CN111763686B - 实现c到a以及c到g碱基突变的碱基编辑系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了实现C到A以及C到G碱基突变的碱基编辑系统及其应用。本发明公开的C突变为A的碱基编辑系统包括胞嘧啶脱氨酶AID和nCas9核酸酶或包括胞嘧啶脱氨酶AID、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖苷酶；本发明公开的C突变为G的碱基编辑系统包括胞嘧啶脱氨酶APOBEC、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖苷酶。通过实验证明：将C到A、C到T以及A到G三种碱基编辑系统相结合可以在原核生物中实现A、T、C或者G到任意碱基的突变；将C到G、C到T以及A到G三种碱基编辑系统相结合可以在真核生物中实现A、T、C或者G到任意碱基的突变。

Description

实现C到A以及C到G碱基突变的碱基编辑系统及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及实现C到A以及C到G碱基突变的碱基编辑系统及其应用。
背景技术
基因组编辑是指在基因组尺度对细胞进行有效设计与高效改造，早期的基因组编辑技术主要利用同源重组介导的打靶技术，但由于效率较低(10-6-10-9)，为解决这一难题，一系列人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术被开发。目前主要有3种编辑技术，分别为人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)技术、转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技术和RNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas RGNs)技术，其中CRISPR-Cas9技术相较而言设计更加简单、操作更便捷、基因编辑效率更高，目前已经成功的应用于多种目的细胞的基因组编辑研究。
虽然CRISPR/Cas9方法可以精确地对DNA进行编辑，但受限于同源DNA修复的效率低的缺点，因此现在主要用于基因的敲除，无法高效产生单核苷酸突变。为了提高定点突变的效率，将CRISPR系统与胞嘧啶脱氨酶或者腺嘌呤脱氨酶结合构建的单碱基编辑系统，可以在不产生双链DNA断裂的情况下对特定靶位点实现胞嘧啶C到胸腺嘧啶T、腺嘌呤A到鸟嘌呤G的精确替换。单碱基编辑系统作为新一代基因编辑工具，目前仍然存在一定的缺陷：由于酶功能的限制，目前单碱基编辑系统只能实现单个碱基C→T或A→G的编辑，限制了碱基编辑系统的应用，这就急切需要构建新的碱基编辑方式甚至任意碱基到任意碱基的单碱基编辑系统。
发明内容
本发明的目的是如何实现将基因组序列中的靶标碱基C突变为A，以及提高靶标碱基C突变为A、靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率，进而实现任意碱基到任意碱基的突变。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法。
本发明提供的将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法为如下D1)或D2)或D3)或D4)：
D1)所述方法包括如下步骤：使用CRISPR/Cas9系统、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖苷酶进行单碱基编辑，实现靶标碱基C突变为A；
D2)所述方法包括如下步骤：使用CRISPR/Cas9系统和胞嘧啶脱氨酶进行单碱基编辑，实现靶标碱基C突变为A；
D3)所述方法包括如下步骤：使用CRISPR/Cas9系统、胞嘧啶脱氨酶AID和尿嘧啶DNA糖苷酶进行单碱基编辑，实现靶标碱基C突变为A；
D4)所述方法包括如下步骤：使用CRISPR/Cas9系统和胞嘧啶脱氨酶AID进行单碱基编辑，实现靶标碱基C突变为A。
进一步的，所述将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶的编码基因、CRISPR核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶的编码基因、CRISPR核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现靶标碱基C突变为A；
d2)所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶的编码基因、CRISPR核酸酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶的编码基因、CRISPR核酸酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现靶标碱基C突变为A；
d3)所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现靶标碱基C突变为A；
d4)所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现靶标碱基C突变为A；
所述sgRNA靶向靶点序列；所述靶标碱基C位于所述靶点序列。
所述d1)和所述d3)中，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶AID、所述CRISPR核酸酶或nCas9核酸酶与所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述受体生物或受体生物细胞中可进行融合表达，也可游离表达。
所述d2)和所述d4)中，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶AID与所述CRISPR核酸酶或nCas9核酸酶在所述受体生物或受体生物细胞中可进行融合表达，也可游离表达。
所述胞嘧啶脱氨酶可为不同来源的胞嘧啶脱氨酶，如鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1(GenBank：AAH03792.1)、人源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A(GenBank：AKE33285.1)、七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA(Accession：ABO15149.1)等。具体的，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶AID为七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如NCBI中Accession：ABO15149.1所示。
所述尿嘧啶DNA糖苷酶可为不同来源的尿嘧啶DNA糖苷酶，如人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG(GenBank：CAG46474.1)、酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1(Accession：CAA86634.1)、大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung(Accession：EGT65982.1)等。具体的，所述尿嘧啶DNA糖苷酶为大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如NCBI中Accession：EGT65982.1所示。
所述CRISPR核酸酶可为不同来源的CRISPR核酸酶或其突变体，如化脓链球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：Q99ZW2.1)或其突变体、金黄色葡萄球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：AYD60528.1)或其突变体、土拉热弗朗西丝菌来源的cpf1核酸酶(Accession：A0Q7Q2.1)或其突变体。具体的，所述CRISPR核酸酶或所述nCas9核酸酶为Cas9突变体nCas9-D10A，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的CRISPR核酸酶的氨基酸序列为将NCBI中Accession：Q99ZW2.1所示的氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列。
更进一步的，所述d3)中，所述胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、所述nCas9核酸酶的编码基因、所述尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因通过重组质粒A导入受体生物或受体生物细胞中；所述重组质粒A表达由胞嘧啶脱氨酶AID、nCas9核酸酶、尿嘧啶DNA糖苷酶组成的融合蛋白。
所述d4)中，所述胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因和所述nCas9核酸酶的编码基因通过重组质粒B导入受体生物或受体生物细胞中；所述重组质粒B表达由胞嘧啶脱氨酶AID和nCas9核酸酶组成的融合蛋白。
在本发明的具体实施例中，所述重组质粒B的核苷酸序列如序列1所示；所述重组质粒A的核苷酸序列如序列3所示。
上述将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法中，所述受体生物可为原核生物；所述C突变为A为在原核生物中实现C突变为A。
进一步的，所述原核生物可为大肠杆菌。
更进一步的，所述大肠杆菌具体为野生型大肠杆菌MG1655或大肠杆菌ATCC 8739。
为了实现上述目的，本发明又提供了一种提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的碱基编辑效率的方法。
本发明提供的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的碱基编辑效率的方法为上述D1)或D3)所述的方法或上述d1)或d3)所述的方法。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法。
本发明提供的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法为如下E1)或E2)：
E1)所述方法包括如下步骤：使用CRISPR/Cas9系统、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖苷酶进行单碱基编辑，实现提高靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率；
E2)所述方法包括如下步骤：使用CRISPR/Cas9系统、胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶DNA糖苷酶进行单碱基编辑，实现提高靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率。
进一步的，上述提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法为如下e1)或e2)：
e1)所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶的编码基因、CRISPR核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶的编码基因、CRISPR核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现提高靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率；
e2)所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶APOBEC的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶APOBEC的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现提高靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率；
所述sgRNA靶向靶点序列，所述靶标碱基位于所述靶点序列。
所述e1)和所述e2)中，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC、所述CRISPR核酸酶或nCas9核酸酶与所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述受体生物或受体生物细胞可进行融合表达，也可游离表达。
所述胞嘧啶脱氨酶可为不同来源的胞嘧啶脱氨酶，如鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1(GenBank：AAH03792.1)、人源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A(GenBank：AKE33285.1)、七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA(Accession：ABO15149.1)等。具体的，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC为鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如NCBI中GenBank：AAH03792.1所示。
所述尿嘧啶DNA糖苷酶可为不同来源的尿嘧啶DNA糖苷酶，如人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG(GenBank：CAG46474.1)、酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1(Accession：CAA86634.1)、大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung(Accession：EGT65982.1)等。具体的，所述尿嘧啶DNA糖苷酶为改造后的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG，其氨基酸序列为将NCBI中GenBank：CAG46474.1所示的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的氨基酸序列自N端起第1-84位所示的氨基酸序列删除后得到的氨基酸序列。
所述CRISPR核酸酶可为不同来源的CRISPR核酸酶或其突变体，如化脓链球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：Q99ZW2.1)或其突变体、金黄色葡萄球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：AYD60528.1)或其突变体、土拉热弗朗西丝菌来源的cpf1核酸酶(Accession：A0Q7Q2.1)或其突变体。具体的，所述CRISPR核酸酶或所述nCas9核酸酶为Cas9突变体nCas9-D10A，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的CRISPR核酸酶的氨基酸序列为将NCBI中Accession：Q99ZW2.1所示的氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列。
更进一步的，所述e2)中，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC的编码基因、所述nCas9核酸酶的编码基因、所述尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因通过重组质粒C导入受体生物或受体生物细胞中；所述重组质粒C表达由胞嘧啶脱氨酶APOBEC、nCas9核酸酶、尿嘧啶DNA糖苷酶组成的融合蛋白。
在本发明的具体实施例中，所述重组质粒C的核苷酸序列如序列5所示。
上述提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法中，所述受体生物细胞可为真核生物细胞。
进一步的，所述真核生物细胞可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物包括人。
更进一步的，所述哺乳动物细胞具体为HEK293T细胞或Hela细胞。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种在原核生物中实现基因组序列中的任意碱基到任意碱基定点突变的方法。
本发明提供的在原核生物中实现基因组序列中的任意碱基到任意碱基定点突变的方法(原理如图1所示)为如下M1)或M2)或M3)或M4)：
M1)包括m1)或m2)或m3)：
m1)当基因组序列中的靶标碱基为碱基C时，由碱基C出发，利用C突变为T的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基C突变为碱基T，实现了碱基C到碱基T的编辑；
m2)当基因组序列中的靶标碱基为碱基C时，由碱基C出发，利用C突变为A的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基C突变为碱基A，实现了碱基C到碱基A的编辑；
m3)当基因组序列中的靶标碱基为碱基C时，按照m2)所述方法获得靶标碱基为碱基A的突变体，由碱基A出发，利用A突变为G的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基A突变为碱基G，实现了碱基C到碱基G的编辑；
由此实现了碱基C到碱基T、碱基A以及碱基G的任意定点突变；
M2)当基因组序列中的靶标碱基为碱基G时，由于碱基G为碱基C的互补碱基，按照M1)所述方法也实现了碱基G到碱基A、碱基T以及碱基C的任意定点突变；
M3)包括m4)或m5)或m6)：
m4)当基因组序列中的靶标碱基为碱基T时，靶标碱基的互补碱基为碱基A，由碱基A出发，利用A突变为G的碱基编辑系统可将靶标碱基的互补碱基由碱基A突变为碱基G，碱基G的互补碱基为碱基C，实现了碱基T到碱基C的编辑；
m5)当基因组序列中的靶标碱基为碱基T时，按照m4)所述方法获得靶标碱基为碱基C的突变体，由碱基C出发，利用C突变为A的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基C突变为碱基A，实现了碱基T到碱基A的编辑；
m6)当基因组序列中的靶标碱基为碱基T时，按照m5)所述方法获得靶标碱基为碱基A的突变体，由碱基A出发，利用A突变为G的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基A突变为碱基G，实现了碱基T到碱基G的编辑；
由此实现了碱基T到碱基C、碱基A和碱基G的任意定点突变；
M4)当基因组序列中的靶标碱基为碱基A时，由于碱基A为碱基T的互补碱基，按照M3)所述方法也实现了碱基A到碱基G、碱基T和碱基C的任意定点突变；
所述C突变为A的碱基编辑系统为C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ或C突变为A的碱基编辑系统Ⅱ或C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ或C突变为A的碱基编辑系统Ⅳ；
所述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ包括胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料、CRISPR核酸酶或与所述CRISPR核酸酶相关的生物材料和尿嘧啶DNA糖苷酶或与所述尿嘧啶DNA糖苷酶相关的生物材料；
所述C突变为A的碱基编辑系统Ⅱ包括胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料和CRISPR核酸酶或与所述CRISPR核酸酶相关的生物材料；
所述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ包括胞嘧啶脱氨酶AID或与所述胞嘧啶脱氨酶AID相关的生物材料、nCas9核酸酶或与所述nCas9核酸酶相关的生物材料和尿嘧啶DNA糖苷酶或与所述尿嘧啶DNA糖苷酶相关的生物材料；
所述C突变为A的碱基编辑系统Ⅳ包括胞嘧啶脱氨酶AID或与所述胞嘧啶脱氨酶AID相关的生物材料和nCas9核酸酶或与所述nCas9核酸酶相关的生物材料。
进一步的，所述胞嘧啶脱氨酶可为不同来源的胞嘧啶脱氨酶，如鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1(GenBank：AAH03792.1)、人源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A(GenBank：AKE33285.1)、七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA(Accession：ABO15149.1)等。具体的，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶AID为七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如NCBI中Accession：ABO15149.1所示。
所述尿嘧啶DNA糖苷酶可为不同来源的尿嘧啶DNA糖苷酶，如人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG(GenBank：CAG46474.1)、酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1(Accession：CAA86634.1)、大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung(Accession：EGT65982.1)等。具体的，所述尿嘧啶DNA糖苷酶为大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如NCBI中Accession：EGT65982.1所示。
所述CRISPR核酸酶可为不同来源的CRISPR核酸酶或其突变体，如化脓链球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：Q99ZW2.1)或其突变体、金黄色葡萄球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：AYD60528.1)或其突变体、土拉热弗朗西丝菌来源的cpf1核酸酶(Accession：A0Q7Q2.1)或其突变体。具体的，所述CRISPR核酸酶或所述nCas9核酸酶为Cas9突变体nCas9-D10A，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的CRISPR核酸酶的氨基酸序列为将NCBI中Accession：Q99ZW2.1所示的氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列。
所述原核生物为大肠杆菌。
更进一步的，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655或大肠杆菌ATCC 8739。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种在真核生物中实现基因组序列中的任意碱基到任意碱基定点突变的方法。
本发明提供的在真核生物中实现基因组序列中的任意碱基到任意碱基定点突变的方法(原理如图2所示)为如下N1)或N2)或N3)或N4)：
N1)包括n1)或n2)或n3)：
n1)当基因组序列中的靶标碱基为碱基C时，由碱基C出发，利用C突变为T的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基C突变为碱基T，实现了碱基C到碱基T的编辑；
n2)当基因组序列中的靶标碱基为碱基C时，由碱基C出发，利用C突变为G的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基C突变为碱基G，实现了碱基C到碱基G的编辑；
n3)当基因组序列中的靶标碱基为碱基C时，按照n2)所述方法获得靶标碱基为碱基G的突变体，碱基G的互补碱基为碱基C，由碱基C出发，利用C突变为T的碱基编辑系统可将靶标碱基的互补碱基由碱基C突变为碱基T，碱基T的互补碱基为碱基A，实现了碱基C到碱基A的编辑；
由此实现了碱基C到碱基T、碱基A以及碱基G的任意定点突变；
N2)当基因组序列中的靶标碱基为碱基G时，由于碱基G为碱基C的互补碱基，按照N1)所述方法也实现了碱基G到碱基A、碱基T以及碱基C的任意定点突变；
N3)包括n4)或n5)或n6)：
n4)当基因组序列中的靶标碱基为碱基T时，碱基T的互补碱基为碱基A，由碱基A出发，利用A突变为G的碱基编辑系统可将靶标碱基的互补碱基由碱基A突变为碱基G，碱基G的互补碱基为碱基C，实现了碱基T到碱基C的编辑；
n5)当基因组序列中的靶标碱基为碱基T时，按照n4)所述方法获得靶标碱基为碱基C的突变体，由碱基C出发，利用C突变为G的碱基编辑系统可将靶标碱基由碱基C突变为碱基G，实现了碱基T到碱基G的编辑；
n6)当基因组序列中的靶标碱基为碱基T时，按照n5)所述方法获得靶标碱基为碱基G的突变体，碱基G的互补碱基为碱基C，由碱基C出发，利用C突变为T的碱基编辑系统可将靶标碱基的互补碱基由碱基C突变为碱基T，实现碱基T到碱基A的编辑；
由此实现了碱基T到碱基C、碱基A和碱基G的任意定点突变；
N4)当基因组序列中的靶标碱基为碱基A时，由于碱基A为碱基T的互补碱基，按照N3)所述方法也实现了碱基A到碱基G、碱基T和碱基C的任意定点突变；
所述C突变为G的碱基编辑系统为C突变为G的碱基编辑系统Ⅰ或C突变为G的碱基编辑系统Ⅱ或C突变为G的碱基编辑系统Ⅲ或C突变为G的碱基编辑系统Ⅳ；
所述C突变为G的碱基编辑系统Ⅰ包括胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料、CRISPR核酸酶或与所述CRISPR核酸酶相关的生物材料和尿嘧啶DNA糖苷酶或与所述尿嘧啶DNA糖苷酶相关的生物材料；
所述C突变为G的碱基编辑系统Ⅱ包括胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料和CRISPR核酸酶或与所述CRISPR核酸酶相关的生物材料；
所述C突变为G的碱基编辑系统Ⅲ包括胞嘧啶脱氨酶APOBEC或与所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC相关的生物材料、nCas9核酸酶或与所述nCas9核酸酶相关的生物材料和尿嘧啶DNA糖苷酶或与所述尿嘧啶DNA糖苷酶相关的生物材料；
所述C突变为G的碱基编辑系统Ⅳ包括胞嘧啶脱氨酶APOBEC或与所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC相关的生物材料和nCas9核酸酶或与所述nCas9核酸酶相关的生物材料。
进一步的，所述胞嘧啶脱氨酶可为不同来源的胞嘧啶脱氨酶，如鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1(GenBank：AAH03792.1)、人源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A(GenBank：AKE33285.1)、七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA(Accession：ABO15149.1)等。具体的，所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC为鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如NCBI中GenBank：AAH03792.1所示。
所述尿嘧啶DNA糖苷酶可为不同来源的尿嘧啶DNA糖苷酶，如人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG(GenBank：CAG46474.1)、酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1(Accession：CAA86634.1)、大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung(Accession：EGT65982.1)等。具体的，所述尿嘧啶DNA糖苷酶为改造后的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG，其氨基酸序列为将NCBI中GenBank：CAG46474.1所示的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的氨基酸序列自N端起第1-84位所示的氨基酸序列删除后得到的氨基酸序列。
所述CRISPR核酸酶可为不同来源的CRISPR核酸酶或其突变体，如化脓链球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：Q99ZW2.1)或其突变体、金黄色葡萄球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：AYD60528.1)或其突变体、土拉热弗朗西丝菌来源的cpf1核酸酶(Accession：A0Q7Q2.1)或其突变体。具体的，所述CRISPR核酸酶或所述nCas9核酸酶为Cas9突变体nCas9-D10A，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的CRISPR核酸酶的氨基酸序列为将NCBI中Accession：Q99ZW2.1所示的氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列。
所述真核生物为真核生物细胞。
更进一步的，所述真核生物细胞为哺乳动物细胞，如HEK293T细胞或Hela细胞。
为了实现上述目的，本发明还提供了如下a1)-a8)中任一种应用：
a1)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ在将基因组序列中的靶标碱基C突变为A中的应用；
a2)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅱ在将基因组序列中的靶标碱基C突变为A中的应用；
a3)尿嘧啶DNA糖苷酶或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ在提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的碱基编辑效率中的应用；
a4)尿嘧啶DNA糖苷酶或上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅰ在提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率中的应用；
a5)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在原核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用；
a6)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅱ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在原核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用；
a7)上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅰ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在真核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用；
a8)上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅱ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在真核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用。
为了实现上述目的，本发明还提供了如下b1)-b8)中任一种应用：
b1)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ在将基因组序列中的靶标碱基C突变为A中的应用；
b2)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅳ在将基因组序列中的靶标碱基C突变为A中的应用；
b3)尿嘧啶DNA糖苷酶或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ在提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的碱基编辑效率中的应用；
b4)尿嘧啶DNA糖苷酶或上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅲ在提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率中的应用；
b5)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在原核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用；
b6)上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅳ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在原核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用；
b7)上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅲ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在真核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用；
b8)上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅳ、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统在真核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基的定点突变中的应用。
为了实现上述目的，本发明最后提供了如下c1)-c5)中任一种产品：
c1)将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的产品，其包括上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅱ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅳ；
c2)提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的碱基编辑效率的产品，其包括上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ；
c3)提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的产品，其包括上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅰ或上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅲ；
c4)在原核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基定点突变的产品，其包括C突变为A的碱基编辑系统、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统；所述C突变为A的碱基编辑系统为上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅰ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅱ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅲ或上述C突变为A的碱基编辑系统Ⅳ；
c5)在真核生物中实现基因组序列中任意碱基到任意碱基定点突变的产品，其包括C突变为G的碱基编辑系统、C突变为T的碱基编辑系统和A突变为G的碱基编辑系统；所述C突变为G的碱基编辑系统为上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅰ或上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅱ或上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅲ或上述C突变为G的碱基编辑系统Ⅳ。
上述任一所述应用或产品或方法中，所述a1)或a2)或a3)或b1)或b2)或b3)或c1)或c2)或d1)或d2)或d3)或d4)中，所述靶标碱基C突变为A为在原核生物中实现靶标碱基C突变为A。
所述a4)或b4)或c3)或e1)或e2)中，所述靶标碱基C突变为G为在真核生物中实现靶标碱基C突变为G。
上述任一所述应用或产品中，所述胞嘧啶脱氨酶可为不同来源的胞嘧啶脱氨酶，如鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1(GenBank：AAH03792.1)、人源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A(GenBank：AKE33285.1)、七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA(Accession：ABO15150.1)。具体的，在原核生物(如大肠杆菌)中进行C到A的碱基编辑所使用的胞嘧啶脱氨酶为七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如NCBI中Accession：ABO15149.1所示；在真核生物(如哺乳动物细胞)中进行C到G的碱基编辑所使用的胞嘧啶脱氨酶为鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如NCBI中GenBank：AAH03792.1所示。
与所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶AID或所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC相关的生物材料为如下X1)至X5)中的任一种：
X1)编码所述胞嘧啶脱氨酶或所述胞嘧啶脱氨酶AID或所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC的核酸分子；
X2)含有X1)所述核酸分子的表达盒；
X3)含有X1)所述核酸分子的重组载体、或含有X2)所述表达盒的重组载体；
X4)含有X1)所述核酸分子的重组微生物、或含有X2)所述表达盒的重组微生物、或含有X3)所述重组载体的重组微生物；
X5)含有X1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有X2)所述表达盒的转基因细胞系。
编码所述胞嘧啶脱氨酶的核酸分子为如下x1)或x2)或x3)：
x1)序列表中序列1第4405-5028位(编码胞嘧啶脱氨酶pmCDA)或序列4第1038-1721位(编码胞嘧啶脱氨酶APOBEC1)所示的cDNA分子或DNA分子；
x2)与x1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述胞嘧啶脱氨酶的cDNA分子或DNA分子；
x3)在严格条件下与x1)或x2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述胞嘧啶脱氨酶的cDNA分子或DNA分子。
所述CRISPR核酸酶可为不同来源的CRISPR核酸酶或其突变体，如化脓链球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：Q99ZW2.1)或其突变体、金黄色葡萄球菌来源的Cas9核酸酶(Accession：AYD60528.1)或其突变体、土拉热弗朗西丝菌来源的cpf1核酸酶(Accession：A0Q7Q2.1)或其突变体。具体的，在原核生物(如大肠杆菌)中进行C到A的碱基编辑或在真核生物(如哺乳动物细胞)中进行C到G的碱基编辑所使用的CRISPR核酸酶均为化脓链球菌来源的Cas9核酸酶的Cas9突变体nCas9-D10A，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的CRISPR核酸酶的氨基酸序列为将NCBI中Accession：Q99ZW2.1所示的氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列。
与所述CRISPR核酸酶或所述nCas9核酸酶相关的生物材料为如下Y1)至Y5)中的任一种：
Y1)编码所述CRISPR核酸酶或所述nCas9核酸酶的核酸分子；
Y2)含有Y1)所述核酸分子的表达盒；
Y3)含有Y1)所述核酸分子的重组载体、或含有Y2)所述表达盒的重组载体；
Y4)含有Y1)所述核酸分子的重组微生物、或含有Y2)所述表达盒的重组微生物、或含有Y3)所述重组载体的重组微生物；
Y5)含有Y1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有Y2)所述表达盒的转基因细胞系。
编码所述Cas9突变体nCas9-D10A的核酸分子为如下y1)或y2)或y3)：
y1)序列表中序列1第1-4104位所示的cDNA分子或DNA分子；
y2)与y1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述nCas9核酸酶的cDNA分子或DNA分子；
y3)在严格条件下与y1)或y2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述nCas9核酸酶的cDNA分子或DNA分子。
所述尿嘧啶DNA糖苷酶可为不同来源的尿嘧啶DNA糖苷酶，如人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG(GenBank：CAG46474.1)、酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1(Accession：CAA86634.1)、大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung(Accession：EGT65982.1)等。具体的，在原核生物(如大肠杆菌)中进行C到A的碱基编辑所使用的尿嘧啶DNA糖苷酶为大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung，其氨基酸序列是本领域公知的，在本发明的一个例子中，使用的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如NCBI中Accession：EGT65982.1所示；在真核生物(如哺乳动物细胞)中进行C到G的碱基编辑所使用的尿嘧啶DNA糖苷酶为改造后的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG，其氨基酸序列为将NCBI中GenBank：CAG46474.1所示的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的氨基酸序列自N端起第1-84位所示的氨基酸序列删除后得到的氨基酸序列。
与所述尿嘧啶DNA糖苷酶相关的生物材料为如下Z1)至Z5)中的任一种：
Z1)编码所述尿嘧啶DNA糖苷酶的核酸分子；
Z2)含有Z1)所述核酸分子的表达盒；
Z3)含有Z1)所述核酸分子的重组载体、或含有Z2)所述表达盒的重组载体；
Z4)含有Z1)所述核酸分子的重组微生物、或含有Z2)所述表达盒的重组微生物、或含有Z3)所述重组载体的重组微生物；
Z5)含有Z1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有Z2)所述表达盒的转基因细胞系。
编码所述尿嘧啶DNA糖苷酶的核酸分子为如下z1)或z2)或z3)：
z1)序列表中序列3第1-687位(编码大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung)或序列5第1-663位(编码改造后的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG)所示的cDNA分子或DNA分子；
z2)与z1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述尿嘧啶DNA糖苷酶的cDNA分子或DNA分子；
z3)在严格条件下与z1)或z2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述尿嘧啶DNA糖苷酶的cDNA分子或DNA分子。
上述任一所述方法或应用或产品中，所述C突变为T的碱基编辑系统可为现有技术中本领域技术人员公知的任一种可实现C突变为T的碱基编辑系统，如包括胞嘧啶脱氨酶(胞嘧啶脱氨酶APOBEC1)和nCas9核酸酶的碱基编辑系统，或者包括胞嘧啶脱氨酶(胞嘧啶脱氨酶APOBEC1)、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白UGI的碱基编辑系统。
上述任一所述方法或应用或产品中，所述A突变为G的碱基编辑系统可为现有技术中本领域技术人员公知的任一种可实现A突变为G的碱基编辑系统，如包括腺嘌呤脱氨酶(如腺嘌呤脱氨酶TadA)和nCas9核酸酶的碱基编辑系统。
上述任一所述应用或产品中，所述碱基编辑系统均还包括sgRNA；所述sgRNA靶向靶点序列，所述靶标碱基位于所述靶点序列。
上述任一所述方法或应用或产品中，所述任意碱基为A、G、C或T。
本发明提供了在原核生物中实现C突变为A的碱基编辑系统以及在真核生物中实现C突变为G的碱基编辑系统及其应用。C突变为A的碱基编辑系统包括胞嘧啶脱氨酶AID和nCas9核酸酶或包括胞嘧啶脱氨酶AID、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖苷酶；C突变为G的碱基编辑系统包括胞嘧啶脱氨酶APOBEC、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖苷酶。通过实验证明：将C到A、C到T以及A到G三种碱基编辑系统相结合可以在原核生物(如大肠杆菌)中实现A、T、C或者G到任意碱基的突变；将C到G、C到T以及A到G三种碱基编辑系统相结合可以在真核生物(如哺乳动物细胞)中实现A、T、C或者G到任意碱基的突变。
附图说明
图1为将C突变为A的碱基编辑系统、C突变为T的碱基编辑系统以及A突变为G的碱基编辑系统相结合实现A、T、C或者G到任意碱基的突变的碱基编辑示意图。上图为由C或者G出发实现任意碱基的突变的碱基编辑示意图；下图为由A或者T出发实现任意碱基的突变的碱基编辑示意图。
图2为将C突变为G的碱基编辑系统、C突变为T的碱基编辑系统以及A突变为G的碱基编辑系统相结合实现A、T、C或者G到任意碱基的突变的碱基编辑示意图。上图为由C或者G出发实现任意碱基的突变的碱基编辑示意图；下图为由A或者T出发实现任意碱基的突变的碱基编辑示意图。
图3为ptrc_nCas9_AID质粒(pnCas9_AID质粒)的图谱。
图4为大肠杆菌gRNA质粒的图谱。
图5为ptrc_ung_nCas9_AID质粒(pUNG_nCas9_AID质粒)的图谱。
图6为pAPOBEC_nCas9质粒(pAPOBEC_nCas9_UGI质粒)的图谱。
图7为pAPOBEC_nCas9_UNG质粒的图谱。
图8为哺乳动物细胞gRNA质粒的图谱。
图9为实施例3的靶基因、靶序列及编辑结果。图9A为在HEK293T细胞中的定点碱基替换的靶基因、靶序列及编辑结果；图9B为在Hela细胞中的定点碱基替换的靶基因、靶序列及编辑结果。
图10为pTadA_nCas9质粒的图谱。
图11为实施例4的靶基因、靶序列及编辑结果。图11A为以C碱基出发到任意碱基的编辑效率；图11B为以T碱基出发到任意碱基的编辑效率。
图12为xcas9(3.7)-ABE(7.10)质粒的图谱。
图13为实施例5的靶基因、靶序列及编辑结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的HEK293T细胞、Hela细胞、野生型大肠杆菌MG1655、野生型大肠杆菌ATCC 8739均是美国菌种保藏中心的产品。
下述实施例中在哺乳动物细胞中使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC为胞嘧啶脱氨酶APOBEC1(GenBank：AAH03792.1)，其编码基因序列如序列4第1038-1721位所示。
下述实施例中在大肠杆菌中使用的胞嘧啶脱氨酶AID为胞嘧啶脱氨酶pmCDA(Accession：ABO15149.1)，其编码基因序列如序列1第4405-5028位所示。
下述实施例中在大肠杆菌中使用的尿嘧啶DNA糖苷酶为大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung(Accession：EGT65982.1)，其编码基因序列如序列3第1-687位。
下述实施例中在哺乳动物细胞中使用的尿嘧啶DNA糖苷酶为改造后的人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG，其氨基酸序列为将人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG(GenBank：CAG46474.1)氨基酸序列的第1-84位所示的氨基酸序列删除后得到的氨基酸序列，其编码基因序列如序列5第1-663位。
下述实施例中在哺乳动物和大肠杆菌中使用的nCas9核酸酶均为Cas9突变体nCas9-D10A，其氨基酸序列为将Cas9核酸酶(Accession：Q99ZW2.1)氨基酸序列的第10位所示的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列，其编码基因序列如序列1第1-4104位所示。
下述实施例中各基因靶序列编辑后的PCR检测引物序列如表1所示。
表1、各基因靶序列编辑后的PCR检测引物序列
引物名称 引物序列
dcuA_genome_F TGCTGGCGATCTTCTTGGG
dcuA_genome_R CCCGTGTCATCCATCTGTACC
dcuB_genome_F AACGGATCGCTGGTTATCTG
dcuB_genome_R CCGGTACGGAGATGAATTTCTG
dcuC_genome_F ATCGGCGCGAATGATATG
dcuC_genome_R ATCACTAGCCCAACAAGC
dcuD_genome_F CGGTTATGCCCGCTACATGG
dcuD_genome_R GGGATCGCTGTTCGCTTCAC
relA_genome_F TCGCGTACTGGATCTGTTCTGC
relA_genome_R GTTGCCAACACCTTCGACTACC
rpoS_genome_F AACCAGTACGCCTATCTC
rpoS_genome_R ACTCAGGGTTCTGGATTG
spoT_genome_F CCTGGCCTTTGAGATGAG
spoT_genome_R GTTCAGGACGCTGTAGAG
lacZ1_genome_F AGTTGCGTGACTACCTAC
lacZ1_genome_R AGACCAGACCGTTCATAC
lacZ2_genome_F CGTCTGAATTTGACCTGAG
lacZ2_genome_R CCGTCGATATTCAGCCATGTG
ung_genome_F CCCTCTTCCGCTTAGTAACTTG
ung_genome_R GAAGTGTTGCGTCGTCAG
RNF2_genome_F CCTGATCACCTCCCAAAGTC
RNF2_genome_R CCTGATCACCTCCCAAAGTC
实施例1、一种在大肠杆菌中实现C突变为A的碱基编辑方法
将胞嘧啶脱氨酶(AID)与nCas9在大肠杆菌中融合表达，在gRNA的引导下可以实现大肠杆菌特定位点胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)到腺嘌呤(A)的定点突变，其中C到T的突变占总突变的40.7％，C到A的突变占总突变的59.3％。
一、试验方法
将含有胞嘧啶脱氨酶(AID)和nCas9融合表达系统的pnCas9_AID质粒分别与含有不同靶向位点的大肠杆菌gRNA质粒导入野生型大肠杆菌MG1655或者野生型大肠杆菌ATCC8739中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序。
pnCas9_AID质粒的图谱如图3所示，其核苷酸序列如序列1所示，其中，第1-4104位为nCas9的编码基因序列，第4405-5028位为胞嘧啶脱氨酶(AID)的编码基因序列，第6609-7268位为氯霉素基因，第8335-6245位复制原点。pnCas9_AID质粒表达由胞嘧啶脱氨酶(AID)与nCas9组成的融合蛋白。
含有不同靶向位点的大肠杆菌gRNA质粒为靶向不同基因dcuA、dcuB、dcuC、dcuD、relA、rpoS、lacZ或靶向同一基因不同位点的gRNA质粒。gRNA质粒的具体靶向位点如表2所示。以靶向lacZ基因第1444-1463位的gRNA质粒为例，其图谱如图4所示，其核苷酸序列如序列2所示，其中，第336-1148位为安普霉素基因，第1421-1440位为靶点序列，第1441-1518位为gRNA序列，第2001-2620位为复制原点。本实施例或下文中的靶向其他位点的大肠杆菌gRNA质粒仅将序列2所示的gRNA质粒中的靶点序列替换为其他基因靶点序列或同一基因的其他靶点序列即可得到。
表2、gRNA质粒的具体靶向位点
Figure BDA0002639751750000131
二、试验结果
在野生型大肠杆菌MG1655和ATCC 8739中利用胞嘧啶脱氨酶(AID)与nCas9融合表达系统分别选择dcuA、dcuB、dcuC、dcuD、relA、rpoS、lacZ等不同基因以及同一基因不同位点进行定点碱基编辑。
编辑结果如表2所示。结果表明：在大肠杆菌MG1655的7个靶位点中，共有51个C变成T，70个C变成A。在大肠杆菌ATCC 8739的6个靶位点中，共有10个C变成T，19个C变成A。其中，C到T的突变占总突变的40.7％(61/150)，C到A的突变占总突变的59.3％(89/150)。以上结果表明：利用胞嘧啶脱氨酶(AID)与nCas9组成的碱基编辑系统不仅可实现胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的碱基替换，还可实现胞嘧啶(C)到腺嘌呤(A)的碱基替换。
实施例2、一种在大肠杆菌中提高C突变为A的碱基编辑效率的方法
为了提高大肠杆菌特定位点胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)的碱基编辑效率，将胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶在大肠杆菌中融合表达，使胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)的碱基编辑效率能达到94.5％。
一、试验方法
将含有胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶融合表达系统的pUNG_nCas9_AID质粒与含有不同靶向位点的大肠杆菌gRNA质粒导入野生型大肠杆菌MG1655中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序。
pUNG_nCas9_AID质粒的图谱如图5所示，其核苷酸序列如序列3所示，其中，第1-687位为尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因序列，第736-4839位为nCas9的编码基因序列，第5140-5781位为胞嘧啶脱氨酶(AID)的编码基因序列，第7344-8003位为氯霉素基因，第6070-6980位复制原点。pUNG_nCas9_AID质粒表达由胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9与尿嘧啶DNA糖苷酶组成的融合蛋白。
含有不同靶向位点的大肠杆菌gRNA质粒为靶向lacZ基因不同位点的gRNA质粒。gRNA质粒的具体靶向位点如表3所示。
表3、gRNA质粒的具体靶向位点
Figure BDA0002639751750000141
二、试验结果
在野生型大肠杆菌MG1655中选择lacZ基因四个位点进行定点碱基编辑，并计算碱基编辑效率{碱基编辑效率＝(发生目标碱基替换的阳性菌株个数/分析的总的阳性菌株的个数)*100％}。
编辑结果如图7所示。结果表明：在野生型大肠杆菌MG1655的4个靶位点中，共有121个C突变为A，5个C突变为T，2个C突变为G。C到A的突变占总突变的94.5％(121/128)。以上结果表明：利用胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶组成的碱基编辑系统可以显著提高C突变为A的碱基编辑效率。
实施例3、一种在哺乳动物细胞中提高C突变为G的碱基编辑效率的方法
文献：Komor,A.C.,Kim,Y.B.,Packer,M.S.,Zuris,J.A.&Liu,D.R.Programmableediting of a target base in genomic DNA without double-stranded DNAcleavage.Nature 533,420-424(2016).中已发现将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)与nCas9在哺乳动物细胞中融合表达可以实现哺乳动物细胞特定位点胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)到鸟嘌呤(G)的碱基替换，其中C到T的突变占总突变的89.6％，C到G的突变占总突变的10.4％。
为了提高哺乳动物细胞特定位点胞嘧啶(C)到鸟嘌呤(G)的碱基编辑效率，将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶在哺乳动物细胞中融合表达，使胞嘧啶(C)到鸟嘌呤(G)特异性碱基编辑效率能到达95.2％。
一、试验方法
将含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白(UGI)融合表达系统的pAPOBEC_nCas9_UGI质粒和含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9和尿嘧啶DNA糖苷酶的融合表达系统的pAPOBEC_nCas9_UNG质粒分别与含有靶向靶位点的哺乳动物细胞gRNA质粒利用Lipofectamine 2000(Life，Invitrogen，11668019)试剂转染到HEK293T或者Hela细胞，转染96小时后提取细胞基因组DNA，对被编辑位点进行PCR检测并测序。每种组合方式每种细胞做两个平行(实验1和实验2)。
pAPOBEC_nCas9_UGI质粒的图谱如图6所示，其核苷酸序列如序列4所示，其中，第1038-1721位为胞嘧啶脱氨酶(APOBEC1)的编码基因序列，第1773-5873位为nCas9的编码基因序列，第5943-6191位为尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白(UGI)的编码基因序列，第7430-8018位为大肠杆菌扩增用的复制子，第8189-9049位为大肠杆菌扩增用的氨苄霉素抗性基因。pAPOBEC_nCas9_UGI质粒表达由胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白(UGI)组成的融合蛋白。
pAPOBEC_nCas9_UNG质粒的图谱如图7所示，其核苷酸序列如序列5所示，其中，第1-663位为尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因序列，第1902-2490位为大肠杆菌扩增用的复制子，第2661-3521位为大肠杆菌扩增用的氨苄霉素抗性基因，第4695-5375位为胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)的编码基因序列，第5430-9530位为nCas9的编码基因序列。pAPOBEC_nCas9_UNG质粒表达由胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9和尿嘧啶DNA糖苷酶组成的融合蛋白。
含有靶向靶位点(靶向RNF2基因第42220-42239位)的哺乳动物细胞gRNA质粒的图谱如图8所示，其核苷酸序列如序列6所示，其中，第322-341位为靶点序列，第342-417位为gRNA序列，第1167-1766位为哺乳动物细胞嘌呤霉素基因，第2453-3041位为大肠杆菌扩增用复制子，第3212-4072位为大肠杆菌扩增用氨苄霉素基因。本实施例或下文中的靶向其他位点的哺乳动物细胞gRNA质粒仅将序列6所示的gRNA质粒中的靶点序列替换为其他基因靶点序列或同一基因的其他靶点序列即可得到。
二、试验结果
在哺乳动物细胞HEK293T或者Hela中选择RNF2基因靶位点进行定点碱基编辑，对靶位点进行PCR并对PCR产物进行深度测序分析，每个PCR产物深度测序reads数超过10万，并按照如下公式计算碱基编辑效率：碱基编辑效率＝(发生目标碱基替换reads数/分析的总reads数)*100％。测序引物序列如下：
RNF2-deep-F1：CGTGTATCACCACGCC；
RNF2-deep-R1：CAATACAAAGATTTTCCTAC；
RNF2-deep-F2：TGAGATGGAGTCTTGCTGTG；
RNF2-deep-R2：CAGGCAGATCACAAGGTCAG。
编辑结果如图9所示。结果表明：在HEK293T细胞中C6位的C到G的碱基编辑效率由10.4％提高到95.2％，在Hela细胞中C6位的C到G的碱基编辑效率由14.8％提高到87.9％。
实施例4、一种在大肠杆菌中实现任意碱基到任意碱基定点突变的碱基编辑方法
将C突变为A的碱基编辑系统、C突变为T的碱基编辑系统以及A突变为G的碱基编辑系统相结合在大肠杆菌中实现A、T、C或者G到任意碱基的突变，如图1所示。
一、试验方法
1、以碱基C出发到任意碱基的突变
将含有胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶融合表达系统的pUNG_nCas9_AID质粒与大肠杆菌gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为TTTCTTTCACAGATGTGGAT，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)导入野生型大肠杆菌MG1655中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序，分别筛选出特定位点由C突变为A的菌株，实现碱基C到碱基A的编辑。
将含有胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9融合表达系统的pnCas9_AID质粒与大肠杆菌gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为TTTCTTTCACAGATGTGGAT，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)导入野生型大肠杆菌MG1655中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序，分别筛选出特定位点由C突变为T的菌株，实现碱基C到碱基T的编辑。
将筛选出的C突变为A的菌株培养并丢失质粒，然后将含有腺嘌呤脱氨酶(TadA)和nCas9融合表达系统的pTadA_nCas9质粒与大肠杆菌gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为TTTATTTCACAGATGTGGAT，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)导入C突变为A的菌株中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由C突变为G的菌株，实现碱基C到碱基G的编辑。
2、以碱基T出发到任意碱基的突变
将含有腺嘌呤脱氨酶(TadA)和nCas9融合表达系统的pTadA_nCas9质粒与大肠杆菌gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为AGGCCAATCCGCGCCGGATG，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)导入野生型大肠杆菌MG1655中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由A突变为G的菌株，实现碱基T到碱基C的编辑。
将筛选出的A突变为G的菌株无抗生素培养丢失质粒，再将含有胞嘧啶脱氨酶(AID)、nCas9以及UNG融合表达系统的pUNG_nCas9_AID质粒与大肠杆菌gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为GATCGGCCTGAACTGCCAGC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)导入A突变为G的菌株中，培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由C突变为A的菌株，实现碱基T到碱基A的编辑。
将筛选出的C突变为A的菌株无抗生素培养丢失质粒，再将含有腺嘌呤脱氨酶(TadA)和nCas9融合表达系统的pTadA_nCas9质粒与大肠杆菌gRNA质粒(gRNA质粒中的靶点序列为GATAGGCCTGAACTGCCAGC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)导入C突变为A的菌株中培养24小时后涂板，随机选择部分菌落对被编辑位点进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由A突变为G的菌株，实现碱基T到碱基G的编辑。
pTadA_nCas9质粒的图谱如图10所示，其核苷酸序列如序列7所示，其中，第3982-4530位为腺嘌呤脱氨酶(TadA)编码基因序列，第4531-8637位为nCas9编码基因序列，第1563-2222位为氯霉素基因，第289-1199位为复制原点。pTadA_nCas9质粒表达由腺嘌呤脱氨酶(TadA)和nCas9组成的融合蛋白。
二、试验结果
在野生型大肠杆菌MG1655中选择lacZ基因两个位点进行任意碱基编辑，并计算碱基编辑效率{碱基编辑效率＝(发生目标碱基替换的阳性菌株个数/分析的总的阳性菌株的个数)*100％}。
编辑结果如图11所示。结果表明：以碱基C出发，碱基C到碱基T的编辑效率为66.7％，碱基C到碱基A的编辑效率为96％，碱基C到碱基G的编辑效率为96％*41.2％＝39.6％。以碱基T(互补碱基为碱基A)出发，碱基T到碱基C的编辑效率为45.8％，碱基T到碱基A的编辑效率为45.8％*95.4％＝43.7％，碱基T到碱基G的编辑效率为45.8％*95.4％*50.2％＝21.9％。
实施例5、一种在哺乳动物细胞中实现任意碱基到任意碱基定点突变的编辑方法
将C突变为G的碱基编辑系统、C突变为T的碱基编辑系统以及A突变为G的碱基编辑系统相结合在哺乳动物细胞中实现A、T、C或者G到任意碱基的突变，如图2所示。
一、试验方法
1、以碱基C出发到任意碱基的突变
将含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶融合表达系统的pAPOBEC_nCas9_UNG质粒与哺乳动物细胞gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为TCCCAAAGTACTGAGATTAC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)转染HEK293T细胞，转染24小时后加入终浓度为5ug/ml的嘌呤霉素(puromycin)，72小时后使用流式细胞仪分选单个细胞，96孔板培养，24小时后提取细胞基因组进行PCR检测并测序，分别筛选出特定位点由C突变为G的细胞，实现碱基C到碱基G的编辑。
将含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9融合表达系统的pAPOBEC_nCas9质粒与哺乳动物细胞gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为TCCCAAAGTACTGAGATTAC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)转染HEK293T细胞，转染24小时后加入终浓度为5ug/ml的嘌呤霉素(puromycin)，72小时后使用流式细胞仪分选单个细胞，96孔板培养，24小时后提取细胞基因组进行PCR检测并测序，分别筛选出特定位点由C突变为T的细胞，实现碱基C到碱基T的编辑。
将含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白(UGI)融合表达系统的pAPOBEC_nCas9_UGI质粒与哺乳动物细胞gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为GTACTTTCGGAGGCCGAGGC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)转染C突变为G的细胞，转染24小时后加入终浓度为5ug/ml的嘌呤霉素(puromycin)，72小时后使用流式细胞仪分选单个细胞，96孔板培养，24小时后提取细胞基因组进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由C突变为T的细胞，实现碱基C到碱基A的编辑。
2、以碱基T出发到任意碱基的突变
将含有腺嘌呤脱氨酶(TadA)和xCas9(3.7)融合表达系统的xcas9(3.7)-ABE(7.10)质粒与哺乳动物细胞gRNA质粒(gRNA质粒中的靶序列为GCTTTAGCGTCTTGAGTAGC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)转染HEK293T细胞，转染24小时后加入终浓度为5ug/mL的嘌呤霉素(puromycin)，72小时后使用流式细胞仪分选单个细胞，96孔板培养，24小时后提取细胞基因组进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由A突变为G的细胞，实现碱基T到碱基C的编辑。
将含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、nCas9以及尿嘧啶DNA糖苷酶融合表达系统的pAPOBEC_nCas9_UNG质粒和哺乳动物细胞gRNA质粒(gRNA质粒中的靶点序列为CGCCAAAGCAGGAGAATCGC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)转染A突变为G的细胞，转染24小时后加入终浓度为5ug/ml的嘌呤霉素(puromycin)，72小时后使用流式细胞仪分选单个细胞，96孔板培养，24小时后提取细胞基因组进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由C突变G的细胞，实现碱基T到碱基G的编辑。
将含有胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)与nCas9融合表达系统的pAPOBEC_nCas9质粒和哺乳动物细胞gRNA质粒(gRNA质粒中的靶点序列为GCTTTCGCGTCTTGAGTAGC，下划线所示的碱基为待编辑的特定位点)转染C突变为G的细胞，转染24小时后加入终浓度为5ug/ml的嘌呤霉素(puromycin)，72小时后使用流式细胞仪分选单个细胞，96孔板培养，24小时后提取细胞基因组进行PCR检测并测序，筛选出特定位点由C突变为T的细胞，实现碱基T到碱基A的编辑。
xcas9(3.7)-ABE(7.10)质粒的图谱如图12所示，其核苷酸序列如序列7所示，其中，第676-1176位为腺嘌呤脱氨酶(TadA)的编码基因序列，第1867-5967位为xCas9(3.7)的编码基因序列，第7544-8404位为氨苄基因，第6785-7373位为复制原点。
二、试验结果
在HEK293T细胞中选择RNF2基因两个位点进行任意碱基编辑，对靶位点进行PCR并对PCR产物进行深度测序分析，每个PCR产物深度测序reads数超过10万，并按照如下公式计算碱基编辑效率：碱基编辑效率＝(发生目标碱基替换reads数/分析的总reads数)*100％。测序引物序列如下：
RNF2-deep-F1：CGTGTATCACCACGCC；
RNF2-deep-R1：CAATACAAAGATTTTCCTAC；
RNF2-deep-F2：TGAGATGGAGTCTTGCTGTG；
RNF2-deep-R2：CAGGCAGATCACAAGGTCAG。
编辑结果如图13所示。结果表明：以碱基C出发，碱基C到碱基T的编辑效率为52.5％，碱基C到碱基G的编辑效率为46.3％，碱基C到碱基A的编辑效率为46.3％*43.5％＝20.1％。以碱基T(互补碱基为碱基A)出发，碱基T到碱基C的编辑效率为48.6％，碱基T到碱基G的编辑效率为48.6％*38.2％＝18.6％，碱基T到碱基A的编辑效率为48.6％*38.2％*50.7％＝9.4％。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>实现C到A以及C到G碱基突变的碱基编辑系统及其应用
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>9027
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
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ttggccttag cgcatatgat taagtttcgt ggtcattttt tgattgaggg agatttaaat 1260
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attaaactac ctaaatatag tctttttgag ttagaaaacg gtcgtaaacg gatgctggct 4380
agtgccggag aattacaaaa aggaaatgag ctggctctgc caagcaaata tgtgaatttt 4440
ttatatttag ctagtcatta tgaaaagttg aagggtagtc cagaagataa cgaacaaaaa 4500
caattgtttg tggagcagca taagcattat ttagatgaga ttattgagca aatcagtgaa 4560
ttttctaagc gtgttatttt agcagatgcc aatttagata aagttcttag tgcatataac 4620
aaacatagag acaaaccaat acgtgaacaa gcagaaaata ttattcattt atttacgttg 4680
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tatacgtcta caaaagaagt tttagatgcc actcttatcc atcaatccat cactggtctt 4800
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ctgaacgtga tggttagcga gcactatcaa tgctgccgta aaatctttat tcagagcagc 5640
cacaaccaac tgaacgagaa ccgttggctg gaaaagaccc tgaaacgtgc ggagaagcgt 5700
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ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctttaatta acgatgataa gctgtcaaac 6060
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cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa 6540
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acaccatcat acactaaatc agtaagttgg cagcatcacc cgacgcactt tgcgccgaat 7140
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ccaactttca ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat 7320
tttcaggagc taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata 7380
tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct 7440
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atttccctaa agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt 7800
tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca 7860
tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc 7920
atgccgtctg tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg 7980
atgagtggca gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg 8040
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gtttgctcag gctctccctt aattaaacta gtcatatggg catgcattta cgttgacacc 8280
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tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa 8460
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gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg 8580
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caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg 8760
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ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg 8940
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attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc 9180
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cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc 9360
gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 9420
gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag cgcgaattga tctggtttga 9480
cagcttatca tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc 9540
tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc 9600
ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat 9660
gagctgttga caattaatca tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 9720
tttcacacag gaaacagacc atggaattca aggagatata cc 9762
<210>4
<211>9185
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
gccaagctaa ttcgagctcg gtacctgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60
attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt 120
gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 180
gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 240
aaggacaatt gcatgaagaa tctgcttagg gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta 300
cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg 360
gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 420
ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 480
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gctccagggc catcaccgag ttcctcagcc gctacccaca cgtcaccctg ttcatctaca 1380
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agaggctccc accacacatc ctgtgggcta ccggcctcaa gtccggcagc gagacgccag 1740
gcacctccga gagcgctacg cctgaactta aggacaagaa gtactcgatc ggcctcgcca 1800
tcgggacgaa ctcagttggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg ccctctaaga 1860
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tcctgttcga cagcggggag accgctgagg ctacgaggct caagagaacc gctaggcgcc 1980
ggtacacgag aaggaagaac aggatctgct acctccaaga gattttctcc aacgagatgg 2040
ccaaggttga cgattcattc ttccaccgcc tggaggagtc tttcctcgtg gaggaggata 2100
agaagcacga gcggcatccc atcttcggca acatcgtgga cgaggttgcc taccacgaga 2160
agtaccctac gatctaccat ctgcggaaga agctcgtgga ctccaccgat aaggcggacc 2220
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agggggatct caacccagac aacagcgatg ttgacaagct gttcatccaa ctcgtgcaga 2340
cctacaacca actcttcgag gagaacccga tcaacgcctc tggcgtggac gcgaaggcta 2400
tcctgtccgc gaggctctcg aagtccagga ggctggagaa cctgatcgct cagctcccag 2460
gcgagaagaa gaacggcctg ttcgggaacc tcatcgctct cagcctgggg ctcaccccga 2520
acttcaagtc gaacttcgat ctcgctgagg acgccaagct gcaactctcc aaggacacct 2580
acgacgatga cctcgataac ctcctggccc agatcggcga tcaatacgcg gacctgttcc 2640
tcgctgccaa gaacctgtcg gacgccatcc tcctgtcaga tatcctccgc gtgaacaccg 2700
agatcacgaa ggctccactc tctgcctcca tgatcaagcg ctacgacgag caccatcagg 2760
atctgaccct cctgaaggcg ctggtccgcc aacagctccc ggagaagtac aaggagattt 2820
tcttcgatca gtcgaagaac ggctacgctg ggtacatcga cggcggggcc tcacaagagg 2880
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cccaccaaat ccatctcggg gagctgcacg ccatcctgag aaggcaagag gacttctacc 3060
ctttcctcaa ggataaccgg gagaagatcg agaagatcct gaccttcaga atcccatact 3120
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tcaagcgccg gagatacacc ggctggggga ggctgtcccg caagctcatc aacggcatcc 3780
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ccgcgatcaa gaagggcatc ctccagaccg tgaaggttgt ggacgagctc gtgaaggtca 4020
tgggccggca caagcctgag aacatcgtca tcgagatggc cagagagaac caaaccacgc 4080
agaaggggca aaagaactct agggagcgca tgaagcgcat cgaggagggc atcaaggagc 4140
tggggtccca aatcctcaag gagcacccag tggagaacac ccaactgcag aacgagaagc 4200
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ccatcgacaa caaggtcctc accaggtcgg acaagaaccg cggcaagtca gataacgttc 4380
catctgagga ggtcgttaag aagatgaaga actactggag gcagctcctg aacgccaagc 4440
tgatcacgca aaggaagttc gacaacctca ccaaggctga gagaggcggg ctctcagagc 4500
tggacaaggc cggcttcatc aagcggcagc tggtcgagac cagacaaatc acgaagcacg 4560
ttgcgcaaat cctcgactct cggatgaaca cgaagtacga tgagaacgac aagctgatca 4620
gggaggttaa ggtgatcacc ctgaagtcta agctcgtctc cgacttcagg aaggatttcc 4680
agttctacaa ggttcgcgag atcaacaact accaccatgc ccatgacgct tacctcaacg 4740
ctgtggtcgg caccgctctg atcaagaagt acccaaagct ggagtccgag ttcgtgtacg 4800
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agatcgtgtg ggacaagggc agggatttcg cgaccgtccg caaggttctc tccatgcccc 5040
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agggcaagtc caagaagctc aagagcgtga aggagctcct ggggatcacc atcatggaga 5280
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agaaggacct gatcatcaag ctcccgaagt actctctctt cgagctggag aacggcagga 5400
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ccgcagcaac caagaaggca gggcaagcaa agaagaagaa gacgcgtgac tccggcggca 5940
gcaccaacct gtccgacatc atcgagaagg agacgggcaa gcaactcgtg atccaggaga 6000
gcatcctcat gctgccagag gaggtggagg aggtcatcgg caacaagcca gagtccgaca 6060
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ctccataaat aatgtgtgag tagtttcccg ataagggaaa ttagggttct tatagggttt 6360
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tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatctcctaa 6480
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ctagttccct cacaccggtg acggggatcg catgcgatat ctcgagatct agcttggcgt 7020
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ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3780
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ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 3900
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 3960
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 4020
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 4080
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 4140
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 4200
ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4260
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 4320
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 4380
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 4440
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 4500
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 4560
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 4620
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccattcgcca ttcaggctgc 4680
gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag cccaagctac 4740
catgataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca ataaaatatc 4800
tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac taacatacgc 4860
tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc ccagtgcaag 4920
tgcaggtgcc agaacatttc tctatcgata 4950
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<400>7
gtgcctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 60
gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 120
aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg 180
acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct 240
ttttgcgttt ctttaattaa cgatgataag ctgtcaaaca tgagaattac aacttatatc 300
gtatggggct gacttcaggt gctacatttg aagagataaa ttgcactgaa atctagaaat 360
attttatctg attaataaga tgatcttctt gagatcgttt tggtctgcgc gtaatctctt 420
gctctgaaaa cgaaaaaacc gccttgcagg gcggtttttc gaaggttctc tgagctacca 480
actctttgaa ccgaggtaac tggcttggag gagcgcagtc accaaaactt gtcctttcag 540
tttagcctta accggcgcat gacttcaaga ctaactcctc taaatcaatt accagtggct 600
gctgccagtg gtgcttttgc atgtctttcc gggttggact caagacgata gttaccggat 660
aaggcgcagc ggtcggactg aacggggggt tcgtgcatac agtccagctt ggagcgaact 720
gcctacccgg aactgagtgt caggcgtgga atgagacaaa cgcggccata acagcggaat 780
gacaccggta aaccgaaagg caggaacagg agagcgcacg agggagccgc cagggggaaa 840
cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccaccac tgatttgagc gtcagatttc 900
gtgatgcttg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacggc tttgccgcgg ccctctcact 960
tccctgttaa gtatcttcct ggcatcttcc aggaaatctc cgccccgttc gtaagccatt 1020
tccgctcgcc gcagtcgaac gaccgagcgt agcgagtcag tgagcgagga agcggaatat 1080
atcctgtatc acatattctg ctgacgcacc ggtgcagcct tttttctcct gccacatgaa 1140
gcacttcact gacaccctca tcagtgccaa catagtaagc cagtatacac tccgctagcg 1200
ctgatgtccg gcggtgcttt tgccgttacg caccaccccg tcagtagctg aacaggaggg 1260
acagctgata gaaacagaag ccactggagc acctcaaaaa caccatcata cactaaatca 1320
gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc 1380
acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact 1440
tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa 1500
taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta 1560
aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag 1620
aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg 1680
atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta 1740
ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt ccgtatggca atgaaagacg 1800
gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg 1860
aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat 1920
attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg 1980
agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg 2040
tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag 2100
gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca tgccgtctgt gatggcttcc 2160
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aagcagtgtg accgtgtgct tctcaaatgc ctgaggccag tttgctcagg ctctccctta 2460
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acctacaatc aattatttga agaaaaccct attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg 5160
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gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc t 8731

Claims (13)

1.一种将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶的编码基因、nCas9核酸酶的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现靶标碱基C突变为A；其中，所述sgRNA靶向靶点序列，所述靶标碱基C位于所述靶点序列；
所述nCas9核酸酶为：将NCBI中Accession Number：Q99ZW2.1所示的化脓链球菌来源的Cas9氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸突变为丙氨酸后得到的突变体；
所述受体生物为大肠杆菌；
所述受体生物细胞为大肠杆菌细胞。
2. 根据权利要求1所述的将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法，其特征在于所述胞嘧啶脱氨酶AID为七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：ABO15149.1所示。
3. 根据权利要求1或2所述的将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法，其特征在于，所述尿嘧啶DNA糖苷酶为人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：CAG46474 .1所示；或将人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG氨基酸序列自N端起第1-84位所示的氨基酸序列删除后得到的氨基酸序列所示的蛋白质，所述人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的氨基酸序列如NCBI中Accession Number：CAG46474.1所示；或酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：CAA86634.1所示；或大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：EGT65982.1所示。
4.根据权利要求3所述的将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法，其特征在于将所述胞嘧啶脱氨酶AID的编码基因、所述nCas9核酸酶的编码基因、所述尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因通过重组质粒A导入受体生物或受体生物细胞中；所述重组质粒A表达由胞嘧啶脱氨酶AID、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖苷酶组成的融合蛋白；所述重组质粒A的核苷酸序列如序列3所示。
5. 根据权利要求1或2所述的将基因组序列中的靶标碱基C突变为A的方法，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655或大肠杆菌ATCC 8739。
6.一种提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：将胞嘧啶脱氨酶的编码基因、nCas9的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，使胞嘧啶脱氨酶的编码基因、nCas9的编码基因、尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因和sgRNA的编码基因均得到表达，实现提高靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率；其中，所述sgRNA靶向靶点序列，所述靶标碱基C位于所述靶点序列；
所述nCas9核酸酶为：将NCBI中Accession Number：Q99ZW2.1所示的化脓链球菌来源的Cas9氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸突变为丙氨酸后得到的突变体；
所述受体生物为哺乳动物；
所述受体生物细胞为哺乳动物细胞；
所述方法为非疾病治疗目的的方法。
7.根据权利要求6所述的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法，其特征在于所述胞嘧啶脱氨酶是胞嘧啶脱氨酶APOBEC。
8. 根据权利要求7中所述的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法，其特征在于所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC为鼠源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：AAH03792.1所示；或人源的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：AKE33285.1所示；或七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：ABO15149.1所示。
9. 根据权利要求6-8中任一项所述的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法，其特征在于：所述尿嘧啶DNA糖苷酶为人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：CAG46474 .1所示；或将人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG氨基酸序列自N端起第1-84位所示的氨基酸序列删除后得到的氨基酸序列所示的蛋白质，所述人源的尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的氨基酸序列如NCBI中Accession Number：CAG46474.1所示；或酵母来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung1，其氨基酸序列如NCBI中AccessionNumber：CAA86634.1所示；或大肠杆菌来源的尿嘧啶DNA糖苷酶ung，其氨基酸序列如NCBI中Accession Number：EGT65982.1所示。
10.根据权利要求9所述的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法，其特征在于将所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC的编码基因、所述nCas9核酸酶的编码基因、所述尿嘧啶DNA糖苷酶的编码基因通过重组质粒C导入受体生物或受体生物细胞中；所述重组质粒C表达由胞嘧啶脱氨酶APOBEC、nCas9核酸酶和尿嘧啶DNA糖苷酶组成的融合蛋白；所述重组质粒C的核苷酸序列如序列5所示。
11.根据权利要求6-8任一项所述的提高将基因组序列中的靶标碱基C突变为G的碱基编辑效率的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞或Hela细胞。
12.一种碱基编辑产品，其特征在于由胞嘧啶脱氨酶、nCas9核酸酶、尿嘧啶DNA糖苷酶和sgRNA相关的生物材料构成，能够用于实现权利要求1-11任一项所述的方法；
所述胞嘧啶脱氨酶是胞嘧啶脱氨酶AID或胞嘧啶脱氨酶APOBEC；
所述nCas9核酸酶为：将NCBI中Accession Number：Q99ZW2.1所示的化脓链球菌来源的Cas9氨基酸序列自N端起第10位所示的天冬氨酸突变为丙氨酸后得到的突变体。
13.一种碱基编辑应用，其特征在于使用权利要求12所述的碱基编辑产品；所述应用为非疾病治疗目的的应用。
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