶的第二核酸导入细胞中，
(ii)选择在细胞基因组中包含第一核酸的转基因细胞，
(iii)从所述细胞再生转基因非人动物，及
(iv)育种所述转基因非人动物。
所述第一和第二核酸可以在单个核酸分子上导入细胞，或者，可以在分离的核酸分子上导入细胞。优选地，所述第一和第二核酸在分离的核酸分子上导入细胞。
在一个实施方案中，转座子是Tol2转座子，转座酶是Tol2转座酶。
在另一个实施方案中，细胞是鸡原生殖细胞。
本发明进一步提供了抗两个的转基因非人动物。
在一个实施方案中，所述转基因动物包含编码包含双链区的RNA分子的核酸构建体，其中当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低动物细胞中甲型流感病毒复制。
在另一个实施方案中，所述转基因动物包含编码包含双链区的RNA分子的核酸构建体，其中当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低在动物细胞中感染性甲型流感病毒颗粒的产生。
在另一个实施方案中，所述转基因动物包含编码包含双链区的RNA分子的核酸构建体，其中当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的动物细胞中的表达。
在另一个实施方案中，所述转基因非人动物是鸡，流感是甲型流感。
优选地，所述转基因非人生物包含本发明的核酸构建体、本发明的分离的和/或外源的核酸、本发明的载体和/或本发明的细胞。
本发明进一步提供了本发明的非人转基因动物或本发明的转基因非人生物的育种用途。
本发明进一步提供了本发明的非人转基因动物或本发明的转基因非人生物的生产食品的用途。
显而易见，本发明的一个方面的优选特征和特性适用于本发明的许多其它方面。
在整个申请中，词语“包含”或其变化形式应理解包括所述元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的组，但是不排除任何其它元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的组。
本发明以下通过非限制实施例和附图描述。
附图简述
图1.shRNA表达盒的PCR。用于产生shRNA表达载体的PCR策略的示意图。PCR使用与包含所有shRNA成分的反向引物配对的正向引物。所有最终PCR产物由鸡U6或7SK启动子、shRNA有义、环、shRNA反义、终止序列和XhoI位点组成。
图2.MWH-1转基因的构建。A，逐个转录单位用一步PCR法产生。PCR产物含有鸡polIII启动子和shRNA成分(有义、环、反义和终止子序列)。B，三个转录单位用PCR产物的5’和3’末端的相容的SalI和XhoI位点连接在一起。C，最终的转基因含有3个转录单位，表达3个shRNA以靶向选择的甲型流感病毒基因。
图3.pStuffit的质粒图(6151bp)。图上标出鸡基因组4个克隆区域并加阴影。指出了克隆限制位点及其它相关的导入的限制位点。MWH转基因被插入位于ME1200和GRM5200之间的唯一的EcoRI位点。TheHindl[iota]l enzyme sites of pIC20H的HindIII位点可以用于切割包括填充片段/buffer侧翼序列的完整MWH转基因作为一个单片段插入鸡基因组。
图4.转基因小鼠的流感攻击。A，表达shNP-1496的小鼠相对于表达shEGFP的小鼠的％重量变化。B，表达shNP-1496的小鼠相对于表达shEGFP的小鼠的相对病毒基因表达。
序列表关键点
SEQ ID NO：1-甲型流感PB2基因的共有核苷酸序列。
SEQ ID NO：2-甲型流感PB1基因的共有核苷酸序列。
SEQ ID NO：3-甲型流感PA基因的共有核苷酸序列。
SEQ ID NO：4-甲型流感NP基因的共有核苷酸序列。
SEQ ID NO：5-甲型流感M1基因的共有核苷酸序列。
SEQ ID NO：6-15-靶向甲型流感基因和/或其编码的mRNA的核酸分子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16-MWH1和填充序列的核苷酸序列。5′填充序列(核苷酸1-1748)；cU6-3shMP-592(核苷酸1759-2234)；cU6-1shPA-2087(核苷酸2235-2622)；cU6-4shNP-1496(核苷酸2623-2974)；3′填充序列(核苷酸2985-4745)。
SEQ ID NO：17-MWH2和填充序列的核苷酸序列。5′填充序列(核苷酸1-1748)；cU6-4shPBl-2257(核苷酸1774-2125)；cU6-1shPB2-2240(核苷酸2126-2513)；c7SK shPBl-129(核苷酸2514-2911)；3′填充序列(核苷酸2936-4696)。
SEQ ID NO：18-MWH3和填充序列的核苷酸序列。5′填充序列(核苷酸1-1748)；cU6-4shNP-1484(核苷酸1774-2129)；cU6-1shPA-2087(核苷酸2130-2517)；c7SK shPBl-2257(核苷酸2518-2917)；3′填充序列(核苷酸2947-4702)。
SEQ ID NO：19-MWH1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20-MWH2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21-MWH3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22-鸡U6-1启动子(cU6-1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23-鸡U6-3启动子(cU6-3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24-鸡U6-4启动子(cU6-4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：25-鸡7SK启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26-51-寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：52-54-靶向甲型流感基因和/或其编码的mRNA的核酸分子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：55to 60-寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：61-MWH4的核苷酸序列。
SEQ ID NO：62-MWH3和Tol2转座子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：63-MWH4和Tol2转座子的核苷酸序列。
发明详述
一般技术及选择的定义
除非特别限定，则本文所用所有技术及科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同(例如，在细胞培养、分子遗传学、病毒学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。
除非另外指出，本发明使用的分子生物学、病毒学、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这种技术在文献资源中有描述和解释，如J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley andSons(1984)，J.Sambrook etal，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，EssentialMolecular Biology：A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNACloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)，andF.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直至目前的所有增订)，Ed Harlowand David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory，(1988)，and J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols inImmunology，JohnWiley & Sons(包括直至目前的所有增订)，并且引入本文做参考。
如本文所用，术语“治疗”包括给予足以降低或消除甲型流感病毒特别是禽流感病毒感染的至少一种症状的治疗有效量的本发明的核酸构建体、载体、细胞和/或核酸分子。
术语“预防”是指保护暴露于甲型流感病毒的对象免于产生甲型流感病毒感染的至少一种症状，或者降低暴露于甲型流感病毒的对象中的感染症状的严重性。
如本文所用，对病毒病原体有“抗性”的动物当暴露于该病毒病原体例如当暴露于流感病毒时显示出与易感动物相比降低的疾病症状或无疾病症状。
本文所用术语“禽类”是指分类学鸟纲生物的任何物种、亚种或品种(race)，例如但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀类、鹰、乌鸦和平胸类鸟包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡。该术语包括Gallus gallus(鸡)的各种已知品系，例如White Leghorn，BrownLeghorn，Barred-Rock，Sussex，New Hampshire，Rhode Island，Australorp，Cornish，Minorca，Amrox，California Gray，Italian Partidge-coloured，以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟的品系以及以商业数量育种的其它家禽。
术语“家禽”包括被保持、收获或驯养用于肉用或蛋用的所用禽类，例如鸡、火鸡、鸵鸟、春鸡(game hen)、雏鸟、珍珠鸡(guinea fowl)、野鸡、鹌鹑、鸭、鹅和鸸鹋。
如本文所用，“禽流感病毒”是指可感染鸟类的任何甲型流感病毒。禽流感病毒的例子包括但不限于亚型H1-H16和N1-N9的任一或多个，并包括高致病株和低致病株。在一个实施方案中，禽流感病毒是H5亚型。在另一个实施方案中，禽流感病毒是H7亚型。在另一个实施方案中，禽流感病毒是H5N1亚型。
术语“甲型流感病毒多肽”是指由甲型流感病毒基因编码的任何蛋白质，例如PB1，PB1-F2，PB2，聚合酶PA(PA)，血凝素(HA)，核壳蛋白(NP)，神经氨酸酶(NA)，基质蛋白1(M1)，基质蛋白2(M2)，非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)。
本文所用“病毒复制”是指病毒基因组在宿主细胞中的扩增。
本文所用术语“病毒颗粒”是涉及完整病毒结构，包含用蛋白质外壳或衣壳包围的核酸。一些病毒颗粒还包括包围蛋白质外壳的糖蛋白包膜，在这种情况中术语病毒颗粒也包括病毒包膜。“感染性病毒颗粒”能够进入生物体的细胞并复制。
“降低多肽或基因的表达”是指宿主细胞中多肽序列的翻译和/或核苷酸序列的转录被下调或抑制。下调或抑制程度根据提供给宿主细胞的核酸构建体或核酸分子的性质和数量、从该构建体表达的RNA分子的性质和水平以及给予后时间等而变化，但是表现为例如靶基因蛋白质表达和/或相关靶或细胞功能的可检测变化，或者例如病毒复制水平的降低等；希望的是可实现与未根据本发明处理的细胞相比大于10％，33％，50％，75％，90％，95％或99％的抑制程度。
如本文所用，术语“对象”是指动物如鸟类或哺乳动物。在一个实施方案中，对象可以是禽类，例如家禽如鸡、火鸡或鸭。
“样品”是指怀疑含有本发明的核酸构建体、核酸分子、载体和/或细胞的材料。样品可以直接得自来源而使用或者在至少一步(部分)纯化后使用。样品可以在不干扰本发明方法的任何方便介质中制备。典型地，样品是水溶液或生物学液体，如下详述。样品可以源自于任何来源，如生理学液体，包括血液、血清、血浆、唾液、痰、晶状体液、汗、粪便、尿、乳汁、腹水、粘膜滑液、腹膜液体、透皮渗出物、咽渗出物、支气管肺泡灌洗液、气管吸出物、脑脊液、精液、宫颈粘液、阴道或尿道分泌物、羊水等。在一个实施方案中，样品是血液或其部分。预处理可涉及例如从血液制备血浆，稀释粘液等。处理方法可以包括过滤、蒸馏、分离、浓缩、失活干扰成分和加入试剂。测试前生物学样品的选择和预处理是本领域公知的，无需进一步描述。
如本文所用，术语“转座子”是指遗传元件，其可以从一个位置移动(转座)到生物体基因组内的另一位置，移动过程不需要转座子与插入位点之间有广泛DNA序列同源性，也不需要经典同源交换所需的重组酶。
如本文所用，“等基因”是指生物体或细胞，其特征为基本上相同的基因组DNA，例如基因组DNA与等基因生物体或细胞的基因组DNA至少大约92％、优选至少大约98％、最优选至少大约99％相同。
如本文所用，术语“导入”当其涉及核酸构建体或核酸分子时是指最广义含义，包括导致核酸构建体或核酸分子存在于细胞或生物体中的任何方法。例如，核酸构建体或核酸分子可以作为裸DNA经任何合适转染或转化技术如电穿孔输送到细胞。或者，核酸构建体或核酸分子可以插入基因组和/或被细胞中的转基因表达。
RNA干扰
术语“RNA干扰”、“RNAi”或“基因沉默”通常是指一个过程，其中双链RNA分子降低与所述双链RNA分子功效实质上或全部同源性的核酸序列的表达。但是，最近发现RNA干扰可以用非RNA双链分子实现(参见例如US 20070004667)。
本发明包括包含和/或编码用于RNA干扰的双链区的核酸分子。所述核酸分子典型地是RNA但是看包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
双链区应该有至少19个连续核苷酸，例如大约19-23个核苷酸，或可以更长，例如30或50个核苷酸，或100个核苷酸或更多。相应于完整基因转录物的全长序列可以使用。优选地，它们长度为大约19至大约23个核苷酸。
核酸分子双链区与靶向转录物的相同性程度应该至少90％，更优选95-100％。核酸分子当然可以包含无关序列，其可以稳定分子。
术语“小干扰RNA”或“siRNA”如本文所用是指包含能抑制或下调基因表达的核糖核苷酸的核酸分子，例如通过一序列特异性方式介导RNAi，其中双链部分长度小于50个核苷酸，优选地长度大约19至大约23个核苷酸。例如，siRNA可以是包含自身互补有义和反义区的核酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，有义区具有相应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siRNA可以从两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链，另一链是反义链，其中反义和有义链是自身互补的。
如本文所用，术语siRNA与用于描述能介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语是等价的，例如微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰寡核苷酸、小干扰核酸(siNA)、小干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。另外，如本文所用，术语RNAi与用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语等价，如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学。例如，本发明的siRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平表观遗传地(epigenetically)沉默基因。在非限制性例子中，本发明siRNA分子对基因表达的外遗传调节可以得自染色质结构的siRNA介导的修饰以改变基因表达。
″shRNA″或“短发夹RNA”是指RNA分子，其中少于大约50个核苷酸、优选地大约19至大约23个核苷酸与位于同一RNA分子上的互补序列碱基配对，并且其中所述序列和互补序列由至少大约4至大约15个核苷酸的非配对区分开，其在由两个碱基互补区产生的茎结构之上形成单链环。单链环序列的例子包括：5′UUCAAGAGA 3′。
包括的shRNA是双指(dual or bi-finger)和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包括两个或多个由单链间隔区分开的这种茎环结构。
设计完成后，包含双链区的核酸分子可以通过本领域已知的任何方法产生，例如通过体外转录、重组或合成手段产生。
核苷酸修饰或类似物可以被导入以改良本发明核酸分子的性质。改良的性质包括增加的核酸酶抗性和/或增加的透过细胞膜的能力。因此，术语“核酸分子”和“双链RNA分子”包括合成修饰的碱基，例如但不限于，肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基-，2-丙基-及其它烷基-腺嘌呤，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，6-氮胞嘧啶和6-氮胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-thiuracil，8-卤代腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-硫代腺嘌呤(thiol adenine)，8-硫代烷基腺嘌呤(thiolalkyl adenines)，8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤，8-卤代鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，8-硫代鸟嘌呤，8-硫代烷基鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤，其它氮和脱氮腺嘌呤，其它氮和脱氮鸟嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。
核酸
“分离的核酸分子”是指通常已从其天然状态(如果其天然存在)中所结合或连接的核苷酸序列分离开的核酸分子。优选地，分离的核酸分子至少60％、更优选至少75％、更优选至少90％不含其天然结合的其它成分。另外，术语“核酸分子”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用。
术语“外源的”在核酸上下文中是指当核酸(包括本发明的核酸构建体)存在于细胞或无细胞表达系统中时以相比于其天然状态改变的量存在。在一个特别优选的实施方案中，细胞是不天然包含所述核酸或核酸构建体的细胞。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。其可以是基因组或合成来源的DNA或RNA，及与碳水化合物、脂质、蛋白质或其它进行本文定义的特定活性的其它材料组合。
核酸分子的相同性百分比是通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCGprogram)确定，缺口产生罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。查询序列长度至少19个核苷酸，GAP分析对比两个序列至少19个核苷酸区域。或者，查询序列长度至少150个核苷酸，GAP分析对比两个序列至少150个核苷酸区域。或者，查询序列长度至少300个核苷酸，GAP分析对比两个序列至少300个核苷酸区域。优选地，两个序列以其完整长度对比。
对于限定的核酸分子，应理解高于上文提供的％相同性数字包括优选的实施方案。因此当适用时，对于最小的％相同性数字，优选的是核酸分子包含与相关的SEQ ID NO至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％、更优选至少99.9％相同的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可选择性与编码甲型流感病毒多肽的多核苷酸在严格条件下杂交。如本文所用，在严格条件下是(1)采用低离子浓度和高温度洗涤的条件，例如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂如甲酰胺的条件，例如50％(vol/vol)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，含有750mMNaCl的50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，75mM柠檬酸钠，42℃；或者(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt′s溶液，超声化鲑精DNA(50g/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃于0.2x SSC和0.1％SDS中。
当与天然发生的分子相比时，本发明的核酸分子可以具有这样的区域(例如天然发生的启动子)，其具有一或多个是核苷酸残基的缺失、插入或取代的突变。突变体可以是天然发生的(即从天然来源分离)或者合成的(例如，通过在上述核酸上进行定点诱变)。因此很明显本发明的多核苷酸可以是天然发生的或者重组的。
通常，核酸单体通过磷酸二酯键或其类似物连接而形成寡核苷酸，大小范围从相对较短的单体单位，例如12-18，至几百个单体单位。磷酸二酯键类似物包括：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，phosphoroanilothioate，phosphoranilidate，氨基磷酸酯。
核酸构建体
如本文所用，“核酸构建体”是指编码本文定义的双链RNA分子的任何核酸分子，并包括在载体中的所述核酸分子，以染色体外核酸分子存在于细胞中的所述核酸分子，以及整合进染色体中的核酸分子。典型地，核酸构建体是双链DNA或双链RNA或其组合。另外，核酸构建体典型地包含与编码所述双链RNA的开放读框可操纵连接的合适的启动子。核酸构建体可包含编码双链RNA分子的第一单链的第一开放读框，互补(第二)链由不同的或优选相同的核酸构建体第二开放读框编码。核酸构建体可以是线性片段或环状分子，其可以或不能复制。本领域技术人员理解本发明的核酸构建体可以包括合适载体中。将核酸构建体转染或转化进受体细胞使得细胞表达由所述核酸构建体编码的RNA分子。
本发明的核酸构建体可表达多个拷贝的相同和/或一或多个(例如1、2、3、4、5或更多个)包括多个不同的含双链区的RNA分子，例如短发夹RNA。被认为彼此“相同”的RNA分子是仅包含相同双链序列的那些，被认为彼此“不同”的RNA分子包含不同的双链序列，而无论被每种不同双链序列靶向的序列是否在同一或不同基因中，或者两个不同基因的序列。
核酸构建体还可以含有额外的遗传元件。可包括在构建体中的元件类型没有显著并可由本领域技术人员选择。在一些实施方案中，核酸构建体作为转基因插入到宿主细胞中。在这种情况中，希望的是在构建体中包括“填充”片段，它们被设计用于保护编码RNA分子的序列免于转基因插入过程，并且降低外部转录连读的风险。填充片段也可以包括在构建体中以增加例如启动子与编码序列和/或终止子元件之间的距离。填充片段可以是从5-5000或更多个核苷酸的任意长度。启动子之间可以有一或多个填充片段。在多个填充片段情况中，它们可以是相同或不同长度。填充DNA片段优选地是不同序列。优选地，填充序列包含与其所插入的细胞或其后代中发现的序列相同的序列。在另一个实施方案中，核酸构建体包含位于编码双链RNA的开放读框侧翼的填充区域。
或者，核酸构建体可以包括可转座元件，例如转座子，特征在于位于编码双链RNA的开放读框侧翼的末端反向重复序列。合适的转座子的例子包括Tol2，mini-Tol，SleepingBeauty，Mariner和Galluhop。
可被包括在核酸构建体中的额外的遗传元件的例子包括报道基因，如编码以下物质的一或多个基因：荧光标记蛋白如GFP或RFP；容易测定的酶如β-半乳糖苷酶、萤光素酶、β-普糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌型胚胎碱性磷酸酶；或者可以容易利用免疫测定的蛋白质如激素或细胞因子。用于本发明实施方案中的其它遗传元件包括编码赋予细胞选择性生长优势的的那些，如腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycodicphosphotransferase)，二氢叶酸还原酶、潮霉素B-磷酸转移酶，或药物抗性。
当核酸构建体被转染进动物时，希望的是启动子和任意的遗传元件由动物基因组中天然发生的核苷酸序列组成。进一步希望的是编码RNA分子的序列有甲型流感病毒序列组成。
启动子
如本文所用，“启动子”是指能指导可操纵连接的核酸分子的转录的核酸序列，包括例如RNA聚合酶II和RNA聚合酶III启动子。这一定义还包括转录调节元件(例如增强子)，其足以赋予细胞类型特异性、组织特异性或时间特异性方式可控的启动子依赖性基因表达，或者可由外部试剂或信号诱导。
当包含启动子的核酸构建体被转染进宿主动物中时，希望的是该启动子是该动物基因组中天然存在的启动子。例如，当转基因动物是鸡时，启动子优选是鸡启动子；其中转基因动物是火鸡时，启动子优选是火鸡启动子；其中转基因动物是鸭时，启动子优选是鸭启动子。
本文所用“可操纵连接”是指两个或多个核酸(例如DNA)节段之间的功能关系。典型地，其是指转录调节元件与被转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节编码序列在合适细胞中的转录，则该启动子与编码序列如编码本文定义的双链RNA分子的开放读框可操纵连接。通常，与被转录序列可操纵连接的启动子转录调节元件是与被转录序列物理相邻的，即他们是顺式作用的。但是，一些转录调节元件如增强子无需与其增强转录的编码序列物理相邻或紧密接近。
“RNA聚合酶III启动子”或“RNA pol III启动子”或“聚合酶III启动子”或“polIII启动子”是指任何无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物启动子，例如鸡、人、鼠、猪、牛、灵长类、猿等的启动子，其在细胞中天然环境下与RNA聚合酶III结合或相互作用以转录其可操纵连接的基因，或者其任何变体，天然的或工程化的，它们在选择的宿主细胞中与RNA聚合酶III相互作用而转录可操纵连接的核酸序列。U6启动子(例如鸡U6、人U6、鼠U6)、H1启动子或7SK启动子是指任何无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物启动子或多态性变体或突变体，其在自然界发现与RNA聚合酶III相互作用而分别转录其关联RNA产物，即U6 RNA，H1 RNA或7SKRNA。合适的启动子的例子包括cU6-1(SEQ ID NO：22)，cU6-3(SEQ IDNO：23)，cU6-4(SEQID NO：24)和c7SK(SEQ ID NO：25)。
在一些应用中优选的是III型RNA pol III启动子包括U6、H1和7SK，它们存在于5’侧翼区，包括TATA盒，并缺少内部启动子序列。内部启动子针对pol III 5S rRNA，tRNA或VARNA基因而发生。7SK RNA pol III基因含有若内部启动子和在转录所需基因的5’侧翼区的序列。应用特定应用如表达双链RNA分子如发夹RNA抗禽类或人类病毒的核酸构建体中的polIII启动子可有利地被选择用于由宿主细胞RNA聚合酶III的最佳结合和转录，例如包括禽类pol III启动子在表达构建体中，以设计转录多个发夹dsRNA以在禽类宿主细胞中抗禽类病毒如禽流感病毒(H5N1)。
“不同的”聚合酶启动子是指任何两个RNA聚合酶启动子，如RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子，包括变体如多态性和突变体，其在特定物种中驱动不同关联转录物的转录，例如人7SK启动子，人U6启动子和人H1启动子，它们被认为是三种“不同的”聚合酶启动子。“不同的”聚合酶启动子还指一个启动子家族的各个成员，例如鸡U6启动子家族，其中cU6-1，cU6-2，cU6-3和cU6-4启动子被认为是“不同的”启动子。不同的聚合酶启动子在本发明构建体中的应用会降低分子内和/或分子间重组事件如重排或缺失的可能性。
在一些方面中，多拷贝的“相同”RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子可以包括在本发明核酸构建体中。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体可含有多拷贝的相同聚合酶启动子而没有“不同的”聚合酶启动子，例如3个、4个、5个或更多个U6启动子，每个均可操纵连接编码RNA分子如shRNA的序列。任选地，在一些实施方案中，除了两个或多个聚合酶启动子之外，还可包括其它启动子，例如一或多个聚合酶I启动子，一或多个线粒体启动子等。在一个方面，包含多个聚合酶启动子(2、3、4、5或更多个)的表达构建体被工程化以表达多个dsRNA发夹或shRNA，其中可以使用相同聚合酶启动子的2、3、4、5或更多个拷贝，而无论是否还包括“不同的”RNA聚合酶启动子。
在一些情况中，还希望的是核酸构建体包含组织特异性或细胞特异性启动子。术语“组织特异性”当用于启动子时是指能指导感兴趣核苷酸序列在特异类型组织(例如肺)中选择性表达的启动子，而相同的感兴趣核苷酸序列在不同组织类型(例如脑)中不表达。这种组织特异性启动子包括启动子如Ick，myogenin或thyl。术语“细胞特异性”当用于启动子时是指能指导感兴趣核苷酸序列在特异类型细胞中选择性表达的启动子，而相同感兴趣核苷酸序列在相同组织的不同类型细胞中不表达(参见例如Higashibata，etal.(2004)；Hoggatt，et al.(2002)；Sohal，et al，(2001)；and Zhang，et al.，(2004))。术语“细胞特异性”当用于启动子时还指能促进感兴趣核苷酸序列在单个组织的一个区域中选择性表达的启动子。或者，启动子可以是组成型或可调节的。另外，启动子可以被修饰以具有不同特异性。
核酶扩增
“聚合酶链反应”(“PCR”)是一种反应，其中用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”和聚合催化剂如DNA聚合酶、典型地热稳定聚合酶制备靶多核苷酸的复制拷贝。PCR方法是本领域已知的，并且在例如“PCR”中有教导(Ed.MJ.McPherson and S.GMoller(2000)BIOSScientific Publishers Ltd，Oxford)。PCR可以在得自逆转录分离自生物学样品的mRNA的cDNA上进行。
引物通常是寡核苷酸，通常大约20个核苷酸长，最低大约15个核苷酸，其能够以序列特异性方式与靶序列杂交并在PCR过程中被延伸。较长的核酸分子例如至少50或100或更多个核苷酸长的核酸分子也可以用作引物。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是延伸产物，其包含引物和新合成拷贝的靶序列。多重PCR系统含有多个引物组，导致同时产生一个以上扩增子。引物可以与靶序列完全匹配或者它们可以含有内部错配碱基，导致在特异靶序列中导入限制酶或催化核酸识别/裂解位点。引物还可以含有额外的序列和/或修饰的或标记的核苷酸以促进扩增子捕获或检测。DNA热变性、引物与它们的互补序列退火及退火引物用聚合酶延伸的重复循环导致靶序列指数扩增。术语靶或靶序列或模板是指被扩增的核酸序列。
另一种核酸扩增技术是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。首先，互补DNA(cDNA)用逆转录酶从RNA模板制备，然后在所得cDNA上进行PCR。
另一种扩增方法是连接酶链反应(“LCR”)，如EP 0320308披露。在LCR中，两个互补探针对被制备，在靶序列存在下，每个探针对结合靶的相反互补链，从而它们邻接。在连接酶存在下，两个探针对连接形成一个单位。通过温度循环，如在PCR中一样，结合的连接单位从靶解离，然后作为“靶序列”用于连接过量探针对。U.S.Pat.No.4,883,750描述了类似于LCR的方法，用于将探针对与靶序列结合。
扩增核酸分子的其它方法是本领域技术人员已知的，包括等温扩增方法和基于转录的扩增系统。用于扩增核酸构建体或其片段或者分离的或外源的核酸分子或其片段的任何合适方法可以用于本发明方法中。
载体及宿主细胞
在一些情况中，希望的是将本发明的核酸构建体和/或核酸分子插入载体中。载体可以是例如质粒、病毒或人工染色体，源自例如噬菌体、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、痘病毒或疱疹病毒。这种载体包括染色体的、附加型的和病毒衍生的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒的载体，源自上述组合的载体，如源自质粒和噬菌体遗传元件的那些，粘粒和噬菌粒。因此，一种举例的载体是双链DNA噬菌体载体。另一举例载体是双链DNA病毒载体。
被插入核酸构建体的载体还看包括可转座元件，例如特征在于位于编码双链RNA的开放读框侧翼的末端反向重复序列的转座子。合适的转座子的例子包括Tol2，Mini-Tol2，Sleeping Beauty，Mariner和Galluhop。本文所称的Tol2转座子包括源自Tol2的转座子，如Mini-Tol2。
本发明还提供了宿主细胞，其中已导入本发明的核酸构建体、核酸分子和/或载体。本发明的宿主细胞可以用作例如生产系统以生产或表达dsRNA分子。对于体外生产，可以使用真核细胞或原核细胞。
有用的真核宿主细胞可以是动物、植物或真菌细胞。作为动物细胞，可以使用哺乳动物细胞如CHO，COS，3T3，DF1，CEF，MDCK骨髓瘤，幼仓鼠肾(BHK)，HeLa或Vero细胞，两栖类细胞如非洲爪蟾卵母细胞，或昆虫细胞如Sf9，Sf21或Tn5细胞。缺少DHFR基因的CHO细胞(dhfr-CHO)或CHO K-1也可以使用。载体可以通过例如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖方法、阴离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim)方法、电穿孔、脂转染等导入宿主细胞中。
有用的原核细胞包括细菌细胞如大肠杆菌，例如JM109，DH5a和HB101，或枯草芽孢杆菌。
培养基如DMEM，MEM，RPM11640或IMDM可以用于动物细胞。培养基可以含有或不含血清补剂如胎牛血清(FCS)而使用。培养基的pH优选在大约6到8之间。细胞典型地在30-40℃培养大约15-200小时，培养基可以更换、通气或搅拌，如果需要。
转基因非人动物
“转基因非人动物”是指除了人之外的动物，其含有在同一物种或品种的野生型动物中未发现的核酸构建体(“转基因”)。本文所称“转基因”具有生物技术领域正常意义并包括已通过重组DNA或RNA及时产生或改变以及已导入动物优选禽类的细胞中的遗传序列。转基因可包括源自动物细胞的遗传序列。典型地，转基因已通过人工操作例如转化导入动物中，但是可以使用本领域技术人员已知的任何方法。转基因包括导入染色体中以及染色体外的遗传序列。
产生转基因动物的技术是本领域熟知的。这一主题的有用教科书是Houdebine，Transgenic animals-Generation and Use(Harwood Academic，1997)。
杂合DNA可以被导入例如受精卵中。例如，全能或多能肝细胞可以通过显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或其它方法转化，转化的细胞然后导入胚胎中，胚胎然后发育成转基因动物。在一种方法中，发育胚胎用含有希望的DNA的逆转录病毒感染，转基因动物从感染的胚胎产生。然而在另一种方法中，合适的DNA被共注射进优选在单细胞阶段的胚胎的原核或细胞质中，胚胎发育成成熟转基因动物。
有用产生转基因动物的另一种方法涉及将核酸经标准方法显微注射进原核阶段卵(pro-nuclear stage eggs)中。注射的卵然后培养，之后转移到假孕受体的输卵管中。
转基因动物还可以通过核转移技术产生。使用这个方法，来自供体动物的成纤维细胞用质粒稳定转染，所述质粒掺入了在调节序列控制下的感兴趣的结合结构域或结合配偶体的编码序列。稳定的转染子然后与去核卵母细胞融合，培养，转移进雌性受体。
精子介导的基因转移(SMGT)是可用于产生转基因动物的另一种方法。这个方法首先由Lavitrano et al.(1989)描述。
产生转基因动物的另一种方法是基于接头的精子介导的基因转移技术(LB-SMGT)。这一程序在美国专利7067308中描述。简而言之，新鲜收集的精子被洗涤并与鼠单克隆抗体mAbC(由ATCC登录号PTA-6723的杂交瘤分泌)保温，然后与构建体DNA保温。单克隆抗体帮助DNA结合精子。精子/DNA复合物然后人工受精到雌性中。
种系转基因鸡可以通过将复制缺陷逆转录病毒注射进新下的蛋中的鸡囊胚层的胚下腔中而产生(U.S.Pat.No.5,162,215；Bosselman et al.，1989；Thoraval et al.，1995)。携带外来基因的逆转录病毒核酸随机插入胚细胞的染色体中，产生转基因动物，其中一些在其种系中携带转基因。使用插入在融合基因构建体的5’或3’去的绝缘体元件以克服插入位点的位置效应已经描述(Chim et al.，1993)。
产生种系转基因动物的另一种方法是用转座子例如Tol2转座子以整合本发明的核酸构建体进入动物基因组中。Tol2转座子首先从鳉鱼Oryziaslatipe中分离，属于转座子hAT家族，描述于Koga et al.(1996)and Kawakamiet al.(2000)。Mini-Tol2是Tol2变体，描述于Balciunas et al.(2006)。Tol2和Mini-Tol2转座子当与Tol2转座酶共作用时促进转基因整合进生物体基因组中。通过在单独的不复制质粒上输送Tol2转座酶，仅Tol2或Mini-Tol2转座子和转基因被整合进基因组，含有Tol2转座酶的质粒在有限数目细胞分裂后丧失。因此，整合的Tol2或Mini-Tol2转座子不再具有经历后续转座事件的能力。另外，由于Tol2已知不是天然发生的禽类转座子，禽类细胞如鸡细胞中无导致进一步转座事件的内源转座酶活性。
任何其它合适的转座子系统可以用于本发明方法中。例如，转座子系统可以是Sleeping Beauty，Frog Prince或Mos1转座子系统，或者属于cl/mariner或hAT转座子家族的任何转座子均可以使用。
US 7,145,057描述了将禽类胚胎干细胞注射进受体胚胎以产生嵌合鸟类。育种所得嵌合体产生转基因鸟类，其基因组由外源DNA组成。
从禽类原生殖细胞(PGC)的长期培养物获得转基因鸡的方法如美国专利申请20060206952所述。当通过已知程序与宿主禽类胚胎组合时，那些ixush的PGC通过种系传递以产生转基因后代。
基于任何合适病毒的病毒输送系统可以用于输送本发明的核酸构建体至细胞。另外，可以使用杂合病毒系统。病毒输送系统的选择取决于各种参数，如输送进感兴趣的细胞、组织或器官的效率，系统的转导效率，致病性，免疫学和毒性考虑，等等。清楚的是不存在适合所有应用的单一病毒系统。当选择用于本发明的病毒输送系统时，重要的是选择这样的系统，其中含有核酸构建体的病毒颗粒优选地：1)能重复和稳定繁殖；2)能被纯化至高效价；和3)能够介导靶向输送(将核酸表达构建体输送至感兴趣的细胞、组织或器官，无需广泛传播)。
组合物和施用
在优选的实施方案中，本发明的组合物是包含合适载体的药物组合物。合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉粉末、滑石粉、alkonoic acids的纤维素酯、硬脂酸镁、氧化镁、结晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、明胶、甘油、藻酸钠、抗细菌剂、抗真菌剂、阿拉伯胶、阿拉伯树胶、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇、盐水和水。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体和/或核酸分子与一或多种阴离子脂质或阴离子两亲分子复合，如US 4,897,355；US 5,264,618；或US5,459,127中公开的组合物。在其它实施方案中，它们与包括阴离子脂质和任何地包括其它成分如中性脂质的脂质体/脂质体组合物复合(参见例如US5,279,833；US 5,283,185；and US 5,932,241)。在其它实施方案中，它们与US5,837,533；6,127,170；和6,379,965的多功能分子复合物复合，或者希望地与WO 03/093449的多功能分子复合物或油/水阴离子两亲分子乳液复合。后一申请教导了一种组合物，其包括核酸、包括胆固醇或脂肪酸的溶内体(endosomolytic)精胺，以及包括细胞表面分子配体的靶向精胺。组合物的正负电荷之比在0.1-2.0，优选地0.5-1.5，包括端值；所述溶内体精胺组成了组合物中至少20％的含精胺分子；靶向精胺组成了组合物中至少10％的含精胺分子。希望地，正负电荷之比在0.8-1.2，包括端值，如0.8-0.9，包括端值。
核酸构建体、核酸分子和/或组合物的给予可以方便地通过注射进禽类卵中实现，通常注射进气囊中。尽管气囊是卵给予的优选途径，但是其它区域如卵黄囊或绒毛膜尿囊液也可以经注射接种。当气囊不是给予靶时孵化率可能略有下降，但是不是必须在商业上不能接受水平。注射机理不是本发明实施关键的，尽管优选的是针不导致卵或发育胚胎的组织和器官或者围绕胚胎的胚胎外膜的过度损害。
通常，配有大约22号针的皮下注射器适于禽的卵给予。本发明方法特别适于自动化注射系统，如US 4,903,635，US 5,056,464，US 5,136,979和US20060075973所述的那些。
在另一个实施方案中，本发明的核酸构建体、核酸分子和/或组合物经肺输送给予，如通过吸入气溶胶或喷雾干燥的配制品。例如，气溶胶可以通过吸入装置或喷雾器给予(参见例如US 4,501,729)，提供了核酸分子快速局部摄入相关肺组织。含有微粉化核酸组合物的可呼吸干燥颗粒的固体颗粒组合物可以如下制备：研磨干燥或冻干的核酸组合物，然后将微粉化组合物通过例如400目筛以粉碎或分离出大聚集体。包含本发明的核酸组合物的固体颗粒组合物可以任选地含有促进气溶胶的配制的分散剂以及其它治疗化合物。合适的分散剂是乳糖，其可以与核酸化合物以任何合适比例混合，如1∶1重量比。
喷雾器是可商购装置，其通过将压缩气体典型地为空气或氧加速通过文氏管孔或通过超声搅拌而将活性成分的溶液或悬浮液转化为治疗性气溶胶雾。用于喷雾器中的合适配制品包含在液体载体中的活性成分，其量为至多40％w/w配制品，优选小于20％w/w配制品。载体典型是水或稀水性醇溶液，优选通过加入例如氯化钠或其它合适盐制成与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂，如果配制品不是无菌制备，例如，羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂，调味剂，挥发油，缓冲剂和乳化剂及其它配制表面活性剂。含有活性组合物和表面活性剂的固体颗粒的气溶胶可以类似地用任何固体颗粒气溶胶产生器生产。用于将固体颗粒治疗剂给予对象的气溶胶产生器产生可呼吸的颗粒，如上所述，并产生含有以合适人类给药的速率预定计量剂量的治疗组合物的气溶胶体积。
本发明的核酸构建体、核酸分子和/或组合物也可以加入到动物饲料或饮用水中。可以方便地配制饲料和饮用水组合物，从而动物与其饮食一起摄取治疗合适数量。还可以方便地将组合物作为预混合料加入饲料或饮用水中。
实施例
实施例1.选择包括在转基因中的shRNA序列
选择甲型流感的最高度保守的基因PB1、PB2、PA、NP和M1用于RNAi靶向。发明人使用siVirus(基于网络的抗病毒siRNA设计软件，用于高度趋异的病毒序列，Naito et al.，2006)鉴别选择的基因内的高保守区，并且预测能够筛选用于选择shRNA的siRNA序列。该软件高亮指出了分析的甲型流感病毒基因组节段内的一些区域，它们对于shRNA设计是特别感兴趣的，即PB1，PB2，PA和NP的3’区域。更具体地，这些是节段1(PB2基因)核苷酸2240-2341；节段2(PB1基因)核苷酸2257-2341；节段3(PA基因)核苷酸2087-2233；节段5(NP基因)核苷酸1484-1565。
发明人选择了29个从siVirus预测的siRNA序列以筛选选择shRNA(表1)。有若干算法可用于选择针对特异靶基因的潜在siRNA。但是已经显示许多这些预测的siRNA当从表达的shRNA加工时不能有效起作用。Taxmanet al.(2006)具体设计了一种算法以预测有效的shRNA分子，本发明人对该算法进行了修改以改善shDNTA预测。本发明人对29个siVirus选择的siRNA应用了修饰的Taxman算法以选择序列用于作为shRNA测试对甲型流感病毒复制的特异性抑制。
表1靶向甲型流感病毒基因的shRNA序列的算法选择
shRNA 5’末端得分 ΔG中心 3’末端得分 3’中的A+T 得分
PB1-6 1 -13.8 1 2 4
PB1-129 1 -12.7 -1 1 1
PB1-2257 1 -13.9 1 2 4
PB2-2210 1 -14.7 1 2 4
PB2-2240 1 -14.1 1 2 4
PB2-8 1 -11.8 1 1 3
PB2-10 -1 -12.2 1 1 1
PA-44 -1 -13.1 -1 2 0
PA-739 1 -10.9 -1 0 0
PA-2087 1 -13.6 1 0 2
PA-2110 -1 -17.2 1 2 2
PA-2131 -1 -12.6 -1 0 -2
NP-224 -1 -15.3 1 2 2
NP-231 -1 -12.8 -1 0 -2
NP-344 1 -13.4 1 2 4
NP-390 -1 -13.5 1 0 0
NP-771 1 -11.4 1 1 3
NP-778 -1 -13.3 1 1 1
NP-1472 1 -11.4 1 2 4
NP-1484 -1 -8.7 1 1 1
NP-1496 1 -8.7 -1 0 0
MP-37 1 -13.3 1 0 2
MP-331 1 -13.3 1 2 4
MP-480 1 -14 -1 0 0
MP-554 1 -12.0 1 2 4
MP-592 1 -13.4 1 1 3
MP-598 -1 -14.5 1 0 0
MP-934 1 -11 -1 0 0
MP-5 1 -10.8 1 2 4
使用Taxman算法对于shRNA选择有4个标准。3个标准被评分最多4分。这些标准是：1)序列5’末端的C或G＝1分，5’末端A或T＝-1分；2)序列3’末端的A或T＝1分，3’末端C或G＝-1分；3)7个3’碱基中有5个或更多个A或T＝2分，7个3’碱基中有4个A或T＝1分。优选具有最高评分的shRNA序列。第四个标准是基于计算对于19个核苷酸序列的shRNA序列的6个中心碱基(与反义链的碱基9-14杂交的有义链的碱基6-11)的自由能。优选具有中心双螺旋ΔG＞-12.9kcal/mol的shRNA。本发明人对Taxman算法的修改是使用不同的自由能参数预测RNA双螺旋稳定性，如Freier et al.(1986)所公开的。基于该算法，发明人选择了13个siVirus siRNA序列用于潜在有效的shRNA中以测试它们抑制甲型流感病毒复制的能力。选择的序列在表1中黑体示出，它们的5’-3’序列示于表2。这13个序列用于构建ddRNAi质粒以表达10个shRNA。
表2.选择用于病毒抑制测定的shRNA的序列
shRNA 5’-3’序列
PB1-129 CAGGAUACACCAUGGAUAC(SEQ ID NO：6)
PB1-2257 GAUCUGUUCCACCAUUGAA(SEQ ID NO：7)
PB2-2240 CGGGACUCUAGCAUACUUA(SEQ ID NO：8)
PB2-8 CAGCGACCAAAAGAATTCGGA(SEQ ID NO：52)
PB2-10 AAGAATTCGGATGGCCATCAA(SEQ ID NO：53)
PA-2087 GCAAUUGAGGAGUGCCUGA(SEQ ID NO：9)
NP-771 CCAGGAAAUGCUGAGAUCGAA(SEQ ID NO：10)
NP-1472 GAGUAAUGAAGGAUCUUAUUU(SEQ ID NO：11)
NP-1484 AUCUUAUUUCUUCGGAGACAA(SEQ ID NO：12)
NP-1496 GGAUCUUAUUUCUUCGGAG(SEQ ID NO：13)
MP-554 CACUAAUCAGACAUGAGAA(SEQ ID NO：14)
MP-592 CUACAGCUAAGGCUAUGGA(SEQ ID NO：15)
MP-5 GTGGATTCTTGATCGTCTT(SEQ ID NO：54)
实施例2.鸡启动子序列
已知当设计转基因构建体时，希望的是包括这样的启动子，其包括上游序列以使得聚合酶有效附着到启动子序列。尽管如此，鸡U6启动子被设计及测试以含有引起shRNA转录所需的最低量的启动子序列，因此使得降低转基因构建体的整体大小。
测试了两个版本的构建体，pcU6-4shNP-1496和pcU6-4(+100)shNP-1496，经RNAse保护测定测试shRNA表达，或测试病毒沉默。第一个质粒含有表达shNP-1496短发夹RNA所需的最小的鸡U6-4序列。第二个质粒含有100bp额外的cU6-4启动子上游序列。预期含有100bp额外上游序列的第二个构建体将提供更好的shRNA表达。
表3提供了测量由来自两个质粒的shRNA表达诱导的对病毒产生的抑制的血凝测定(HA测定)实验结果。为进行这个测定，MDCK细胞生长至对数期，然后使用AmaxaNucleofector用所述shRNA质粒电穿孔。转染的细胞然后8小时后用低致病H1N1 A/PR/8/34(PR8)甲型流感病毒以一系列感染复数(moi)感染。病毒效价(HA单位)在感染后48小时用HA测定测量。测定在V底96孔板中进行。系列2倍稀释的病毒样品与等体积的鸡红细胞的0.5％悬液(vol/vol)混合，在冰上保温1小时。含有粘附的均质层的红细胞的孔被记录为阳性。
在HA测定实验中，含有最小启动子序列的pcU6-4shNP-1496在所有测试的MOI在沉默病毒方面均比含有额外上游启动子序列的pcU6-4(+100)shNP-1496及模拟质粒更有效。
表3.血凝测定(HA测定)结果
MOI.001 MOI.0001 MOI.00001
模拟质粒 32 32 16
pcU6-4(+100)shNP-1496 32 16 4
pcU6-4shNP-1496 4 2 2
实施例3.用于表达选择的shRNA的ddRNAi质粒的构建
鸡聚合酶III启动子cU6-1(GenBank登录号DQ531567)，cU6-3(DQ531569)，cU6-4(DQ531570)和c7SK(EF488955)用作模板以经一步PCR构建用于选择的shRNA的ddRNAi表达质粒(图1)。构建质粒的PCR使用引物TD135与TD218或TD275配对，用于cU6-1启动子；TD 175与TD216、TD274或TD302配对用于cU6-4启动子；TD176与TD217配对用于cU6-3启动子；TD269与TD307或TD316配对用于c7SK启动子(引物序列及扩增的特异shRNA的细节参见表4)。每个PCR中的反向引物被设计包含每个启动子序列的最后20个核苷酸、shRNA有义、环和shRNA反应序列，并被HPLC纯化。全长扩增的表达盒产物连接进pGEM-T Easy，然后测序。
在选择的13个shRNA中，对于7个序列成功构建了表达质粒。用于病毒抑制测定中的最终shRNA表达质粒被命名为pcU6-1-shPB2-2240，pcU6-1-shPA-2087，pcU6-3-shMP-592，pcU6-4-shNP-1496，pcU6-4-shNP-1484，pc7SK-shPB1-129，pcU6-4-shPB1-2257和pc7SK-shPB1-2257。还构建了cU6-1无关对照质粒，用于在病毒抑制测定中进行模拟比较(见下述)。对于这一模拟质粒，正向引物TD135与包含chU6-1启动子的最后20个核苷酸和所有其它无关shRNA(shirr)成分的反向引物TD155配对。PCR产物连接进pGEM-T Easy并测序。
每个ddRNAi质粒被构建以便每个shRNA序列在天然U6或7SKsnRNA转录物的+1位。Xhol限制酶位点被工程化在终止信号下游以使得筛选插入pGEM-T Easy中的全长shRNA产物。所有最终shRNA表达载体由全长鸡U6或7SK启动子之一、shRNA有义序列、环序列、shRNA反义序列、终止序列和XhoI位点组成。所有shRNA中使用的环序列是5′UUCAAGAGA 3′。
实施例4.测试选择shRNA的病毒抑制
表5总结了血凝测定(HA测定)实验测量由shRNA表达质粒诱导的病毒产生的抑制的结果。为进行这些测定，MDCK细胞生长至对数期，然后用Amaxa NucleofectorTM用shRNA质粒电穿孔。转染细胞8小时后用甲型流感病毒低致病性H1N1A/PR/8/34(PR8)或高致病性H5N1A/chicken/Vietnam/008/2004(H5N1)以一系列感染复数(moi)感染。病毒效价(HA单位)在感染后48小时通过HA测定测量。测定在V底96孔板中进行。系列2倍稀释的病毒样品与等体积的鸡红细胞的0.5％悬液(vol/vol)混合，在冰上保温1小时。含有粘附的均质层的红细胞的孔被记录为阳性。
表4.序列及所用引物细节
在表5总结的所有HA测定实验中，表达shPB1-2257，shNP-1484和shNP-1496的质粒与模拟质粒相比能非常有效地抑制PR8和H5N1病毒的产生。在shPB1-2257和shNP-1484情况中，它们在许多实验中均能完全抑制两种病毒的复制，证实它们的有效性。表达shPA-2087和shMP-592的质粒也能有效抑制病毒的产生，但是不像shPB1-2257、shNP-1484和shNP-1496那样有效。shPB1-129分子抑制低致病性PR8毒株的产生但不抑制高致病性H5N1毒株。最后，尽管被鉴别为潜在的靶shRNA序列，但是shPB2-2240不能抑制每种测试病毒的复制。
表5shRNA对MDCK细胞中流感病毒产生的作用。括号中数字是感染复数(moi)值
实施例5.多弹头(MWH)转基因的构建
已经确定从一个转基因表达多个shRNA以进一步降低病毒靶序列变异对RNAi策略的风险有显著益处。这些“多弹头”(MWH)转基因由多个转录单位组成，每个具有不同的鸡pol III启动子(cU6-1，cU6-3，cU6-4和c7SK)表达各个shRNA分子靶向上述不同甲型流感病毒基因的保守序列。启动子序列对于鸡是天然的，小的21bp shRNA已经存在于AI感染的或接种的鸟类中。RNAi靶是绝对特异于甲型流感病毒的，因此这种特异的转基因不会由脱靶效应(off target effects)。
从选择的shRNA如下构建了4种MWH转基因：
a.MWH1-cU6-3shMP-592；cU6-1shPA-2087；cU6-4shNP-1496
每个MWH转基因含有3个转录单位，它们从鸡pol III启动子独立地表达单个shRNA分子。3个转录单位用一步PCR扩增，所得片段然后连接在一起以产生MWH转基因(图2)。MWH然后从单个转基因表达3个shRNA。MWH 1的3个转录单位是：cU6-4shNP-1496；cU6-3shMP-592和cU6-1shPA-2087。cU6-4shNP-1496转录单位用正向引物TD233和反向引物TD216扩增，cU6-3shMP-592转录单位用正向引物TD234和反向引物TD217扩增，cU6-1shPA-2087转录单位用正向引物TD232和反向引物TD218扩增(引物如表4所述)。每个PCR产物克隆进pGEM-TEasy，各自含有5′SalI限制位点和3′XhoI限制位点。这些限制位点具有相容的突出端，使得各个转录单位依次连接在一起，以产生最终的MWH转基因(图2)。
b.MWH 2-cU6-4shPB1-2257；cU6-1shPB2-2240；c7SKshPB1-129
MWH 2的3个转录单位是：cU6-4shPB 1-2257；cU6-1shPB2-2240和c7SK shPB1-129。cU6-4shPB1-2257转录单位用正向引物TD233和反向引物TD274扩增，cU6-1shPB2-2240转录单位用正向引物TD232和反向引物TD275扩增，c7SK shPB1-129转录单位用正向引物TD306和反向引物TD307扩增(引物如表4所述)。每个PCR产物克隆进pGEM-T Easy，如上所述和如图2所述各个转录单位依次连接在一起，以构建最终的MWH转基因。
c.MWH3-cU6-4shNP-1484；cU6-1shPA-2087；c7SKshPB1-2257
MWH 3的3个转录单位是：cU6-4shNP-1484；cU6-1shPA-2087和c7SKshPB1-2257。cU6-4shNP-1484转录单位用正向引物TD233和反向引物TD302扩增，cU6-1shPA-2087转录单位用正向引物TD232和反向引物TD218扩增，c7SK shPB1-2257转录单位用正向引物TD306和反向引物TD316扩增(引物如表4所述)。每个PCR产物克隆进pGEM-T Easy，如上所述和如图2所述依次连接在一起，以构建最终的MWH转基因。
d.MWH4-cU6-4shPB1-2257；cU6-3shNP-1484；cU6-1shPA-2087
MWH 3的3个转录单位是：cU6-4shPB1-2257；cU6-3shNP-1484和cU6-1shPA-2087。cU6-4shPB1-2257转录单位用正向引物TD233和反向引物TD274扩增，cU6-3shNP-1484转录单位用正向引物TD234和反向引物TD343扩增，cU6-1shPA-2087转录单位用正向引物TD232和反向引物TD218扩增(引物如表4所述)。每个PCR产物同样克隆进pGEM-T Easy，如上所述和如图2所述依次连接在一起，以构建最终的MWH转基因。
在HA测定中使用H5N1甲型流感病毒还测试了4个最终MWH转基因的抑制病毒产生的能力(表4，实验8)。MWH 3和MWH 4是最有效的转基因。MWH 1也有效抑制H5N1病毒产生，而MWH 2不如MWH 1有效。
实施例6.MWH转基因克隆进pStuffit载体
将每个MWH克隆进pSuffit质粒(图3)。这一质粒促进MWH转基因插入鸡基因组DNA的填充/缓冲片段之间以潜在保护MWH序列免于转基因插入过程和外部转录连读。从鸡基因组的大内含子序列(即基因组desert)选择ME1和GRM5填充片段，其不含可能干扰MWH转基因表达的转录元件。GenBank中描述的具体区域为：ME11500(chr3)gb|AADN02002420.130995-32489bp；ME1200(chr3)gb|AADN02002420.15079-5276bp；和GRM51500(chr1)gb|AADN02004814.113141-13113，13078-12911，12848-11638bp；GRM5200(chr1)gb|AADN02004814.110126-9927bp。
质粒pStuffit构建
通过将鸡基因组的4个区域以应用限制酶位点限定的特异顺序克隆进pIC20H克隆载体而构建质粒pStuffit(图3)。表6所列片段首先用表7所列引物进行PCR扩增，然后逐个克隆进pGEM-T Easy(Invitrogen)并测序。这些片段然后从pGEM-T Easy切下并用表5所列限制酶位点依次克隆。首先，GRM5 200克隆进pC20H，随后是ME1 200，GRM5 1500和ME11500。在每个克隆阶段，所得质粒用限制酶消化和DNA测序检查。最终组装的质粒命名为pStuffit。
表6.pStuffit构建。克隆片段名称和其扩增中使用的引物
片段名称 引物 酶位点
GRM5 200 TD277/TD278 EcoRI/EcoRV
ME1 200 TD281/TD282 BamHI/EcoRI
GRM5 1500 TD279/TD280 EcoRV/XhoI
ME1 1500 TD283/TD284 SphI/BamHI
表7pStuffit构建。PCR引物名称和序列。限制酶位点下划线示出
MWH转基因插入pStuffit
pStuffit载体具有位于GRM5 200和ME1 200序列之间的唯一EcoRI限制位点以允许插入每个MWH转基因。每个MWH转基因通过连接进这个EcoRI限制位点而插入pStuffit。还包括PacI和SwaI以允许切下具有不同量侧翼序列的构建体(图3)。pIC20H载体的HindIII限制酶位点可以用于切下完整的克隆序列。因此，含有每种MWH插入序列的最终的pStuffit质粒用HindIII限制酶消化以释放最终插入序列，以纯化并用于精子介导的基因转移(SMGT)方法。
实施例7.基于接头的精子介导的基因转移
将构建体输送进受精的鸡卵的方法可以通过基于接头的精子介导的基因转移实现。这一方法如US 7,067,308所述进行。简而言之，洗涤新鲜采集的鸡精子，并与鼠单克隆抗体mAbC(由ATCC登录号PTA-6723的杂交瘤分泌)保温，然后与构建体DNA保温。加入的单克隆抗体有助于DNA与精子的结合。精子/DNA复合物然后人工受精母鸡。这一方法重复4次，受精间隔72小时。首次受精后2天开始每天收集鸡蛋，直至最后一次受精后3天。
实施例8.MWH转基因插入Tol2并输送至鸡中
MWH 3(SEQ ID NO：21)和MWH 4(SEQ ID NO：61)转基因被克隆进Tol2转座子载体pminiTol2/MCS((SEQ ID NO：64)；Balciunas et al.，2006)。两个转基因通过用SalI和XhoI双酶切从pGEM-T Easy载体取出。这一片段然后连接进位于Tol2转座子载体的多克隆位点内的唯一的XhoI位点中。
输送MWH 3Tol2构建体(SEQ ID NO：62)和MWH 4Tol2构建体(SEQID NO：63)进入鸡胚的方法可以用原生殖细胞(PGC)实现。简而言之，PGC从供体鸡胚收集，当胚胎是2日龄时从血中收集或者从5.5日龄胚胎的性腺中收集。用Magnetic Antibody Cell Separation(MACS)从血液或性腺组织中纯化PGC。用Amaxa Nucleofector将纯化的PGC然后用Tol2构建体和编码Tol2转座酶的单独质粒(pCMV-Tol2；SEQ ID NO：65；Balciunas et al.，2006)电穿孔。这些细胞然后注射回到2.5日龄的受体胚胎中。转换的PGC迁移以建立发育胚胎的性腺。
输送Tol2构建体进入鸡胚的方法也可以通过直接电穿孔新下的蛋的囊胚层而实现。简而言之，打开新下的受精卵以暴露囊胚层。用显微毛细管将Tol2构建体DNA与编码Tol2转座酶的质粒一起注射进囊胚层。然后用BTX ECM830 Electro Square Porator卵内电穿孔所述囊胚层。PGC位于囊胚层中心，如果这些细胞在电穿孔后用构建体转化，它们会变成在发育的胚胎的性腺中的生殖细胞。
实施例9.筛选转基因的G0后代
从1周龄G0后代的翼静脉或羽尖取少量血。用QIAmp DNA Blood Minikit(Qiagen)从翼静脉血制备基因组DNA。来自羽尖血的DNA用QuickExtract(TM)DNA ExtractionSolution(Epicentre Biotechnologies)制备。在这些样品上进行两项测试以证实构建体的存在。
Southern印迹
用表8列出的正向和反向引物在基因组样品上进行PCR。PCR混合物然后在琼脂糖凝胶上电泳，转移至膜上兵与放射性标记的锁核酸探针(表8)杂交。在杂交并用高严格溶液洗涤后，膜在X光胶片上曝光。由在所得放射自显影上检测到正确大小的条带指示阳性。
表8.用于Southern印迹PCR分析的寡核苷酸。下划线为锁核酸碱基。
功能 命名 序列
正向引物 TD320 TTG CCC CCA AAC AGC AA(SEQ ID NO：55)
反向引物 TD321 GAC CAT CCA CGT GCT GCT TA(SEQ ID NO：56)
探针 TD319 CAT TCG ACG TAG CTG CA(SEQ ID NO：57)
实时定量PCR
用表9列出的引物在基因组样品上进行实时PCR。该测定用SYBRGreen试剂与双链DNA结合，随后用熔融曲线分析确定阳性样品。
表9.实时PCR分析中使用的引物
功能 命名 序列
正向引物 BC F 03 GCA GCA CGT GGA TGG TCT C(SEQ ID NO：58)
反向引物(启动子cU6-4) TD251 TCT TCC GCC GTC CCA CAA TT(SEQ ID NO：59)
反向引物(启动子cU6-3) TD252 GCT TAG AAA GCC TGA CGT CT(SEQ ID NO：60)
实施例10.测试转基因鸟类
LB-SMGT
在G0群中鉴别为转基因的鸟将被保留并圈养直至性成熟。一旦性成熟，将该鸟用于交配实验以产生G1转基因后代，其在每个细胞中均具有构建体的拷贝。再次使用Southern印迹和实时PCR以显示G1后代的转基因性质。
在这些鸟上进行关于插入位点和构建体拷贝数的更详细的分析，使用基因组Southern印迹和PCR。
饲养鉴别为具有相关构建体插入的G1鸟直至性成熟。来自这些鸟的一些G2后代用于动物试验中以验证它们对各种禽流感毒株抗性。其它G2鸟被分析构建体在各种组织和各个年龄的表达。
Tol2转座子
接受Tol2转化的PGC或已经用Tol2构建体电穿孔的G0胚胎被孵化。仅G0雄性鸡被保持并饲养直至性成熟。从所述雄性鸡收集精子并进行PCR以证实任何任何一个鸡含有相关构建体。PCR阳性的鸡用于交配实验以产生G1转基因后代，其在每个细胞中均具有构建体拷贝。使用Southern印迹和实时PCR以显示G1后代的转基因性质
实施例11.模型系统-甲型流感抗性转基因小鼠
本发明人构建了两个shRNA转基因盒以用于产生转基因小鼠。每个盒含有小鼠U6启动子用于表达shNP-1496或shEGFP。两个转基因然后用于实验慢病毒技术产生转基因小鼠。简而言之，shNP-1496和shEGFP shRNA转基因盒被克隆进慢病毒基因转移载体(AusGene，Bentleigh，Australia)。转基因病毒构建体然后包装成慢病毒颗粒。确定慢病毒效价并将慢病毒颗粒注射进早期小鼠胚胎的卵周隙。胚胎重植入假孕雌性小鼠中，通过southern印迹分析筛选所得后代。获得了转基因建立者小鼠，其具有每个转基因的稳定整合。建立者然后与野生型小鼠交配以产生F1后代。转基因F1小鼠然后在攻击实验中测试对甲型流感感染的抗性。
攻击实验包括3组，每组含有5只小鼠。组1和组2各含有5只具有shEGFP shRNA的小鼠。组2和组3接受5x102TCID50的低致病性H1N1A/PR/8/34(PR8)甲型流感病毒的鼻内攻击。组1用不含病毒的磷酸盐缓冲盐水攻击。攻击后每天监测体重10天，在实验结束时小鼠安乐死，取肺样品进行病毒RNA的qPCR测量。
如图4所示，具有shNP-1496转基因的转基因小鼠与具有无关shEGFP转基因的小鼠相比具有优异的抗感染水平。shNP-1496小鼠在实验期间与PBS对照组相比不丧失体重。相比之下，shEGFP小鼠显示统计学显著的体重降低，表明流感病毒的活性感染。当测量来自组2和组3小鼠的肺样品的病毒RNA时，具有shNP-1496转基因的小鼠与含有无关shEGFP转基因的小鼠相比具有大于90％的病毒RNA降低。整体上这些结果表明含有特异地靶向甲型流感病毒的shRNA分子如shNP-1496的转基因小鼠对于用H1N1A/PR/8/34(PR8)甲型流感病毒的实验攻击是高度抗性的。
本领域技术人员明白可以对特异实施方案示出的本发明进行各种改变和/或修改而不偏离本发明的精神或范围。本发明实施方案因此被认为是示意性和非限制性的。
本文讨论和/或参考的所有出版物以其全文引入本文。
本申请要求US 60/938,315和AU 2007902616的优先权，其全部内容引入本文作参考。
包括在本说明书中的任何文件、活动、材料、装置、文章等的任何讨论仅仅是提供本发明的背景。不应理解为承认本发明的这些内容的任何或全部构成现有技术的一部分或是在本发明优先权日之前存在的本发明所属技术领域中的常识。
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<212>RNA
<213>Artificial
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<400>1
agcraaagca ggucaaauau auucaauaug gagagaauaa aagaauuamg agaucuaaug 60
ucacaguccc gcacucgcga gauacuaaca aaaaccacug uggaccauau ggccauaauc 120
aagaaauaca caucaggaag acaagagaag aacccugcuc ucagaaugaa auggaugaug 180
gcaaugaaau auccaaucac agcggacaag agaauaauag agaugauucc ugaaaggaau 240
gaacaagggc agacgcucug gagcaagaca aaugaugcug gaucggacag ggugauggug 300
ucuccccuag cuguaacuug guggaauagg aaugggccgr cgacaagugc aguccauuau 360
ccaaagguuu acaaaacaua cuuugagaag guugaaaggu uaaaacaugg aaccuucggu 420
cccguucauu uccgaaacca aguuaaaaua cgccgccgag uugauauaaa uccuggccau 480
gcagaucuca gugcuaaaga agcacaagau gucaucaugg aggucguuuu cccaaaugaa 540
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gagcuccaag auuguaagau ugcucccuua augguugcau acauguugga aagggaacug 660
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uacuuuguug aaacacuagc gaggaguauc ugugagaaac uugagcaauc uggacuccca 840
gucggaggga augagaagaa ggcuaaauug gcaaacgucg ugaggaagau gaugacuaac 900
ucacaagaua cugaacucuc cuuuacaauu acuggagaca auaccaaaug gaaugagaau 960
cagaauccua ggauguuucu ggcaaugaua acruacauca caaggaacca gccagaaugg 1020
uuucggaaug ucuuaagcau ugcyccuaua auguucucaa acaaaauggc gagayuagga 1080
aaaggauaca uguucgaaag uaagagcaug aaguuacgaa cacaaauacc agcagaaaug 1140
cuugcaaaca uugaucuuaa auacuucaau gaauuaacga aaaagaaaau ugagaaaaua 1200
agrccucuau uaauagaugg uacagccuca uugagcccug gaaugaugau gggcauguuc 1260
aacaugcuga guacaguccu aggaguyuca auccugaauc uuggacagaa aagguacacc 1320
aaaaccacau auugguggga cggacuccaa uccucugaug auuucgcucu caucguaaau 1380
gcaccgaauc augagggaau acaagcagga guggauaggu uuuauaggac uuguaaacua 1440
guuggaauca auaugagcaa gaagaagucu uacauaaauc ggacagggac auuugaauuc 1500
acgagcuuuu ucuaccgcua uggauuugua gccaauuuca guauggagcu gcccaguuuu 1560
ggagugucug gaauuaauga aucggccgac augagcauug guguuacagu gauaaaraac 1620
aauaugauaa acaacgaccu ugggccagca acagcucaga uggcucuuca gyuauucauc 1680
aaggacuaca gauacacaua ccgaugccac agaggggaua cgcaaaucca aacraggaga 1740
ucauucgagc ugaagaagcu gugggagcaa acccguucaa aggcaggacu guugguuuca 1800
gauggaggac caaaucuaua caauauccga aaucuccaua uuccugargu cugcuuraaa 1860
ugggaauuga uggaugaaga uuaccagggc agacugugua auccucugaa uccruucguc 1920
agccauaagg aaauugaauc ugucaacaau gcuguaguaa ugccagcuca uggcccggcc 1980
aagaguaugg aauaugaugc cguugcaacu acacauucau ggauuccuaa aaggaaycgu 2040
uccauucuca auacgaguca aaggggaauu cuugaggaug aacagaugua ccagaagugc 2100
ugcaaucuau ucgagaaauu cuuccccagc aguucauauc ggaggccagu uggaauuucc 2160
agcauggugg aggccauggu gucuagggcc cgaauugacg cacgaauuga uuucgagucu 2220
ggaaggauua agaaagaaga guuugcugag aucaugaaga ucuguuccac cauugaagar 2280
cucagacggc aaaaauagug aauuuagcuu guccuucgug aaaaaaugcc uuguuucuac 2340
u 2341
<210>3
<211>2181
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>Consensus sequence of the Influenza A PA gene
<400>3
auggaagacu uugugcgaca augcuucaau ccaaugauug ucgarcuugc ggaaaaggca 60
augaaagaau auggggaaga uccgaaaauc gaaacgaaca aguuugcugc aauaugcaca 120
cacuuggagg ucuguuucau guauucggau uuucacuuua uugaugaacg gagugaauca 180
auaauuguag aaucuggaga uccgaaugca uuauugaaac accgauuuga aauaauugaa 240
ggaagagacc gaacgauggc cuggacugug gugaauagua ucugcaacac cacaggaguu 300
gagaaaccua aauuucuccc agauuuguau gacuacaaag agaaccgauu caucgaaauu 360
ggagugacac ggagggaagu ucauacauac uaucuggaga aagccaacaa gauaaaaucc 420
gagaagacac auauucacau auucucauuc acaggggagg aaauggccac caaagcggac 480
uacacccuug augaagagag cagggcaaga auuaaaacca ggcuguucac cauaaggcag 540
gaaauggcca guaggggucu augggauucc uuucgucaau ccgagagagg cgaagagaca 600
auugaagara aauuugaaau cacuggaacc augcgcagac uugcagacca aagucuccca 660
ccgaacuucu ccagccuuga aaacuuuaga gccuaugugg auggauucga accgaacggc 720
ugcauugagg gcaagcuuuc ucaaauguca aaagaaguga augcuagaau ugagccauuu 780
uugaagacaa cgccacgccc ucucagacua ccugaugggc cuccuugcuc ucagcggucg 840
aaguucuugc ugauggaugc ccuuaaauua agcaucgaag acccgaguca ugagggggag 900
gggauaccac uauacgaugc aaucaaaugc augaagacau uuuucggcug gaaagagccc 960
aacaucguga aaccacauga aaaagguaua aaccccaauu accuccuggc uuggaagcaa 1020
gugcuggcag aacuccaaga uauugaaaau gaggagaaaa ucccaaaaac aaagaacaug 1080
aaaaaaacaa gccaguugaa gugggcacum ggugagaaca uggcaccaga gaaaguagac 1140
uuugaggacu gcaaagaugu uagcgaucua agacaguaug acagugauga accagagucu 1200
agaucacuag caagcuggau ucagagugaa uucaacaagg caugugaauu gacagauucg 1260
aguuggauug aacuugayga aauaggagaa gacguagcuc caauugagca cauugcaagu 1320
augagaagga acuauuuuac agcggaagua ucccauugca gggccacuga auacauaaug 1380
aagggagugu acauaaacac agcccuguug aaugcauccu gugcagccau ggaugacuuu 1440
caacugauuc caaugauaag caaaugcaga accaaagaag gaagacggaa aacuaaucug 1500
uauggauuca uuauaaaagg gagaucccac uugaggaaug auaccgaugu gguaaauuuu 1560
gugaguaugg aauucucucu uacugauccg agrcuggagc cacacaagug ggaaaaguac 1620
uguguccucg agauaggaga caugcuccuc cggacugcag uaggccaagu uucamggccc 1680
auguuccugu auguaagaac caauggaacc uccaagauca aaaugaaaug gggcauggaa 1740
augaggcgau gccuucuuca aucccuucaa caaauugaaa gcaugauuga agccgagucu 1800
ucugucaaag agaaggacau gaccaaagaa uucuuugaaa ayaaaucaga aacauggccg 1860
auuggagagu cccccaaggg aguggaggaa ggcuccaucg gaaaggugug cagaaccuug 1920
cuggcgaagu cuguguucaa caguuuauau gcaucuccac aacucgaggg guuuucagcu 1980
gaaucaagaa aauugcuucu cauugcucag gcacuuaggg acaaccugga accugggacc 2040
uucgaucuug gagggcuaua ugaagcaauu gaggagugcc ugauuaacga ucccuggguu 2100
uugcuuaaug cgucuugguu caacuccuuc cucgcacaug cacugaaaua guuguggcaa 2160
ugcuacuauu ugcuauccau a 2181
<210>4
<211>1565
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>Consensus sequence of the Influenza A NP
<400>4
agcaaaagca ggguagauaa ucacucaccg agugacauca acaucauggc gucucaaggc 60
accaaacgau cuuaugaaca gauggaaacu gguggagaac gccagaaugc uacugagauc 120
agggcaucug uuggaagaau gguuaguggc auugggaggu ucuacauaca gaugugcaca 180
gaacucaaac ucagugacua ugaagggagg cugauccaga acagcauaac aauagagaga 240
augguacucu cugcauuuga ugaaagaagg aacagauacc uggaagaaca ccccagugcg 300
gggaaggacc cgaagaarac uggaggucca auuuaucgga ggagagacgg gaaaugggug 360
agagagcura uucuguacga caaagaggag aucaggagga uuuggcguca agcgaacaau 420
ggagaggacg caacugcugg ucuyacccac cugaugauau ggcauuccaa ucuaaaugau 480
gccacauauc agagaacgag agcucucgug cguacuggaa uggaccccag gaugugcucu 540
cugaugcaag grucaacucu cccgaggaga ucuggagcug ccggugcagc aguraagggg 600
guagggacaa uggugaugga gcugauucgg augauaaaac gagggaucaa cgaccggaau 660
uucuggagag gcgaaaaugg aagaagaaca aggauugcau augagagaau gugcaacauc 720
cucaaaggga aauuccaaac agcagcacaa agagcaauga uggaucaagu gcgagagagc 780
agaaauccug ggaaugcuga aauugaagau cucauuuuuc uggcacgguc ugcacucauc 840
cugagaggau caguggccca uaaguccugc uugccugcuu guguguacgg acuugcagug 900
gccaguggau augacuuuga gagagaaggg uacucucugg uuggaauaga uccuuuccgy 960
cugcuucaaa acagccaggu cuuuagucuc auuagaccaa augagaaucc agcacauaag 1020
agucaauuag uguggauggc augccacucu gcagcauuug aggaccuuag agucucaagu 1080
uucaucagag ggacaagagu ggucccaaga ggacarcuau ccaccagagg gguucaaauu 1140
gcuucaaaug agaacaugga rgcaauggac uccaacacuc uugaacugag aagyagauau 1200
ugggcuauaa gaaccagaag cggaggaaac accaaccagc agagggcauc ugcaggacag 1260
aucagcguuc agcccacuuu cucgguacag agaaaccuuc ccuucgaaag agcgaccauu 1320
auggcagcau uuacaggraa uacugagggc agaacgucug acaugaggac ugaaaucaua 1380
agaaugaugg aaagugccag accagaagau gugucauucc aggggcgggg agucuucgag 1440
cucucggacg aaaaggcaac gaacccgauc gugccuuccu uugacaugar uaaugaagga 1500
ucuuauuucu ucggagacaa ugcagaggag uaugacaauu aaagaaaaau acccuuguuu 1560
cuacu 1565
<210>5
<211>1122
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>Consensus sequence of the Influenza A M1 gene
<400>5
ugcaggaauu cgauagcaga aagcagguag auguugaaag augagucuuc uaaccgaggu 60
cgaaacguac guucucucua ucaucccguc aggcccccuc aaagccgaga ucgcgcagaa 120
acuugaagau gucuuugcag gaaagaacac cgaucucgag gcucucaugg aguggcuaaa 180
gacaagacca auccugucac cucugacuaa agggauuuug ggauuuguau ucacgcucac 240
cgugcccagu gagcgaggac ugcagcguag acgcuuuguc cagaaugccc uaaauggaaa 300
uggagaucca aauaauaugg auagggcagu uaagcuauau aagaagcuga aaagagaaau 360
aacauuccau ggggcuaagg aggucgcacu cagcuacuca acyggugcac uugccaguug 420
caugggucuc auauacaaca ggaugggaac ggugacuacg gaaguggcuu uuggccuagu 480
gugugccacu ugugagcaga uugcagauuc acagcaucgg ucucacagac agauggcaac 540
uaucaccaac ccacuaauca grcaugagaa cagaauggug cuggccagca cuacagcuaa 600
ggcuauggag cagauggcgg gaucaaguga gcaggcagcg gaagccaugg agrucgcuaa 660
ucaggcuagg cagauggugc aggcaaugag gacaauuggg acucauccua acucuagugc 720
uggucugaga gauaaucuuc uugaaaauuu gcaggccuac cagaaacgaa ugggagugca 780
gaugcagcga uucaagugau ccumuuguug uugccgcaar uaucauuggg aucuugcacu 840
ugauauugug gauucuugau cgucuuuucu ucaaaugcau uuaucgucgc cuuaaauacg 900
guuugaaaag agggccukcu acggcaggrg uaccugaguc uaugagggaa gaguaccggc 960
aggaacagca gagugcugug gauguugacg auggucauuu ugucaacaua gaauuggagu 1020
aaaaaacuac cuuguuucua curmkrccgs wwkacuugua cagcucgucc augccgagag 1080
ugaucccggc ggcggucacg aacuccagca ggacccgaug uu 1122
<210>6
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>6
caggauacac cauggauac 19
<210>7
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>7
gaucuguucc accauugaa 19
<210>8
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>8
cgggacucua gcauacuua 19
<210>9
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>9
gcaauugagg agugccuga 19
<210>10
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>10
ccaggaaaug cugagaucga a 21
<210>11
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>11
gaguaaugaa ggaucuuauu u 21
<210>12
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>12
aucuuauuuc uucggagaca a 21
<210>13
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>13
ggaucuuauu ucuucggag 19
<210>14
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>14
cacuaaucag acaugagaa 19
<210>15
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>strand of dsRNA
<400>15
cuacagcuaa ggcuaugga 19
<210>16
<211>4749
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Nucleic acid construct
<400>16
agcttgcatg catttaaatg acagcagcag gtgaaagaca gacataacac caggcacagc 60
actcctgtgt acctcaaaag gcactagttg cctacatgcc acttcaaggg aagtgcttgt 120
cccactctgc tctgcactgg tgcagcctca cctcgagcac tgtgtgcagt tctgggagcc 180
acagtatatg aaggacataa aactagtata gagcacccaa aggaaggcta tgaagatggg 240
gaaggtgagt gaggaatggc tgaggtccct tggtctgcac agcccagagc agaggaggtc 300
tgaggagacg actcatggca gcctatggct cctcaagagg ggagtagagg ggaagtgctg 360
agatgtgctc cctgatgaca gcaacaggac ttgaacagac agtgggggtt aggaaaaggt 420
tcttcaccag agggcggtgg gcatggaaca ggctccctag ggcagtggac atgaccctga 480
gttactgtag ttcaaggaac agagggttgg acatcatgat ttcttgatgc cccttccagc 540
ccctgaaatc ctgtgtgtga ttctgtgaga gtgtttgggc aatactctca ggcaaagggt 600
ttgaattttg ggtggtgctg tgtggagtca ggagttggac tcagtgatcc ttgttggttc 660
cttccaactc acaatattct gtgattctat gatacatgag ccagtacatc aagatccaaa 720
agtccttttg attcccaatc ctcatgtccc actaaaatca tcctactatg aatccttcat 780
attattacag aaatgctcaa gctcaaacta accaaaaaat tgcaagaact ggatctgtat 840
gctttgaatc agagctaggt gacttaaaag tagattccaa ataatcttaa agacatggtg 900
tcatttgcaa actgcatcag aaaaggagaa agaacccccc agcctccacc tcccaaatcc 960
acagaccttt acagctttcc tgcagtgcct gaatctgaga taccactcag ggaacagtta 1020
tgttagtgta agatctgtag agatacctat ccaattactt tcaatgtgag tacactaata 1080
ttgctgtctg gcatattgct acatgtttca gcatcaacta caatttctaa tcttttcctc 1140
tactgttcct gtcccttgta atacaacagt aatacagggt tggcataaaa gccctttggt 1200
gagagctggt gacaatgtgc tctgcaggtc cctatgtccc agtaggacac ctgagtctac 1260
tgaggagctg cctgtggaag tctcccagga catgctgagc accacagaac agttgcactg 1320
ctgaaccccc agagctgata agctcagcgc cctgcaagac atcagatctg ctcgaggtcc 1380
tcagcacatg ctgccattga gctgcacaac ctggggcact tccaagaagg aggtgactgc 1440
tgtgtgaaac caaggactgc agacagaaac ctgggggaaa aagggcaccg agggcttcct 1500
gagcacccac ttgaggatcc ttaattaact ggaaactagg acgtggaagt catatacaat 1560
tcaagatgca agttaatttt atctgcagag aaattgtgtt tcaagaagga agaatacaca 1620
gggtaatgtc ataacctctt cacctaacca catggtaggt aaccatgagc taccactgag 1680
ctcacatcct tgcccccaaa cagcaaacat tcgacgtagc tgcagtaagc agcacgtgga 1740
tggtctcgga attcgattgt cgaccagaca gacgtcaggc tttctaagcc tggactgagt 1800
aagagcggaa gagctccaca gcactctgag tgcgcacaga ccgcgcgtac agcgcacagc 1860
cgcgcggccg ctccttcagg cactgccgac gacagcccag gcggaggtcc tgagcgccgg 1920
cgctaaattt gcataaagaa ctacccagga gccctcgcgc gcggaaacgg gcaaaaaggg 1980
gcttctaata tggaaatatt acgccgaatc gcgttacaaa tcggctaagc gggcctaaga 2040
gttaacaaga tgtgctatta agcggagcct tttggtggga agaaatggag tagtcactgt 2100
gttctaaaag aacttgcaga atgagccttt aaataccgca gtctcgatgc tcttagtcca 2160
ctacagctaa ggctatggag caaatttcaa gagaatttgc tccatagcct tagctgtagt 2220
gttttttgga actcgaccga agaaccgagc gctgctggcc ttaaagtccc accaaaactc 2280
tgaagaaacg aagccagacc cggcactcag cgggcagccc gcgcctcccg ccgccccaca 2340
gtgccgcgcg cgtgcatttg catagcgcgg tgctcgcagg gggaaactca ccccctcaag 2400
tccgcccccc gcttcccgcc cgctgtcccg cacctcatca gtgctgtgcg ctgtctgtgt 2460
cccccagcac gcactctttg ctgttcttac ccggaggctt gccctatcct tgaggtttct 2520
attttttagg ctataaatac cgcctaggag gtagagatat tcgcaattga ggagtgcctg 2580
attcaagaga tcaggcactc ctcaattgct tttttggaac tcgacgaatt gtgggacggc 2640
ggaagacggg ctcccgcccc gcccctatat gcaaagcaga gaacttcccg ccgtgcaccg 2700
cgcgcaatcg gaagagaatt tgggcacttc agacccaaaa aaaaacccaa aacttctgcg 2760
aaaaagaaag aatctcagcg gagtaaatag ggatttttgt taaagaggtg ataccagaag 2820
aagaaatatg caaatacaac gccagctcac cgctacttaa aaatcatgat ataatagagg 2880
cttaaatact gtccgagaga cactggggtt tggatcttat ttcttcggag ttcaagagac 2940
tccgaagaaa taagatcctt ttttggaact cgagaatcac tagtgaattc cataccactg 3000
cgagggtgcc aagtcatggg actgatactc tttaacgtct ttatcaatga cctagaaagt 3060
gttattgaat gaacctgtag tgagttgctg atgactgaac tgagtgctac agttaatatg 3120
agagaaggga gagaaatatg agagaaatgt tgagggaact agacttgttc agaagaaaag 3180
gttccaggca gatcttactg caaccttcca gttaattaag atatcttgtc ccttccagga 3240
acaggaagat tattaaaaaa aaaaaagtca ccataaaaaa aaaaaaaata ctatgctgaa 3300
gtaaggaaat tcagtaaaca agaaaaagag atattaataa tatggattac tttaagtttt 3360
gaattatttt cctttcaata gagtaactgt tagaaacatt ctgaatagtg cctctatact 3420
cagtgcccta tgttcacgtt cactaattca aaacagaaaa aaaaaaaaag attcctgtca 3480
tggttttttt ttgtctgttt gtttgtttgt ttgtttttcc tacttaagat cttgccctcc 3540
catttacact ggaatttaat tcagtacctc cggtaattct ggtattctac attcaatatc 3600
tttagcaaat ctttctgctg tagccagatt actccaacat aagatttctg gtttctggga 3660
aggatgccca tccctgagat atgcaaggtc aggctggatg gggtgctggg cacctgatgg 3720
agctgtagat gtccctgttc attgcagggg atttgaactg aatggccttt aagggtcctt 3780
ttcaactcaa acagttgaat gattctgtgg tttccaagga tagggagggt cctaacattc 3840
aaagctagac tgggaaagaa gaaaaagaca aaaattcttg gttatttcat tgctttggta 3900
gttccatcag cagataaaat tataggtctc ttcttggtct agtgtaagaa atgcctggga 3960
atcattttat cacaaaaatc tttctgtttg catgttttct tctgtactta ccaatcacac 4020
taaatgagtt ggattaaaat tttgggaggt tgagcagaaa atgttcttaa gtattaatat 4080
caattcttca catttaaaat gtgcaaatat tttgaggggt gttagtaggc tttgctcctc 4140
tgaaatttac ctttatggtt taatcaggtg atgcctccag ttgtgcaagt agccactaac 4200
aataatgttt tttcctacta atgggaaggt ggcaaacatt atattcagtg gattactaat 4260
aattttaagg aggaagtctt ttcaatctaa ttaacaagaa atgtgagtaa caaatgacgg 4320
atatttgtca taaaacaaca gtcatcttct cttacatgtg taaatataac attgtatttt 4380
acataagcca gtcagaaatc ttcacaagtc ttggatagtt ccagattgta actcctgatg 4440
cttagctcta tcaggatgat atgactcaga aacgttagtt ctatcaacct agtttccaac 4500
tcttccttgc ttttaatgat ttgtggagct ctactctgaa ccagcctggc tttgaagtaa 4560
atctccttca ctcatcatca gcacactttt tttgaaaagc cacgtcactt atagaatcct 4620
acttatgttg tggctcgatg aacatgtgtt aacactgtgg atcaggggag cgggagtgag 4680
cagtacagga gggaaaatat gattggaaac tccttgtgct gcaatctatt taaatctcga 4740
gctcgcgaa 4749
<210>17
<211>4700
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Nucleic acid construct
<400>17
agcttgcatg catttaaatg acagcagcag gtgaaagaca gacataacac caggcacagc 60
actcctgtgt acctcaaaag gcactagttg cctacatgcc acttcaaggg aagtgcttgt 120
cccactctgc tctgcactgg tgcagcctca cctcgagcac tgtgtgcagt tctgggagcc 180
acagtatatg aaggacataa aactagtata gagcacccaa aggaaggcta tgaagatggg 240
gaaggtgagt gaggaatggc tgaggtccct tggtctgcac agcccagagc agaggaggtc 300
tgaggagacg actcatggca gcctatggct cctcaagagg ggagtagagg ggaagtgctg 360
agatgtgctc cctgatgaca gcaacaggac ttgaacagac agtgggggtt aggaaaaggt 420
tcttcaccag agggcggtgg gcatggaaca ggctccctag ggcagtggac atgaccctga 480
gttactgtag ttcaaggaac agagggttgg acatcatgat ttcttgatgc cccttccagc 540
ccctgaaatc ctgtgtgtga ttctgtgaga gtgtttgggc aatactctca ggcaaagggt 600
ttgaattttg ggtggtgctg tgtggagtca ggagttggac tcagtgatcc ttgttggttc 660
cttccaactc acaatattct gtgattctat gatacatgag ccagtacatc aagatccaaa 720
agtccttttg attcccaatc ctcatgtccc actaaaatca tcctactatg aatccttcat 780
attattacag aaatgctcaa gctcaaacta accaaaaaat tgcaagaact ggatctgtat 840
gctttgaatc agagctaggt gacttaaaag tagattccaa ataatcttaa agacatggtg 900
tcatttgcaa actgcatcag aaaaggagaa agaacccccc agcctccacc tcccaaatcc 960
acagaccttt acagctttcc tgcagtgcct gaatctgaga taccactcag ggaacagtta 1020
tgttagtgta agatctgtag agatacctat ccaattactt tcaatgtgag tacactaata 1080
ttgctgtctg gcatattgct acatgtttca gcatcaacta caatttctaa tcttttcctc 1140
tactgttcct gtcccttgta atacaacagt aatacagggt tggcataaaa gccctttggt 1200
gagagctggt gacaatgtgc tctgcaggtc cctatgtccc agtaggacac ctgagtctac 1260
tgaggagctg cctgtggaag tctcccagga catgctgagc accacagaac agttgcactg 1320
ctgaaccccc agagctgata agctcagcgc cctgcaagac atcagatctg ctcgaggtcc 1380
tcagcacatg ctgccattga gctgcacaac ctggggcact tccaagaagg aggtgactgc 1440
tgtgtgaaac caaggactgc agacagaaac ctgggggaaa aagggcaccg agggcttcct 1500
gagcacccac ttgaggatcc ttaattaact ggaaactagg acgtggaagt catatacaat 1560
tcaagatgca agttaatttt atctgcagag aaattgtgtt tcaagaagga agaatacaca 1620
gggtaatgtc ataacctctt cacctaacca catggtaggt aaccatgagc taccactgag 1680
ctcacatcct tgcccccaaa cagcaaacat tcgacgtagc tgcagtaagc agcacgtgga 1740
tggtctcgga attgcggccg cgggaattcg attgtcgacg aattgtggga cggcggaaga 1800
cgggctcccg ccccgcccct atatgcaaag cagagaactt cccgccgtgc accgcgcgca 1860
atcggaagag aatttgggca cttcagaccc aaaaaaaaac ccaaaacttc tgcgaaaaag 1920
aaagaatctc agcggagtaa atagggattt ttgttaaaga ggtgatacca gaagaagaaa 1980
tatgcaaata caacgccagc tcaccgctac ttaaaaatca tgatataata gaggcttaaa 2040
tactgtccga gagacactgg ggtttgatct gttccaccat tgaattcaag agattcaatg 2100
gtggaacaga tcttttttgg aactcgaccg aagaaccgag cgctgctggc cttaaagtcc 2160
caccaaaact ctgaagaaac gaagccagac ccggcactca gcgggcagcc cgcgcctccc 2220
gccgccccac agtgccgcgc gcgtgcattt gcatagcgcg gtgctcgcag ggggaaactc 2280
accccctcaa gtccgccccc cgcttcccgc ccgctgtccc gcacctcatc agtgctgtgc 2340
gctgtctgtg tcccccagca cgcactcttt gctgttctta cccggaggct tgccctatcc 2400
ttgaggtttc tattttttag gctataaata ccgcctagga ggtagagata ttccgggact 2460
ctagcatact tattcaagag ataagtatgc tagagtcccg ttttttggaa ctcgacgagg 2520
ctcagtgtca cgcagagcgc gggacgagcg ctccgagccc tcccagtgcc gcccccaagg 2580
cagggcggcc ggcgcagctc cccgcagccc gccagtggga aggctctgct ttgcataacg 2640
cgcaaggcct gctgggagga aagcggagcg agaaagagcg ttaacgtgcg ccgagtgttt 2700
tagagcaaaa gcattcagac ctgaagcagc gctgagagat gcctctgccg cccatttact 2760
ggaacgttca gacccaccgc aagtcaccgt gaccttgagg acactgagct gttggccgtt 2820
atatagcact tggggcagct cgtagctttc aggatacacc atggatactt caagagagta 2880
tccatggtgt atcctgtttt tggaactcga gaatcactag tgaattcgcg gccgcgaatt 2940
ccataccact gcgagggtgc caagtcatgg gactgatact ctttaacgtc tttatcaatg 3000
acctagaaag tgttattgaa tgaacctgta gtgagttgct gatgactgaa ctgagtgcta 3060
cagttaatat gagagaaggg agagaaatat gagagaaatg ttgagggaac tagacttgtt 3120
cagaagaaaa ggttccaggc agatcttact gcaaccttcc agttaattaa gatatcttgt 3180
cccttccagg aacaggaaga ttattaaaaa aaaaaaagtc accataaaaa aaaaaaaaat 3240
actatgctga agtaaggaaa ttcagtaaac aagaaaaaga gatattaata atatggatta 3300
ctttaagttt tgaattattt tcctttcaat agagtaactg ttagaaacat tctgaatagt 3360
gcctctatac tcagtgccct atgttcacgt tcactaattc aaaacagaaa aaaaaaaaaa 3420
gattcctgtc atggtttttt tttgtctgtt tgtttgtttg tttgtttttc ctacttaaga 3480
tcttgccctc ccatttacac tggaatttaa ttcagtacct ccggtaattc tggtattcta 3540
cattcaatat ctttagcaaa tctttctgct gtagccagat tactccaaca taagatttct 3600
ggtttctggg aaggatgccc atccctgaga tatgcaaggt caggctggat ggggtgctgg 3660
gcacctgatg gagctgtaga tgtccctgtt cattgcaggg gatttgaact gaatggcctt 3720
taagggtcct tttcaactca aacagttgaa tgattctgtg gtttccaagg atagggaggg 3780
tcctaacatt caaagctaga ctgggaaaga agaaaaagac aaaaattctt ggttatttca 3840
ttgctttggt agttccatca gcagataaaa ttataggtct cttcttggtc tagtgtaaga 3900
aatgcctggg aatcatttta tcacaaaaat ctttctgttt gcatgttttc ttctgtactt 3960
accaatcaca ctaaatgagt tggattaaaa ttttgggagg ttgagcagaa aatgttctta 4020
agtattaata tcaattcttc acatttaaaa tgtgcaaata ttttgagggg tgttagtagg 4080
ctttgctcct ctgaaattta cctttatggt ttaatcaggt gatgcctcca gttgtgcaag 4140
tagccactaa caataatgtt ttttcctact aatgggaagg tggcaaacat tatattcagt 4200
ggattactaa taattttaag gaggaagtct tttcaatcta attaacaaga aatgtgagta 4260
acaaatgacg gatatttgtc ataaaacaac agtcatcttc tcttacatgt gtaaatataa 4320
cattgtattt tacataagcc agtcagaaat cttcacaagt cttggatagt tccagattgt 4380
aactcctgat gcttagctct atcaggatga tatgactcag aaacgttagt tctatcaacc 4440
tagtttccaa ctcttccttg cttttaatga tttgtggagc tctactctga accagcctgg 4500
ctttgaagta aatctccttc actcatcatc agcacacttt ttttgaaaag ccacgtcact 4560
tatagaatcc tacttatgtt gtggctcgat gaacatgtgt taacactgtg gatcagggga 4620
gcgggagtga gcagtacagg agggaaaata tgattggaaa ctccttgtgc tgcaatctat 4680
ttaaatctcg agctcgcgaa 4700
<210>18
<211>4706
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Nucleic acid construct
<400>18
agcttgcatg catttaaatg acagcagcag gtgaaagaca gacataacac caggcacagc 60
actcctgtgt acctcaaaag gcactagttg cctacatgcc acttcaaggg aagtgcttgt 120
cccactctgc tctgcactgg tgcagcctca cctcgagcac tgtgtgcagt tctgggagcc 180
acagtatatg aaggacataa aactagtata gagcacccaa aggaaggcta tgaagatggg 240
gaaggtgagt gaggaatggc tgaggtccct tggtctgcac agcccagagc agaggaggtc 300
tgaggagacg actcatggca gcctatggct cctcaagagg ggagtagagg ggaagtgctg 360
agatgtgctc cctgatgaca gcaacaggac ttgaacagac agtgggggtt aggaaaaggt 420
tcttcaccag agggcggtgg gcatggaaca ggctccctag ggcagtggac atgaccctga 480
gttactgtag ttcaaggaac agagggttgg acatcatgat ttcttgatgc cccttccagc 540
ccctgaaatc ctgtgtgtga ttctgtgaga gtgtttgggc aatactctca ggcaaagggt 600
ttgaattttg ggtggtgctg tgtggagtca ggagttggac tcagtgatcc ttgttggttc 660
cttccaactc acaatattct gtgattctat gatacatgag ccagtacatc aagatccaaa 720
agtccttttg attcccaatc ctcatgtccc actaaaatca tcctactatg aatccttcat 780
attattacag aaatgctcaa gctcaaacta accaaaaaat tgcaagaact ggatctgtat 840
gctttgaatc agagctaggt gacttaaaag tagattccaa ataatcttaa agacatggtg 900
tcatttgcaa actgcatcag aaaaggagaa agaacccccc agcctccacc tcccaaatcc 960
acagaccttt acagctttcc tgcagtgcct gaatctgaga taccactcag ggaacagtta 1020
tgttagtgta agatctgtag agatacctat ccaattactt tcaatgtgag tacactaata 1080
ttgctgtctg gcatattgct acatgtttca gcatcaacta caatttctaa tcttttcctc 1140
tactgttcct gtcccttgta atacaacagt aatacagggt tggcataaaa gccctttggt 1200
gagagctggt gacaatgtgc tctgcaggtc cctatgtccc agtaggacac ctgagtctac 1260
tgaggagctg cctgtggaag tctcccagga catgctgagc accacagaac agttgcactg 1320
ctgaaccccc agagctgata agctcagcgc cctgcaagac atcagatctg ctcgaggtcc 1380
tcagcacatg ctgccattga gctgcacaac ctggggcact tccaagaagg aggtgactgc 1440
tgtgtgaaac caaggactgc agacagaaac ctgggggaaa aagggcaccg agggcttcct 1500
gagcacccac ttgaggatcc ttaattaact ggaaactagg acgtggaagt catatacaat 1560
tcaagatgca agttaatttt atctgcagag aaattgtgtt tcaagaagga agaatacaca 1620
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ctcacatcct tgcccccaaa cagcaaacat tcgacgtagc tgcagtaagc agcacgtgga 1740
tggtctcgga attgcggccg cgggaattcg attgtcgacg aattgtggga cggcggaaga 1800
cgggctcccg ccccgcccct atatgcaagg cagagaactt cccgccgtgc accgcgcgca 1860
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tactgtccga gagacactgg ggtttatctt atttcttcgg agacaattca agagattgtc 2100
tccgaagaaa taagattttt ttggaactcg accgaagaac cgagcgctgc tggccttaaa 2160
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ttactggaac gttcagaccc accgcaagtc accgtgacct tgaggacact gagctgttgg 2820
ccgttatata gcacttgggg cagctcgtag ctttgatctg ttccaccatt gaattcaaga 2880
gattcaatgg tggaacagat cttttttgga actcgagaat cactagtgaa ttcgcggccg 2940
cgaattccat accactgcga gggtgccaag tcatgggact gatactcttt aacgtcttta 3000
tcaatgacct agaaagtgtt attgaatgaa cctgtagtga gttgctgatg actgaactga 3060
gtgctacagt taatatgaga gaagggagag aaatatgaga gaaatgttga gggaactaga 3120
cttgttcaga agaaaaggtt ccaggcagat cttactgcaa ccttccagtt aattaagata 3180
tcttgtccct tccaggaaca ggaagattat taaaaaaaaa aaagtcacca taaaaaaaaa 3240
aaaaatacta tgctgaagta aggaaattca gtaaacaaga aaaagagata ttaataatat 3300
ggattacttt aagttttgaa ttattttcct ttcaatagag taactgttag aaacattctg 3360
aatagtgcct ctatactcag tgccctatgt tcacgttcac taattcaaaa cagaaaaaaa 3420
aaaaaagatt cctgtcatgg tttttttttg tctgtttgtt tgtttgtttg tttttcctac 3480
ttaagatctt gccctcccat ttacactgga atttaattca gtacctccgg taattctggt 3540
attctacatt caatatcttt agcaaatctt tctgctgtag ccagattact ccaacataag 3600
atttctggtt tctgggaagg atgcccatcc ctgagatatg caaggtcagg ctggatgggg 3660
tgctgggcac ctgatggagc tgtagatgtc cctgttcatt gcaggggatt tgaactgaat 3720
ggcctttaag ggtccttttc aactcaaaca gttgaatgat tctgtggttt ccaaggatag 3780
ggagggtcct aacattcaaa gctagactgg gaaagaagaa aaagacaaaa attcttggtt 3840
atttcattgc tttggtagtt ccatcagcag ataaaattat aggtctcttc ttggtctagt 3900
gtaagaaatg cctgggaatc attttatcac aaaaatcttt ctgtttgcat gttttcttct 3960
gtacttacca atcacactaa atgagttgga ttaaaatttt gggaggttga gcagaaaatg 4020
ttcttaagta ttaatatcaa ttcttcacat ttaaaatgtg caaatatttt gaggggtgtt 4080
agtaggcttt gctcctctga aatttacctt tatggtttaa tcaggtgatg cctccagttg 4140
tgcaagtagc cactaacaat aatgtttttt cctactaatg ggaaggtggc aaacattata 4200
ttcagtggat tactaataat tttaaggagg aagtcttttc aatctaatta acaagaaatg 4260
tgagtaacaa atgacggata tttgtcataa aacaacagtc atcttctctt acatgtgtaa 4320
atataacatt gtattttaca taagccagtc agaaatcttc acaagtcttg gatagttcca 4380
gattgtaact cctgatgctt agctctatca ggatgatatg actcagaaac gttagttcta 4440
tcaacctagt ttccaactct tccttgcttt taatgatttg tggagctcta ctctgaacca 4500
gcctggcttt gaagtaaatc tccttcactc atcatcagca cacttttttt gaaaagccac 4560
gtcacttata gaatcctact tatgttgtgg ctcgatgaac atgtgttaac actgtggatc 4620
aggggagcgg gagtgagcag tacaggaggg aaaatatgat tggaaactcc ttgtgctgca 4680
atctatttaa atctcgagct cgcgaa 4706
<210>19
<211>1242
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Multiple shRNA construct 1
<400>19
gaattcgatt gtcgaccaga cagacgtcag gctttctaag cctggactga gtaagagcgg 60
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tatggaaata ttacgccgaa tcgcgttaca aatcggctaa gcgggcctaa gagttaacaa 300
gatgtgctat taagcggagc cttttggtgg gaagaaatgg agtagtcact gtgttctaaa 360
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gaactcgacc gaagaaccga gcgctgctgg ccttaaagtc ccaccaaaac tctgaagaaa 540
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gatcaggcac tcctcaattg cttttttgga actcgacgaa ttgtgggacg gcggaagacg 900
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tgcaaataca acgccagctc accgctactt aaaaatcatg atataataga ggcttaaata 1140
ctgtccgaga gacactgggg tttggatctt atttcttcgg agttcaagag actccgaaga 1200
aataagatcc ttttttggaa ctcgagaatc actagtgaat tc 1242
<210>20
<211>1181
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Multiple shRNA construct 2
<400>20
gcggccgcgg gaattcgatt gtcgacgaat tgtgggacgg cggaagacgg gctcccgccc 60
cgcccctata tgcaaagcag agaacttccc gccgtgcacc gcgcgcaatc ggaagagaat 120
ttgggcactt cagacccaaa aaaaaaccca aaacttctgc gaaaaagaaa gaatctcagc 180
ggagtaaata gggatttttg ttaaagaggt gataccagaa gaagaaatat gcaaatacaa 240
cgccagctca ccgctactta aaaatcatga tataatagag gcttaaatac tgtccgagag 300
acactggggt ttgatctgtt ccaccattga attcaagaga ttcaatggtg gaacagatct 360
tttttggaac tcgaccgaag aaccgagcgc tgctggcctt aaagtcccac caaaactctg 420
aagaaacgaa gccagacccg gcactcagcg ggcagcccgc gcctcccgcc gccccacagt 480
gccgcgcgcg tgcatttgca tagcgcggtg ctcgcagggg gaaactcacc ccctcaagtc 540
cgccccccgc ttcccgcccg ctgtcccgca cctcatcagt gctgtgcgct gtctgtgtcc 600
cccagcacgc actctttgct gttcttaccc ggaggcttgc cctatccttg aggtttctat 660
tttttaggct ataaataccg cctaggaggt agagatattc cgggactcta gcatacttat 720
tcaagagata agtatgctag agtcccgttt tttggaactc gacgaggctc agtgtcacgc 780
agagcgcggg acgagcgctc cgagccctcc cagtgccgcc cccaaggcag ggcggccggc 840
gcagctcccc gcagcccgcc agtgggaagg ctctgctttg cataacgcgc aaggcctgct 900
gggaggaaag cggagcgaga aagagcgtta acgtgcgccg agtgttttag agcaaaagca 960
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ggcagctcgt agctttcagg atacaccatg gatacttcaa gagagtatcc atggtgtatc 1140
ctgtttttgg aactcgagaa tcactagtga attcgcggcc g 1181
<210>21
<211>1196
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Multiple shRNA construct 3
<400>21
gcggccgcgg gaattcgatt gtcgacgaat tgtgggacgg cggaagacgg gctcccgccc 60
cgcccctata tgcaaggcag agaacttccc gccgtgcacc gcgcgcaatc ggaagagaat 120
ttgggcactt cagacccaaa aaaaaaccca aaacttctgc gaaaaagaaa gaatctcagc 180
ggagtaaata gggatttttg ttaaagaggt gataccagaa gaagaaatat gcaaatacaa 240
cgccagctca ccgctactta aaaatcatga tataatagag gcttaaatac tgtccgagag 300
acactggggt ttatcttatt tcttcggaga caattcaaga gattgtctcc gaagaaataa 360
gatttttttg gaactcgacc gaagaaccga gcgctgctgg ccttaaagtc ccaccaaaac 420
tctgaagaaa cgaagccaga cccggcactc agcgggcagc ccgcgcctcc cgccgcccca 480
cagtgccgcg cgcgtgcatt tgcatagcgc ggtgctcgca gggggaaact caccccctca 540
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ctatttttta ggctataaat accgcctagg aggtagagat attcgcaatt gaggagtgcc 720
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acgcagagcg cgggacgagc gctccgagcc ctcccagtgc cgccccccaa ggcagggcgg 840
ccggcgcagc tccccgcagc ccgccagtgg gaaggctctg ctttgcataa cgcgcaaggc 900
ctgctgggag gaaagcggag cgagaaagag cgttaacgtg cgccgagtgt tttagagcaa 960
aagcattcag acctgaagca gcgctgagag atgcctctgc cgcccattta ctggaacgtt 1020
cagacccacc gcaagtcacc gtgaccttga ggacactgag ctgttggccg ttatatagca 1080
cttggggcag ctcgtagctt tgatctgttc caccattgaa ttcaagagat tcaatggtgg 1140
aacagatctt ttttggaact cgagaatcac tagtgaattc gcggccgcga attcca 1196
<210>22
<211>325
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>cU6-1promoter sequence
<400>22
cgaagaaccg agcgctgctg gccttaaagt cccaccaaaa ctctgaagaa acgaagccag 60
acccggcact cagcgggcag cccgcgcctc ccgccgcccc acagtgccgc gcgcgtgcat 120
ttgcatagcg cggtgctcgc agggggaaac tcaccccctc aagtccgccc cccgcttccc 180
gcccgctgtc ccgcacctca tcagtgctgt gcgctgtctg tgtcccccag cacgcactct 240
ttgctgttct tacccggagg cttgccctat ccttgaggtt tctatttttt aggctataaa 300
taccgcctag gaggtagaga tattc 325
<210>23
<211>394
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>cU6-3promoter sequence
<400>23
cagacagacg tcaggctttc taagcctgga ctgagtaaga gcggaagagc tccacagcac 60
tctgagtgcg cacagaccgc gcgtacagcg cacagccgcg cggccgctcc ttcaggcact 120
gccgacgaca gcccaggcgg aggtcctgag cgccggcgct aaatttgcat aaagaactac 180
ccaggagccc tcgcgcgcgg aaacgggcaa aaaggggctt ctaatatgga aatattacgc 240
cgaatcgcgt tacaaatcgg ctaagcgggc ctaagagtta acaagatgtg ctattaagcg 300
gagccttttg gtgggaagaa atggagtagt cactgtgttc taaaagaact tgcagaatga 360
gcctttaaat accgcagtct cgatgctctt agtc 394
<210>24
<211>287
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>cU6-4promoter sequence
<400>24
tgaattgtgg gacggcggaa gacgggctcc cgccccgccc ctatatgcaa agcagagaac 60
ttcccgccgt gcaccgcgcg caatcggaag agaatttggg cacttcagac ccaaaaaaaa 120
acccaaaact tctgcgaaaa agaaagaatc tcagcggagt aaatagggat ttttgttaaa 180
gaggtgatac cagaagaaga aatatgcaaa tacaacgcca gctcaccgct acttaaaaat 240
catgatataa tagaggctta aatactgtcc gagagacact ggggttt 287
<210>25
<211>783
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>7SK promoter sequence
<400>25
gtccagccat ccacctccca ccaatacttc cccactgaac catgtccctc agtagcacag 60
ggtttgtgga acgcctcctg ggacggtgcc tcccccacct gccacgcagc ccattccagc 120
acctgacact tctggagacg aaatttttcc taacgtccaa cctgagtctc ccctggtgca 180
acttgaggct gttcccctga ctcccatcgc tagttacgtg ggaagaaaag acccctaaga 240
ccaccccgtg caaccaccag cccatcccca ccacgcccac tgaccgggcc cctcagtgcc 300
acagcagcac ggttctcgag cgcttcgcag gacggtgagc actgcccgga acctctgcac 360
ggcctcagca acgcgacttt cagccggggt cgctgcccag gagccggcgg cttcggagcg 420
cagagcgagg cgggagagct ccggccgcgg gaggctcagt gtcacgcaga gcgcgggacg 480
agcgctccga gccctcccag tgccgccccc aaggcagggc ggccggcgca gctccccgca 540
gcccgccagt gggaaggctc tgctttgcat aacgcgcaag gcctgctggg aggaaagcgg 600
agcgagaaag agcgttaacg tgcgccgagt gttttagagc aaaagcattc agacctgaag 660
cagcgctgag agatgcctct gccgcccatt tactggaaac gttcagaccc accgcaagtc 720
accgtgacct tgagacactg agctgttggc cgttatatag cacttggggc agctcgtagc 780
ttt 783
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>26
cgaagaaccg agcgctgc 18
<210>27
<211>85
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>27
gggctcgagt tccaaaaaag cgcagtgtta ctccacttct cttgaaagtg gagtaacact 60
gcgctgaata ccgcttcctc ctgag 85
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>28
gaattgtggg acggcggaag 20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>29
cagacagacg tcaggctttc 20
<210>30
<211>83
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>30
ctcgagttcc aaaaaaggat cttatttctt cggagtctct tgaactccga agaaataaga 60
tccaaacccc agtgtctctc gga 83
<210>31
<211>99
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>31
ctcgagttcc aaaaaacact acagctaagg ctatggagca aattctcttg aaatttgctc 60
catagcctta gctgtagtgg actaagagca tcgagactg 99
<210>32
<211>83
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>32
ctcgagttcc aaaaaagcaa ttgaggagtg cctgatctct tgaatcaggc actcctcaat 60
tgcgaatatc tctacctcct agg 83
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>33
gtcgaccgaa gaaccgagcg ctgc 24
<210>34
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>34
gtcgacgaat tgtgggacgg cggaag 26
<210>35
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>35
gtcgaccaga cagacgtcag gctttc 26
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>36
gaggctcagt gtcacgcaga 20
<210>37
<211>83
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>37
ctcgagttcc aaaaaagatc tgttccacca ttgaatctct tgaattcaat ggtggaacag 60
atcaaacccc agtgtctctc gga 83
<210>38
<211>83
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>38
ctcgagttcc aaaaaacggg actctagcat acttatctct tgaataagta tgctagagtc 60
ccggaatatc tctacctcct agg 83
<210>39
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>39
ctcgagttcc aaaaaaatct tatttcttcg gagacaatct cttgaattgt ctccgaagaa 60
ataagataaa ccccagtgtc tctcgga 87
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>40
gtcgacgagg ctcagtgtca cgcag 25
<210>41
<211>83
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>41
ctcgagttcc aaaaaacagg atacaccatg gatactctct tgaagtatcc atggtgtatc 60
ctgaaagcta cgagctgccc caa 83
<210>42
<211>83
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>42
ctcgagttcc aaaaaagatc tgttccacca ttgaatctct tgaattcaat ggtggaacag 60
atcaaagcta cgagctgccc caa 83
<210>43
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>43
gaattccata ccactgcgag ggtgccaagt catgggactg atactc 46
<210>44
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>44
gatatcttaa ttaactggaa ggttgcagta ag 32
<210>45
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>45
gatatcttgt cccttccagg aacag 25
<210>46
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>46
ctcgagattt aaatagattg cagcacaagg ag 32
<210>47
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>47
ggatccttaa ttaactggaa actaggacgt ggaag 35
<210>48
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>48
gaattccgag accatccacg tgctgcttac tgcagctacg tcgaatg 47
<210>49
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>49
gcatgcattt aaatgacagc agcaggtgaa agac 34
<210>50
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>oligonucleotide primer
<400>50
ggatcctcaa gtgggtgctc aggaag 26
<210>51
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Oligonucleotide primer
<400>51
ctcgagttcc aaaaaaatct tatttcttcg gagacaatct cttgaattgt ctccgaagaa 60
ataagatgac taagagcatc gagactg 87
<210>52
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>dsNA coding sequence
<400>52
cagcgaccaa aagaauucgg a 21
<210>53
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>dsNA coding sequence
<400>53
aagaauucgg auggccauca a 21
<210>54
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>dsNA coding sequence
<400>54
guggauucuu gaucgucuu 19
<210>55
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide primer
<400>55
ttgcccccaa acagcaa 17
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide primer
<400>56
gaccatccac gtgctgctta 20
<210>57
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucoleotide primer
<400>57
cattcgacgt agctgca 17
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide primer
<400>58
gcagcacgtg gatggtctc 19
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide primer
<400>59
tcttccgccg tcccacaatt 20
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide primer
<400>60
gcttagaaag cctgacgtct 20
<210>61
<211>1206
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Nucleic acid construct
<400>61
gacgtcgacg aattgtggga cggcggaaga cgggctcccg ccccgcccct atatgcaaag 60
cagagaactt cccgccgtgc accgcgcgca atcggaagag aatttgggca cttcagaccc 120
aaaaaaaaac ccaaaacttc tgcgaaaaag aaagaatctc agcggagtaa atagggattt 180
ttgttaaaga ggtgatacca gaagaagaaa tatgcaaata caacgccagc tcaccgctac 240
ttaaaaatca tgatataata gaggcttaaa tactgtccga gagacactgg ggtttgatct 300
gttccaccat tgaattcaag agattcaatg gtggaacaga tcttttttgg aactcgacca 360
gacagacgtc aggctttcta agcctggact gagtaagagc ggaagagctc cacagcactc 420
tgagtgcgca cagaccgcgc gtacagcgca cagccgcgcg gccgctcctt caggcactgc 480
cgacgacagc ccaggcggag gtcctgagcg ccggcgctaa atttgcataa agaactaccc 540
aggagccctc gcgcgcggaa acgggcaaaa aggggcttct aatatggaaa tattacgccg 600
aatcgcgtta caaatcggct aagcgggcct aagagttaac aagatgtgct attaagcgga 660
gccttttggt gggaagaaat ggagtagtca ctgtgttcta aaagaacttg cagaatgagc 720
ctttaaatac cgcagtctcg atgctcttag tctcttattt cttcggagac aattcaagag 780
attgtctccg aagaaataag atttttttgg aactcgaccg aagaaccgag cgctgctggc 840
cttaaagtcc caccaaaact ctgaagaaac gaagccagac ccggcactca gcgggcagcc 900
cgcgcctccc gccgccccac agtgccgcgc gcgtgcattt gcatagcgcg gtgctcgcag 960
ggggaaactc accccctcaa gtccgccccc cgcttcccgc ccgctgtccc gcacctcatc 1020
agtgctgtgc gctgtctgtg tcccccagca cgcactcttt gctgttctta cccggaggct 1080
tgccctatcc ttgaggtttc tattttttag gctataaata ccgcctagga ggtagagata 1140
ttcgcaattg aggagtgcct gattcaagag atcaggcact cctcaattgc ttttttggaa 1200
ctcgag 1206
<210>62
<211>1664
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Nucleic acid construct
<400>62
cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60
ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120
tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180
ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240
cgctgatgcc cagtttaatt taaatagatc tctcgacgaa ttgtgggacg gcggaagacg 300
ggctcccgcc ccgcccctat atgcaaggca gagaacttcc cgccgtgcac cgcgcgcaat 360
cggaagagaa tttgggcact tcagacccaa aaaaaaaccc aaaacttctg cgaaaaagaa 420
agaatctcag cggagtaaat agggattttt gttaaagagg tgataccaga agaagaaata 480
tgcaaataca acgccagctc accgctactt aaaaatcatg atataataga ggcttaaata 540
ctgtccgaga gacactgggg tttatcttat ttcttcggag acaattcaag agattgtctc 600
cgaagaaata agattttttt ggaactcgac cgaagaaccg agcgctgctg gccttaaagt 660
cccaccaaaa ctctgaagaa acgaagccag acccggcact cagcgggcag cccgcgcctc 720
ccgccgcccc acagtgccgc gcgcgtgcat ttgcatagcg cggtgctcgc agggggaaac 780
tcaccccctc aagtccgccc cccgcttccc gcccgctgtc ccgcacctca tcagtgctgt 840
gcgctgtctg tgtcccccag cacgcactct ttgctgttct tacccggagg cttgccctat 900
ccttgaggtt tctatttttt aggctataaa taccgcctag gaggtagaga tattcgcaat 960
tgaggagtgc ctgattcaag agatcaggca ctcctcaatt gcttttttgg aagtcgagga 1020
ggctcagtgt cacgcagagc gcgggacgag cgctccgagc cctcccagtg ccgcccccca 1080
aggcagggcg gccggcgcag ctccccgcag cccgccagtg ggaaggctct gctttgcata 1140
acgcgcaagg cctgctggga ggaaagcgga gcgagaaaga gcgttaacgt gcgccgagtg 1200
ttttagagca aaagcattca gacctgaagc agcgctgaga gatgcctctg ccgcccattt 1260
actggaacgt tcagacccac cgcaagtcac cgtgaccttg aggacactga gctgttggcc 1320
gttatatagc acttggggca gctcgtagct ttgatctgtt ccaccattga attcaagaga 1380
ttcaatggtg gaacagatct tttttggaac tcgaggtcga ctctagagcg gccgcgcgca 1440
ctagtgaatt ccatggatat caagcttaaa caagaatctc tagttttctt tcttgctttt 1500
acttttactt ccttaatact caagtacaat tttaatggag tactttttta cttttactca 1560
agtaagattc tagccagata cttttacttt taattgagta aaattttccc taagtacttg 1620
tactttcact tgagtaaaat ttttgagtac tttttacacc tctg 1664
<210>63
<211>1723
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Nucleic acid construct
<400>63
cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60
ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120
tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180
ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240
cgctgatgcc cagtttaatt taaatagatc tctcgacgaa ttgtgggacg gcggaagacg 300
ggctcccgcc ccgcccctat atgcaaagca gagaacttcc cgccgtgcac cgcgcgcaat 360
cggaagagaa tttgggcact tcagacccaa aaaaaaaccc aaaacttctg cgaaaaagaa 420
agaatctcag cggagtaaat agggattttt gttaaagagg tgataccaga agaagaaata 480
tgcaaataca acgccagctc accgctactt aaaaatcatg atataataga ggcttaaata 540
ctgtccgaga gacactgggg tttgatctgt tccaccattg aattcaagag attcaatggt 600
ggaacagatc ttttttggaa ctcgaccaga cagacgtcag gctttctaag cctggactga 660
gtaagagcgg aagagctcca cagcactctg agtgcgcaca gaccgcgcgt acagcgcaca 720
gccgcgcggc cgctccttca ggcactgccg acgacagccc aggcggaggt cctgagcgcc 780
ggcgctaaat ttgcataaag aactacccag gagccctcgc gcgcggaaac gggcaaaaag 840
gggcttctaa tatggaaata ttacgccgaa tcgcgttaca aatcggctaa gcgggcctaa 900
gagttaacaa gatgtgctat taagcggagc cttttggtgg gaagaaatgg agtagtcact 960
gtgttctaaa agaacttgca gaatgagcct ttaaataccg cagtctcgat gctcttagtc 1020
tcttatttct tcggagacaa ttcaagagat tgtctccgaa gaaataagat ttttttggaa 1080
ctcgaccgaa gaaccgagcg ctgctggcct taaagtccca ccaaaactct gaagaaacga 1140
agccagaccc ggcactcagc gggcagcccg cgcctcccgc cgccccacag tgccgcgcgc 1200
gtgcatttgc atagcgcggt gctcgcaggg ggaaactcac cccctcaagt ccgccccccg 1260
cttcccgccc gctgtcccgc acctcatcag tgctgtgcgc tgtctgtgtc ccccagcacg 1320
cactctttgc tgttcttacc cggaggcttg ccctatcctt gaggtttcta ttttttaggc 1380
tataaatacc gcctaggagg tagagatatt cgcaattgag gagtgcctga ttcaagagat 1440
caggcactcc tcaattgctt ttttggaact cgaggtcgac tctagagcgg ccgcgcgcac 1500
tagtgaattc catggatatc aagcttaaac aagaatctct agttttcttt cttgctttta 1560
cttttacttc cttaatactc aagtacaatt ttaatggagt acttttttac ttttactcaa 1620
gtaagattct agccagatac ttttactttt aattgagtaa aattttccct aagtacttgt 1680
actttcactt gagtaaaatt tttgagtact ttttacacct ctg 1723
<210>64
<211>3459
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>pminiTol2
<400>64
gggcgaattg ggcccagagg tgtaaagtac ttgagtaatt ttacttgatt actgtactta 60
agtattattt ttggggattt ttactttact tgagtacaat taaaaatcaa tacttttact 120
tttacttaat tacatttttt tagaaaaaaa agtacttttt actccttaca attttattta 180
cagtcaaaaa gtacttattt tttggagatc acttcattct attttccctt gctattacca 240
aaccaattga attgcgctga tgcccagttt aatttaaata gatctggcca tctagagcgg 300
ccgcgcgcac tagtgaattc catggatatc aagcttaaac aagaatctct agttttcttt 360
cttgctttta cttttacttc cttaatactc aagtacaatt ttaatggagt acttttttac 420
ttttactcaa gtaagattct agccagatac ttttactttt aattgagtaa aattttccct 480
aagtacttgt actttcactt gagtaaaatt tttgagtact ttttacacct ctgctcgacc 540
atatgggaga gctcccaacg cgttggatgc atagcttgag tattctatag tgtcacctaa 600
atagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 660
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 720
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 780
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 840
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 900
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 960
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1020
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1080
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1140
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1200
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1260
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1320
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1380
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1440
ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1500
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1560
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1620
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1680
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 1740
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 1800
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 1860
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 1920
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1980
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2040
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2100
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2160
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2220
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2280
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2340
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2400
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2460
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2520
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2580
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2640
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 2700
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 2760
aagtgccacc tgatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 2820
aggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 2880
cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 2940
agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact 3000
ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac 3060
cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 3120
gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga 3180
aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca 3240
ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggctgcg 3300
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 3360
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 3420
taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactata 3459
<210>65
<211>5693
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>pCMV-Tol2
<400>65
ggccgccacc atggaggaag tatgtgattc atcagcagct gcgagcagca cagtccaaaa 60
tcagccacag gatcaagagc acccgtggcc gtatcttcgc gaattctttt ctttaagtgg 120
tgtaaataaa gattcattca agatgaaatg tgtcctctgt ctcccgctta ataaagaaat 180
atcggccttc aaaagttcgc catcaaacct aaggaagcat attgagagaa tgcacccaaa 240
ttacctcaaa aactactcta aattgacagc acagaagaga aagatcggga cctccaccca 300
tgcttccagc agtaagcaac tgaaagttga ctcagttttc ccagtcaaac atgtgtctcc 360
agtcactgtg aacaaagcta tattaaggta catcattcaa ggacttcatc ctttcagcac 420
tgttgatctg ccatcattta aagagctgat tagtacactg cagcctggca tttctgtcat 480
tacaaggcct actttacgct ccaagatagc tgaagctgct ctgatcatga aacagaaagt 540
gactgctgcc atgagtgaag ttgaatggat tgcaaccaca acggattgtt ggactgcacg 600
tagaaagtca ttcattggtg taactgctca ctggatcaac cctggaagtc ttgaaagaca 660
ttccgctgca cttgcctgca aaagattaat gggctctcat acttttgagg tactggccag 720
tgccatgaat gatatccact cagagtatga aatacgtgac aaggttgttt gcacaaccac 780
agacagtggt tccaacttta tgaaggcttt cagagttttt ggtgtggaaa acaatgatat 840
cgagactgag gcaagaaggt gtgaaagtga tgacactgat tctgaaggct gtggtgaggg 900
aagtgatggt gtggaattcc aagatgcctc acgagtcctg gaccaagacg atggcttcga 960
attccagcta ccaaaacatc aaaagtgtgc ctgtcactta cttaacctag tctcaagcgt 1020
tgatgcccaa aaagctctct caaatgaaca ctacaagaaa ctctacagat ctgtctttgg 1080
caaatgccaa gctttatgga ataaaagcag ccgatcggct ctagcagctg aagctgttga 1140
atcagaaagc cggcttcagc ttttaaggcc aaaccaaacg cggtggaatt caacttttat 1200
ggctgttgac agaattcttc aaatttgcaa agaagcagga gaaggcgcac ttcggaatat 1260
atgcacctct cttgaggttc caatgtttaa tccagcagaa atgctgttct tgacagagtg 1320
ggccaacaca atgcgtccag ttgcaaaagt actcgacatc ttgcaagcgg aaacgaatac 1380
acagctgggg tggctgctgc ctagtgtcca tcagttaagc ttgaaacttc agcgactcca 1440
ccattctctc aggtactgtg acccacttgt ggatgcccta caacaaggaa tccaaacacg 1500
attcaagcat atgtttgaag atcctgagat catagcagct gccatccttc tccctaaatt 1560
tcggacctct tggacaaatg atgaaaccat cataaaacga ggcatggact acatcagagt 1620
gcatctggag cctttggacc acaagaagga attggccaac agttcatctg atgatgaaga 1680
ttttttcgct tctttgaaac cgacaacaca tgaagccagc aaagagttgg atggatatct 1740
ggcctgtgtt tcagacacca gggagtctct gctcacgttt cctgctattt gcagcctctc 1800
tatcaagact aatacacctc ttcccgcatc ggctgcctgt gagaggcttt tcagcactgc 1860
aggattgctt ttcagcccca aaagagctag gcttgacact aacaattttg agaatcagct 1920
tctactgaag ttaaatctga ggttttacaa ctttgagtag actagtctga agggcgaatt 1980
ctgcagatat ccatcacact ggcggccgcg gggatccaga catgataaga tacattgatg 2040
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 2100
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 2160
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttcg gatcctctag 2220
agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 2280
attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 2340
ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 2400
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 2460
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 2520
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 2580
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2640
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2700
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 2760
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 2820
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 2880
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 2940
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 3000
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 3060
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 3120
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 3180
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 3240
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 3300
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 3360
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 3420
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3480
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 3540
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 3600
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 3660
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 3720
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 3780
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 3840
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 3900
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 3960
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 4020
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 4080
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 4140
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 4200
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 4260
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 4320
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 4380
cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 4440
taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 4500
gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 4560
ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 4620
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 4680
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca 4740
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 4800
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 4860
aaacgacggc cagtgaattc gagcttgcat gcctgcaggt cgttacataa cttacggtaa 4920
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 4980
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 5040
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 5100
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 5160
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 5220
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 5280
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 5340
acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 5400
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 5460
tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccggactct agaggatccg gtactcgagg 5520
aactgaaaaa ccagaaagtt aactggtaag tttagtcttt ttgtctttta tttcaggtcc 5580
cggatccggt ggtggtgcaa atcaaagaac tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct 5640
aggcctgtac ggaagtgtta cttctgctct aaaagctgcg gaattgtacc cgc 5693

Claims (38)

1.编码3个包含双链区的RNA分子的核酸构建体，其中当与缺少所述RNA分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述RNA分子降低动物细胞中甲型流感病毒复制和/或降低在动物细胞中感染性甲型流感病毒颗粒的产生和/或降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的动物细胞中的表达，其中所述双链区由核苷酸序列SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：12组成，其中所述RNA分子是短发夹RNA。
2.权利要求1的核酸构建体，其中每个RNA分子由与RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子可操纵连接的核苷酸序列编码。
3.权利要求2的核酸构建体，其中所述启动子是RNA聚合酶III启动子。
4.权利要求2或3的核酸构建体，其中启动子是鸡、火鸡和/或鸭启动子。
5.权利要求3或4的核酸构建体，其中启动子选自U6、7SK和/或H1启动子。
6.权利要求5的核酸构建体，其中U6启动子是cU6-l、cU6-2、cU6-3和/或cU6-4。
7.权利要求3-6任一项的核酸构建体，其中编码RNA分子的每个核苷酸序列与不同的RNA聚合酶III启动子可操纵连接。
8.权利要求1-7任一项的核酸构建体，其中所述多肽是禽流感多肽。
9.权利要求8的核酸构建体，其中禽流感是H5N1。
10.权利要求1-9任一项的核酸构建体，其中所述构建体由鸡和甲型流感病毒核苷酸序列组成。
11.包含3种分离的和/或外源的包含双链区的核酸分子的组合物，其中所述双链区由核苷酸序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12组成，其中所述核酸分子是短发夹RNA。
12.权利要求11的组合物，其中当与缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述核酸分子降低动物细胞中甲型流感病毒复制。
13.权利要求11或12的组合物，其中当与缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述核酸分子降低动物细胞中感染性甲型流感病毒颗粒的产生。
14.权利要求11-13任一项的组合物，其中当与缺少所述核酸分子的等基因甲型流感病毒感染的动物细胞相比时，所述核酸分子降低甲型流感病毒多肽在甲型流感病毒感染的动物细胞中的表达。
15.一种载体，其包含权利要求1-10任一项的核酸构建体。
16.一种细胞，其包含权利要求1-10任一项的核酸构建体、权利要求11-14任一项的组合物和/或权利要求15的载体。
17.一种组合物，其包含权利要求1-10任一项的核酸构建体、权利要求15的载体和/或权利要求16的细胞。
18.权利要求1-10任一项的核酸构建体、权利要求11-14任一项的组合物、权利要求15的载体和/或权利要求16的细胞在制备用于治疗和/或预防甲型流感病毒感染的药物中的应用。
19.权利要求18的应用，其中所述核酸构建体、所述组合物、所述载体和/或所述细胞在饮用水或在气溶胶中被给予。
20.权利要求18或19的应用，其中所述甲型流感病毒是禽流感。
21.权利要求18-20任一项的应用，其中所述对象是禽类。
22.权利要求21的应用，其中所述对象是家禽。
23.权利要求22的应用，其中所述对象是鸡、火鸡或鸭。
24.降低细胞中一或多种甲型流感病毒基因表达的体外方法，包括给予细胞权利要求11-14任一项的组合物。
25.一种鉴别包含权利要求1-10任一项的核酸构建体或权利要求11-14任一项的组合物的动物的方法，所述方法包括：确定得自所述动物的样品中权利要求1-10任一项的核酸构建体和/或权利要求11-14任一项的组合物的存在或缺失。
26.权利要求25的方法，其中所述方法包括扩增所述核酸构建体或其片段，或者所述分离的和/或外源的核酸分子或其片段。
27.权利要求25或26的方法，其中所述方法包括：
将得自所述动物的样品与探针接触，所述探针在严格条件下与所述核酸构建体和/或所述分离的和/或外源的核酸分子杂交形成复合物，以及
确定所述复合物的存在或缺失。
28.制备转基因禽类的方法，所述方法包括：
(i)将包含转座子的第一核酸导入细胞中，其中所述核酸包含权利要求1-10任一项的核酸构建体，
(ii)将编码转座酶的第二核酸导入细胞中，
(ii)选择在细胞基因组中包含第一核酸的转基因细胞，
(iii)从所述细胞再生转基因禽类，及
(iv)育种所述转基因禽类。
29.权利要求28的方法，其中所述转座子是Tol2转座子，所述转座酶是Tol2转座酶。
30.权利要求28或29的方法，其中所述细胞是鸡原生殖细胞。
31.转基因禽类的育种用途，所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体。
32.转基因禽类的生产食品的用途，所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体。
33.育种抗流感转基因禽类的方法，所述方法包括：
(a)获得转基因禽类，所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体，以及
(b)育种所述转基因禽类产生转基因后代。
34.权利要求33的方法，其中所述方法进一步包括选择包含所述核酸构建体的转基因后代。
35.生产食品的方法，所述方法包括：
(a)获得转基因禽类，所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体，以及
(b)从所述转基因禽类生产食品。
36.生产食品的方法，所述方法包括：
(a)获得转基因禽类，所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体，
(b)育种所述转基因禽类以产生转基因后代，以及
(c)从所述转基因后代生产食品。
37.转基因禽类或者得自所述转基因禽类的食品物质在制备治疗或预防对象中甲型流感病毒感染的组合物中的应用，所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体。
38.食品物质，包含转基因禽类或其部分，其中所述转基因禽类包含权利要求1-10任一项的核酸构建体。
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