CN114854723A - 水稻尿嘧啶dna糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用。该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或将SEQ IDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。本发明提供的应用，是将含有所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，高效的创制出植物单碱基多样性，扩大了单碱基编辑器的适用范围。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用。
背景技术
近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑。碱基编辑器，目前包括胞苷碱基编辑器(cytidine base editor，CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)，能够在基因组中进行精确的碱基改变而不诱发DNA双链断裂(DSBs)。植物的许多农艺性状是由一个或几个DNA碱基的变化控制的，因此碱基编辑器是植物分子育种的重要工具。
现有的单碱基编辑器CBE和ABE系统，由大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1(rAPOBEC1)，激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)PmCDA1，或进化的tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA，与Cas9切口酶(Cas9nikase,nCas9)或无核酸酶活性的Cas9(nuclease dead Cas9,dCas9)融合，并通过sgRNA(单链向导RNA)将融合蛋白靶向靶位点，在不切割双链DNA的情况下对靶基因位点的单个碱基进行胞嘧啶C->胸腺嘧啶T或腺嘌呤A->鸟嘌呤G的精准编辑，已被应用于许多植物物种。
单碱基变异(SNP)是植物基因组上最常见的突变类型，与众多农艺性状关联。通过对这些特定SNP进行突变，不仅可实现定向遗传改良，而且可拓展遗传多样性，加快育种进程。碱基编辑器是一种高效单碱基替换工具，主要包括诱导胞嘧啶C->胸腺嘧啶T替换的CBE和诱导腺嘌呤A->鸟嘌呤G替换的ABE。目前，传统的植物基因胞嘧啶单碱基编辑系统，主要是诱导胞嘧啶C->胸腺嘧啶T的单碱基定点替换，而由于胞嘧啶C->鸟嘌呤G或胞嘧啶C->腺嘌呤A定点替换效率很低，同时可替换的碱基类型比较有限，大大限制了单碱基编辑器的适用范围。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用，通过水稻尿嘧啶DNA糖苷酶构建包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体(OsCGBE)，将该表达载体导入植物中，以高效诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，实现高效创制植物的单碱基多样性。
本发明为实现上述目的，提供如下的技术方案：
一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG，是由SEQID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因具有：
A、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
B、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或
C、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
D、与A或B或C的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
另一种所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列为：
由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因，具有：
E、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
F、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由E衍生的核苷酸序列；或
G、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
H、与E或F或G的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其是将含有前述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，以高效的创制出植物单碱基多样性。
本发明提供的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用，其有益效果为：
1、本发明将水稻内源的尿嘧啶DNA糖苷酶(OsUNG)融合在胞嘧啶单碱基编辑器的C端，使胞嘧啶C脱氨后形成的尿嘧啶U被高效脱糖苷，形成无嘌呤/嘧啶位点，在细胞内源修复过程中产生胞嘧啶C->鸟嘌呤G替换或胞嘧啶C->腺嘌呤A替换的突变类型，显著扩大了单碱基编辑器的适用范围。
2、在本发明利用水稻内源的尿嘧啶DNA糖苷酶(OsUNG)构建的胞嘧啶单碱基编辑器(OsCGBE)，产生的胞嘧啶C->鸟嘌呤G或胞嘧啶C->腺嘌呤A替换效率是传统的植物胞嘧啶单碱基编辑器(PCBE4)的20.3倍。在稳定转化的水稻材料中，可以产生高达30.5％的胞嘧啶C->鸟嘌呤G的突变，32.2％胞嘧啶C->胸腺嘧啶T的突变类型，以及3.4％的胞嘧啶C->腺嘌呤A的突变类型，极大的拓展了水稻单碱基编辑可产生的突变类型，对于拓展作物遗传多样性具有重要的意义。
附图说明
图1是本发明实施例使用OsUNG构建的新型胞嘧啶单碱基编辑器示意图；
图2是本发明实施例将避光培养的细胞进行离心，裂解后的编辑结果检测示意图；
图3是本发明实施例对分化再生的水稻植株进行基因型鉴定结果示意图；
图4是本发明实施例通过对所有编辑位点的编辑结果进行高通量测序分析结果示意图；
图5是本发明实施例通过对OsCGBE-N的编辑产物进行高通量测序，发现的多种小片段缺失、插入或重复的突变类型；
图6是本发明实施例在OsIPA1的UTR区域利用OsCGBE-N进行编辑的示意图；
图7是本发明实施例在sgRNA8位点的编辑结果显示示意图。
图8是本发明实施例编辑植株的高通量测序结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的详细技术方案进行说明。
本发明提供的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用，通过水稻尿嘧啶DNA糖苷酶构建包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体(OsCGBE)，将该表达载体导入植物中，以高效诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，实现高效创制植物的单碱基多样性。
实施例1：
参见附图1-8，本发明实施例提供的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因具有：
A、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
B、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由A衍生的核苷酸序列；或
C、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
D、与A或B或C的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其是将含有前述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，以高效的创制出植物单碱基多样性。
本实施例提供的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其具体包括如下步骤：
S1.载体构建：
S11、将OsUNG的基因序列融合在植物胞嘧啶单碱基编辑器的N端或C端，构建新型植物单碱基编辑器OsCGBE；
S12、设计特定的靶点gRNA序列，连接到OsCGBE载体上，由U6或U3启动子启动sgRNA转录；
S13、将连接上gRNA序列的OsCGBE-sgRNA载体对水稻受体细胞进行遗传转化，再生获得基因编辑材料；
本发明使用OsUNG构建的新型胞嘧啶单碱基编辑器如图1所示。
S2.在原生质体中，利用OsCGBE单碱基编辑器进行编辑：
S21、取28℃于MS培养基上生长的12天水稻黄化苗茎段切成0.5mm的薄片，在酶解液(1.5％Cellulase R10；0.75％Macerozyme R10；0.6M Mannitol；10mM MES(pH 5.7))中酶解4小时；
S22、加入酶解液等体积的W5溶液(154mM NaCl；125mM CaCl2；5mM KCl；2mM MES(pH 5.7))，摇晃15s，充分释放原生质体；随后用W5溶液润洗无菌网筛(50μm)，将酶解的原生质体通过网筛，过滤到15mL无菌圆底离心管中；1500rmp离心3分钟，去除上清；并用6mLW5溶液重复本步骤S22的前述内容，重悬一次；
S23、加入MMG溶液(0.6M Mannitol；15mM MgCl2；4mM MES(pH 5.7))，使原生质体浓度达到1-5×106cell/mL。
S24、在2mL圆底管中依次加入5-10μg的OsCGBE质粒，再加入100μL提取
好的水稻原生质体。加入110μL 40％PEG溶液，迅速轻弹混匀；
S25、静置于28℃培养箱中避光反应15min，随后加入500μL W5溶液终止反应。1500rmp离心3分钟，小心弃上清；
S26、加入400μL W5溶液重悬细胞，转移到24孔细胞培养板中，放置在28℃培养箱中避光培养24h。
S27、将避光培养的细胞进行离心，裂解后对编辑结果进行检测。
如图2所示，本研究设计了3个gRNA靶向编辑修复荧光素酶活性，结果显示其在sgRNA2位点的效果最优，为传统的PCBE4的效率的12.6倍。由图2可知，相比于PBJ文章报道的在Cas9的C端融合OsUNG(OsCGBE-C)，本发明将OsUNG融合在N端(OsCGBE-N)的编辑活性更高。OsCGBE-N在原生质体报告系统中的3个位点上的编辑效率效率均明显高于OsCGBE-C，提升效果最高达1.72倍，为传统的PCBE4的20.3倍。在3个内源靶点(OsIPA1-SG4，OsBZIP5-SG5及OsSLR1-SG6)的编辑结果也显示了更高的C-to-G的编辑效率(见表2),编辑效率最高的位点为OsSLR1-SG6(65.1％)。
S3.利用OsCGBE单碱基编辑器编辑水稻内源位点，构建遗传多样性：
S31、将构建好的OsCGBE-sgRNA载体转化农杆菌EHA105菌株；
S32、将转化后的阳性农杆菌单克隆进行扩繁活化，侵染水稻愈伤组织；
S33、在含有50mg/L潮霉素的水稻筛选培养基上进行筛选培养，挑选阳性愈伤进行分化再生；对分化再生的水稻植株进行基因型鉴定。如图3和表1所示，本发明设计了6个gRNA靶向水稻内源的5个基因。由图3可以看出，本发明在水稻稳定转化材料中都获得了极高的胞嘧啶C->鸟嘌呤G的编辑效率，其中在sgRNA8靶点处效率最高，达30.5％。
表1
通过对所有编辑位点的编辑结果进行高通量测序分析，其结果如图4所示，该图显示，相对于传统的植物胞嘧啶单碱基编辑器PCBE4来说，融合了OsUNG的新型胞嘧啶单碱基编辑器的单碱基编辑结果中，单碱基突变的多样性得到了极大的拓展，其中诱导胞嘧啶C->鸟嘌呤G的比例从3.6％提高到45.9％，诱导胞嘧啶C->腺嘌呤A的比例从1.1％提高到7.8％。
参见图5，本发明对OsCGBE-N的编辑产物进行高通量测序，还发现了多种小片段缺失、插入或重复的突变类型(平均占总突变的23.1％)。这类突变类型，可以用于实现基因组靶点处的小片段顺式调控元件的删减和重复，从而改变靶点处顺式调控元件的拷贝数。
参见图6，本发明实施例利用OsCGBE-N在OsSLR1-SG6进行编辑的材料的子代中，我们发现了不同株高的植株。有发生C-to-T编辑产生的植株T1-#53ACC->ATT(Thr->Ile)；C-to-G编辑产生的植株T1-#22ACC->AGG(Thr->Arg)；同时产生C-to-G与C-to-T编辑的突变类型的植株T1-#24ACC->AGT(Thr->Ser)，以及一些小片段缺失插入或重复的突变材料T1-#11(9-bp重复)，T1-#18(4-bp缺失)，T1-#36(12-bp缺失)，充分展示了该基因编辑工具产生遗传多样性的能力。突变体的后代的基因型检测结果显示CGBE-N编辑的材料获得的C-to-G突变的子代更多。该编辑器产生的编辑植株的后代中C-to-G的编辑效率见表2。
表2：后代植株中C-to-G的编辑效率
参见图7，本发明在OsIPA1的UTR区域(靶点OsIPA1-SG4)利用OsCGBE-N进行编辑，实现了该基因UTR区域的小片段重复及删除，这对于基因表达调控的功能元件的研究具有重要的意义。
参见图8，本发明实施例在sgRNA8位点的编辑结果显示，该位点产生了8中不同的氨基酸突变类型，其中突变G628E和G628D表现出抗除草剂表型。这显示了融合OsUNG可以拓展植物胞嘧啶单碱基编辑器的编辑类型，使得一个位点产生多种不同的突变，有利于拓展植物遗传多样性。
实施例2：
本发明实施例提供的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用，其与实施例1基本上相同，其不同之处在于：
所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列为：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因，具有：
E、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
F、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由E衍生的核苷酸序列；或
G、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
H、与E或F或G的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明上述实施例提供的OsCGBE-N相比于(Tian et al.,Plant biotechnologyjournal,2022)文章报道OsCGBE03，不仅提高了后代植株中C-to-G的编辑效率(在OsSLR1-SG6上提升效果最好，达2.8倍)，也首次实现，此前无法实现的精准的小片段重复，对于丰富基因编辑类型具有重要意义。
本发明上述实施例所涉及的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，或在此系列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列，其基因编码的核苷酸序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列具有80％同源性的序列。本发明还提供了包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体(OsCGBE)，以及该载体在水稻单碱基编辑方面的应用。将该表达载体导入植物中，可以高效诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，在高效创制植物单碱基多样性方面具有重要的应用价值。
但以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非用以局限本发明的专利范围，故凡运用本发明中记载的步骤、组分的其他实施例，及所作的等效变化，均包含在本发明的保护范围内。
序列表
SEQ ID No.1 水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG的DNA序列
ATGATCGGCCAGAAAACCCTGTACAGCTTCTTCAGCCCATCTCCTGCCAGAAAGCGGCACGCCCCATCTCCAGAACCTGCTGTTCAAGGCACAGGCGTGGCAGGCGTGCCAGAAGAATCTGGCGACGCTGCTGCCATTCCTGCCAAAAAAGCCCCTGCCGGCCAAGAGGAACCTGGCACACCTCCATCTTCTCCACTGTCTGCCGAGCAGCTGGACCGGATCGAGAGAAACAAAGCCGCCGCTCTGCTGAGACTGGCCGCCAGAAATGTGCCTGTTGGCTTTGGCGAGAGCTGGAAGAAGCACCTGTCTGGCGAGTTCGGCAAGCCCTACTTCATCAAGCTGATGGGCTTCGTGGCCGAGGAACGGAAGCACTACACAGTGTACCCTCCACCTCACCAGGTGTTCACCTGGACACAGATGTGCGACATCAAGGACGTGAAGGTGGTCATCCTCGGACAGGACCCTTATCACGGCCCTAATCAGGCCCACGGCCTGTGCTTTAGCGTGCAAAGACCTGTGCCTCCTCCACCTAGCCTGGAAAACATCTACAAAGAGCTGAGCACCGACATCGAGGACTTCGTGCATCCTGGACACGGCGATCTGTCTGGATGGGCTAAACAGGGCGTGCTGCTGCTGAATGCCGTGCTGACAGTTAGAGCCCACCAGGCCAACAGCCACAAAGAGAGAGGCTGGGAGCAGTTCACCGATGCCGTGGTGTCTTGGCTGAACCAGAACAGCAACGGCCTGGTGTTTCTGCTGTGGGGCAGCTACGCCCAGAAGAAGGGAAGCGCCATCGACCGGAAGAGACACCATGTGCTGCAGACAGCTCATCCATCTCCACTGAGCGTGTACCGGGGCTTCTTCGGCTGTAGACACTTCAGCAAGACCAACGAGCTGCTGCAGAAGTCCGGCAAGAAGCCTATCGACTGGAAAGAGCTGTAG
SEQ ID NO.2 水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG氨基酸序列
MIGQKTLYSFFSPSPARKRHAPSPEPAVQGTGVAGVPEESGDAAAIPAKKAPAGQEEPGTPPSSPLSAEQLDRIERNKAAALLRLAARNVPVGFGESWKKHLSGEFGKPYFIKLMGFVAEERKHYTVYPPPHQVFTWTQMCDIKDVKVVILGQDPYHGPNQAHGLCFSVQRPVPPPPSLENIYKELSTDIEDFVHPGHGDLSGWAKQGVLLLNAVLTVRAHQANSHKERGWEQFTDAVVSWLNQNSNGLVFLLWGSYAQKKGSAIDRKRHHVLQTAHPSPLSVYRGFFGCRHFSKTNELLQKSGKKPIDWKEL*
Claims (7)
1.一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG，是
由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
2.根据权利要求1所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因具有：
A、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
B、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由A衍生的核苷酸序列；或
C、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
D、与A或B或C的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于,所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列为：
由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
4.根据权利要求3所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因，具有：
E、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
F、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由E衍生的核苷酸序列；或
G、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
H、与E或F或G的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
5.一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其是将含有权利要求1-4任一项所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，以高效的创制出植物单碱基多样性。
6.根据权利要求5所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其特征在于，其具体是以含有所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料为对象，使用该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG构建新型胞嘧啶单碱基编辑器编辑水稻内源位点，快速构建出植物遗传多样性,其具体包括如下步骤：
S1.载体构建：
S11.将OsUNG的基因序列融合在植物胞嘧啶单碱基编辑器的N端或C端，构建新型植物单碱基编辑器OsCGBE；
S12.设计特定的靶点gRNA序列，连接到OsCGBE载体上，由U6或U3启动子启动sgRNA转录；
S13.将连接上gRNA序列的OsCGBE-sgRNA载体对水稻受体细胞进行遗传转化，再生获得基因编辑材料；
S2.在原生质体中，利用OsCGBE单碱基编辑器进行编辑：
S21.取28℃于MS培养基上生长的12天水稻黄化苗茎段切成0.5mm的薄片，在酶解液中酶解4小时；
S22.加入酶解液等体积的W5溶液，摇晃15s，充分释放原生质体；随后用W5溶液润洗无菌网筛，将酶解的原生质体通过网筛，过滤到15mL无菌圆底离心管中；1500rmp离心3分钟，去除上清；再用6mL W5溶液，重复本步骤的前述内容一次；
S23.加入MMG溶液，使原生质体浓度达到1-5×106cell/mL；
S24)在2mL圆底管中依次加入5-10μg的OsCGBE质粒，再加入100μL提取好的水稻原生质体，加入110μL 40％PEG溶液，迅速轻弹混匀；
S25)静置于28℃培养箱中避光反应15min，随后加入500μL W5溶液终止反应；1500rmp离心3分钟，小心弃上清；
S26)加入400μL W5溶液重悬细胞，转移到24孔细胞培养板中，放置在28℃培养箱中避光培养24h；
S3.利用OsCGBE单碱基编辑器编辑水稻内源位点，构建遗传多样性：
S31)将构建好的OsCGBE-sgRNA载体转化农杆菌EHA105菌株；
S32)将转化后的阳性农杆菌单克隆进行扩繁活化，侵染水稻愈伤组织；
S33)在含有50mg/L潮霉素的水稻筛选培养基上进行筛选培养，挑选阳性愈伤进行分化再生。
7.根据权利要求5所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其特征在于，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
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