JP2001520504A - 組替え豚痘ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスを提供する。その外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIIIK断片内に挿入されており、また豚痘ウイルス感染宿主細胞中で発現されることができる。本発明は更に、相同性ベクター、ワクチン、および免疫感作方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組替え豚痘ウイルス 本出願は、1995年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/480,640号、1995 年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/488,237号、1995年６月７日に提出 された合衆国特許出願第08/472,679号および1995年１月１９日に提出された合衆 国特許出願第08/375,992号の一部継続出願の一部継続出願である。これら親出願 の内容は、本明細書の一部をなす参照文献として本願に組み込まれる。 本願の中には、括弧内のアラビア数字によって、幾つかの出版物が参照される 。これら文献の完全な書誌的引用は明細書の最後、即ち、請求の範囲の直前に見 られる。これらの文献の開示は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込 まれる。 〔発明の背景〕 豚痘ウイルス（ＳＰＶ）はポックスウイルス族（Poxviridae）に属している。 このグループに属しているウイルスは、宿主細胞中の細胞質中で特徴的に発育す る大型の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＳＰＶは、スイポックスウイルス（Suip oxvirus）属の唯一のメンバーである。ＳＰＶは、幾つかの特徴によって、他の ポリウイルスから区別される。ワクシニア等の他のポックスウイルスが宿主範囲 が広いのに比較して、ＳＰＶは種特異性を示す（１８）。組識培養細胞系にＳＰ Ｖを感染させたものと、他のポックスウイルスを感染させたものとでは劇的に異 なる（２４）。ＳＰＶは、ワクシニア・ウイルスと抗原交叉反応を示さず、また オルソ、レポリ、アヴィ、昆虫ポックスグループとＤＮＡレベルで、検出可能な 総体的相同性を示さない（２４）。従って、従来技術において、他のポックスウ イルスに関して知られ、記載されていることは、豚痘ウイルスの先行技術とはな らない。ＳＰＶは、肌および局部的リンパ節においてのみ検出される病巣を持っ た自己規制感染を特徴とする、唯一穏やかな病原菌である。ＳＰＶの感染は非常 に制限されているけれども、ＳＰＶから回復したブタは、ＳＰＶの感作に対して 免疫性があり、活性免疫が発生したことがわかる（１８）。 本発明は、ワクチン抗原およびブタに対する治療剤のデリバー用ベクターとし てＳＰＶを使用することに関する。この原理は、ＳＰＶの下記特質によって支持 される。ＳＰＶは、ブタにおいて唯一穏やかな病原菌であり、種特異的あり、防 御免疫反応を誘導する。よって、ＳＰＶは、ベクターのワクチンおよび治療的特 質によって与えられるその有益性とバランスさせなくてはならない本質的危険が 少ない、ウイルス性ベクターデリバリーシステムの優れた候補である。 本発明の従来技術としては、バクテリア性プラスミド中でのＤＮＡクローン化 および分析の技術がまずあげられる。利用される技術は、マニアチス等１９８３ 年の大部分およびサンブロック等１９８９年に詳述されている。これらの文献に は、一般的組替えＤＮＡ技法の従来技術の状態が教示されている。 ポックスウイルスの中から５つ（ワクシニア、家禽ポックス、カナリアポック ス、鳩およびアライグマポックス）が、本開示の前に、外来ＤＮＡ配列を含む様 に加工された。ワクシニアウイルスは、外来遺伝子のベクターとして広範に使用 されてきており（２５）、これは合衆国特許4,603,112および4,722,848の主題で ある。同様に、家禽ポックスが外来遺伝子のベクターとして使用されており、こ れは幾つかの特許出願、ＥＰＡ 0 284 416、PCT WO89/03429、およびPCT WO89/1 2684の主題である。アライグマ・ポックス（１０）およびカナリアポックス（３ １）は、狂犬病ウイルス起源の抗原を発現するために使用されてきた。ポックス ウイルス中へ挿入する外来遺伝子挿入物の例としては、スイポックスウイルス属 由来の例は含まれない。このように、豚痘ウイルスを遺伝子工学的に加工する方 法、即ち、どこに挿入するか、又どのようにブタポックス中の発現物を得るかと いう方法は教示されていない。 抗原のデリバリーシステムとして生ウイルスを使用するアイデアは、最初の生 ウイルスワクチンまで立ち戻ると、大変長い歴史を有している。デリバーされた 抗原は、外来性でなく、生ウイルスによってワクチン中に自然に発現されもので あった。外来抗原をデリバーするにウイルスを使用することについては、組替え ワクシニアウイルスの研究によって、現在では容易になってきた。ワクシニアウ イルスはベクターであり、伝染性を引き起こす他の疾患起源の様々な抗原は外来 抗原であり、該ワクチンは遺伝子工学によって作成される。これらの開示によっ てこれらの概念が明らかになる一方、明らかにならなかったのは、何によって最 良のウイルスベクター候補が作られるかというより実践的疑問に対する答えであ った。この質問に答えるにあたっては、ウイルスの病原性の詳細、複製部位、そ れが誘導する免疫反応の種類、ウイルスが外来抗原を発現する可能性、遺伝子工 学の適合性、規制当局によって認可される可能性など、選択にあたっての全ての 因子である。これらの実用上の問題については、先行技術は何等教示していない 。 治療剤をデリバーするためにポックスウイルスを使用することに関わる先行技 術としては、インターロイキン２（１２）をデリバリーするワクシニア・ウイル スの使用があげられる。この場合、インターロイキン２は、ワクシニア・ウイル ス上で弱毒性効果を示したけれども、宿主における治療剤効果は実証されなかっ た。 本発明のウイルス性ベクターによってデリバーされる治療剤は、生物学的分子 すなわち、ブタウイルス複製の副産物でなくてはならない。これによって、治療 剤はまず、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白に限られる。これらの化合物クラスに由来す る治療剤の例として、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（１６）、リボ ソーム（３４）、サプレサーｔＲＮＡｓ（２）、インタフェロンに誘発される二 本鎖ＲＮＡの形があげられ、また、インシュリン等のホルモンから、インターフ ェロンおよびインターロイキン等のリンホカイン、天然麻酔剤までの数多くの蛋 白質治療剤の例があげられる。これらの治療剤の発見およびその構造および作用 の解明によって、ウイルスベクターデリバリーシステムにおけるそれを使用する 技量が容易になることはない。 〔発明の概要〕 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入される外来ＤＮＡ配列を含む組替 え豚痘ウイルスであって、該外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHind I II N断片内に挿入され、またブタウイルスに感染した宿主細胞中で発現すること ができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 本発明は、更に相同性ベクター、ワクチンおよび免疫感作の方法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕図１Ａ−１Ｂ： 特徴的な長いターミナル・リピート(ＴＲ)領域を含むＳＰＶゲノムＤＮA(kasza 株)の詳細な図が示される。酵素Hind IIIが制限マップが示される（２３）。断 片は、サイズの減っていく順番に文字で表示される。ターミナル・リピートのサ イズは、2.1Kbより大きいが、9.7Kbより小さい。図２Ａ−２Ｂ： 相同性ベクター515-85.1起源のＤＮＡ配列が示される。相同性ベクター515-85.1 の二つの領域の配列が示される。第一の領域（図２Ａ）（配列認識番号１）は、 ５９９塩基対配列にわたり、ユニークなＡｃｃＩ部位が図３Ａ−３Ｃに示したよ うに、側面に置（フランク）かれる。１１５のアミノ酸のＯＲＦの始めと終わり は、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸の翻訳MetとＶａｌによって示されている。第二 領域(図２Ｂ)(配列認識番号３)は、図３Ａ―３Ｃに示すように、特徴的なHIind III部位の上流８９９塩基対にわたる。２２０アミノ酸ＯＲＦの始めと終わりは 、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸の翻訳ＡｓｐとＩｌｅによって示される。図３Ａ−３Ｃ： 515-85.1 ORFと、ワクシニア・ウイルス０１ＬＯＲＦの間の相同関係を示す。 図３Ａには、二つのマップが示されている。図３Ａの第一のラインは、ＳＰＶHi nd IIIM断片の制限マップであり、第二のラインは、プラスミド515-85.1中のＤ ＮＡ挿入物の制限マップである。515-85.1[VV 01L様]ORFの位置もまた、該マッ プ中に示されている。図３Ｂおよび３Ｃに示されたＤＮＡ配列の位置は、図３Ａ では地図の下に太棒で示されている。図３Ｂは、その夫々のＮ末端におけるＶＶ ０１ＬＯＲＦ(配列認識番号５)と515-85.1ORF(配列認識番号６)の間にある相同 関係を示す。図３Ｃは、その夫々のＣ末端におけるＶＶ０１ＬＯＲＦ(配列認識 番号７)と515-85.1ORF(配列認識番号８)の間にある相同関係を示す。４Ａ−４Ｄ 相同性ベクター520-17.5におけるＤＮＡ挿入物が記載されている。図４Ａは、 プラスミド520-17.5に会合するＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を 示す表が含まれている。図４Ｂには、断片の間にある連結部ＡおよびＢの各々 に位置する配列が示される。図４Ｃには、連結部ＣおよびＤ(配列認識番号９、 １０、１３および１６)に位置する配列が示される。図４Ｂおよび４Ｃには更に 、各断片を生成する制限部位が記載されているのみならず断片を繋ぎ合せるため に使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。合成リン カー配列には、太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子をコードしている配 列の位置、調整要素もまた提示されている。下記二つの取り決めが使用された。 括弧( )中の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に 破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイル ス(ＳＰＶ)、初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター（ＬＰ２）、ラク トースオペロンＺ遺伝子（lac Ｚ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。図５Ａ−５Ｄ 相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。 図５Ａには、プラスミド538-46.16に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および 各断片の起源を示す表が含まれている。図５Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢ に位置する配列が示される。図５Ｃには、連結部Ｃに位置する配列が示され、お よび図５Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号１７、１８、 ２１、２６および２８）が示される。図５Ｂから５Ｄには、各断片を生成するた めに使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リン カー配列が、各連結部について記載されている。該合成リインカー配列には、太 棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もま た与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸 を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示して いる。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイル ス（ＰＲＶ），ｇ５０（ｇＤ）、糖蛋白 ６３（ｇ６３），初期プロモーター（ ＥＰ１）、後期プロモーター１（ＬＰ１）（配列認識番号４６）、後期プロモー ター２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）、および大腸菌(E．co li)．図 ６ 組替えＳＰＶに感染した細胞の溶融物の、ＰＲＶに対する抗血清によるウエスタ ンブロット。レーン（Ａ）未感染ベロ細胞溶融物、（Ｂ）Ｓ−ＰＲＶ−０００ （擬狂犬病ウイルスＳ６２／２６）に感染した細胞の溶融物、（Ｃ）既染色分子 量マーカー、（Ｄ）未感染ＥＭＳＫ細胞溶融物、（Ｅ）Ｓ−ＳＰＶ−０００に感 染した細胞の溶融物、（Ｆ）Ｓ−ＳＰＶ−００３に感染した細胞の溶融物、（Ｇ ）Ｓ−ＳＰＶ−００８に感染した細胞の溶融物。細胞溶融物は、”感染細胞溶融 物の調製”に記載されたように調製された。全溶融物サンプルの約１／５を、各 レーンに搭載した。図 ７： ＮＤＶ血球凝集素ノイラミダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（ＨＮ）(配列認識番号２ ９)。ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクーロンの１９０７塩基対の配列が示される。Ｈ Ｎ遺伝子の翻訳開始停止は、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸翻訳によって示される。図８Ａ−８Ｄ 相同性ベクター538-46.26におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図 ５Ａには、プラスミド538-46.26に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各 断片の起源を示す表が含まれている。図８Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに 位置する配列が示される。図８Ｃには、連結部ＣおよびＤに位置する配列が示さ れ、および図８Ｄには、連結部Ｅに位置する配列（配列認識番号３１、３２、３ ４、３７および４０）が示される。図８Ｂおよび８Ｄには、各断片を生成するた めに使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リン カー配列が、各連結部について記載されている。該合成リインカー配列には、太 棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もま た与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸 を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示して いる。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、ニューカッスル 病ウイルス（ＮＤＶ），血球凝結素ノイラミダーゼ（ＨＮ）、初期プロモーター （ＥＰ１）、後期プロモーター１（ＬＰ１）、後期プロモーター２（ＬＰ２）、 ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）、および大腸菌（E．coli）。図９Ａ−９Ｃ 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１０および相同性ベクター561-36.26におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図９Ａには、プラスミド561-36.26に会合 したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図 ９Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図９Ｃには、 連結部ＣおよびＤに位置する配列(配列認識番号４７、４８、４９、５０)が示さ れる。図９Ｂおよび９Ｃには、各断片を生成するために使用される制限部位のみ ならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部につい で記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与え られている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し 、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。 下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（E．coli）、 チミンキナーゼ（ＴＫ）、ボックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），塩基対（ ＢＰ）図１０Ａ−１０Ｄ 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１１および相同性ベクター570-91.21におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図10Aには、プラスミド570-91.21に会合し たＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図10 Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図10Cには、連 結部Ｃに位置する配列がおよび図１０Ｄには、連結部１０Ｄおよび１０Ｅに位置 する配列（配列認識番号５１、５２、５３、５４、５５）が示される。 図１０Ｂから１０Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみなら ず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記 載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられ ている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角 括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記 の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス 合成初期プロモータ２（ＥＰ２）（配列認識番号４５），ｇＩＩＩ（ｇＣ）、塩 基対（ＢＰ）図１１Ａ−１１Ｄ 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１２および相同性ベクター570-91.41におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図11Aには、プラスミド570-91.41に会合し たＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図11 Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図11Cには、連 結部Ｃに位置する配列がおよび図11Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（ 配列認識番号５６、５７、５８、５９、６０）が示される。 図１１Ｂから１１Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみなら ず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記 載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられ ている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角 括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記 の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス 合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）（配列認識番号４３） ，ｇＩＩＩ（ｇＣ）、塩基対（ＢＰ）。図１２Ａ−１２Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ 挿入物が詳細に記載されている。図12Aには、プラスミド570-91.64に会合したＤ ＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図12Ｂに は、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図12Cには、連結部 Ｃに位置する配列が、および図１２Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列( 配列認識番号６１、６２、６３、６４、６５)が示される。１２Ｂから１２Ｄに は、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するた めに使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つか の遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取 り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は 、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されてい る：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E．coli ）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモーター ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）(配列認識番号４４)，ｇＩＩＩ（ｇＣ）、 塩基 対（ＢＰ）。図１３Ａ−１３Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１４および同ベクター599-65.25におけるＤＮＡ 挿入物が詳細に記載されている。図13Aには、プラスミド599-65.25に会合したＤ ＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図13Ｂに は、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図13Cには、連結部 Ｃに位置する配列が、および図13Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列(配 列認識番号６６、６７、６８、６９、７０)が示される。１３Ｂから１３Ｄには 、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するため に使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの 遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り 決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、 構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている ：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、伝染性咽喉気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（E ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成初期プロモ ータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、糖蛋白Ｇ（ｇＧ）、ポリメラーゼチ ェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図１４Ａ−１４Ｄ 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１６および同ベクター624-20.1CにおけるＤＮＡ 挿入物が詳細に記載されている。図14Aには、プラスミド624-20.1Cに会合したＤ ＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図14Ｂに は、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図14Cには、連結部 Ｃに位置する配列が、および図14Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列(配 列認識番号71.、72、73，74および75)が示される。１４Ｂから１４Ｄには、各断 片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用 される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子 コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが 使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の 最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている： 豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、伝染性咽喉気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（E．c oli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモー タ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｉ（ｇＩ）、ポリメラーゼチェ イン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図１５Ａ−１５Ｄ 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１７および相同性ベクター614-83.18におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図15Aには、プラスミド614--83.18に会合 したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図 15Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図15Cには、 連結部Ｃに位置する配列が、および図15Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配 列が示される。１５Ｂから１５Ｄには、各断片を生成するために使用される制限 部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結 部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も また与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ 酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示し ている。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、伝染性ウシ鼻 気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、大腸菌（E．coli）、ボックス合成後期プロモータ １（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２ ）、糖蛋白Ｇ（ｇＧ）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ） 。図１６ 組替えＳＰＶに感染した細胞の溶融物のポリクローナル・ゴート抗ＰＲＶｇ III （ｇＣ）によるウエスタンブロット。レーン（Ａ）Ｓ−ＰＲＶ−００２（合衆国 特許第4,877,737，1989年10月31日提出）に感染した細胞の溶融物、（Ｂ）既染 色分子量マーカー、（Ｃ）偽感染ＥＭＳＫ細胞溶融物、（Ｄ）Ｓ−ＳＰＶ−００ ３に感染した細胞の溶融物、 （Ｅ）Ｓ−ＳＰＶ−００８に感染した細胞の溶融 物、（Ｆ）Ｓ−ＳＰＶ−０１１感染した細胞の溶融物、（Ｇ）Ｓ−ＳＰＶ−０１ ２に感染した細胞の溶融物、（Ｈ）Ｓ−ＳＰＶ−０１３に感染した細胞の溶融物 。細胞溶融物は、”感染細胞溶融物の調製”に記載されたように調製された。全 溶融物サンプルの約１／５を、各レーンに搭載した。図１７： 5.6キロ塩基対Ｈ ind III M豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片を示すマップ。オ ープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）は、各オープンリーデイングフレームに おけるアミノ酸コードの数と共に示される。豚痘ウイルスのＯＲＦｓは、ワクシ ニアウイルスＯＲＦｓと著しい配列の同一性を示し、ワクシニアウイルスの命名 法(５６および５８)によってラベルされている。Ｉ４ＬＯＲＦ(配列認識番号１ ９６)は、リボヌクレオチド・リダクターゼの大型ユニット（５７）とアミノ酸 配列相同性を示し、また０１ＬＯＲＦ（配列認識番号１９３）は、ある真核生物 の翻訳調節蛋白（１３）に特徴的なロイシン・ジッパー・モチーフに対するアミ ノ酸配列相同性を示す。Ｉ４ＬＯＲＦ中のＢｇｌ II部位および０１ＬＯＲＦ中 のＡｃｃＩ部位は、ブタポックスゲノムの非必須領域中への外来ＤＮＡの挿入部 位である。相同性ベクター738-94.4は、ヌクレオチド１６７９から２４５２(配 列番号１８９)のＳＰＶ ＤＮＡの欠損を含む。底部の黒棒は、ＤＮＡ配列が既知 である領域を示し、配列番号１８９および１９５を示す。制限部位ＡｃｃＩ，Ｂ ｇｌ II，およびHind IIIの位置が示されている。Ｉ３ＬＯＲＦ（配列認識番号 １９０）、Ｉ２ＬＯＲＦ(配列認識番号１９１)、Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（配列認識番 号１９４）が示される。配列認識番号２２１は、Hind III M断片の完全な５７８ ５塩基対配列を含んでいる。ＳＰＶ HindIII M断片内のオープンリーデイングフ レームは、部分的なＩ４ＬＯＲＦ（４４５ＡＡ；ヌクレオチド２から１３３６） ；Ｉ３ＬＯＲＦ（２７５ＡＡ；ヌクレオチド１３８７から２２１１）；Ｉ２ＬＯ ＲＦ（７５ＡＡ：ヌクレオチド２２１５から２４３９）；Ｉ１ＬＯＲＦ（３１３ ＡＡ；ヌクレオチド２４４３から３３８１）；０１ＬＯＲＦ（６７７ＡＡ；ヌク レオチド３５２０から５５５０）；部分的Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（６４ＡＡ；ヌクレ オチド５７８７−５５９６）。図１８Ａ−１８Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３４および相同性ベクター723-59A9.22における ＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図18Aには、プラスミド723-59A9.22に会 合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。 図18Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図18Cには、 連結部Ｃに位置する配列が、および図18Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配 列が示される。１８Ｂから１８Ｄには、各断片を生成するために使用される制限 部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結 部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も また与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ 酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示し ている。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、馬インフルエ ンザウイルス（ＥＩＶ）．大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１ （ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２） 、ノイラミダーゼ（ＮＡ）、プラハ（ＰＲ），ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣ Ｒ）、塩基対（ＢＰ）。図１９Ａ−１９Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図19Aには、プラスミド727-54.60に会合し たＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図19 Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図19Cには、連結 部Ｃに位置する配列が、および図19Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が 示される。１９Ｂから１９Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位 のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部に ついて記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた 与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を 示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示してい る。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ ）、大腸菌（E．coli）、ボックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス 合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｂ（ｇＢ）、 塩基対（ＢＰ）。図２０Ａ−２０Ｄ： には、豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１および相同性ベクター727-67.18におけ るＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図20Aには、プラスミド727-67.18 に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれてい る。図20Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図20Cに は、連結部Ｃに位置する配列が、および図20Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置す る配列が示される。20Ｂから20Ｄには、各断片を生成するために使用される制限 部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結 部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も また与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ 酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示し ている。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（E．c oli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成初期プロモー タ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、抗原（Ａｇ）塩基対（ＢＰ）。図２１Ａ−２１Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３３および相同性ベクター732−18.4におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図21Aには、プラスミド732-18.4に会合し たＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図２ １Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図２１Ｃには、 連結部Ｃに位置する配列が、および図２１Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する 配列が示される。２１Ｂから２１Ｄには、各断片を生成するために使用される制 限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連 結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置 もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミ ノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示 している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（E ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモ ータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、馬インフルエンザウイルス（ＥＩＶ ），ノイラミダーゼ（ＮＡ），アラスカ（ＡＫ）ポリメラーゼチェイン反応（Ｐ ＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２２Ａ−２２Ｃ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３６および相同性ベクター741-80.3におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図22Aには、プラスミド741-80.3に会合し たＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図22 Ｂには、断片間の連結部Ａ，BおよびＣに位置する配列が示され、図22Cには、連 結部Ｄ，Ｅ，およびＦに位置する配列が示される。22Ｂおよび22Ｃには、各断片 を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用さ れる合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コ ード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使 用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最 中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウ イルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）．大腸菌（E．coli）、ヒトサ イトメガロウイルス即時初期（ＨＣＭＶＩＥ）、ポックス合成後期プロモータ１ （ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２） 、ポリアデニレーション部位、塩基対（ＢＰ）。図２３Ａ−２３Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３５および相同性ベクター741-84.14おけるＤＮ Ａ挿入物が詳細に記載されている。図23Aには、プラスミド741-84.14に会合した ＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図23Ｂ には、断片間の連結部Ａ,およびＢにおける配列が示され、図23Cには、連結部Ｃ に位置する配列が示され、また図23Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が 示される。23Ｂから23Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみ ならず、該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部につ いて記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与 えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示 し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している 。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ ＰＲＶ）．大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポ ックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、インターロイ キン−２（ＩＬ−２）、糖蛋白Ｘ（ｇＸ）ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ） 、配列（ｓｅｑ）、塩基対（ＢＰ）。図２４Ａ−２４Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３８および相同性ベクター744-34.おけるＤＮＡ 挿入物が詳細に記載されている。図２４Ａには、プラスミド744-34に会合したＤ ＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図２４Ｂ には、断片間の連結部Ａ,およびＢにおける配列が示され、図２４Ｃには、連結 部Ｃに位置する配列が示され、また図２４Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する 配列が示される。２４Ｂおよび２４Ｄには、各断片を生成するために使用される 制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各 連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位 置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、ア ミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を 示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、馬ヘルペ スウイルス・タイプ１（ＥＨＶ−１）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期 プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（Ｌ Ｐ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｂ（ｇＢ）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基 対（ＢＰ）。図２５Ａ−２５Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３９および相同性ベクター744-38におけるＤＮＡ 挿入物が詳細に記載されている。図２５Ａには、プラスミド744-38に会合したＤ ＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図２５Ｂ には、断片間の連結部Ａ,およびＢにおける配列が示され、図２５Ｃには、連結 部Ｃに位置する配列が示され、また図２５Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する 配列が示される。２５Ｂから２５Ｄには、各断片を生成するために使用される制 限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連 結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置 もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、ア ミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を 示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、馬ヘルペ スウイルス・タイプ１（ＥＨＶ−１）、大腸菌（E．coli）、 ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期 プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｄ（ｇＤ），ポリメラーゼチェイン反応 （ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２６Ａ−２６Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-O7A1におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図には751-O7A1に会合したＤＮＡ断片の配向が示される 。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示 されている。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結 合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている 。図２６Ａから２６Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号１９７)、（配列認 識番号１９８）Ｃ（配列認識番号１９９）、Ｄ(配列認識番号２００)およびＥ( 配列認識番号２０１)に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される 。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記 二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の 制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使 用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、チキン・インターフェロン（ｃＩＦＮ ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス 合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイ ン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２７Ａ−２７Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿 入物の詳細な記載。図にはプラスミド751-56A1に会合したＤＮＡ断片の配向が示 される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配 列も示されている。図２７Ａから２７Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号2 02)、（配列認識番号203)Ｃ（配列認識番号204）、Ｄ(配列認識番号205)および Ｅ(配列認識番号206)に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される 。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず幾つかの遺伝子コード 領域を結合するために使用される合成リンカー配列、および調節要素もまた与え られている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ 酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示し ている。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、チキン・骨髄 単球性成長ファクター（ｃＭＧＦ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プ ロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ Ｅ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２８Ａ−２８Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ 挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド752-22.1に会合したＤＮＡ断片の配向が 示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する 配列も示されている。図２８Ａから２８Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番 号207)、（配列認識番号208）Ｃ（配列認識番号209）、およびＤ(配列認識番号2 10)位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成する ために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リ ンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域お よび調節要素もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。( )内 の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された 部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（Ｌ Ｐ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２９Ａ−２９Ｂ： 図２９Ａ：ＳＰＶ Ｈｉｎｄ III N断片およびＳＰＶ Ｈｉｎｄ III Ｍ断片の 一部における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレ ーム。豚痘ウイルスHind III NおよびHind III MゲノムＤＮＡの非必須部位への 外来遺伝子の挿入物には、EcoR V部位(S-SPV-060)、SnaBI部位(S-SPV-061)、Hin d III N(S-SPV-062)におけるBgl II部位、Hind III M(S-SPV−047)におけるBglI I部位がある。Ｉ７ＬＯＲＦ(配列認識番号２３０)およびＩ４ＬＯＲＦ（配列認 識番号２３１）への外来遺伝子の挿入物によって、全オープンリーデングフレー ムは、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適 である事が示唆される。外来遺伝子のその他の挿入部位に は、二つのHind III部位およびAvaIおよびBamHIがあるがこれに限定されない。 図２９Ｂ：ＳＰＶ Ｈｉｎｄ III Ｋ断片における制限エンドヌークレアーゼマッ プおよびオープンリーデイングフレーム。豚痘ウイルスHind III ＫゲノムＤＮ Ａの非必須部位に挿入された外来遺伝子の挿入物には、EcoR I部位（S-SPV-059 ）があるがこれには限定されない。ＳＰＶ Hind III Ｋ断片の3.2kB領域内では 、３つのオープンリーデイングフレームが確認されている。Ｂ１８ＲＯＲＦ(配 列認識番号２２８)への外来遺伝子の挿入によって、全オープンリーデングフレ ームは、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最 適である事が示唆される。また、Ｂ４ＲＯＲＦ（配列認識番号２２９）が外来遺 伝子の挿入部位として確認された。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ワクシニアウイル ス（ＶＶ）Ｂ１８ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ラビット 繊維腫ウイルス（ＲＦＶ）の77.2kd蛋白よりも相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲ Ｆは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ４ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ４Ｒ ＯＲＦは、ラビット繊維腫ウイルス（ＲＦＶ）のＴ５蛋白とより相同性である。 確認されたオープンリーデイングフレームは、ＳＰＶＨｉｎｄ III K断片の約３ ２００塩基対の内にある。ＳＰＶ Hind III K断片の残りの約３５００塩基対は 、先にシークエンスされている（R．F．Massung et al．Virology 197，511-528 (1993)）。図30Ａ−30C: 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤ ＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド779-94.31に会合したＤＮＡ断片の 配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位 置する配列も示されている。図30Ａから30Ｃには、断片間の連結部Ａ(配列認識 番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)およ びＥ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示され る。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するた めに使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つか の遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取 り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は 、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用され ている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、 ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合 成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。図３１Ａ−３１Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.7に会合したＤＮＡ断片の配向 が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置す る配列も示されている。図３１Ａ−３１Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番 号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（ 配列認識番号：）およびＦ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に 位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみなら ず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記 載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられ ている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角 括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記 の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸 菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポッ クス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。図３２Ａ−３２Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.27に会合したＤＮＡ断片の配 向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置 する配列も示されている。図３２Ａ−３２Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識 番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ （配列認識番号：），Ｆ（配列認識番号：）およびＧ（配列認識番号：）に位置 する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使 用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配 列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節 要素 の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数字は 、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残 片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂 犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロ モータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。図３３Ａ−３３Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.47に会合したＤＮＡ断片の配 向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置 する配列も示されている。図３３Ａ−３３Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識 番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ （配列認識番号：），Ｆ（配列認識番号：）およびＧ（配列認識番号：）に位置 する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使 用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配 列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節 要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。()内の数 字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位 の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、 擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成初期プロモータ１後期 プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩 基対（ＢＰ）。図３４Ａ−３４E: 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５５および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.73に会合したＤＮＡ断片の配 向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置 する配列も示されている。図３４Ａ−３４Ｅは、断片間の連結部Ａ(配列認識番 号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（ 配列認識番号：），Ｆ（配列認識番号：）、Ｇ（配列認識番号：）およびＨ（配 列 認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片 を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用さ れる合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コ ード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使 用される。()内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最 中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウ イルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成後 期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモー タ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ １）、塩基対（ＢＰ）。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組 み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮ ＡのHindIII Ｋ断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で 発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 一態様において、この組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの 前記HindIII Ｎ断片における略２ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内に挿入された前 記外来ＤＮＡを含んでいる。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウ イルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片における略２ＫｂのHindIII〜BamHI亜断片 内のオープンリーディングフレーム内に挿入される。他の態様において、該オー プンリーディングフレームはＩ７Ｌ遺伝子をコードする。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に 挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤ ＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるSnaBI制限エンドヌクレアー ゼ部位内に挿入される。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記 HindIII N断片における略1.2ＫｂのBamHI〜HindIII亜断片内に挿入される。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindII I N断片の略1.2ｋＢのBamHI〜HindIII亜断片内のオープンリーディングフレーム 中に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、Ｉ４Ｌ遺伝子をコ ードするオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の熊様において、前 記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記略1.2ｋＢのBamHI〜Hind III亜断片内のBglII制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される。 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組 み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮ ＡのHindIII M断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で 発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 一態様において、この組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの 前記HindIII M断片における略２ＫｂのBglII〜HindIII亜断片内に挿入された前 記外来ＤＮＡ配列を有する。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウ イルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片の略２ＫｂのBglII〜HindIII亜断片内 のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、該オープ ンリーディングフレームは、Ｏ１Ｌ遺伝子をコードする。好ましい態様において 、前記外来遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ｋＢのBglII〜HindIII亜 断片内におけるBglII制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。 他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ の前記HindIII Ｍ断片における略3.6ｋＢの大きい方のHindIII〜BglII亜断片内 に挿入される。他の態様において、前記外来配列は、略3.6ｋＢの大きい方のHin dIII〜BglII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態 様において、このオープンリーディングフレームは、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードする 。 一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、前記HindIII Ｍ断片の非必須の オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に挿入される。ＯＲＦの例には、Ｉ ４Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｏ１ＬおよびＥ１０Ｌが含まれるが、これらに限定されるもので はない。 他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスの外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイ ルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断 片内に挿入される。好ましい態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイル スゲノムＤＮＡの前記略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断片内に位置するBglII部位 内に挿入される。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前 記HindIII M断片における大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に挿入される。好 ましい態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記 大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に位置するAccI部位内に挿入される。 他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、更に、豚痘ウイルスチミジ ンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に挿入された外来ＤＮ Ａ配列を具備する。一つの態様において、この外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルス チミジンキナーゼをコードしているオープンリーディングフレーム内に位置した ＮｄｅＩ部位中に挿入される。 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組 み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮ ＡのHindIII Ｋ断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で 発現することができる組み換え豚痘ウイルスと提供する。 一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前 記HindIII K断片における略3.2Ｋｂの亜断片内に挿入される。他の態様において 、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII K断片にお ける略3.2Ｋｂの亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他 の態様において、該オープンリーディングフレームはＢ１８Ｒ遺伝子をコードす る。他の態様において、該オープンリーディングフレームはＢ４Ｒ遺伝子をコー ドする。 本発明の目的において、「複製できる組み換え豚痘ウイルス」とは、当業者に 周知の組み換え法、例えば、＜材料および方法＞の項の組み換えＳＰＶを作成す るための相同組み換え法に記載した方法によって作成され、組み換え豚痘ウイル スの複製に不可欠の遺伝子物質を欠失されていない生の豚痘ウイルスである。 本発明の目的において、「豚痘ウイルスの複製に不可欠でない挿入部位」とは 、 ＤＮＡの配列がウイルスの複製のために必要とされない豚痘ウイルスゲノムにお ける位置、例えば、複合タンパク結合配列、逆転写酵素または必須糖タンパクを コードする配列、パッケージングに必要なＤＮＡ配列等である。 本発明の目的において、「プロモータ」とは、外来ＲＮＡポリメラーゼが付着 し、そこで外来ＲＮＡの複製が開始されるＤＮＡ分子上の特定のＤＮＡ配列であ る。 本発明の目的において、「オープンリーディングフレーム」とは、ＲＮＡに転 写されてアミノ酸配列に翻訳されるコドンを含み、且つ終始コドンを含まないＤ ＮＡ切片である。 加えて、本発明は、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物中で複製でき る組み換え豚痘ウイルス（ＳＰＶ）であって、豚痘ウイルスＤＮＡと、前記組み 換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来存在しないＲＮＡをコードする外来 ＤＮＡとを具備し、該外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスの複製に不可欠ではない部位 で豚痘ウイルスＤＮＡ中に挿入されており、且つプロモータの制御下にある組み 換え豚痘ウイルスを提供する。 本発明は更に、ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列または外来ＲＮＡを 提供する。好ましくは、このポリペプチドは動物において抗原性である。好まし くは、この抗原性ポリペプチドは、10個を越えるアミノ酸がペプチド結合によっ て結合された線形ポリマーであり、動物を刺激して抗体を産生させる。 本発明は更に、検出マーカーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含 んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。好ましくは、この検出マー カーはポリペプチドである大腸菌βガラクトシダーゼまたは大腸菌βグルクロニ ダーゼである。好ましくは、大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡ の挿入部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片内に位置するAccI制限エン ドヌクレアーゼである。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ −００３（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335）と称するものである。このＳ−ＳＰＶ− ００３豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダ ペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335の下に、アメリカ合衆国郵便番 号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託され ている。 本発明の目的において、「検出マーカーであるポリペプチド」には、ポリペプ チドの形の二量体、三量体および四量体が含まれる。大腸菌βガラクトシダーゼ は、四つのポリペプチドまた亜はモノマーサブユニットで構成される四両体であ る。 本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイル ス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇ Ｂ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ III（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐ ＲＶ）糖タンパクＨ、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＥ、遺伝性胃腸 炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク 、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、サー プリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシ・ウイ ルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ） 赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、もしくは豚ｆｌｕノ イラミニダーゼである抗原性ポリペプチド、またはこれらに山来する抗原性ポリ ペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイルスを提供する。好 ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク ５０（ｇＤ）である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、ニューキャッスル 病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼである。 本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイル ス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイ ルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのよ うな検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができ る。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来Ｄ ＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルス ＤＮＡのHindIII Ｍ断片内のAccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウ イルスは、Ｓ−ＳＰＶ−００８（ＡＴＣＣ受付番号2339）と称するものである。 このＳ−ＳＰＶ−００８豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339の下に、アメ リカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ123 01に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託 施設に寄託されている。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）をコードする 外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換 え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする 外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶ Ｃおよび大腸菌 βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲ ノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片内のAccI部位で ある。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ−Ｓ ＰＶ−０１２、またはＳ−ＳＰＶ−０１３と命名されたものである。Ｓ−ＳＰＶ −０１３と命名された豚痘ウイルスは、1993年６月16日に、特許手続き上の微生 物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ 2418の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パーク ローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 特許カルチャー寄託施設に寄託された。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外 来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え 豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外 来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）お よび大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘 ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片内の AccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０１５ （ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ 2466）と命名されたものである。このＳ−ＳＰＶ−０ １５豚痘ウイルスは、1994年７月22日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2466の下に、アメ リカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ123 01に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー 寄託施設に寄託された。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）および仮性狂犬 病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製 可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大 腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むよう に、更に加工することができる。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、 豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片 内のAccI部位である。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）および仮性狂犬 病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可 能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸 菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように 、更に加工することができる。ＰＲＸ７ｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ） および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚 痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片内 のAccI部位である 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＣ）および仮性狂犬 病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可 能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸 菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように 、更に加工することができる。ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ） および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚 痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片内 のAccI部位である 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウ イルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ （ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを 提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸菌βガラクトシダーゼのよう な検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる 。 ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ）およ び大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウ イルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII Ｍ断片内のAc cI部位である 本発明は更に、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素-ノイラ ミニダーゼをコードするＲＮＡをコードする外来ＤＮＡを含み、更に検出マーカ ーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む、複製可能な組み換え豚痘 ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−００９（ＡＴＣ Ｃ受付番号ＶＲ 2344）と命名されたものである。 このＳ−ＳＰＶ−００９豚 痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条 約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2344の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852 メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されている。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性ウシ鼻腔 気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイル スに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する 。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タン パクＥおよび糖タンパクＧである。本発明の好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０１ ７およびＳ−ＳＰＶ−０１９と称する組み換え豚痘ウイルスである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性咽頭気管 炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに 感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。こ のような抗原性ポリペプチドの例は、感染性咽頭気管支炎ウイルス糖タンパクＧ および糖タンパクＩである。本発明の好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０１４およ びＳ−ＳＰＶ−０１６と称する組み換え豚痘ウイルスである。 上記組み換え豚痘ウイルスの一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列はサイ トカインである。他の態様において、該サイトカインはニワトリ骨髄単球増殖因 子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）である。サイトカ インには下記のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：即ち、形 質転換増殖因子ベータ、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増 殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体拮抗剤、イン ターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン ５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インタ ーロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン １１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンジオジェニン、ケモ カイネス(chemokines)、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ・コロニー 刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、ｃ ーｋｉｔリガンド、白血球阻害因子、オンコスタチンＭ(oncostatin M)、プライ オトロピン(μｌeiotrophin)、分泌性は血球プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子、 腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体である。これらのサイトカイン類はヒ ト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタまたは鳥類に由来するものである。このよう な組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ− ０４３である。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原体由来 の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子 中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 サイトカイン類を発現する組み換えＳＰＶは、単独で、もしくは疾病を起こす 微生物のサイトカイン類または抗原遺伝子を含むワクチンと組み合わせて、免疫 応答性を高めるために用いられる。 ヒトヘルペスウイルスから誘導されるヒト病原体の抗原性ポリペプチドには、 Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面およびコア抗 原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単 純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイ ルス、水痘帯状庖疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウ イルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス(Hanta anvirus)、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器シンシ チアウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、狂犬病ウイルス、 ムンプスウイルス、マラリア(Plasmodium falciparum)、百日咳菌、ジフテリア 菌、発疹チフスリケッチア、ボレリア・ベルフドルフェリ(Borrelia berfdorfer i)、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原が含まれるが、こられに限定されるもので はない。 本発明の一態様において、組み換え豚痘ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスコアタ ンパクをコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる。好ましくは、このような組み 換えウイルスはＳ−ＳＰＶ−０３１と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚 痘ウイルスに感染した宿主子において免疫を刺激することができるサイトカイン をコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができ る組み換え豚痘ウイルスを提供する。 本発明の一つの態様において、組み換え豚痘ウイルスは、ヒト・インターロイ キン−２をコードする外来ＤＮＡ配列を含む。好ましくは、このような組み換え ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０３５と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体から 誘導された抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染し た宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルスまたはウマ ヘルペスウイルスから誘導することができる。一態様において、この抗原性ポリ ペプチドは、ウマインフルエンザ・ノイラミニダーゼまたは赤血球凝集素である 。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク ５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイ ラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミ ニ ダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー９２ノイラミニダー ゼ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖タンパクＢ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖 タンパクＤ、ストレプトコッカス・エクイ(Streptocoddus equi)、ウマ感染性貧 血ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ウマ・ライノウイルス、およびウマ・ロタウイ ルスである。このような組み換え豚痘ウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ− ０３３、Ｓ−ＳＰＶ−０３４、Ｓ−ＳＰＶ−０３８、Ｓ−ＳＰＶ−０３９および Ｓ−ＳＰＶ−０４１と命名されたものである。 更に、本発明は抗原性ポリペプチドを提供する。該抗原性ポリペプチドには豚 コレラウイルスｇＥ１、豚コレラウイルスｇＥ２、豚インフルエンザウイルス赤 血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク、仮性狂犬病ウ イルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、並びにＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７からなる群から 誘導される組み換え豚痘ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではな い。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器シン シチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスから誘導された抗原性 ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現す ることができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 例えば、上記の抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、 ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウマ病原体、ウマインフルエンザウイルス、齲 歯呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシ チアウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核 キャプシドタンパク（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型 融合タンパクおよびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラ ミニダーゼから誘導することができる。好ましい態様において、この組み換え豚 痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０４５と命名されたものである。 ウシ呼吸器シンシチアウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来Ｄ ＮＡを含む組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰ Ｖ−０２９、およびＳ−ＳＰＶ−０３０と命名されたものである。また、ウシ・ パラインフルエンザウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ を含む組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２８と命名されたも のである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ・ウイルス 性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク４８または糖タンパク５３をコードし、 また前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現 することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ま しい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ−ＳＰＶ−０４０、Ｓ−ＳＰＶ−０４９、 およびＳ−ＳＰＶ−０５０と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢症ウイ ルスから誘導される抗原性ポリペプチドをコードし、また前記外来ＤＮＡ配列は 、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え 豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢症ウ イルスポリタンパクおよびＶＰ２である。このようなウイルスの好ましい態様は 、Ｓ−ＳＰＶ−０２６、およびＳ−ＳＰＶ−０２７と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が抗原性ポリペプチ ドをコードする組み換え豚痘ウイルスを提供する。該抗原性ポリペプチドには下 記のものが含まれるが、これらに限定されることはない：即ち、ＭＤＶ ｇＡ、 ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ Ｄ、ＮＤＶ ＨＮ、ＮＤＶ Ｆ、ＩＬＴ ｇＢ、ＩＬＴ ｇＩ、ＩＬＴ ｇＤ、ＩＢＤＶ ＶＰ２、ＩＢＤＶ ＶＰ３、ＩＢＤＶ ＶＰ ４、ＩＢＤＶポリタンパク、ＩＢＶスパイク、ＩＢＶマトリックス、鳥類脳脊髄 炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類ロタウイルス、 ニワトリ貧血ウイルス、サルモネラｓｐｐ．、大腸菌、パスツレラｓｐｐ．、百 日咳菌ｓｐｐ．(Bordetella spp.)、エイメリアｓｐｐ．(Eimeria spp.)、ヒス トモナスｓｓｐ．、トリコモナスｓｓｐ．、家禽線虫、条虫、吸虫、鳥類ダニ／ シラミ、鳥類原生動物である。 本発明は更に、前記挿入された外来ＤＮＡ配列がプロモータの制御下にある組 み換え豚痘ウイルスを提供する。一態様において、該プロモータは豚痘ウイルス プロモータである。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、内因性の上流豚 痘ウイルスプロモータの制御下にある。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列 は、異種上流プロモータの制御下にある。 本発明の目的において、前記プロモータには、合成豚痘ウイルスプロモータ、 ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２、初期プロモー タ２、ボックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌ プロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩＩＬプロモータ、ポックス Ｅ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初 期、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、ＩＬＴ ｇＢ、ＢＨＶ−1.1 ＶＰ８およびＩＬＴ ｇＤが含まれるが、これらに限定されるものではない。 別のプロモータは、当業者に周知の方法、例えば、材料と方法の項における「合 成ポックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法」に記載した方法に よって作成される。 本発明は、豚痘ウイルスのゲノムＤＮＡ中に外来ＤＮＡを挿入することにより 組み換え豚痘ウイルスを製造するための、相同性ベクターを提供する。 この相同性ベクターは、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来 的に存在しない実質的に二本鎖の外来ＤＮ（ＲＮＡ）配列からなる二本鎖ＤＮＡ 分子を具備し、該外来二本鎖ＤＮＡの一端には、豚痘ウイルスの複製に不可欠で ないゲノムＤＮＡの一方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性であ る二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有し、前記外来ＤＮＡの他端には、前記豚痘ウイ ルスゲノムの他方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本 鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有する。好ましくは、前記ＲＮＡはポリペプチドをコー ドする。 本発明の他の熊様において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡ は、HindIII Ｍ断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。他の対応 において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、略２ｋＢのHind III〜BglII亜断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好まし い態様において、前記二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、このHindIII〜BglII亜断片 の中に位置したBglII部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。 他の態様において、この二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方のHindIII〜B glII亜断片に含まれたオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡ に対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方 のHindIII〜BglII亜断片に位置したAccI制限エンドヌクレアーゼ部位内に存在す るゲノムＤＮＡに対して相同性である。 好ましい態様において、当該相同性ベクターは、752-29.33、751-07.A1、751- 56.A1、751-22.1、746-94.1、767-67.3、738-94.4、および771-55.11と命名され たものである。 一つの態様において、前記ポリペプチドは検出マーカーである。好ましくは、 検出マーカであるポリペプチドは、大腸菌βガラクトシダーゼである。 一つの態様において、前記ポリペプチドは動物において抗原性である。好まし くは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０ （ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、遺伝性 胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタン パク、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、 サープリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシ・ ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５およびｇ４８、ニューキャッスル病ウ イルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、も しくは豚ｆｌｕノイラミニダーゼ、またはこれらに由来する。好ましくは、該抗 原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）で ある。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、セルプリナ・ヒオディセンテリエ (Serpulina Hyodysenteriae)、口蹄疫ウイルス、豚これらウイルスｇＥ１および ｇＥ２、豚インフルエンザウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラズ マ・ハイポニュモニエ、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダ ーゼおよびマトリックスおよび核タンパク、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７、および Ｂ型肝炎ウイルス核タンパク、またはこれらから誘導されたものである。 本発明の一つの態様において、相同性ベクター中の二本鎖外来ＤＮＡ配列は、 ヒト病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。 例えば、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒト・ヘルペスウイルス、単純 ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイル ス、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイ ルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全 ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウ イルスからなる群から誘導される。更に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、 プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)、ボルデテリア・ペ ルトゥスシス（Bordetelia pertussis）および悪性腫瘍からなる群から選択され る、マラリアまたは悪性腫瘍に関連していてもよい。 本発明の一態様において、前記相同性ベクターにおける二本鎖外来ＤＮＡ配列 は、ヒト免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードする。一つの態 様において、このサイトカインは、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）また はニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である。例えば、該サイトカインは インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、イン ターフェロン、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、およびインターロ イキン受容体であることができるが、これに限定されるものではない。 本発明の一態様において、相同性ベクターにおける前記二本鎖外来ＤＮＡ配列 は、ウマ病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。 ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルスまたはウ マ・ヘルペスウイルスから誘導することができる。このような抗原性ポリペプチ ドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ 、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・ インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフル エンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイ ルス１型糖タンパクＢ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤからな る群から選択される組み換え豚痘ウイルスである。 本発明の一態様において、前記相同性ベクターの二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ウ シ呼吸器シンシチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスをコード する。 例えば、該抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ 呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチ アウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キ ャプシドタンパク（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融 合タンパク、およびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラ ミニダーゼから誘導される。 本発明の一態様において、前記相同性ベクターの前記二本鎖外来ＤＮＡ配列は 、感染性嚢症ウイルスから誘導される。このような抗原性ポリペプチドの例は、 感染性嚢症ウイルスポリペプチドおよび感染性嚢症ウイルスＶＰ２、ＶＰ３また はＶＰ４である。 本発明の目的において、「相同性ベクター」とは、豚痘ウイルスゲノムの特定 の部位に外来ＤＮＡを挿入するために構築されたプラスミドである。 本発明の一つの態様において、上記で述べた相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイ ルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレー ム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘 ウイルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフ レーム中に位置するNdeI制限エンドヌクレアーゼ内に存在するゲノムＤＮＡに対 して相同性である。 本発明は更に、上記の相同性ベクターであって、その外来ＤＮＡ配列が、前記 外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの制御下にある相同性ベクターを提 供する。該プロモータは、内因性豚痘ウイルスプロモータまたは外因性プロモー タであることができる。プロモータには、合成ポックスウイルスプロモータ、ポ ックス合成後期プロモータ１、ボックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２ 、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ボックスＩ３Ｌプロ モータ、ボックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１Ｌプロモータおよびポックス Ｅ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１・アルファ４、ＨＣＮ４Ｖ即時 型初期、ＢＨＶ−１．１ ＶＰ８、感染性咽頭気管炎ウイルス糖タンパクＢ、感 染性 咽頭気管炎ウイルスｇＤ、マレック病ウイルス糖タンパクＡ、マレック病ウイル ス糖タンパクＢ、マレック病ウイルス糖タンパクＤが含まれるが、これらに限定 されるものではない。 本発明は、Ｓ−ＳＰＶ−０４４、Ｓ−ＳＰＸ７−０４６、Ｓ−ＳＰＶ−０４７ 、Ｓ−ＳＰＶ−０４８、Ｓ−ＳＰＶ−０５２、Ｓ−ＳＰＶ−０５１、Ｓ−ＳＰＶ −０５３、Ｓ−ＳＰＶ−０５４、Ｓ−ＳＰＶ−０５５、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ −ＳＰＶ−０５７、Ｓ−ＳＰＶ−０５８、Ｓ−ＳＰＶ−０５９、Ｓ−ＳＰＶ−０ ６０、Ｓ−ＳＰＶ−０６１、Ｓ−ＳＰＶ−０６２と命名された組み換え豚痘ウイ ルスを提供する。 本発明は更に、有効免疫量の本発明の組み換え豚痘ウイルスと、適切なキャリ アとを含有するワクチンを提供する。 豚痘ウイルスのための適切なキャリアは当該技術において周知であり、タンパ ク、糖などが含まれる。このような適切なキャリアの一例は、安定化された加水 分解タンパク、ラクトース等のような１以上の安定家財を含有する、生理学的に バランスされた培養培地である。 本発明の目的において、「有効免疫量」の本発明の組み換え豚痘ウイルスは、 １０³〜１０⁹ＰＦＵ／投与量の範囲である。 本発明はまた、動物を免疫化する方法であって、該動物がヒト、豚、牛、ウマ ヤギ(caprine)またはヒツジ(ovine)である方法を提供する。本発明の目的におい て、この方法には、疾患を生じるウイルス（類）に対して動物を免疫化すること が含まれ、これらウイルス（類）には、仮性狂犬病ういるす、遺伝性胃腸炎（Ｔ ＧＥ）ウイルス、豚ロタウイルス、豚パルボウイルス、サープリナ・ヒドジセン テリエ(Serpulina hydodysenteriae)、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイル ス、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、豚インフルエンザウイルス、ＰＲ ＲＳ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型 、口蹄病ウイルス、豚コレラウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラ ズマ・ハイポニュモニエが含まれる。本発明の目的において、この免疫化方法に はまた、ヒト病原体、ウシ病原体、ウマ病原体、鳥類病原体に対して動物を免疫 化することが含まれる。 この方法には、動物に対して、有効免疫投与量の本発明のワクチンを投与する ことが含まれる。このワクチンは、当業者に周知の何れかの方法、例えば筋肉内 注射、皮下注射、副空内注射または静脈内注射によって投与すればよい。或いは 、このワクチンは、鼻腔内または経口的に投与してもよい。 本発明はまた、豚が本発明のワクチン、特に組み換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ −００８（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339）を含有する実施例で予防接種されている かどうか、または天然に存在する野生型の仮性狂犬病ウイルスに感染しているか どうかを決定するために、豚を試験する方法を提供する。この方法は、試験すべ き豚から適切な体液のサンプルを取得することと、該サンプル中において仮性狂 犬病ウイルスに対する抗体の存在を検出する（このような抗体が存在しないこと によって、前記豚が予防接種も感染もされていないことが示される）ことと、仮 性狂犬病ウイルスに対する抗体が存在する豚について、前記サンプル中において 、天然に存在する仮性狂犬病ウイルスに感染した豚の体液中には通常存在するが 、予防接種された豚には存在しない仮性狂犬病ウイルス抗原に対する抗体が存在 していないことを検出することにより、該豚が予防接種されていることまたは感 染していないことが示されることとを具備する。 本発明は、外来ＤＮＡ配列または遺伝子と共に挿入されると、診断試験として 用い得る組み換えＳＰＶを提供する。一つの態様においては、ＦＩＶｅｎｖおよ びｇａｇ遺伝子類、並びにＤ．イミティス(immitis)ｐ３９および２２ｋｄが、 ＦＩＶによって起こされたネコ免疫不全を検出し、またＤ．イミティスによって 起こされたイヌ糸状虫を検出するための診断試験に用いられる。 本発明はまた、複製できる組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主細胞を提供す る。一つの実施例において、宿主細胞は哺乳類細胞である。好ましくは、この哺 乳類細胞はベロ細胞(Vero cell)である。好ましくは、前記哺乳類細胞はＥＳＫ −４細胞、ＰＫ−１５細胞またはＥＭＳＫ細胞である。 本発明の目的において、「宿主細胞」とは、ベクターおよびその挿入物を増殖 させるために用いられる細胞である。害細胞の感染は、当業者に周知の方法、例 えば、＜材料と方法＞の項における「感染−トランスフェクション法」に記載し た方法によって達成された。 上記の組み換え豚痘ウイルスを構築し、選択し、精製するための方法は、下記 の＜材料と方法＞の項で詳述する。 〔実験の詳細〕 ＜材料と方法＞ 豚痘ウィルスストック試料の調製 豚痘ウィルス(SPV)試料はイスコーブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modif ied Dulbecco's Mediunl)(IMDM)と２mMのグルタミン，100units/mlのペニシリン ，100units/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地の1:1混合溶液中(これ らの構成成分はシグマ社もしくは相当の供給元から得られ，そしてこれ以後EMSK 陰性培地(negative medium)と呼ぶ)でブタ胎児腎臓(EMSK)細胞，ESK-4細胞，PK- 15細胞もしくはベロ細胞を，0.01PFU/細胞の感染多重度で感染させることにより 調製された．感染に先立ち，細胞単層は微量のウシ胎児血清を除去するためEMSK 陰性培地を用いて１回洗浄された．その後，最初の接種原(10cmのプレートに対 しては0.5ml；T175cmのフラスコに対しては10ml)に含まれるSPVは，30分間ごと に繰り返し拡散させつつ(redistributed),２時間細胞単層中へ吸収させられた． この期間の後，最初の接種原は規定の(recommended)容量まで完全EMSK培地(5%の ウシ胎児血清を加えたEMSK陰性培地)を加えられた．プレートは細胞変性の効果 が完全となるまで，5% CO₂中37℃でインキュベートされた．培地と細胞は回収さ れ，50mlのスクリューキャプ付き円錐管(conical screw cap tube)中で-70℃で 凍結された．37℃で解凍されるとすぐに，ウイルスストックは1.0mlバイアルに 分注され，-70℃にて再凍結された．力価は通常約106PFU/mlであった． SPV DNA の調製 豚痘ウィルスDNAを単離するために，T175cm2フラスコ中の集密的EMSK細胞単 層は多重度0.1で感染させられ，細胞が100%細胞変性の効果を示すまで４から６ 時間インキュベートされた．感染細胞はその後，培地中に細胞をこすり落とされ ，臨床的な遠心分離(clinical centrifuge)にて300rpmで５分間遠心分離するこ とにより回収された．培地は別の容器に移され，細胞ペレットはリン酸 緩衝溶液1.0ml(PBS:水比中に1.5gのリン酸二ナトリウム，0.2gのリン酸二水素カ リウム，0.8gの塩化ナトリウム及び0.2gの塩化カリウムを含む)(T175あたり)中 で穏やかに再懸濁され，連続２回の凍結−解凍処理(-70℃から37℃まで)を受け た．最後の解凍の際，細胞(氷上で)は30秒間２回の超音波処理を施され，１回目 と２回目の間には45秒間の冷却時間をおいた．その後，細胞の残骸はHB4ロータ ーで4℃下，3000rpm，５分間の遠心分離(ソーヴァルRC-5B超高速遠心機)(Sorval l RC-5B superspeed centrifuge)により取り除かれた．上清中に存在するSPVウ ィルス粒子(virions)は，その後SS34ローター(ソーヴァル)(Sorvall)で４℃下， 15,000rpm，20分間の遠心分離によりペレット化され，10mMのトリス(pH7.5)中に 再懸濁された．その後，この画分は36%ショ糖の密度勾配(10mMトリスpH7.5中で のw/v)中へ層状化され，SW41ローター(ベックマン)で４℃下，18,000rpm，60分 間遠心分離(ベックマンL8-70M超遠心機)(Beckman L8-70M ultracentrifuge)され た．ウィルス粒子ペレットは10mMのトリス緩衝溶液pH7.5中に再懸濁され，氷上 で30秒間超音波処理を施された．この画分は20%から50%の連続的ショ糖密度勾配 (continuous sucrose gradient)で層状化され，SW41ローターで4℃下，16,000rp m，60分間遠心分離された．その勾配の下方約４分の３に位置するSPVウィルス粒 子のバンドが回収され，20%シヨ糖溶液で希釈され，SW41ローターで４℃下，18, 000rpm，60分間の遠心分離によりペレット化された．生成されたペレットは，そ の後微量のショ糖を除去するために10mMのトリス緩衝溶液pH7.5を用いて１回洗 浄され，最終的に10mMのトリス緩衝溶液pH7.5中で再懸濁された．その後，EDTA ，SDS及びプロテイナーゼＫをそれぞれ20mM，0.5％及び0.5mg/mlの最終濃度にな るように添加して誘導された溶解(lysis)(60℃，４時間）により精製されたウィ ルス粒子から，SPV DNAが抽出された．消化(digestion)の後，フェノール：クロ ロホルム(1:1)抽出が３回実施され，２倍量の100%エタノールの添加と-20℃，30 分間のインキュベートにより試料は沈殿させられた．その後，試料はエッペンド ルフミニフュージ(eppendorf minifuge)にて５分間，最高速度(full speed)で遠 心分離された．上清は他の容器に移され，ペレットは風乾され，4℃にて1mM EDT Aを含む0.01Mのトリス緩衝溶液pH7.5中で再水和された．感染細胞溶解物(infected cell lysates)の調製 細胞溶解物の調製用に，血清を含まない培地が用いられた．25cm2フラスコ または60mmペトリ皿中で集密的細胞単層(SPVに対しEMSK，ESK-4，PK-15またはVe ro，またはPRVに対してVERO)は100μｌのウィルス試料で感染させられた．細胞 変性の効果が完全となった後，培地と細胞は回収され，細胞は3000rpm，５分間 の臨床的な遠心分離(clinical centrifuge)でペレット化された．細胞ペレット は250μｌの破壊緩衝液(disruption buffer)(2%のドデシル硫酸ナトリウム，2% のβ-メルカプトエタノール)中に再懸濁された．試料は氷上で30秒間の超音波処 理を施され，-20℃で保存された． ウェスタンブロッティング法 細胞溶解物試料と標準タンパク質はラエムンリ（Laemnli）(1970)の方法に 従ってポリアクリルアミドゲル上で泳動された．ゲル電気泳動後，タンパク質は 変性され，サムブルックら(Sambrook et al.)(1982)の方法に従って処理された ．１次抗体はトリスナトリウム塩化物及びアジ化ナトリウム(TSA:水比中に6.61g のトリス塩酸，0.97gのトリス塩基，9.0gの塩化ナトリウム及び2.0gのアジ化ナ トリウムを含む)中にて5%の無脂肪乾燥ミルクで1:100の割合に希釈されたブタ抗 PRV血清(Shope strain;lot370，PDV8201，NVSL，Ames，IA)であった．２次抗体 はTSAで1:1000の割合に希釈されたヤギ抗ブタアルカリ性フォスファターゼ抱合 体(goat anti-swine alkaline phosphatase conjugate)であった． 分子生物学的手法 制限エンドヌクレアーゼを用いた消化，ゲル電気泳動，ゲルからのDNAの抽 出，ライゲーション，キナーゼを用いたリン酸化，ホスファターゼを用いた処理 ，細菌培養の成長，DNAを用いた細菌の形質転換法などを含む，細菌とDNAの操作 に関する技術及びその他の分子生物学的方法はマニアティスら(Maniatis et al. )(1982)及びサムブルックら（Sambrook et al.）(1989)により示されている．例 外として，これらの方法には若干の修正が加えられた． DNA シークエンシング シークエンシングはUSBシークエナーゼキット(USB Sequenase Kit)と35S-dA TP(NEN)を用いて行われた．圧縮された領域(areas of compression)を解 明するためdGTP混合物とdITP混合物の両方を用いる反応が実行された．あるいは ，圧縮された領域(compressed areas)はフォルムアミドゲルで解析された．テン プレートにはダブルストランドのプラスミドサブクローンもしくはシングルスト ランドM13サブクローンを用い，プライマーはシークエンスされるべき挿入断片 のずぐ外側のベクターに対して，あるいは以前に得られた配列に対して作成され た．得られた配列は編集され，ドナスターソフトウエアー(Dnastar software)を 用いて比較された．得られた配列の取り扱いや比較はコラルソフトウェア(Coral Software)のスーパークローンTM(SupercloneTM)とスーパーシーTMプログラム(S uperseeTM programs)を用いて行れた． 複製連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)を用いたクローニング 種々のDNAの繰作に都合のよい制限（酵素）部位を導入するために複製連鎖 反応(Polymerase Chain Reaction)(PCR)が用いられた．用いられた方法はインニ スら(Innis，et al．)(1990)により示されている．一般に，増幅された断片はサ イズ的には500塩基対より小さく，増幅された断片の臨界領域(critical region) はDNAシークエンシングにより確かめられる．それぞれの場合において用いられ たプライマーは，以下に示す相同性ベクターの構築についての記述で詳しく述べ られている． 組み換えSPV生成のための相同的組み換え法(Homologous Recombination Prode cure) この方法は，豚痘ウィルスDNAとトランスフェクションされたプラスミド相 同性ベクターの両方を含む組織培養細胞中に生じた，豚痘ウィルスDNAとプラス ミド相同性ベクターDNA間の相同的組み換えに依拠する．相同的組み換えを生じ させるために，EMSK細胞単層はこれらの細胞中へのSPVの複製(すなわちDNA合成) を誘導するべく，感染多重度 0.01 PFU/細胞でS-SPV-001(カスザSPV株，17)(Ka sza SPV strain，17)に感染させられる．その後，プラスミド相同性ベクターDNA は感染−トランスフェクション法(Infection‐Transfected Procedure)に従い， これらの細胞にトランスフェクションされる．本方法で用いた相同性ベクターの 構築は以下に示される． 感染−トランスフェクション法 EMSK細胞の６cmプレート(集密度約80%)はEMSK陰性培地中にて感染多重度0.0 1PFU/細胞でS-SPV-001に感染させられ，CO₂濃度5%の加湿された環境下で37℃に て５時間インキュベートされた．用いられたトランスフェクション法は基本的に はリポフェクチンTM試薬(LipofectinTM Reagent)(BRL)の使用説明書に示された 方法である．簡単に説明すると，６cmプレートのそれぞれにつき，15μgのプラ スミドDNAが水で100μｌまで希釈された．これとは別に50μgのリポフェクチン 試薬が水で100μｌまで希釈された．その後，ポリスチレン製の５mlのスナップ キャップ付き試験管中の希釈されたプラスミドDNAに，希釈されたリポフェクチ ン試薬100μｌが滴下的に加えられ，穏やかに混合された．その後，混合物は室 温にて15から20分間インキュベートされた．この間に，ウィルスの接種原は６cm プレートから除去され，細胞単層はEMSK陰性培地を用いて１回洗浄された．その 後，3mlのEMSK陰性培地がプラスミドDNA/リポフェクチン混合物に加えられ，そ の内容物は細胞単層上にピペットで移された．細胞は一晩(約16時間)，CO₂濃度5 %の加湿された環境下で37℃にてインキュベートされた．翌日，3mlのEMSK陰性培 地は取り除かれ，5mlのEMSK完全培地に置き換えられた．細胞はウィルスによる 細胞変性の効果が80%から100%になるまで，CO₂濃度5%下37℃で３日間から７日間 インキュベートされた．ウィルスはウィルスストックの調製で上記したようにし て回収された．このストックはトランスフェクションストック(transfection st ock)と呼ばれ，引き続いて組み換え豚痘ウイルス検出用のブルオガルスクリーン (Bluogal Screen)もしくは組み換え豚痘ウィルス検出用CPRGスクリーン(CPRGScr een)により，組み換えウィルスの検出がなされた． β−ガラクトシダーゼを発現している組み換えSPVの検出(Screen) （ブルオガル(Bluogal)及びCPRG分析） 組み換えウィルスに大腸菌(E．coli)のβ−ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカ ー遺伝子が組み込まれた場合，組み換え体を含んでいるプラークは，２つの簡単 な方法のうちのどちらか１つによって視覚化された．１番目の方法では，プラー ク分析の間ブルオガル(BluogalTM)試薬(ベテスダ研究所)(Bethesda Research La bs)がアガロース上層(agarose overlay)に組み込まれ(200μg/ml)，β−ガラク トシダーゼ活性を発現しているプラークは青になる．青いプラークはその後， 新しい細胞(EMSK)上に選び取られ，青いプラークのさらなる単離により精製され た．２番目の方法では，プラーク分析の間CPRG(ベーリンガー マンハイム)(Boe hringer Mannheim)がアガロース上層(agarose overlay)に組み込まれ(400μg/ml )，β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているプラークは赤になる．赤いプラー クはその後，新しい細胞(EMSK)上に選び取られ，赤いプラークのさらなる単離に より精製された．どちらの場合においてもウィルスは，典型的には，３回のプラ ーク精製で精製された． ブラックプラーク分析(Black Plaque Assays)を用いた 組み換えSPV中における外来遺伝子発現の検出(screen) 組み換え豚痘ウィルスにより発現した外来抗原の発現を分析するために，EM SK細胞単層は組み換えSPVで感染させられ，アガロース栄養培地に重層され(over layed)，プラーク成長(plaque development)が生じるまで37℃で６日間から７日 間インキュベートされた．その後，アガロース上層(overlay)はペトリ皿から除 かれ，細胞は100%メタノールによりで室温で10分間固定され，風乾された．細胞 の固定により表面抗原と同様に細胞質抗原も検出されるようになるが，未固定の 細胞を用いることにより特異的な表面抗原の発現が検出可能である．その後，１ 次抗体はPBSを用いて適当な希釈倍率まで希釈され，細胞単層上に室温で２時間 インキュベートされた．S-SPV-008由来のPRV g50(gD)の発現を検出するために， ブタ抗PRV血清(ショープ株;ロット370，PDV8201，NVSL，エームズ，IA)(shope s train;lot370，PDV8201，NVSL，Ames，IA)が用いられた(1:100希釈)．S-SPV-009 由来のNDV HNの発現を検出するために，HNタンパク質に特異的なウサギ抗血清(r abbit anti-NDV#2)が用いられた(1:1000希釈)．その後結合していない抗体は，P BSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除かれた．２次抗体としては ，ヤギ抗ブタ(PRV g50(gD);S-SPV-008)もしくはヤギ抗ウサギ(NDV HN;S-SPV-009 )のいずれかと西洋ワサビパーオキシダーゼの抱合体がPBSを用いて1:250に希釈 され，室温下で２時間，細胞とともにインキュベートされた．その後，結合して いない２次抗体は，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除去さ れた.その後,細胞は新しく調製された基質溶液(substrate solution)(PBS中に10 0μg/mlの４クロロ-1-ナフトール(4-chloro-1- naphthol)，0.003%の過酸化水素を含む)とともに室温で15分間から30分間インキ ュベートされた．正しい抗原性を発現するプラークは黒く染色される． 診断法として使用されるためのウィルス性糖タンパク質の精製に関する方法 ウィルス性糖タンパク質は抗体アフィニティカラムを用いて精製される．モ ノクローナル抗体を生成するために，８週から10週齢のBALB/c雌マウスはS-SPV- 009，-014,-016，-017，-018もしくは-019の107 PFUを２週から４週間隔で７回 ，腹膜内にワクチン接種(vaccinated)される．最後のワクチン接種から３週間後 ，マウスは相応のウィルス性糖タンパク質40mgを腹膜内に注射される．最後の抗 原投与から３日後に脾臓が取り出される． オイとハーゼンバーグ(Oi and Herzenberg)(41)の手法を改良した方法により ，脾細胞はマウスNS1/Ag4プラスマ細胞腫細胞と融合される．脾細胞とプラスマ 細胞腫細胞は10分間300ｘgの遠心分離で一緒にペレット化される．ポリエチレン グリコール(分子量1300から1600)の50%溶液１mlが，１分間攪拌されながら細胞 ペレットに加えられる．ダルベッコ改良イーグル培地(Dulbecco's modified Ea, gles's Medium)(5ml)が３分間にわたり細胞に加えられる．細胞は300ｘg，10分 間の遠心分離によりペレット化され，10%のウシ胎児血清と100mMヒポキサンチン ，0.4mMアミノプテリン及び16mMチミジンを含む培地(HAT)中に再懸濁される．10 0mlの標準の脾臓支持細胞層細胞(normal spleen feeder layer cells)を含有す る８から10個の96穴の組織培養プレートに細胞(100ml)が加えられ，37℃でイン キュベートされる．細胞には３日間から４日間ごとに新しいHAT培地が供給され る． ハイブリドーマ培養上清は，100ngのウィルス性糖タンパク質がコートされた9 6穴マイクロタイタープレート(96-well microtiter plates)中でのエリサ（ELIZ A）分折により検査される．活性ハイブリドーマ由来の上清はさらにブラックプ ラーク分析(black-plaque assay)とウェスタンブロット(Western Blot)により解 析される．選抜されたハイブリドーマは限界希釈(limiting dilution)により二 度クローニングされる．プリスタン処理されたBALB/cマウスに5x106ハイブリド ーマ細胞を腹膜内注射することにより腹水液(ascetic fluld)が生成される． S-SPV-009，-014，-016，-017，-018もしくは-019由来の細胞溶解物は感染細 胞溶解物の調製で示されたようにして得られる．糖タンパク質を含む細胞溶解物 (100mls)は，2mlのアガロース親和性樹脂を通される．製造元(AFC培地，ニュー ブランズウィックサイエンティフィック，エディソン，ニュージャージー)(AFCM edium，New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)の使用説明に従うと，そのカ ラムでは20mgの糖タンパク質モノクローナル抗体が固定化されている．カラムは 非特異的に結合した物質を除くために，0.1%のノニデットP-40(Ｎｏｎｉｄｅｔ P-40)を含むリン酸緩衝溶液(PBS)100mlを用いて洗浄された．結合した糖タンパ ク質は100mM炭酸緩衝液(carbonate buffer)，pH10.6(40)で溶出される．溶出前 後の画分(pre-posteluted fractions)は，エリサ(ELISA)システム中でのSPVモノ クローナル抗体に対する活性により純度(purity)がモニターされる． エリサ検定(ELISA ASSAY) ワクチン接種と抗原投与に引き続いておこる畜牛の免疫状態を測定するため に，標準的な酵素結合免疫吸着剤検定法(ELISA)の手順が用いられる． 糖タンパク質抗原溶液(PBS中にng/mlにて100ml)(100ml at ng/ml in PBS)はマ イクロタイター皿の穴に4℃下18時間吸着させられる．コートされた穴はPBSを用 いて１回リンスされる．穴は1%のBSA(シグマ)(Sigma)を含むPBSを250ml加えるこ とによりブロックされ，37℃で１時間インキュベートされる．ブロックされた穴 は0.02%のツィーン20(Tween20)を含むPBSで１回リンスされる．50mlの供試血清( 前もって1%BSAを含むPBS中で1:2に希釈された)が穴に添加され，37℃で１時間イ ンキュベートされる．抗血清は除去され，穴は0.02%のツィーン20(Tween20)を含 むPBSで３回洗浄される.特異的な抗原に対する抗体を含んでいる穴を視覚化する ために，西洋ワサビパーオキシダーゼ(1% BSAを含むPBS中で1:500に希釈された もの，キッケガードとペリー研究所社(Kirkegaard and Perry Laboratories，Tn c.))に結合した抗ウシIgGを含む50mlの溶液が添加される．溶液は37℃で１時間 インキュベートされ，その後溶液は除去され，0.02%のツィーン20(Tween20)を含 むPBSで３回洗浄される．それぞれの穴に100mlの基質溶液(ATBS，キッケガード とペリー研究所社)(ATBS，Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.)が加えら れ，15分間発色させられ．反応は0.1Mのシュウ酸の添加により終止させられた． 色は自動プレート読みとり機(automatic plate reader)にて吸光度410nmで読みとられた． 合成ボックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法 組み換え豚痘ベクターに関して，合成痘プロモーター(synthetic poxpromot ers)は，外来遺伝子発現の強度とタイミングを制御する能力を含むいくつかの利 点を供する．ワクシニアウィルス(1,7及び8)中で決定されたプロモーターに基づ いた３つのプロモーターカセットLP1，EP1及びLP2が設計された．それぞれのカ セットはワクシニア中で決定されたDNA配列に制限酵素部位を配したものを含む ように設計された．この制限酵素部位により，カセットはいかなる順番にでも， いかなる組み合わせにでも結合させて利用できるようになる．EcoRIもしくはBam HIサイトでフレーム内融合(inframe fusion)ができるように，イニシエーターメ チオニンもそれぞれのカセット中に設計された．３つのリーディングフレームす べてに含まれる一連の翻訳終了コドンと初期(early)転写終止シグナル（early t ranscriptional termination signal）(9)もフレーム内融合(inframefusion)サ イトの下流に組み込まれた．それぞれのカセットをコードするDNAは標準的な手 法に従って合成され，適当な相同性ベクターへクローニングされた(図4,5及び８ 参照). 仮性狂犬病(Pseudovabies)ウィルス糖タンパク質遺伝子を含む 組み換え豚痘ウィルスを用いたブタにおけるワクチン接種実験： 仮性狂犬病(Pseudorabies)非感染群からの離乳した幼ブタが，１つまたはそ れ以上の仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルス糖タンパク質遺伝子(SPV/PRV)を有 する組み換え豚痘ウィルスの効力を検査するために用いられる．約103から107プ ラーク形成単位(PFU)の組み換えSPV/PRVウィルスが筋肉内，皮下，あるいは経口 的に幼ブタに接種される． 免疫性はPRV血清抗体のレベルを測定することと，ワクチン接種されたブタに 仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルスの病原性株を抗原投与(challenge)すること により決定される．ワクチン接種の３から４週間後，ブタの接種したグループと 接種していないグループはともに仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルスの病原性株 (VDL4892)を抗原投与(challenge)される．抗原投与(challenge)後，ブタは14日 間毎日，仮性狂犬病(Pseudorabies)の臨床的兆候を観察される． ワクチン接種した時点，抗原投与の時点，及び接種後２から３週の間１週おき に血清試料が得られ，血清中和抗体を検査された． ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素と ノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング カッツら(Katz et al．)(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関 して示したのと基本的に同様の手法により，ウマインフルエンザウィルス赤血球 凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA)遺伝子がクローニングされた．ウィルスRNA はMDBK細胞(インフルエンザA/ウマ／アラスカ/91とインフルエンザA/ウマ/マイ アミ/63に関して)またはMDCK細胞(インフルエンザA/ウマ/プラハ/56とインフル エンザA/ウマ/ケンタッキー/81に関して)内で成長したウィルスから調製され， 最初に標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変 えられた.cDNAは標的とした遺伝子領域のPCRクローニング(51)のためのテンプレ ートとして用いられた．PCRプライマーは，EHV内での発現のための適当なシグナ ルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵 素サイトを組み込むように設計された．コードする領域のそれぞれにつき１対の オリゴヌクレオチドプライマーが必要であった．抗原型２(H3)ウィルス(インフ ルエンザA/ウマ/マイアミ/63，インフルエンザA/ウマ/ケンタッキー/81，及びイ ンフルエンザA/ウマ/アラスカ/91)由来のHA遺伝子をコードしている領域は，cDN Aのプライミング(priming)のため以下のプライマー5'-GGAGGCCTTCATGACAGACAACC ATTATTTTGATACTACTGA-3'(SEQ ID NO:120)を用いてクローニングされ，PCRのため に5'-GAAGGCCTTCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTGCC-3'(SEQ ID NO:121)と結合さ せられた．抗原型１（H7）ウィルス(インフルエンザA/ウマ/プラハ/56)由来のHA 遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプ ライマー を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．抗原型２（N8）ウィルス(インフルエンザA/ウマ/マイアミ/6 3，インフルエンザA/ウマ/ケンタッキー/81，及びインフルエンザA/ウマ/ アラスカ/91)由来のNA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(pri ming)ため以下のプライマー を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．抗原型１（N7）ウィルス(インフルエンザA/ウマ/プラハ/56) 由来のNA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため 以下のプライマー5'-GGGATCCATGAATCCTAATCAAAAACTCTTT-3'(SEQ ID NO:118)を用 いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．この一般的な手法は，ウマ インフルエンザAウィルスの他の 株からHA遺伝子とNA遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたこ とに留意されたい．EIVHA遺伝子またはNA遺伝子はブラントエンド処理されたsal IまたはBamHI断片として，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターの下流のブ ラントエンド処理されたEcoRIサイトにクローニングされた． パラインフルエンザ-3 ウィルス融合(parainfluenza-3 virus fusion)と赤血 球凝集素遺伝子のクローニング カッツら(Katz et al．)(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関 して示したのと基本的に同様のPCRクローニング法により，パラインフルエンザ- 3 ウィルス融合（F）(parainfluenza-3 virus fusion(F))と赤血球凝集素(HN) 遺伝子がクローニングされた．マーデン-ダービイ(Madin-Darby)ウシ腎臓(MDBK) 細胞中で成長させたウシPI-3ウィルスから調製されたウィルスRNAは最初に，標 的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた ．その後，cDNAは標的とされる領域の複製連鎖反応(PCR)クローニング(15)のた めのテンプレートとして用いられた．PCRプライマーは，SPV内での発現のための 適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能 とする制限酵素サイトを組み込むように設計された．コードする領域のそれぞれ につき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった．PI-3株SF-4(VR-28 1)由来のＦ遺伝子をコードする領域は，cDNAのプライミング(priming)の ため以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．PI-3株SF-4(VR-281)由来のHN遺伝子をコードしている領域は ，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．この一般的な手法は，PI-3の他の株からF遺伝子とHN遺伝子 をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい．PI-3 H N(遺伝子)またはF(遺伝子)に対応するDNA断片は，それぞれ1730bpもしくは1620b pの断片を得るためにBamHIを用いて消化された．PI-3 HN断片は，SPV相同性ベク ターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた．PI-3 F断片は相同性ベクター713-55.10.を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プ ロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた． ウシウィルス性下痢ウィルス(Bovine Viral Diarrhea Virus)g48とg53遺伝子 のクローニング カッツら(Katz et al.)(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関 して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシウィルス性下 痢ウィルスg48とg53遺伝子はクローニングされた．マーデン-ダービイ(Madin-Da rby)ウシ腎臓(MDBK)細胞中で成長したBVDウィルスシンガー株(BVD Virus Singer strain)から調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌ クレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた．その後，cDNAは複製連鎖反 応(PCR)クローニング(15)のためのテンプレートとして用いられた． PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に， 増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むよう に設計された．コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプラ イマーが必要であった．BVDVシンガー株(BVDV Singer strain)(49)由来のg48遺 伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプラ イマー：を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．BVDVウィルスシンガー株(BVDV Singer strain)（49）由来 のg53遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下 のプライマー： 5'-CGTGGATCCTCAATTACAAGAGGTATCGTCTAC-3'(SEQ ID NO:136)を用いてクロー ニングされ，PCRのために と結合させられた．この一般的な手法は，BVDVの他の株からg48遺伝子とg53遺伝 子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい．BVDV g48に対応するDNA断片は，678bpの断片を得るためにBamHIで消化された．BVDV g53に対応するDNA断片は，1187bpの断片を得るためにBglIIとBamHIを用いて消 化された．BVDV g48とg53 DNA断片は，それぞれ相同性ベクター727-78.1と738-9 6を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイ トにクローニングされた． ウシ呼吸器合胞体ウィルス融合(Bovine Respiratory Syncytial Virus Fusion ) ，ヌクレオカプシド(Nucleocapsid)及び糖タンパク質遺伝子のクローニング カッツら(Katz et al.)(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関 して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシ呼吸器合胞体 ウイルス融合(Bovine respiratory syncytial virus fusion)(F)，ヌクレオカ プシド(Nucleocapsid)(N)及び糖タンパク質(G)遺伝子がクローニングされた．ウ シ鼻甲介(nasal turbinate)(BT)細胞中で成長させたBRSVから調製されたウィル スRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用し てcDNAに変えられた．その後，cDNAは複製連鎖反応(PCR)クローニング(15)のた めのテンプレートとして用いられた．PCRプライマーは，SPV内での発現のための 適当なシグナル含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能と する制限酵素サイトを組み込むように設計された．コードする領域のそれぞれに つき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった．BRSV株375（VR-1339 ）由来のF遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため 以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．BRSV株375(VR-1339)由来の領域をコードしているN遺伝子は ，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．BRSV株375(VR-1339)由来のG遺伝子をコードしている領域は ，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．この一般的な手法は，BRSVの他の株からF遺伝子，N遺伝子及 びG遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意された い．BRSVのF,N及びGに対応するDNA断片は，それぞれ1722bp，1173bp及び771bpの 断片を得るためにBamHIで消化された．BRSVのF，N,及びGのDNA断片は，相同性ベ クター727-20.10，713-55.37，及び727-20.5を得られようにSPV相同性ベクター のLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにそれぞれクローニングされた コンカナバリンA(Concanavalin A)で処理されたニワトリ脾臓細胞から単離さ れたRNA ニワトリ脾臓は３週齢のSPAFAS孵化ヒナから解剖して取り出され，洗浄され ，細胞を解離するために注射筒/針を通して粉砕された．細胞質と残渣が除かれ た後，細胞はペレット化され，PBSで二回洗浄された．細胞ペレットは赤血球細 胞を溶血させるために低張性溶解緩衝液で処理され，脾細胞は回収され，PBSで 二回洗浄された．脾細胞は5% FBSと５μg/mlのコンカナバリンA(concanavalin A)を含むRPMI中に5x106細胞/mlにて再懸濁され，39℃下で，48時間インキュベー トされた．総RNAはグアニジンイソチオネート溶解剤(guanidine isothionatelys is reagents)とプロメガRNA単離キット(プロメガ社RNA isolation Kit)(プロメ ガ社 マディソン ウィスコンシン)(プロメガ社Corpora，tion，Madison WI)に よる手順を用いて細胞から単離された．４μgの総RNAが，適当なアンチセンスプ ライマーとAMV逆転写酵素(プロメガ社 マディソン ウィスコンシン)(プロメガ 社Corporation，Madison WI)を含むそれぞれの第一鎖(1st strand)反応に用いら れた．逆転写酵素反応に続いてcDNA合成が同じ試験管内で，適当なセンスプライ マー(sense primers)とVentR DNAポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ社，ベテ スダ，メリーランド）(Life technologies，Inc．Bethesda，MD)を用いて行われ た． 酵素のマーカー遺伝子を発現させる組み換えヘルペスウィルスの検出(Screen) 大腸菌β−ガラクトシダーゼ(uidA)マーカー遺伝子が組み換えウィルスに組 み込まれた時，組み換え体を含むプラークは簡単な分析により視覚化された．プ ラーク分析の間，アガロース上層(agarose overlay)に酵素基質が組み入れられ た(300μg/ml)．uidAマーカー遺伝子に関しては，基質x-グルクロChx(X-Glucuro Chx)(5-ブロモ-4クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニック酸シクロヘキシルア ンモニウム塩，バイオシンスAG)(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-gluctlroni c acid Cyclohexy lammonium salt，Biosynth AG)が用いられた．マーカー酵素 活性を示したプラークは青に変わった．その後，青いプラークは新しいESK-4細 胞上に選び取られ，青いプラークをさらに単離することにより精製された．酵素 マーカー遺伝子が除去された場合の組み換えウィルス手法では分析に際し，親（ 世代）の青いプラークのバックグランドから白いプラークを精製したものが用い られた．どちらの場合においても，典型的には，３回のプラーク精製によりウィ ルスは精製された． 相同性ベクター515-85.1 プラスミド515-85.1は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．このプラ スミドは外来DNAが挿入されうる特異なAccI制限酵素サイトを含んでいる．AccI サイトに外来DNA挿入（断片）を有しているプラスミドが「組み換えSPV生成のた めの相同的組み換え法」に従って使用されると，外来DNAを有するウィルスが生 じるだろう．相同性ベクター515-85.1内のDNA挿入（断片）の制限酵素地図を図4 A-4Dに示す．このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用い(22と29)，以下 に示す供給源からの２つ制限酵素（切断）断片を結合させることで構築される． １つめの断片はpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972 塩基対の制限酵素切断断片である．２番目の断片はSPV HindIII消化断片M(23)の HindIIIからBglIIまでの約3628塩基対の亜断片(sub-fragment)である． 相同性ベクター520-17.5 プラスミド520-17.5は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．このプラ スミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(IacZ)マーカー遺伝子を もつ．マーカー遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．マーカー遺 伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．このプラスミドが「組み換えS PV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，マーカー遺伝子をコ ードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ (lacZ)マーカー遺伝子は合成初期/後期(early/late)痘プロモーターの制御下に あることに留意されたい．プラスミドの詳細を図4A-4Dに示す．このプラスミド は標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源 由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図4A -4Dに示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社）のHindIII からBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV H indIII消化断片M(23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragm ent)である．断片２はプラスミドpJF751(11)のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基 対の制限酵素断片である．断片３はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからBglII までの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である． 相同性ベクター538-46.16 プラスミド538-46.16は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．このプ ラスミドはSPV DNAに隣接して，大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝 子とPRV g50(gD)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片 である．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．このプラスミ ドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外 来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダー ゼ(lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，g50 (gD)遺伝子は合成初期/後期(early/late)痘プロモーター(EP1Lp1)の制御下にあ ることに留意されたい．プラスミドの詳細を図5A-5Dに示す．このプラスミドは 標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由 来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図5A-5 Dに示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIか らBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV Hin dIII消化断片M(23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragmen t)である．断片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基 対の制限酵素断片である．断片３はPRV BamHI消化断片７(21)のEcoRIからStuIま での約1571塩基対の亜断片(sub-fragment)である．EcoRIサイトはPCRクローニン グによりこの断片に導入されたことに留意さ れたい．この手法において，以下に示されたプライマーはpSP64にサブクローニ ングしたPRV BamHI #7断片からなるテンプレートとともに用いられた．１つめの プライマー87.03(5'-CGCGAATTCGCTCGCAGCGCTATTGGC-3')(SEQ ID NO:41)は，PRVg 50(gD)配列(26)上で，遺伝子の3'末端方向にプライミング(priming)しながら略 アミノ酸３の位置にバインド(sit down)する．２つめのプライマー87.06(5'-GTA GGAGTGGCTGCTGAAG-3')(SEQ ID NO:42)は，逆鎖上で，遺伝子の5'末端方向にプラ イミング(Priming)しながら略アミノ酸174の位置にバインド(sit down)する．PC R産物は，約509塩基対の断片を得るために，EcoRIとSalIで消化されてもよい．P RV BamHI #7のSalIからStuIまでの約1049塩基対の亜断片(sub-fragment)はその 後，EcoRIからStuIまでの約1558塩基対の断片３を得るために約509塩基対のEcoR IからSalIまでの断片にライゲーションされてもよい．断片４はSPV HindIII消化 断片M(23)のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である． 相同性ベクター570-91.21 プラスミド570-91.21は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラス ミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子とPR V gIII(gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片であ る．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが 「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺 伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(l acZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII(gC )遺伝子は合成初期(early)痘プロモーター(EP2)の制御下にあることに留意され たい．プラスミドの詳細を図10A-10Dに示す．このプラスミドは標準的な組み換 えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（ 切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図10A-10Dに示す．こ のプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまで の約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消化断 片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断 片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの 約3002塩基対の制限酵素断片である．断片３はPRV BamHI #2と#9の亜断片(sub- fragment)である，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断 片である．この断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置 換された．断片４はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからHindIIIまでの約2149 塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断片１と断片４中のAccIサイトは合成DN Aリンカーを用いてPstIに転換された． 相同性ベクター570-91.41 プラスミド570-91.41は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラス ミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子とPR V gIII(gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片であ る．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．このプラスミドが 「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺 伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(l acZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII(gC )遺伝子は合成初期後期(early late)痘プロモーター(EP1LP2)の制御下にあるこ とに留意されたい．プラスミドの詳細を図11A-11Dに示す．このプラスミドは標 準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来 の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図11A-11 Dに示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIか らBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV Hin dIII消化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment) である．断片２はプラスミドpJF751(11)のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の 制限酵素断片である．断片３はPRV BamHI #2と#9の亜断片(sub-fragment)であ る，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である．この 断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された．断片 ４はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片( sub-fragment)である．断片１と断片４中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用い てPstIに転換された． 相同性ベクター570-91.64 プラスミド570-91.64は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラス ミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子とPR V gIII(gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片であ る．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが 「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺 伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(l acZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII(gC )遺伝子は合成後期初期(late early)痘プロモーター(Lp2EP2)の制御下にあるこ とに留意されたい．プラスミドの詳細を図12A-12Dに示す．このプラスミドは標 準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来 の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図12A-12 Dに示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIか らBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV Hin dIII消化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment) である．断片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対 の制限酵素断片である．断片３はPRV BamHI #2と#9の亜断片(sub-fragment)で ある，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である．こ の断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された．断 片４はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断 片(sub-fragment)である．断片１と断片４中のAccIサイトは合成DNAリンカーを 用いてPstIに転換された． 相同性ベクター538-46.26 プラスミド538-46.26は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラス ミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β−ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子と ニューカッスル病ウイルス(NDV)赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子を もつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．外来遺伝子の下 流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．このプラスミドが「組み換えSPV生成の ための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNA を有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー 遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，HN遺伝子は合成初期/ 後期(early/late)痘プロモーター(EP1Lp2)の制御下にあることに留意されたい． プラスミドの詳細を図8A-8Dに示す．このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術 を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断 片を加えることで構築されるだろう．この配列を図8A-8Dに示す．このプラスミ ドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩 基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消化断片M(23)のHi ndIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断片２はNDV HN cDNAクローンのAvaIIからNaeIまでの約1810塩基対の制限酵素断片である．H N cDNAクローンの配列を図７に示す．cDNAクローンは標準的なcDNAクローニング 技術(14)を用いてNDVのB1株から集められた．断片３はプラスミドpJF751（11） のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限酵素断片である．断片４はSPV Hind III消化断片M(23)のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment) である． 相同性ベクター599-65.25 プラスミド599-65.25は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラス ミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子とIL T gG遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．外 来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが「組み 換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子を コードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マ ーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，ILT gG遺伝子 は合成初期/後期(early/late)痘プロモーター(EP1LP2)の制御下にあることに留 意されたい．プラスミドの詳細を図13A-13Dに示す．このプラスミドは標準的な 組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限 酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図13A-13Dに示 す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamH Iまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消 化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断 片(sub-fragment)である．断片２はEcoRIからMboIまでの約1073塩基対の断片で ある．EcoRIサイトはPCRクローニングにより導入されたことに留意されたい．こ の手法において，以下に示されたプライマーはILTウィルスゲノムの5.1KbのAsp7 18I断片のSst IからAsp718Iまでの2.6kbの亜断片(sub-fragment)からなるテンブ レートとともに用いられた．１つめのプライマー91.13(5'-CCGAATTCCGGCTTCAGTA ACATAGGATCG-3')(SEQ ID NO:81)は，ILT gG配列上で，アミノ酸２の位置にバイ ンド(sit down)する．本プライマーはさらにアミノ酸１とアミノ酸２の間にアス パラギン残基を付加し，またEcoRI制限酵素サイトを導入する．２つめのプライ マー91.14(5'-GTACCCATACTGGTCGTGGC-3')(SEQ ID NO:82)は，逆鎖上で，遺伝子 の5'末端方向にプライミング(priming)しながら，おおよそアミノ酸196の位置に バインド(sit down)する．PCR産物は．約454塩基対の断片を得るためにEcoRIとB amHIで消化される．ILT Asp718I(5.1Kb)断片の約485塩基対のMboIの亜断片(sub- fragment)は，長さ約939塩基対(293アミノ酸)であるEcoRIからMboIまでの（断片 ）から断片２を得るために，約454塩基対のEcoRIからBamHIまでの断片にライゲ ーションされる．断片３はプラスミドpJF751(11)のBamHIからPvuIIまでの約3002 塩基対の制限酵素断片である．断片４はSPV HindIII消化断片MのAccIからHindII Iまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断片１と断片４中のAccI サイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された． 相同性ベクター624.20.1C プラスミド624.20.1Cは，外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラ スミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子と ILT gI遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である． 外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが「組 み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子 をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ) マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，ILT gI遺伝 子は合成後期/初期(late/early)痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに 留意されたい．プラスミドの詳細を図14A-14Dに示す．このプラスミド は標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源 由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図14 A-14Dに示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindII IからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消化断片M(23)のBgl IIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragm ent)である．断片２はPCRクローニングにより合成された末端にEcoRIとBamHIサ イトをもつ約1090塩基対の断片であり，ILT gI遺伝子の全てのアミノ酸をコード する配列を含んでいる．ILT gI遺伝子は２つの別個のPCR反応により合成された ．この手法において，以下に示されたプライマーが8kbのILT Asp 718I断片から なるテンプレート共に用いられた．１つめのプライマー103.6（5'CCGGAATTCGCTA CTT GGAACTCTGG-3'）(SEQ ID NO:83)は，ILT gI配列上で，アミノ酸２の位置に バインド(sit down)し，ILT gI遺伝子の5'末端にEcoRIサイトを導入する．２つ めのプライマー103.3(5'-CATTGTCCCGAGACGGACAG-3')(SEQ ID NO:84)は，プライ マー103.6に対する逆鎖上の，ILT gI配列上のおおよそアミノ酸269の位置にバイ ンド(sit down)し，遺伝子の5'末端方向へ向けてプライミング(priming)する．P CR産物はILT gI遺伝子の5'末端側に相当する長さ625塩基対の断片を得るために ，EcoRIとBglI(BglIはプライマー2に対して5'末端側の179塩基対である，約アミ ノ酸209の位置にある)で消化される．３つめのプライマー103.4は(5'-CGCGATCCA ACTATCGGTG-3')(SEQ ID NO:85)はILT gI遺伝子上で，遺伝子の3'末端方向にプラ イミング(priming)しながら，略アミノ酸153の位置にバインド(sit down)する． ４つ目のプライマー103.5(5'-GCGGATCCACATTCAG ACTTAATCAC-3')(SEQ ID NO:86 )はILT gI遺伝子の3'末端側のUGA終始コドンから14塩基対先の位置にバインドし (sit down)，BamHIの制限酵素サイトと遺伝子の5'末端側方向へのプライミング( priming)を誘導する．PCR産物はILT gI遺伝子の3'末端側に相当する長さ476塩基 対の断片を得るために，Bgl I(209アミノ酸の位置にある)とBamHIを用いて消化 される．断片２は長さ約1101塩基対(361個のアミノ酸)のEcoRIからBamHIまでの 断片であるILT gI遺伝子を得るために，一緒にライゲーションされた２つのPCR 反応産物からなる．断片３はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約 3002塩基対の制 限酵素断片である．断片４はSPV HindIII消化断片MのAccIからHindIIIまでの約2 149塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断片１と断片４中のAccIサイトはNot Iリンカーを用いて特異なNotIサイトに転換された． 相同性ベクター614-83.18 プラスミド614-83.18は，外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラ スミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子と IBR gG遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である． 外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが「組 み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子 をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ) マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，IBR gG遺伝 子は合成後期/初期(late/early)痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに 留意されたい．プラスミドの詳細を図15A-15Dに示す．このプラスミドは標準的 な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制 限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図15A-15Dに 示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindlIIIからB amHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindII I消化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(Ssub-fragment)で ある．断片２は末端にEcoRIとBamHIサイトをもつ，PCRクローニングにより合成 された約1085塩基対の断片であり，IBR gG遺伝子のアミノ酸２からアミノ酸362 由来のアミノ酸をコードする配列を含んでいる．PCRクローニング手法において ，以下に示されたプライマーはIBR-000ウィルス(クーパー株)(Cooper Strain)か らなるテンプレートと共に用いられた．１つめのプライマー106.9 は，IBR gG配列上で，アミノ酸１の位置にバインド(sit down)し，IBR gG遺伝子 の5'末端にEcoRIサイトを，アミノ酸１とアミノ酸２の間に２つのアミノ酸を付 加させる．２つめのプライマー106.8 は，プライマー１に対する逆鎖上の，IBR gG配列上のおおよそアミノ酸362の位 置にバインド(sit down)し，IBR gG遺伝子の5'末端方向への合成をプライミング (priming)する．断片２はIBR gG遺伝子のアミノ末端側の362アミノ酸(約80%)に 相当する長さ1085塩基対の断片を得るために，PCR産物をEcoRIとBamHIを用いて 消化することにより生成された．断片３はプラスミドpJF751（11）のBamHIからP vuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である．断片４はSPV HindIII消化断片M のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断片１ と断片４中のAccIサイトはNotIリンカーを用いて特異なNotIサイトに転換された ． S-SPV-019 を構築するための相同性ベクター (LacZ/IBR gE 相同性ベクター)： このLacZ/IBR gE相同性ベクターは外来DNAをSPVに挿入する目的で構築され た．プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー 遺伝子とIBR gE遺伝子をもつ．このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相 同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有する ウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子は合成後 期(late)痘プロモーターの制御下に，gE遺伝子は合成後期/初期(late/early)痘 プロモーターの制御下にあることに留意されたい．相同性ベクターは標準的な組 み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す適当な合成DNA配列をもつ供給源由 来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．このプラスミドベ クターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対 の制限酵素切断断片を起源とする．SPVホモロジーの上流はSPV HindIII消化断片 M(23)の約1146塩基対のBglIIIからAccIまでの制限酵素切断亜断片(sub-fragment )である．IBR gE遺伝子は，EcoRIとBamHIの制限酵素サイト末端をもつ，PCRクロ ーニングにより合成された約1888塩基対の断片である．PCRクローニング手法に おいて，以下に示されたプライマーはIBR-000ウィルス(クーパー株)(Cooper Str ain)からなるテンプレートとともに用いられた．１つめのプライマー4/93.17DR は，IBR gE遺伝子上で，アミノ酸１の位置にバインド(sit down)し，IBR gE遺伝 子の5'末端にEcoRIサイトを導入し，タンパク質のアミノ末端に２つのアミノ酸 を付加をした．２つめのプライマー4/93.18DR は，プライマー１に対する逆鎖上の，IBR gE配列上のおおよそアミノ酸648の位 置にバインド(sit down)し，IBR gE遺伝子の5'末端方向への合成をプライミング (Priming)する．lacZプロモーターとマーカー遺伝子はプラスミド520-17.5で用 いられたものと同一である．SPVホモロジー下流は，SPV HindIII消化断片M(23) の約2156塩基対のAccIからHindIIIまでの制限酵素切断亜断片(sub-fragment)で ある．SPV相同性ベクター中のAccIサイトは特異なXbaIサイトに転換された． S-SPV-018 を構築するための相同性ベクター （LacZ/PRV gE相同性ベクター）： 相同性ベクターは外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラスミドは SPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子とPRV gE遺 伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．外来遺伝 子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが「組み換えSPV 生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードす るDNAを有するウィルスが生じる．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子は 合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，PRV gE遺伝子は合成初期/後期 (early/late)痘プロモーター(EP1LP2)の制御下にあることに留意されたい．この 相同性ベクターは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す合成D NA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろ う．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamH Iまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消 化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である ．断片２はプラスミド520-17.5で用いられたものと同 一のLacZプロモーターとマーカー遺伝子である．断片３はPRV BamHI #7 DNA断 片に由来するPRVの,DraIからMluIまでの約2484塩基対の亜断片(sub-fragment)で ある．DraIサイトは合成DNAリンカーを用いてEcoRIサイトに転換された.DraIは 本来のgE開始コドンの45bp上流に位置し，タンパク質のアミノ末端側のオープン リーディングフレームを15アミノ酸伸長する．合成痘プロモーター/EcoRI DNAリ ンカーはさらに４つのアミノ酸を付加した．結局，付加された19個のアミノ酸を 含む合成されたgE遺伝子がgEのアミノ末端に融合された．19個のアミノ酸とはMe t-Asn-Ser-Gly-Asn-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-His-Thr-Gly-Val-Glu-Th rである．断片４は，SPV HindIII消化断片M(23)のAccIからHindIIIまでの約2149 塩基対の亜断片(sub-fragment)である．断片１と断片４中のAccIサイトは合成DN Aリンカーを用いてPstIサイトに転換された． 相同性ベクター520-90.15 プラスミド520-90.15は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．このプ ラスミドは外来DNAが挿入されうる特異なNdeI制限酵素サイトを含んでいる．Nde Iサイトに外来DNA挿入（断片）を有しているプラスミドが「組み換えSPV生成の ための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来DNAを有するウィルスが 生じるだろう．プラスミド520-90.15は標準的な組み換えDNA技術を用い(22と30) ，以下に示す供給源からの２つ制限酵素（切断）断片を結合させることで構築さ れる．１つめの断片はpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの 約2972塩基対の制限酵素切断断片である．２番目の断片はSPV HindIII消化断片G (23)のHindIIIからBamHIまでの約1700塩基対の亜断片(sub-fragment)である． 相同性ベクター708-78.9 プラスミド708-78.9は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラスミ ドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子と感染 性ウシ鼻気管炎ウィルス(IBRV)gE遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの 約1484塩基対断片である．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片であ る．このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って 使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じる だろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモ ーター(LP1)の制御下に，IBRV gE遺伝子は合成後期/初期(late/early)痘プロモ ーター(LP2EP2)の制御下にあることに留意されたい．相同性ベクターは標準的な 組み換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す供給源由来の制限酵素(切断)断 片を加えることで構築されるだろう．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ )(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起 源とする．断片１はSPV HindIII消化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩 基対の亜断片(sub-fragment)である．断片２は末端にEcoRIとBamHIサイトをもつ 約475塩基対の断片である．EcoRIサイトとBamHIサイトはPCRクローニングにより 合成された．PCR産物には全アミノ酸をコードしているIBRV gE遺伝子の配列を含 む．PCRクローニング手法において，以下に示されたプライマーはIBR-000ウィル ス(クーパー株)(Cooper Strain)(44)からなるテンプレートとともに用いられた ．１つめのプライマー2/94.5DR は，IBR gE遺伝子上で，アミノ酸１の位置にバインド(sit down)し，IBRV gE遺 伝子の5'末端にEcoRIサイトを，タンパク質のアミノ末端に２つのアミノ酸付加 を導入する．２つめのプライマー4/93.18DR は，プライマー１に対する逆鎖上の，IBRV gE配列(44)上の略アミノ酸648の位置 にバインド(sit down)し，IBRV gE遺伝子の5'末端方向に合成をプライミング(pr iming)する．PCR産物はIBRV gE遺伝子に相当する長さ約1950塩基対の断片を得る ために，EcoRIとBamHIを用いて消化された．断片３はプラスミドpJF751（11）の BamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である．断片４はSPV HindII I消化断片MのAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)であ る．断片１と断片４中のAccIサイトはNotIリンカーを用いて特異なNotIサイトに 転換された． 相同性ベクター723-59A9.22 プラスミド723-59A9.22は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラ スミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子と ウマインフルエンザウィルスNA PR/56遺伝子をもつ．このプラスミドが「組み換 えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコー ドするDNAを有するウィルスが生じる．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝 子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，EIV PR/56 NA遺伝子は合 成後期/初期(late/early)痘プロモーター(LP2EP2)の制御下にあることに留意さ れたい．プラスミドの詳細を図18A-18Dに示す．相同性ベクターは標準的な組み 換えDNA技術を用いて(22と30)，以下に示す適当な合成DNA配列をもつ供給源由来 の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．このプラスミドベク ターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の 制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消化断片M(23)のBglIIか らAccIまでの約1484塩基対の亜断片(aub-fragment)である．断片２はウマインフ ルエンザA/プラハ/56(血清型１(N7)ウィルス)由来のNA遺伝子をコードしている 領域であり，cDNAのプライミング(Priming)のために以下のプライマー を用い，大きさ約1450塩基対のBamHI断片としてクローニングされたものである ．そしてそれはPCRのため と結合させられた．(「ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素とノイラミニダ ーゼ(Neuraminidase)遺伝子のクローニング」参照)．断片３はプラスミドpJF751 （11）のBamHIからPvuIIまでの約3010塩基対の制限酵素断片である．断片４はSP V HindIII消化断片M（23）のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub- fragment)である．SPV相同性ベクター中のAccIサイトは特異なNotIサイトに転換 された． 相同性ベクター７２７−５４．６０ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために、プラスミド７２７−５４．６０を構 築した。これにより、ＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ） ｇII（ｇＢ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取 込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断 片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対 断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え 手順」に従って用いることにより、上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有す るウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合 成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合 成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される 。本プラスミドの詳細は第１９Ａ−１９Ｄ図に示されている。本プラスミドは、 標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第１９Ａ−１９Ｄ図に示す合成Ｄ ＮＡ塩基配列を有する下記の起源に由来する制限断片を相互に結合させることに より構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社） から入手可能な略２９７２塩基対のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導 した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対 のＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡのＫ ｐｎＩ Ｃ断片（２１）内にあるＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略 ３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む 略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対 ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０ 塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミド ｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である 。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−Ｈｉｎ ｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用 いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７２７−６７．１８ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７２７−６７．１８を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したＢ型肝炎ウイウスコア抗原遺伝子と大 腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来 遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外 来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプ ラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いるこ とにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上 記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（Ｌ Ｐ１）の制御下にあり、上記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子は合成後期／早期 痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミ ドの詳細は第２０Ａ−２０Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術 （２２、３０）を用い、第２０Ａ−２０Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する 下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プ ラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄII I−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片 Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は 、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制 限断片である。断片３は、末端にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限部位を有する略５ ８９塩基対断片である。本断片はＢ型肝炎コア抗原をコードする塩基配列（アミ ノ酸２５−２１２）（４５、５０参照）を含有する。断片４は、ＳＰＶ Ｈｉｎ ｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と 断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換 した。 相同性ベクター７３２−１８．４ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７３２−１８．４を用いた。 これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウマインフルエンザウイルスＡＫ／９１Ｎ Ａ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。 このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用 いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られ る。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモータ ー（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ウマインフルエンザウイルスＡＫ／９１ＮＡ 遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが 注目される。本プラスミドの詳細は第２１Ａ−２１Ｄ図に示す。本相同性ベクタ ーは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列 を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラス ミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII− ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ （２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、 ｃＤＮＡプライミング用の５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣ ＡＡＡＡＧＡＴＡＡ−３’（配列番号：１２４）にＰＣＲ用５’−ＧＧＧＴＣＧ ＡＣ ＴＴＡＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡ−３’（配列番号：１２５） を結合したプライマーを用いて略１４５０塩基対ＳａｌＩ断片としてクローニン グを行ったウマインフルエンザＡ／アラスカ／９１（抗原型２（Ｎ８）ウイルス ）由来のＮＡ遺伝子をコードする領域である（「ウマインフルエンザウイルス血 球凝集素及びノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング」参照）。断片３は、プラ スミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片 である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略２１４９塩基 対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜制限断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃ Ｉ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７４１−８０．３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４１−８０．３を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８ ４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩 基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組 換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有 するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は ヒトサイトメガロウイルス即時早期（ＨＣＭＶ ＩＥ）プロモーターの制御下に あることが注目される。本プラスミドの詳細は第２２Ａ−２２Ｃ図に示す。本プ ラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２２Ａ−２２Ｃ図 に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させるこ とにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ 社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片 １は、 ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−Ａｃｃ Ｉ制限亜断片である。断片２は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター（４６）を含有す るＨＣＭＶ ２．１ｋｂ ＰｓｔＩ断片から誘導した１１５４塩基対ＰｓｔＩ− ＡｖａII断片である。断片３は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐ Ｊ Ｆ７５１（４９）から誘導した３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片で ある。断片４は、ＰＲＶ ｇＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルとカルボキシ末 端の１９個のアミノ酸とを含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７から誘導した略７ ５０塩基対ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片である。断片５は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断 片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片５ のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７４１−８４．１４ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４１−８４．１４を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２ ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。 これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し 、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列 する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従 って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが 得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロ モーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ヒトＩＬ−２遺伝子は合成後期／早期 痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。ヒトＩＬ− ２タンパク質をコードする配列は、そのアミノ末端で膜輸送用ＰＲＶ ｇＸシグ ナル配列に融合する。本プラスミドの詳細は第２３Ａ−２３Ｄ図に示す。本プラ スミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２３Ａ−２３Ｄ図に 示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させること により構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社 ）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１ は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−Ａ ｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、末端にＥｃｏＲＩとＢｇｌII制限部位を有 する略 ４７５塩基対断片である。ＥｃｏＲＩ部位はＰＣＲクローニングにより合成され 、ＢｇｌII部位はヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ（４３、４７）の３’末端に位置する。 ＰＣＲ生産物は、ＰＲＶ ｇＸシグナル配列−ヒトＩＬ−２遺伝子の全アミノ酸 コード配列を含有する。本法では、ＰＲＶ ｇＸシグナル配列−ヒトＩＬ−２の ＣＤＮＡ（４３）から成る鋳型を用いて下記プライマーを適用した。第１プライ マー５／９４．２３（５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴ ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣ−３’）（配列番号：１２６）は、ＰＲＶ ｇＸシグナル 配列上の第１番目アミノ酸の位置に坐し、上記遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部 位を導入する。第２プライマー５／９４．２４（５’−ＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣ ＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号：１２７）は、ヒトＩＬ−２遺 伝子配列上のプライマー５／９４．２３の反対鎖上の３’非翻訳領域内に坐し、 上記遺伝子の５’末端方向にプライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩと ＢｇｌII（ＢｇｌIIはヒトＩＬ−２遺伝子のための停止コドンを略３個のヌクレ オチド分越えたところに位置する）を用いて消化して長さにおいてＰＲＶ ｇＸ シグナル配列−ヒトＩＬ−２遺伝子に対応する４７５塩基対断片を生成した。断 片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−Ｐｖ ｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ Ｈｉｎｄ・断片Ｍの略２１４９塩基対 ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、Ｎｏ ｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７４４−３４ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４４−３４を構築した。こ れによりＳＰＸ７ ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＢ遺伝子と大 腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来 遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外 来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプ ラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いるこ とにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上 記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（Ｌ Ｐ１）の制御下にあり、上記ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモ ー ター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は 第２４Ａ−２４Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３ ０）を用い、第２４Ａ−２４Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来 の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベ クターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂａｍ ＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３ ）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、末端に ＥｃｏＲＩとＰｍｅＩ制限部位を有する略２９４１塩基対断片である。断片２は 、略２９４１塩基対ＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片である。断片２は、５’末端にＥ ＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”断片内の自然ＢａｍＨＩ部位と合成Ｅ ｃｏＲＩ部位を有する略４２９塩基対ＰＣＲ断片並にＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡの ＢａｍＨＩ“ｉ”断片内のＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩを３’末端に有する略２５１２ 塩基対制限断片（４８）として合成された。５’末端ＰＣＲ断片を製造する際、 ＥＨＶ−１ ＢａｍＨＩ“ａ”並に“ｉ”断片から成る鋳型を用いて下記プライ マーを適用した。第１プライマー５／９４．３（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ ＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴ−３’）（配列番号：１２８）は、ＥＨＶ−１ ｇＢ配列 上の第２番目アミノ酸の位置に座し、上記ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５’末端に ＥｃｏＲＩ部位を導入しさらにＡＴＧ開始コドンを導入する。第２プライマー５ ／９４．４（５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＴ−３’）（ 配列番号：１２９）は、ＥＨＶ−１ ｇＢ配列上のプライマー５／９４．３の反 対鎖上の略１４４番目アミノ酸の位置に座し、上記遺伝子の５’末端方向にプラ イミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化して鎖長 においてＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５’末端に対応する４２９塩基対断片を生成 した。断片２は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（Ｂ ａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸） のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子を生成したものであ る。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ −ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４ ９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位 は、Ｎｏｔ Ｉリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７４４−３８ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４４−３８を構築した。こ れによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＤ遺伝子と大腸 菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺 伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来 遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラ スミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いること により上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記 β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ １）の制御下にあり、上記ＥＨＶ−１ ｇＤ遺伝子は合成後期／早期痘プロモー ター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は 第２５Ａ−２５Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３ ０）を用い、第２５Ａ−２５Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来 の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベ クターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂａｍ ＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３ ）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＥＨＶ −１のＢａｍＨＩ“ｄ”断片（４８）内の略１２４０塩基対ＨｉｎｄIII断片で ある。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨ Ｉ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１ ４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部 位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター６８９−５０．４ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド６８９−５０．４を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリ プロテイン遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込 まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片 が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断 片 が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順 」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイ ルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期 痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子 は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目さ れる。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、下記源由 来の制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミド ベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂａ ｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２ ３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラ スミド２−８４／２＝４０（５１）由来の末端にＳｍａＩとＨｐａＩ制限部位を 有する略３４００塩基対断片である。この断片は、ＩＢＤＶポリプロテインをコ ードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０ １０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ Ｈｉｎｄ III断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII断片である。断片１と断片 ４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した 。相同性ベクター６８９−５０．７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド６８９−５０．７を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ ２遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。 これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し 、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列 する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従 って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが 得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロ モーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は合成後期／ 早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラ スミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、下記源由来の制限断片 を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、 ｐ ＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片 から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８ ４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、両末端にＢｃｌＩと ＢａｍＨＩ制限部位を有する略１０８１塩基対断片である。本断片は、ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質をコードしており、全鎖長ＩＢＤＶ ｃＤＮＡクローン（５ １）から誘導される。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０ 塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII 断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片 ４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した 。 相同性ベクター７５１−０７．Ａ１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−０７．Ａ１を用いた 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ） 遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。こ のプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用い ることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる 。上記β−ガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)標識遺伝子は合成後期痘プロモーター( ＬＰ１)の制御下にあり、上記ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組 換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記 源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクター は、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制 限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略 １１４６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリ ンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並にポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＩＦＮ遺伝 子（５４）をコードする略５７７塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ断片である。逆転 写とＰＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．１３）は５’− ＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’ （配列番号：２１１）であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９ ４．１２）は ５’−ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号：２１２）であった。逆転写とＰＣＲにより得られたＢ ａｍＨＩ断片はゲル精製され、５’末端に非反復ＥｃｏＲＩ部位を導入し３’末 端に非反復ＢｇｌII部位を導入するための第２ＰＣＲ反応用鋳型として用いられ た。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．２２（５’−ＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣ ＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧ−３’、配 列番号：２１３）を用い、３’末端でプライマー６／９４．３４（５’−ＣＧＡＡＧＡＴＣＴ ＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’、配列番 号：２１４）を用いて略５７７塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は、ニワ トリインターフェロンをコードする成熟タンパク質の１６２個アミノ酸とアミノ 末端の３１個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるニワトリインターフェロンタ ンパク質（５４）の第１番目アミノ酸から第１９３番目アミノ酸までをコードす る配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩 基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断 片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本 ＳＰＶ相同性ベクターのＡＣＣＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７５１−５６．Ａ１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−５６．Ａ１を用いた 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ） 遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。こ のプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用い ることにより-L記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる 。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター (ＬＰ１)の制御下にあり、上記ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター (ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組 換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記 源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクター は、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制 限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略 １１４６ 塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激 ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＭＧＦ遺伝子（５５ ）をコードする略６４０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片である。逆転写とＰ ＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．２０）は５’−ＣＧＣ ＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配 列番号：２１５）であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９４． ５）は５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣ ＴＧ−３’（配列番号：２１６）であった。ＰＣＲより誘導されたＢａｍＨＩ断 片はサブクローニングを行ってプラスミドとし、第２ＰＣＲ反応用鋳型として用 いた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．１６（５’−ＧＣＧ ＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’、配列番 号：２１７）を用い、３’末端でプライマー６／９４．２０（５’−ＣＧＣＡＧ ＧＡＴＣＣ ＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’、配列番 号：２１８）を用いて略６４０塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は、ｃＭ ＧＦをコードする成熟タンパク質の１７８個アミノ酸とアミノ末端の２３個アミ ノ酸シグナル配列とを含んでなるｃＭＧＦタンパク質（５５）の第１番目アミノ 酸から第２０１番目アミノ酸までをコードする配列を含有する。断片３は、プラ スミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片 である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対Ａ ｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部 位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７５２−２２．１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２２．１を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５ 塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１１３塩基 対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換 え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有す る ウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘 ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあることが注目される。本相同性 ベクターはまた第２の外来遺伝子が非反復ＢａｍＨＩあるいはＥｃｏＲＩ部位に 挿入された合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）を含有する。本プラス ミドの詳細は第２８Ａ−２８Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技 術（２２、３０）を用い、第２８Ａ−２８Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有す る下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベ クターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−Ｓｐｈ Ｉ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３） の略８５５塩基対亜断片である。すなわちＤＮＡプライマーである５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣ ＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ −３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧ ＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を 用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５塩 基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である 。断片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。即 ち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡ ＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）と５ ’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴ ＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳ ａｌＩ並にＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。 相同ベクター７５２−２９．３３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２９．３３を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＢ遺伝子 と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺 伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺 伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１３塩基対断片が配列する。このプラスミ ドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることによ り上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β− ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモー ターの制御下にあり、上記ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は後期／早期プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にあることが注目される。ＬＰ２ＥＰ２プロモーター／ ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子カセットは同族ベクター７３８−９４．４のＮｏｔＩ部 位へ挿入された。同族ベクター７５２−２９．３３は、標準組換えＤＮＡ技術（ ２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互 に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメ ガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片 １は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である 。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴ ＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５） と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣ ＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応 を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２ は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導され た３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＰＣＲ反応生成 物（ＥｃｏＲＩ＝ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して 鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であ るＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子を生成したものである。上記ＰＣＲ断片は、ＥＨＶ− １ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”断片内の３’末端に自然ＢａｍＨＩ部位を有 しこの遺伝子の５’末端に合成ＥｃｏＲＩ部位を有する略４２９塩基対断片であ る。上記制限断片は、ＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“Ｉ”断片内のＢａ ｍＨＩからＰｍｅＩに至る略２５１２塩基対断片である。５’末端ＰＣＲ断片を 製造する際、ＥＨＶ−１ ＢａｍＨＩ“ａ”並に“ｉ”断片から成る鋳型を用い て下記プライマーを適用した。第１プライマー５／９４．３（５’−ＣＧＧＡＡ ＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＧＴ−３’）（配列番号：１２８）は、ＥＨＶ −１ ｇＢ配列上の第２番目アミノ酸の位置に座し、上記ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝 子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入しさらにＡＴＧ開始コドンを導入する。第 ２プライ マー５／９４．４(５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＴ−３ ’)（配列番号：１２９）は、ＥＨＶ−１ ｇＢ配列上のプライマー５／９４． ３の反対鎖上の略１４４番目アミノ酸の位置に座し、上記遺伝子の５’末端方向 にプライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化し て鎖長においてＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５’末端に対応する４２９塩基対断片 を生成した。上記のように、断片３は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ ＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（ ９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝 子を生成したものである。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３ 塩基対亜断片である。即ち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧ ＡＣ ＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（ 配列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴ ＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いてポリメ ラーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩ並にＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断 片を合成した。 相同性ベクター７４６−９４．１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４６−９４．１を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク 質Ｅ（ｇＥ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取 込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列 し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配 列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に 従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルス が得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルス Ｏ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子は後期／ 早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラス ミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有 する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子（カルボキシ末端膜内外領域のアミノ酸１５８個が欠如）の第１番目 アミノ酸から第４１７番目アミノ酸をコードする１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂ ａｍ ＨＩ断片を相同性ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の非反復Ｅ ｃｏＲＩ並にＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂａ ｍＨＩ断片は、ＩＢＲＶ（Ｃｏｏｐｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プラ イマー１０／９４．２３（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＣ−３’；配列番号：２１９）をＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子の ５’末端（第１番目アミノ酸）で且つプライマー１０／９４．２２（５’−ＧＧ ＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＣＧＣＴ−３’；配列 番号：２２０）をＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子の第４１７番目アミノ酸で用いてポリメ ラーゼ連鎖反応（１５）を行い合成した。 相同性ベクター７６７−６７．３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６７−６７．３を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパ ク質５３（ＢＶＤＶ ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５ ５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１ １３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための 相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡ を含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺 伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ ｇｐ５３遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあること が注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、 合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることによ り構築した。ＢＶＤＶ ｇｐ５３をコードする１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片を 相同性ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ 部位に挿入した。上記１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢 症ウイルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ 連鎖反応（１５）により合成した。 相同性ベクター７７１−５５．１１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７１−５５．１１を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タン パク質４８（ＢＶＤＶ ｇｐ４８）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８ ５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１ １１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するため の相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮ Ａを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識 遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ ｇｐ４８遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあるこ とが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い 、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることに より構築した。ＢＶＤＶ ｇｐ４８をコードする６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片を 相同ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部 位に挿入した。上記６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウ イルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖 反応（１５）により合成した。 相同性ベクター５５１−４７．２３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド５５１−４７．２３を構築し た。本ブラスミドには大腸菌β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）標識遺伝子が 後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に取込まれる。上記標識遺 伝子をＳＰＶゲノムの部位に挿入し組換え豚痘ウイルスを産生することは有用で ある。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い下記源由来 の制限断片を結合して構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ 社）の略３００５塩基対ＨｉｎｄIII制限断片から誘導した。断片１は、プラス ミドｐＲＡＪ２６０（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の略１８２３塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｓ ｍａＩ断片である。ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位はＰＣＲクローニングにより導入 されたものであることが注目される。プラスミド５５１−４７．２３を用いて組 換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５９，Ｓ−ＳＰＶ−０６０，Ｓ−ＳＰＶ−０６ １並にＳ−ＳＰＶ−０６２を産生した。相同性ベクター７７９−９４．３１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７９−９４．３１を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ ｇII）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれ る。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略５３８塩基対断片が配列 し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１８０塩基対断片が配 列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に 従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルス が得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プ ロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早 期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラス ミドの詳細は第３０Ａ−３０Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技 術(２２、３０)を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相 互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の 略２９８６塩基対ＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ制限断片から誘導した。断片１は、Ｓ ＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略５４２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢｇｌII 制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡのＫｐｎＩ Ｃ断片（２１ ）内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である 。断片２は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、 ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と 、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片(２１)とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３ ０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ Ｈｉｎ ｄIII断片Ｍの略１１８０塩基対ＢｇｌII−ＰｓｔＩ亜断片である。断片１と断 片４のＢｇｌII部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ 変換した。 相同性ベクター７８９−４１．７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇ II）遺伝子とＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ ｌａ ｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡ の略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮ Ａの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生 するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコード するＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲ Ｖ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあ り、上記ＰＲＶ ｇＤ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２） の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３１Ａ−３１Ｄ図に 示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮ Ａ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラス ミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII− ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ （２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、 ＰＲＶ ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする 配列を含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である 。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライ マーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は 通常、ＰＲＶ ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位 に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断 片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断 片である。断片４は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ Ｃ断片内のＰ ＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片４ は、ＰＲＶｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ Ｋ ｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２ １）とを含有する。断片５は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩 基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片６は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断 片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３ のＡｃｃＩ部位 は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６ のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換 した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基 対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片(ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４;配列番号 :)が欠失していた。 相同性ベクター７８９−４１．２７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．２７を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス(ＰＲＶ)ｇＢ(ｇI I)遺伝子とＰＲＶ ｇＣ（ｇIII）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌ ａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮ Ａの略１５６０塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ Ｄ ＮＡの略１４８４塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発 生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコー ドするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記Ｐ ＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に あり、上記ＰＲＶ ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２ ）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３２Ａ−３２Ｄ図 に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、図示合 成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。 プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ の略１５６０塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限亜断片である。断片２は、ゲ ノムＰＲＶ ＤＮＡのＫｐｎＩ Ｃ断片（２１）内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコー ドする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子 のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片 由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断 片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断 片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−Ｐｖ ｕII制限 断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略48塩基対ＡｃｃＩ−Ｎ ｄｅＩ亜断片である。断片５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃２並に＃９の亜断片で あるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片で ある。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片６ は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＡｃｃＩ−Ｂ ｇｌII制限亜断片である。断片１と断片４のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリン カーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。断片４と断片６のＡｃｃＩ部 位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。ＳＰＶ断片４ と６に広がる、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−Ｎｄｅ Ｉ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：）が欠失してい た。相同性ベクター７８９−４１．４７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．４７を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＣ（ｇ III）遺伝子とＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ （ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶ を発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子を コードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上 記ＰＲＶ ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御 下にあり、上記ＰＲＶ ｇＤ遺伝子も合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１Ｌ Ｐ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３３Ａ−３３ Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合 成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。 プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断 片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２ は、ＰＲＶ ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコード する配列 を含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。Ｅ ｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマー を用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常 、ＰＲＶ ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始 まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３ は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片で ある。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨ Ｉ−ＰｖｕII制限断片である。断片５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃２並に＃９の亜 断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ 断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。 断片６は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄI II亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて 非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄII Iリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広が る、ＳＰＶＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌ クレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：）が欠失していた。 相同性ベクター７８９−４１．７３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７３を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ ｇII）遺伝子とＰＲＶ ｇＣ（ｇIII）遺伝子とＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子 並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これら の外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これ らの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。 このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用 いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られ る。上記β−ガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)標識遺伝子は合成後期痘プロモーター (ＬＰ１)の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモー ター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＣ遺伝子は合成早期／後 期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＤ遺伝子は 合 成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される 。本プラスミドの詳細は第３４Ａ−３４Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換 えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の 制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プ ロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した 。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII −ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ 酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コ ドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応か ら誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ ｇＩ遺伝子３’−ＰＲ Ｖ ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレ ームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃２並 に＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ −ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより 置換した。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ− ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ Ｃ断片内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片で ある。断片５は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片 と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断 片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−Ｅｃ ｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片６は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１） の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片７は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断 片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位 へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて 非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ Ｈｉ ｎｄIII Ｍ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番 号１５６０乃至２１０４；配列番号：）が欠失していた。相同性ベクター７９１−６３．１９ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．１９を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４ ８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９ 塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同 組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含 有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子 は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラ スミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を 有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクター は、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制 限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略 １４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐ ＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。 断片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄI II亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて 非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７９１−６３．４１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．４１を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４ ８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９ 塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同 組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含 有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子 は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラ スミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を 有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクター は、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制 限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略 １４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐ ＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。 断片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄI II亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて 非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７９６−１８．９ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９６−１８．９を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８ ４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩 基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組 換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有 するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は 合成早期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラス ミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有 する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは 、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限 断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１ ４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪ Ｆ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断 片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII 亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非 反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７８３−３９．２ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８３−３９．２を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパ ク質５３（ＢＶＤＶ ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ） 標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４ 塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４ ９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相 同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを 含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝 子は後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＢＶＤＶ ｇｐ５３遺伝 子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される 。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩 基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させ構築した。プラスミドベ クターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂａｍ ＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３ ）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＢＶＤ Ｖ ｇｐ５３をコードする略１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片である。この１１８ ７塩基対ＢａｍＨＩ断片は「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並にｇｐ５ ３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成し た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ −ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４ ９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位 は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７４９−７５．７８ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４９−７５．７８を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ポ リメラーゼ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込 まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片 が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断 片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手 順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウ イルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後 期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子 は合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目され る。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ 塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミ ドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂ ａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（ ２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、Ｉ ＢＤＶＲＮＡ鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とｃＤＮＡクローニン グにより合成した略２７００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＡｓｃＩ制限断片である。ｃＤ ＮＡとＰＣＲプライマー（５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡ ＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣ−３’；１２／９３．４）（配列番号：）並に（ ５’−ＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＧＣＣＡＧＧ−３’；９／９３．２ ８）（配列番号：）を用いてＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の５’末端に略１４０ ０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を合成した。また、ｃＤＮＡとＰＣＲプライ マー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴ−３’；１ ２／９３．２）（配列番号：）並に（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＡＡＧ ＧＣＣＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧ−３’；１２／９３．３）（配列番号：）を用いて ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の３’末端に略１８００塩基対ＢｃｌＩ−ＡｓｃＩ 断片を合成した。これらの二個の断片をＢｃｌＩ部位で連結して略２７００塩基 対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を産生した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（ １１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、Ｓ ＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片であ る。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復Ｎｏｔ Ｉ部位へ変換した。 相同性ベクター７６１−７５．Ｂ１８ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６１−７５．Ｂ１８を構築 した。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）プ ロテアーゼ（ｇａｇ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺 伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５塩基対断 片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１１３塩基対 断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え 手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有する ウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘 ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子 は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。 本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ 塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミ ドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−Ｓ ｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２ ３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’− ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡ ＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴ ＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８ ６）を用いるポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８ ５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラス ミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII 断片である。断片３は、ＦＩＶ（ＰＰＲ株）（６１）由来のｃＤＮＡを用いるポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成した略１８７８塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂ ｇｌII制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡ ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴ−３’；１１／９４．９）（配列番号：）は ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の５’末端から合成され、この遺伝子の５’末端にＥｃｏ ＲＩ部位を更にＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＡＧＣＣＡ ＧＡＴＣＴ ＧＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣ−３’；１１／９４．１０）（ 配列番号：）は、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産生物 は、ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化してＦＩＶ ｇａｇ遺伝子に対応する鎖長の１ ８７８塩基対断片を生成した。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１ １３塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡ ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ −３’（配列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡ ＧＴＡ ＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いるポリ メラーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩとＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断 片を合成した。 相同性ベクター７８１−８４．Ｃ１１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８１−８４．Ｃ１１を用い た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エン ベロープ（ｅｎｖ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝 子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え 手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有する ウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成 後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子は合 成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される 。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合 成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。 プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ Ｈｉｎｄ・断片Ｍ （２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片３は、 「ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング」に従い合成したＦＩＶ ｅｎｖ遺 伝子（６１）の略２５６４塩基対ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片である。このＰＣ Ｒ反応のための鋳型としてＦＩＶ ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡ（６１）を用いた。 ＦＩＶ ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡの６２６３番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子の５’末端に対応する上流プライマー１０／９３．２１（５’−Ｇ ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’;配列 番号:）を合成した。本法では５’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。このＢ ａｍＨＩ部位は、ＰＣＲ断片のクローニングの際破壊された。ＦＩＶ ＰＰＲゲ ノムｃＤＮＡの８８２７番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子の３’ 末端に対応する下流プライマー１０／９３．２０（５’−ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣ ＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’；配列番号：）を合成した 。本法では３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。断片３は、プラスミドｐＪ Ｆ７５１ （１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、 ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−Ｈｉｎ ｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復Ｎ ｏｔＩ部位へ変換した。 〔実施例〕実施例１ 相同性ベクター５１５−８５．１ 相同性ベクター５１５−８５．１は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入に有用なプ ラスミドである。プラスミド５１５−８５．１は、それに外来性ＤＮＡをクロー ン化し得る唯一のＡｃｃＩ制限部位を含有する。かかる外来性ＤＮＡインサート を含有するプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従っ て用いて、外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得ることができる。この方法を首尾 よく行うためには、挿入部位（ＡｃｃＩ）がＳＰＶの複製に必須ではない領域に あって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介する のに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。相同性 ベクター５１５−８５．１におけるＡｃｃＩ部位を用いて、外来性ＤＮＡを少な くとも３つの組換えＳＰＶに挿入する（実施例２−４参照）。 適当な挿入部位を規定するために、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のライブ ラリーを創製した。これらの制限断片のうちいつくかを（ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｇ 、ＪおよびＭ、図１Ａ−１Ｂ参照）制限マッピング解析に付した。可能な挿入部 位として２つの制限部位が各断片で同定された。これらの部位は断片Ｇにおける ＮｒｕＩ、断片ＪにおけるＢａｌＩおよびＸｂａＩ、および断片ＭにおけるＡｃ ｃＩおよびＰｓｔＩを含むものであった。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マ ーカー遺伝子を可能な部位の各々に挿入した。得られたプラスミドを「組換えＳ ＰＶを創製するための相同組換え法」で利用した。組換えウイルスの創製は「β −ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶをスクリーニングするアッセイ」に よって判断した。６つの部位のうち４つは組換えウイルスを生じることが判明し たが、これらの各ウイルスが親ＳＰＶから精製除去される能力は大きく変動した 。１つの場合において、ウイルスを１％のレベルを超えて精製できず、もう１つ の場合において、ウイルスを５０％のレベルを超えて精製できが、および第３の 場合において、ウイルスを９０％のレベルを超えて精製できなかった。これらの ウイルスを精製できないことは、挿入部位における不安定性を示す。これは対応 する部位を外来性ＤＮＡの挿入に不適当とする。しかしながら、１の部位(相同 性 ベクター５１５−８５．１のＡｃｃＩ部位)における挿入の結果、容易に１００ ％まで精製できたウイルスが得られ（実施例２参照）、これは外来性ＤＮＡの挿 入のための適当な部位を規定する。 相同性ベクター５１５−８５．１をＤＮＡ配列解析によってさらに特徴付けた 。相同性ベクターの２つの領域を配列決定した。第１の領域は、唯一のＡｃｃＩ 部位に隣接する５９９塩基対配列をカバーする（図２Ａおよび２Ｂ参照）。第２ の領域は唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流の８９９塩基対をカバーする（図２Ａ および２Ｂ参照）。第１の領域の配列はGoebelら,1990によって同定されたワク シニアウイルス（ＶＶ）ＯＩＬオープンリーディングフレームのアミノ酸１ない し１１５に対して相同性を示すオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコー ドする（図３Ａ−３Ｃ参照）。第２の領域の配列は同ワクシニアウイルスＯＩＬ オープンリーディングフレームのアミノ酸５６８ないし６６６に対して相同性を 示すオープンリーディングフレームをコードする（図３Ａ−３Ｃ参照）。これら のデータは、ＡｃｃＩ部位はほぼアミノ酸４１において推定ＶＶ ＯＩＬ−様Ｏ ＲＦを中断することを示し、これは、このＯＲＦがＳＰＶ複製につき必須でない 遺伝子をコードすることを示唆する。Goebelらは、ＶＶ ＯＩＬ ＯＲＦはある 種の真核生物転写調節蛋白質に特徴的なロイシンジッパー・モチーフを含有する ことを提案しているが、彼らはこの遺伝子がウイルス複製に必須か否かは知られ ていないことを示している。ＶＶ ＯＩＬ−様ＯＲＦの上流に位置するＤＮＡ配 列（図２Ａ参照）は豚痘ウイルスのプロモーターを含有することが予測されるで あろう。この豚痘ウイルスのプロモーターは豚痘ゲノムに導入された外来性ＤＮ Ａ対照要素として有用であろう。実施例２ Ｓ−ＳＰＶ−００３ Ｓ−ＳＰＶ−００３は外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コ リ(E.coli)β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）をＳＰＶ ５１５−８５．１ ＯＲＦに導入した。外来性遺伝子（ｌａｃＺ）は合成初期／ 後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−００３はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは 「祖換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５２０ −17．５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して 達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリ ーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェク ション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−Ｓ ＰＶ−００３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青 色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを 、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイ した。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、こ れはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現していたことを示す。 ここに記載するアッセイはＶＥＲＯ細胞ならびにＥＭＳＫ細胞で行い、これはＶ ＥＲＯ細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産のための適当な基礎となろうことを示 す。Ｓ−ＳＰＶ−００３は受託番号２３３５の下でＡＴＣＣに寄託された。実施例３ Ｓ−ＳＰＶ−００８ Ｓ−ＳＰＶ−００８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）（２６）についての遺伝子をＳＰ Ｖ ５１５−８５．１ ＯＲＦに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモー ター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモ ーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−００８はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５３８ −４６．１６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−００８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−００８を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶ血清はＳ−ＳＰＶ−００８プラークと特異的に反応す るがＳ−ＳＰＶ−００９陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示され た。全てのＳ−ＳＰＶ−００８で観察されたプラークはブタ抗血清と反応し、こ れは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。また、 黒色プラーク・アッセイを固定されていない単層で行った。固定されていない単 層上のＳＰＶプラークもブタ抗−ＰＲＶ血清との特異的反応性を呈し、これはＰ ＲＶ抗原が感染細胞表面で発現されることを示す。 ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感 染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析し た。ブタ抗−ＰＲＶ血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。図６に 示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−００８感染細胞からの溶解物はほぼ４８ｋｄの特異的 バンド、ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）（３５）の報告されたサイズを示す。 ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）はＨＳＶ−１（２６）のｇ５０（ｇＤ）同族体である 。幾人かの研究者は、ＨＳＶ−１ ｇ５０（ｇＤ）を発現するＶＶはマウスをＨ ＳＶ−１での攻撃から保護することを示している（６および３４）。従って、Ｓ −ＳＰＶ−００８はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があ るはずである。 いくつかの他のＰＲＶ糖蛋白質がＰＲＶ病から保護するための組換え豚痘ワク チンの創製で有用であろうことが予想される。これらのＰＲＶ糖蛋白質はｇＩＩ （２８）、ｇＩＩＩ（２７）、およびｇＨ（１９）を含む。ＰＲＶ ｇＩＩＩ暗 号領域はいくつかの合成ｐｏｘプロモーターの後に作成された。Ｓ−ＳＰＶ−０ ０８の創製で利用した技術は、全ての４つのこれらのＰＲＶ糖蛋白質遺伝子を発 現する組換え豚痘ウイルスを創製するのに使用されるであろう。かかる組換え豚 痘ウイルスはＰＲＶ病に対するワクチンとして有用であろう。ここに記載するＰ ＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン 接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａｓｅ^R）と適 合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−００８は受託番号ＶＲ２３３９の下でＡＴＣＣに 寄託された。実施例４ Ｓ−ＳＰＶ−０１１ Ｓ−ＳＰＶ−０１１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０ −３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓ ｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１） の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期プロモーター（Ｅ Ｐ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−００１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７９ −９１．２１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１１を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ − ０１１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＸ７−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１１で観察された プラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝 子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞で 行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが 示される。 ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ 特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−０１１感染 細胞からの溶解物はほぼ９２ｋｄの特異的バンド、ＰＲＶｇ ＩＩＩ（ｇＣ）（ ３７）の報告されたサイズを示す。 組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有 意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰ ＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１ １はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。 ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、そ れらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診 断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎ Ｅａｓｅ^R）と適合するであろう。実施例５ Ｓ−ＳＰＶ−０１２ Ｓ−ＳＰＶ−０１２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０ −３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓ ｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１） の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期後期プロモーター （ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７０ −９１．４１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１２を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ −０１２プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１２で観察された プラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝 子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞お よびＶＥＲＯ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した 基礎となろうことが示される。 ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−Ｓ ＰＶ−０１２で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブ ロットし、分析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を 用いてＰＲＸ７特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰ Ｖ−０１２感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告 されたサイズである２つの特異的バンド−９２ｋｄ成熟形態および７４ｋｄプレ −ゴルジ 形態を示す。 組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有 意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰ ＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１ ２はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。 ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、そ れらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診 断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋＲ，ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋＲおよびＣｌｉ ｎＥａｓｅＲ）と適合するであろう。実施例６ Ｓ−ＳＰＶ−０１３ Ｓ−ＳＰＶ−０１３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０ −３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓ ｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１） の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期初期プロモーター （ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７０ −９１．６４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ −０１３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１２で観察された プラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝 子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞お よびＶＥＲＯ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した 基礎となろうことが示される。 ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ 特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−０１３感染 細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告されたサイズで ある２つの特異的バンド−９２ｋｄ成熟形態および７４ｋｄプレ−ゴルジ形態を 示す。 組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有 意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰ ＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１ ３はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。 ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、そ れらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診 断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎ Ｅａｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０１３は受託番号２４１８の下 でＡＴＣＣに寄託された。 組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を 用いるアウエスキー病に対する保護 Ｓ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を含有するワクチン(１×１０ ６ＰＦＵ／ｍｌ）（２種のウイルスの１：１混合物の２ｍｌ）を皮内接種または 経口／咽頭スプレイによって、２群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５ 匹ブタの対照群には皮内および経口／咽頭接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂 取させた。ワクチン接種から３週間後に、鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ 株４９８２でブタを攻撃した。表は臨床的応答の要約を与える。該データは、Ｓ −ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較したＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ −０１３ワクチン接種体におけるアウエスキー病からの保護の増加を支持する。 実施例７ Ｓ−ＳＰＶ−０１５ Ｓ−ＳＰＶ−０１５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）についての遺伝子をＳＰＶ ６１ ７−４８．１ ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏｔＩ制限部位で 置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７ −５４．６０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０１５プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１５で観察されたプラークは該抗血清 と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを 示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰ Ｖ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。 ＰＲＶ ｇＩＩ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１５で 感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に 付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析 した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を 検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１５感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩ糖蛋白 質の予測されたサイズである、１２０ｋｄ、６７ｋｄおよび５８ｋｄに対応する バンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタにおいて仮性狂犬病ウイルスに対するワクチンとし て有用である。優れたワクチンは、ブタにおいて仮性狂犬病に対する保護のため にＳ−ＳＰＶ−００８（ＰＲＶ ｇ５０）、Ｓ−ＳＰＶ−０１３（ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ）と戦うことによって処方される。 従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンと して価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまた はｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別する のに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ Ｈｅ ｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０ １５は受託番号２４６６の下でＡＴＣＣに寄託された。実施例８ ＰＲＶ糖蛋白質の１種のみを発現する組換え豚痘ウイルスを用いることによっ て得ることができるものよりもＰＲＶ感染に対して保護する増強された能力を持 つ組換え豚痘ウイルスを得るために、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）に対する中 和抗体の産生を誘導できる、１種を超える仮性狂犬病糖蛋白質を発現する組換え 豚痘ウイルスを構築する。 １種を超えるＰＲＶ糖蛋白質を発現するかかる組換え豚痘ウイルスのいくつか の例がある：ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩＩ（ｇＤ）を発現する組換え 豚痘ウイルス、ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩ（ｇＢ）を発現する組換え 豚痘ウイルス；ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）およびｇＩＩＩ（ｇＣ）を発現する組換 え豚痘ウイルス；およびｇ５０（ｇＤ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇＩＩ（ｇＢ ）を発現する組換え豚痘ウイルスを発現する組換え豚痘ウイルス。前記引用ウイ ルスの各々は、組換え豚痘ウイルスのクローニングを容易とするであろうイー・ コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有させ発現させるようにも設 計される。 以下にリストするのは、ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ） 、ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）およびイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ） を発現する組換え豚痘ウイルスの３つの例である。 ａ）ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲ Ｖ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全て の４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片内の唯一のＡ ｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子 は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ(ｇＣ)遺伝子は合成初期プロモーター(ＥＰ２)の制御下にあり、ＰＲＶ ｇ ＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に あり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある 。 ｂ）ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲ Ｖ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全て の４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片内の唯一のＡ ｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子 は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下に あり、ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２Ｅ Ｐ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１ ）の制御下にある。 ｃ）ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲ Ｖ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全て の４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片内の唯一のＡ ｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子 は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＥＰ２ＬＰ２）の制御下に あり、ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２Ｅ Ｐ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１ ）の制御下にある。 組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３および Ｓ−ＳＰＶ−０１５を用いるアウエスキー病に対する保護 Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ−０１５を含有 するワクチン（１×１０７ＰＦＵ／ｍｌウイルスの２ｍｌ）またはＳ−ＳＰＶ− ００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、およびＳ−ＳＰＶ−０１５の混合物（３種ウイル スの１：１：１混合物の２ｍｌ；１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）を筋肉内接種によっ て、４群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５匹ブタの対照群には筋肉内 接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂取させた。ワクチン接種から４週間後に、 鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ株４９８２でブタを攻撃した。仮性狂犬病 の臨床的徴候につき１４日間毎日ブタを観察し、表は臨床的応答の要約を与える 。該データは、Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ− ０１５でワクチン接種したブタは、Ｓ−ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較 して、仮性狂犬病ウイルスによって引き起こされたアウエスキー病に対する部分 的保護を有し、組合せワクチンＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ−０１３／Ｓ− ＳＰＶ−０１５でワクチン接種したブタは完全な保護を有したことを示す。 実施例９ Ｓ−ＳＰＶ−００９ Ｓ−ＳＰＶ−００９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子） およびニューカッスル病ウイルス血球凝集素についての遺伝子（ＨＮ遺伝子）を ＳＰＶ ５１５−８５．１ ＯＲＦに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロ モーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＨＮ遺伝子は合成初期／後期プロモーター （ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−００９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５３８ −４６．２６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−００９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−００９を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ウサギ抗−ＮＤＶ ＨＮ抗血清はＳ−ＳＰＶ−００９プラークと特異 的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００８陰性対照プラークとは特異的に反応しないこ とが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−００９で観察されたプラークはブタ抗血清と 反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示 す。Ｓ−ＳＰＶ−００９は受託番号ＶＲ２３４４の下でＡＴＣＣに寄託された。 ＮＤＶ ＨＮ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、 感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「 ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ウサ ギ抗−ＮＤＶ ＨＮ血清を用いてＨＮ蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ０９感染細胞からの溶解物は、ほぼ７４ｋｄの特異的バンド、ＮＤＶ ＨＮの報 告 されたサイズ（２９）を呈した。実施例１０ Ｓ−ＳＰＶ−０１４ Ｓ−ＳＰＶ−０１４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｇについての遺伝子（ＩＬＴ ｇＧ）をＳＰ Ｖ ５７０−３３．３２ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ部位は唯一のＰｓ ｔｌ部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＩＬＴ ｇＧ遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５９９ −６５．２５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、これはＥＳＫ−４細胞 がＳＰＶ組換えワクチンの生産についての適当な基礎となろうことを示す。 ＩＬＴ ｇＧ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１４で感 染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析し た。ＩＬＴ ｇＧに対するペプチド抗血清を用いてＩＬＴ特異的蛋白質の発現を 検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１４感染細胞からの溶解物は、ＩＬＴ ｇＧ蛋白質の 予測されたサイズである４３ｋｄにおけるバンドおよびＩＬＴ ｇＧについての 欠失突然変異体には存在しない蛋白質の糖鎖付加形態を表す高分子量のさらなる バンドを呈した。 このウイルスをＩＬＴ糖蛋白質Ｇ（ｇＧ）を発現させるための発現ベクターと して用いる。かかるＩＬＴ ｇＧを抗原として用いて、ｇＧ欠失ＩＬＴウイルス に対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＬＴウイルスに対して向けられた 抗体を同定する。このウイルスはＩＬＴ ｇＧ特異的モノクローナル抗体の産生 のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＬＴ ｇＧ蛋白質につき特異 的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使 用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイ ルスを利用してマウスにおいて創製される。実施例１１ Ｓ−ＳＰＶ−０１６ Ｓ−ＳＰＶ−０１６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｉについての遺伝子（ＩＬＴ ｇＩ）をＳＰ Ｖ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮ ｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ １）の制御下にあり、ＩＬＴ ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６２４ −２０．１Ｃ（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１６を、ＩＬＴ ｇＩ−およびβ−ガラクト シダーゼ−特異的抗原の発現につきアッセイした。ニワトリ抗−ＩＬＴポリクロ ーナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０１６プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−０ １７陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰ Ｖ−０１６で観察されたプラークはニワトリ抗血清と反応し、これは該ウイルス がＩＬＴ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセ イをＥＳＫ−４細胞において行い、これはＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチ ンの生産についての適当な基礎となろうことを示す。 ＩＬＴ ｇＩ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１６で感 染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析し た。ニワトリ抗−ＩＬＴポリクローナル抗体を用いてＩＬＴ特異的蛋白質の発現 を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１６感染細胞からの溶解物は４０ないし２００ｋｄ の抗−ＩＬＴ抗体に対して反応性であるバンドの範囲を呈し、これはＩＬＴ ｇ Ｉがかなり修飾されたらしいことを示す。 このウイルスをＩＬＴ糖蛋白質Ｉ（ｇＩ）を発現させるための発現ベクターと して用いる。かかるＩＬＴ ｇＩを抗原として用いて、ｇＩ欠失ＩＬＴウイルス に対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＬＴウイルスに対して向けられた 抗体を同定する。このウイルスはＩＬＴ ｇＩ特異的モノクローナル抗体の産生 のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＬＴ ｇＩ蛋白質につき特異 的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使 用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイ ルスを利用してマウスにおいて創製される。実施例１２ Ｓ−ＳＰＶ−０１７ Ｓ−ＳＰＶ−０１７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｇについての遺伝子（ＩＢＲ ｇＧ）をＳ ＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一の ＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（Ｌ Ｐ１）の制御下にあり、ＩＢＲ ｇＧ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（Ｌ Ｐ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６１４ −８３．１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１７を、ＩＢＲ−特異的抗原の発現につきア ッセイした。ＩＢＲ ｇＧに対するモノクローナル抗体およびペプチド抗血清は Ｓ−ＳＰＶ−０１７プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−０１６陰性対照 プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１７で 観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＢＲ外来性遺伝子 を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞に おいて行い、これはＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産についての適 当な基礎となろうことを示す。 ＩＢＲ ｇＧ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１７で感 染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析し た。ＩＢＲ ｇＧに対する抗血清を用いてＩＢＲ特異的蛋白質の発現を検出した 。 Ｓ−ＳＰＶ−０１７感染細胞からの溶解物は、ＩＢＲ ｇＧ蛋白質の予測された サイズである４３ｋｄにおけるバンドおよびＩＢＲ ｇＧについての欠失突然変 異体に存在しない蛋白質の糖鎖付加形態を表す高分子量のさらなるバンドを呈し た。 このウイルスをＩＢＲ糖蛋白質Ｉ（ｇＧ）を発現させるための発現ベクターと して用いる。かかるＩＢＲ ｇＧを抗原として用いて、ｇＧ欠失ＩＢＲウイルス に対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＢＲウイルスに対して向けられた 抗体を同定する。このウイルスはＩＢＲ ｇＧ特異的モノクローナル抗体の産生 のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＢＲ ｇＧ蛋白質につき特異 的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使 用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイ ルスを利用してマウスにおいて創製される。実施例１３ Ｓ−ＳＰＶ−０１９ Ｓ−ＳＰＶ−０１９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）ｇＥについての遺伝子をＳＰＶ ６１ ７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制 限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制 御下にあり、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７０８ −７８．９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０１９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 このウイルスをＩＢＲ糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）を発現させるための発現ベクターと して用いる。かかるＩＢＲ ｇＥを抗原として用いて、ｇＥ欠失ＩＢＲウイルス に対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＩＢＲウイルスに対して向けられた 抗体を同定する。このウイルスはＩＢＲ ｇＥ特異的モノクローナル抗体の産生 のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＩＢＲ ｇＥ蛋白質につき特異 的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使 用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイ ルスを利用してマウスにおいて創製される。実施例１４ Ｓ−ＳＰＶ−０１８ Ｓ−ＳＰＶ−０１８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｅ（ＰＲＶ ｇＥ）についての遺伝子をＳＰＶ ５ ７０−３３．３２ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ部位は唯一のＰｓｔＩ部 位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下 にあり、ＰＲＶ ｇＥ遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の 制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において最終相同性ベクターお よびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダー ゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよび ＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニング される。組換えウイルスの赤色プラーク精製はＳ−ＳＰＶ−０１８と命名される 。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数 継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびイン サートの安定性につきアッセイする。最初の３ラウンドの精製後、観察された全 て のプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子 を発現することを示す。 このウイルスをＰＲＶ糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）を発現させるための発現ベクターと して用いる。かかるＰＲＶ ｇＥを抗原として用いて、ｇＥ欠失ＰＲＶウイルス に対して向けられた抗体とは反対に、野生型ＰＲＶウイルスに対して向けられた 抗体を同定する。このウイルスはＰＲＶ ｇＥ特異的モノクローナル抗体の産生 のための抗原としても用いられる。かかる抗体はＰＲＶ ｇＥ蛋白質につき特異 的な診断テストの開発で有用である。モノクローナル抗体は、「診断剤として使 用されるウイルス糖蛋白質の精製手法」（材料および方法）に従って、このウイ ルスを利用してマウスにおいて創製される。実施例１５ 相同性ベクター５２０−９０．１５ 相同性ベクター５２０−９０．１５は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入に有用な プラスミドである。プラスミド５２０−９０．１５は、それに外来性ＤＮＡをク ローン化し得る唯一のＮｄｅＩ制限部位を含有する。かかる外来性ＤＮＡインサ ートを含有するプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に 従って用いて、外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得る。この方法を首尾よく行う ためには、挿入部位がＳＰＶの複製に必須ではない領域にあって、該部位に、ウ イルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイル スＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。プラスミド５２０−９０．１ ５における唯一のＮｄｅＩ制限部位はＳＰＶチミジンキナーゼ遺伝子（３２）の 暗号領域内に位置する。従って、豚痘ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子はＤＮ Ａ複製に必須ではなく、適当な挿入部位であることが示された。実施例１６ Ｓ−ＰＲＶ−０１０ Ｓ−ＳＰＶ−０１０は外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コ リβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をチミジンキナーゼ遺伝子内の唯一 のＮｄｅＩ制限部位に挿入する。外来性遺伝子（ｌａｃＺ）は合成後期プロモー ター、ＬＰ１の制御下にある。かくして、豚痘ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝 子は該ウイルスの複製に必須でない領域であり、適当な沿うに結う部位であるこ とが示された。 ＨｉｎｄＩＩＩ Ｇ断片からサブクローン化された１７３９塩基対ＨｉｎｄＩ ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片は豚痘ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子を含有し、命名 された相同性ベクター５２０−９０．１５である。該相同性ベクター５２０−９ ０．１５をＮｄｅＩで消化し、ＡｓｃＩリンカーを該チミジンキナーゼ遺伝子内 のこの唯一の部位に挿入した。ＡｓｃＩリンカーを持つＬＰ１プロモーター−ｌ ａｃＺカセットをチミジンキナーゼ遺伝子内のＡｓｃＩ部位に結んだ。組換え相 同性ベクター５６１−３６．２６を、「組換えＳＰＶを創製するための相同組換 え法」によってウイルスＳ−ＳＰＶ−００１で共トランスフェクトし、β−ガラ クトシダーゼを発現するウイルス・プラークを「β−ガラクトシダーゼを発現す る組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧア ッセイ）によって選択した。青色および赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ１−０１０と命名された組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。こ こに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞において行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ 組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。実施例１７ 種々の病気を引き起こす微生物からの抗原を発現させるための豚痘ウイルスを 利用するワクチンの開発を企画することができる。 伝染性胃腸炎ウイルス 豚痘ウイルスベクターで使用する、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）の主要中 和抗原、糖蛋白質１９５をクローン化した。該中和抗原のクローンは１９８７年 ７月２７日に出願された米国特許出願第０７８,５１９号に開示されている。Ｐ ＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明 細書に開示した手法はＴＧＥに適用できると考えられる。 ブタ・パルボウイルス ブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）の主要キャプシド蛋白質を豚痘ウイルスベク ターで使用するためにクローン化した。該キャプシド蛋白質は１９９１年１１月 ２６日に発行された米国特許第５,０６８,１９２号に開示されている。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に 開示した手法はＰＰＶに適用できると考えられる。 ブタ・ロタウイルス ブタ・ロタウイルスの主要中和抗原、糖蛋白質３８を豚痘ウイルスベクターで 使用するためにクローン化した。糖蛋白質３８のクローンは１９９１年１１月２ ６日に発行された米国特許第５,０６８,１９２号に開示されている。ＰＲＶ ｇ ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開 示した手法はＳＲＶに適用できると考えられる。 ブタ・コレラウイルス ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルスの主要中和抗原を、１９８８年７月 ２７日に出願された米国特許出願第２２５，０３２号に開示されているごとくに クローン化した。ＢＶＤおよびブタ・コレラウイルスは交差保護性であるので( ３１)、ＢＶＤ)ウイルス抗原は豚痘ウイルスベクターで使用するために標的化さ れている。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された 、および本明細書に開示した手法はＢＶＤに適用できると考えられる。 セルプリナ・ヒオディセンテリエ（Serpulina Hyodysenteriae） 豚痘ウイルスベクターで使用するためのSerpulina Hyodysenteriae（３）の保 護抗原はクローン化されている。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現 させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はSerpulina Hyodysente riaeに適用できると考えられる。 以下の微生物からの抗原も動物ワクチンを開発するのに利用できる：ブタ・イ ンフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタ・コレ ラウイルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)、 ブタ生殖系および呼吸器系症候群／ブタ不妊症および呼吸器系症候群（ＰＲＲＳ ／ＳＩＲＳ）。 以下の微生物からの抗原も動物ワクチンで利用できる：イヌ−ヘルペスウイル ス、イヌ・ジステンパー、イヌ・アデノウイルス１型（肝炎）、アデノウイルス ２型（呼吸器系病）、パラインフルエンザ、レプトスピラ・カニコラ(Leptospir a canicola)、イクテロヘモラジア(icterohemorragia)、パルボウイルス、コロ ナウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、イヌ・ヘル ペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronshiseptica) 、ディロフィラエ・イミティス(Dirofilaria immitis)（イヌ糸状虫）および狂 犬病ウイルス、２）ネコ−Ｆｉｖ ｇａｇおよびｅｎｖ、ネコ白血病ウイルス、 ネコ免疫不全ウイルス、ネコ・ヘルペスウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、 イヌ・ヘルペスウイルス、イヌ・コロナウイルス、イヌ・パルボウイルス、(イ ヌおよびネコにおけるDirofilaria immitisを含めた)動物における寄生虫病、ウ マ感染性貧血、ストレプトコッカス・エキィ(Streptococcusequi)、球虫類亜綱( coccidia)、エメリア(emeria)、ニワトリ貧血ウイルス、ボレリア・ブルグドルフ ェリ(Borrelia burgdorferi)、ウシ・コロナウイルス、パステレラ・ヘマリティ カ(Pasteurella haemolytica)。実施例１７Ａ ブタ・コレラウイルス、ブタ・インフルエンザウイルスおよび（ブタ生殖系お よび呼吸器系症候群）ＰＲＲＳウイルスからの抗原を発現する組換え豚痘ウイル スを含有するワクチン ブタ・コレラウイルス、ブタ・インフルエンザウイルスおよびＰＲＲＳウイル スに対する中和抗原についての遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスはブタにお ける病気を予防するのに有用である。組換えＳＰＶで発現された遺伝子は、限定 されるものではないが、ブタ・コレラウイルスｇＥ１およびｇＥ２遺伝子、ブタ ・インフルエンザウイルス血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび 核蛋白質、およびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７を含む。実施例１８ 組換え豚痘ウイルスは、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１、 ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラグ５６、ウマ・ヘルペスウイルス１型 ｇＢ、またはウマ・ヘルペスウイルス１型ｇＤ遺伝子を発現する。Ｓ−ＳＰＶ− ０３３およびＳ−ＳＰＶ−０３４はウマ・インフルエンザ感染に対するワクチン として有用であり、Ｓ−ＳＰＶ−０３８およびＳ−ＳＰＶ−０３９はウマ鼻気管 炎およびウマ流産を引き起こすウマ・ヘルペスウイルス感染に対するワクチンと して有用である。これらのウマ・インフルエンザおよびウマ・ヘルペスウイルス 抗原は動物において保護免疫応答を生起させるのに鍵となる。組換えウイルスは 単独でまたは効果的なワクチンとして組合せにおいて有用である。豚痘ウイルス は、（ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ／６３およびウマ・インフ ルエンザウイルスＡ型／ケンタッキィー／８１を含めた）ウマ・インフルエンザ ウイルスの他のサブタイプをクローニングして、この病気における変異体の急速 な進化に対して保護するのに有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−０３３、Ｓ−ＳＰ Ｖ−０３４、Ｓ−ＳＰＶ−０３８、およびＳ−ＳＰＶ−０３９はウマ・インフル エンザまたはウマ・ヘルペスウイルス抗原を発現させるための発現ベクターとし て有用である。かかるウマ・インフルエンザまたはウマ・ヘルペスウイルス抗原 は野生型ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスに対して 向けられた抗体を同定するのに有用である。また、該ウイルスは単一特異性ポリ クローナルもしくはモノクローナル抗体の産生のための抗原を生産するにおいて 有用である。かかる抗体はウイルス蛋白質に特異的な診断テストの開発で有用で ある。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断剤として用いられ るウイルス糖蛋白質の精製法」（材料および方法）に従って、これらのウイルス を利用してマウスにおいて創製される。実施例１８Ａ Ｓ−ＳＰＶ−０３３： Ｓ−ＳＰＶ−０３３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する組換え豚痘ウ イルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ） およびウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼにつ いての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ Ｉ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後 期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＩＶ Ａｋ／９１ ＮＡ遺伝子は 合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３２ −１８．４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によっトランスフェク ション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−Ｓ ＰＶ−０３３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青 色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを 、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイ した。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、こ れはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。実施例１８Ｂ Ｓ−ＳＰＶ−０３４： Ｓ−ＳＰＶ−０３４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラグ５６ノイラミニダーゼについての遺 伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位 は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモー ター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＩＶ ＰＲ／５６ ＮＡ遺伝子は合成後期／ 初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３２ −５９Ａ９．２２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を 利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについて のスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトラン スフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果 はＳ−ＳＰＶ−０３４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記 載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウ イルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につき アッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色で あり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示 す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０３４を、ＥＩＶ−特異的抗原の発現につきア ッセイした。ＥＩＶ ＰＲ／５６ ＮＡに対する単一特異性ポリクローナル抗体 はＳ−ＳＰＶ−０３４プラークと特異的に反応するがＳＰＶ−０３４陰性対照プ ラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０３４で観 察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＥＩＶ ＰＲ／５６ ＮＡ性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳ Ｋ−４細胞において行い、これによりＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの 生産についての適当な基礎となろうことが示された。実施例１８Ｃ Ｓ−ＳＰＶ−０３８： Ｓ−ＳＰＶ−０３８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂについての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４ ８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位 で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下に あり、ＥＨＶ−１ ｇＧ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２） の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４４ −３４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達 成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリー ニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０３８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これ はウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。実施例１８Ｄ ＳＳＰＶ−０３９： Ｓ−ＳＰＶ−０３９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｄについての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４ ８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位 で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下に あり、ＥＨＶ−１ ｇＤ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２） の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４４ −３８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達 成された。「β−ガラクトシダーゼを発現すろ組換えＳＰＶについてのスクリー ニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０３９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これ はウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。実施例１９ 組換え豚痘ウイルスは、ウシ・呼吸器系シンシチウムウイルス付着蛋白質（Ｂ ＲＳＶ Ｇ）、ＢＲＳＶ融合蛋白質（ＢＲＳＶ Ｆ）、ＢＲＳＶヌクレオキャプ シド蛋白質（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ｇ４ ８、ＢＶＤＶｇ５３、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）Ｆ 、またはＢＰＩ−３ ＨＮを発現する。Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２ ９、 Ｓ−ＳＰＶ−０３０およびＳ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ−ＳＰＶ−０２８はウシの病 気に対するワクチンとして有用である。これらのＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢ ＰＩ−３抗原は動物において保護免疫応答を生起させるのに鍵となる。組換えウ イルスは単独でまたは効果的なワクチンとして組合せにおいて有用である。豚痘 ウイルスは、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３の他のサブタイプをクロー ニングして、この病気における変異体の急速な進化に対して保護するのに有用で ある。また、Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２９、Ｓ−ＳＰＶ−０３０、 およびＳ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ−ＳＰＶ−０２８はＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、および ＢＰＩ−３抗原を発現させるための発現ベクターとして有用である。かかるＢＲ ＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢＰＩ−３抗原は野生型ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、およびＢ ＰＩ−３に対して向けられた抗体を同定するのに有用である。また、該ウイルス は単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の産生のための抗原と しても有用である。かかる抗体はウイルス蛋白質に特異的な診断テストの開発で 有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断剤として用 いられるウイルス糖蛋白質の精製法」（材料および方法）に従って、これらのウ イルスを利用してマウスにおいて創製される。実施例１９Ａ Ｓ−ＳＰＶ−０２０ Ｓ−ＳＰＶ−０２０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス(ＢＲＳＶ)Ｇについての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＢＲＳＶ Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０２０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７ −２０．５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０２０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２０を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ウシ抗−ＢＲＳＶ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ− ０２０プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは 特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２０で観察されたプ ラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現 していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ −４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示さ れた。 ＢＲＳＶ Ｇ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２０で感 染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析し た。ウシ抗−ＢＲＳＶ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）を用いてＢＲＳＶ特異 的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２０感染細胞からの溶解物は、ＢＲ ＳＶ Ｇ蛋白質の非糖鎖付加形態の予測されるサイズである３６ｋｄにおけるバ ンドおよびＢＲＳＶ Ｇ蛋白質の糖鎖付加形態の予測それるサイズである５３な いし４５ｋｄおよび８０ないし９０ｋｄにおけるバンドを呈した。実施例１９Ｂ Ｓ−ＳＰＶ−０２９： Ｓ−ＳＰＶ−０２９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス(ＢＲＳＶ)Ｆについての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＢＲＳＶ Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０２９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７ −２０．１０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０２９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２９を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ウシ抗−ＢＲＳＶ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ- ０２９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは 特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２９で観察されたプ ラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現 していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ −４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示さ れた。実施例１９Ｃ Ｓ−ＳＰＶ−０３０： Ｓ−ＳＰＶ−０３０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス(ＢＲＳＶ)Ｎについての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＢＲＳＶ Ｎ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７１３ −５５．３７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０３０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０３０を、ＢＲＳＶ特異的抗原の発現につきア ッセイした。ウシ抗−ＢＲＳＶ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ−ＳＰＶ −０３０プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０３０で観察された プラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発 現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳ Ｋ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示 された。 ＢＲＳＶ Ｎ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０３０で感 染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析し た。ウシ抗−ＢＲＳＶ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）を用いてＢＲＳＶ特異 的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０３０感染細胞からの溶解物は、ＢＲ ＳＶ Ｎ蛋白質の予測されるサイズである４３ｋｄにおけるバンドを尾した。実施例１９Ｄ Ｓ−ＳＰＶ−０２８： Ｓ−ＳＰＶ−０２８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・パラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）Ｆについての遺伝子をＳ ＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一の ＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター(Ｌ Ｐ１)の制御下にあり、ＢＰＩ−３ Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター(Ｌ Ｐ２ＥＰ２)の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０２８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７１３ −５５．１０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０２８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２８を、ＢＰＩ−３−特異的抗原の発現につ きアッセイした。ウシ抗−ＢＰＩ−３ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）はＳ− ＳＰＶ−０２８プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラ ークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２８で観察 されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＢＰＩ−３外来性遺伝子 を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で 行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろ うことが示された。 ＢＰＩ−３ Ｆ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２８で 感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に 付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析 した。ウシ抗−ＢＰＩ−３ ＦＩＴＣ（Accurate Chemicals）を用いてＢＰＩ− ３特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２８感染細胞からの溶解物は 、ＢＰＩ−３ Ｆ蛋白質の予測されるサイズである４３ｋｄ、および７０ｋｄに おけるバンドを呈した。実施例１９Ｅ Ｓ−ＳＰＶ−０３２： Ｓ−ＳＰＶ−０３２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)ｇ４８についての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇ４８遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７ −７８．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０３２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。実施例１９Ｆ Ｓ−ＳＰＶ−０４０： Ｓ−ＳＰＶ−０４０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)ｇ５３についての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇ４８遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３８ −９６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達 成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリー ニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０４０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これ はウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。実施例１９Ｇ 船積熱ワクチン 船積熱またはウシ呼吸器系病（ＢＲＤ）合併症はウシの感染性病気およびさら なるストレス関連因子（５２）の組合せの結果として発現される。ストレスの病 理生理学的効果によって増大される呼吸器系ウイルス感染は多数のメカニズムに よるパスツレラ属生物に対するウシの罹患性を改変する。ＢＲＤを開始させるウ イルス感染の制御は該病気症候群（５３）を防止するのに必須である。 ＢＲＤに寄与する主要感染性病気の病原体は、限定されるものではないが、鼻 気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ−３）、 ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス（ＢＲＳＶ）、およびパスツレラ・ヘモリテ ィカ（Paeteurella haemolytica）（５３）を含む。ＢＲＤを引き起こす生物に 対する保護抗原を発現する組換え豚痘ウイルスはワクチンとして有用である。Ｓ −ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰＶ−０２９、Ｓ−ＳＰＶ−０３０、およびＳ−ＳＰ Ｖ−０２８はかかるワクチンの有用な成分である。実施例２０ 組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３１およびＳ−ＳＰＶ−０３５はヒトの病 気に対するワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０３１はＢ型肝炎ウイルス のコア抗原を発現する。Ｓ−ＳＰＶ−０３１はヒトにおいてＢ型肝炎感染に対し て有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０３５はサイトカイン、インターロイキン−２を発 現し、ヒトにおいて免疫応答を増強させるための免疫モジュレーターとして有用 である。Ｓ−ＳＰＶ−０３１およびＳ−ＳＰＶ−０３５を組み合わせると、Ｂ型 肝炎に対して優れたワクチンが生産される。実施例２０Ａ Ｓ−ＳＰＶ−０３１： Ｓ−ＳＰＶ−０３１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および Ｂ型肝炎コア抗原についての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入 した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａ ｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、Ｂ型肝炎コア抗 原遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７ −６７．１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０３１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０３１を、Ｂ型肝炎コア抗原−特異的抗原の発 現につきアッセイした。Ｂ型肝炎コア抗原に対するウサギ抗血清はＳ−ＳＰＶ− ０３１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは 特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０３１で観察されたプ ラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＢ型肝炎コア抗原遺伝子を安定に 発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、Ｅ ＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが 示された。 Ｂ型肝炎コア抗原遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０３１ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。Ｂ型肝炎コア抗原に対するウサギ抗血清を用いてＢ型肝炎特異的蛋白質 の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０３１感染細胞からの溶解物は、Ｂ型肝炎コア 抗原の予測されるサイズである２１ｋｄにおけるバンドを呈した。実施例２０Ｂ： Ｓ−ＳＰＶ−０３５： Ｓ−ＳＰＶ−０３５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ヒトＩＬ−２についての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した （唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ 遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ヒトＩＬ−２遺伝子 は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０３５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４１ −８４．１４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０３５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。実施例２１ 組換え豚痘ウイルスをベクターとして用いるヒト・ワクチン 組換え豚痘ウイルスはヒトの病気に対するワクチンとして有用である。例えば 、ヒト・インフルエンザウイルスは、その中和ウイルス・エピトープが急速に変 化する、急速に進化するウイルスである。有用な組換え豚痘ワクチンは、該イン フルエンザウイルス中和エピトープがインフルエンザウイルスの新しい株に対し て保護するための組換えＤＮＡ技術によって迅速に適合されるものである。ヒト ・インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＮ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ） 遺伝子は、「ウマ・インフルエンザウイルス血球凝集素およびノイラミニダーゼ 遺伝子のクローニング」（材料および方法および実施例１７参照）に記載されて いるように豚痘ウイルスにクローン化される。 組換え豚痘ウイルスは、以下の病気類または病気微生物からの外来性抗原が豚 痘ウイルスベクターで発現されると、他のヒトの病気に対するワクチンとして有 用である：Ｂ方肝炎ウイルス表面およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫 不全ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス、単純疱疹ウイルス−１、単純疱疹ウイ ルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタンバールウイルス、バリセラ −ゾスター（Varicella-Zoster）ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト ・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターン（ hantaan）ウイルス、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼 吸器系シンシチウムウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス、 狂犬病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、マラリア(プラスモジウム・ファル シパルム(Plasmodium falciparum))、ボルデテリア・ペルトゥスシス(Bordetelia pertussis)、ジフテリア、リケッチア・プロワゼッキィー(Rickettsia prowazek ki)、ボレリア・ベルグドルフェリ（Borrelia bergdorferi）、破傷風トキソイ ド、悪性腫瘍抗原。 さらに、Ｓ−ＳＰＶ−０３５（実施例２０）は、豚痘ウイルス・インターロイ キン−２と組み合わせると、ヒトにおいて免疫応答を増強するのに有用である。 限定されるものではないが、ヒトおよび他の動物からのインターロイキン−２、 インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターフェロン、顆粒球− マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン受容体を含めたさらなるサ イトカインは、豚痘ウイルス・ゲノム中の非必須部位にベクターにより入れられ 、引き続いて発現されると、免疫刺激効果を有する。 組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系で外来性遺伝子を発現する。Ｓ−ＳＰＶ−０ ０３（ｌａｃＺ遺伝子を発現するＥＰ１ＬＰ２プロモーター）は、β−ガラクト シダーゼ活性を測定することによると、ＴＨＰヒト単球細胞系においてｌａｃＺ 遺伝子を発現した。豚痘ウイルスの細胞障害効果がＴＨＰヒト単球細胞で観察さ れ、これは組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系で外来性遺伝子を発現するが、ヒト 細胞系において再現性よく感染したり複製されないことを示す。豚痘ウイルスは ＥＳＫ−４細胞（胚性ブタ腎臓）でよく複製されることが示され、これはＥＳＫ −４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことを示す 。実施例２２ 組換え豚痘ウイルスをベクターとして用いる鳥類ワクチン実施例２２Ａ Ｓ−ＳＰＶ−０２６ Ｓ−ＳＰＶ−０２６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリプロテインについての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子は合成初期／後期プロモーター( ＥＰ１ＬＰ２)の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０２６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６８９ −５０．４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０２６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２６を、ＩＢＤＶポリプロテイン−特異的抗 原の発現につきアッセイした。ＩＢＤＶポリプロテインに対するラット抗血清は Ｓ−ＳＰＶ−０２６プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照 プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２６で 観察されたプラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＢＤＶポリプロテ イン遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ −４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した 基礎となろうことが示された。 ＩＢＤＶポリプロテイン遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０２６で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロット し、分析した。ＩＢＤＶプロテインＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４に対するラッ ト抗血清ならびにＩＢＤＶ ＶＰ２に対するモノクローナル抗体を用いてＩＢＤ Ｖプロテインの発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２６感染細胞からの溶解物は、 ＩＢＤＶプロテインの予測されるサイズである３２ないし４０ｋｄにおけるバン ドを呈した。実施例２２Ｂ Ｓ−ＳＰＶ−０２７ Ｓ−ＳＰＶ−０２７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性包病ウイルス(ＩＢＤＶ)ＶＰ２(４０ｋｄ)についての遺伝子をＳＰＶ ６ １７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ 制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰＩ ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０２７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター６８９ −５０．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０２７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０２７を、ＩＢＤＶ ＶＰ２−特異的抗原の発 現につきアッセイした。ＩＢＤＶプロテインに対するラット抗血清はＳ−ＳＰＶ −０２７プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０２７で観察された プラークは抗血清と反応し、これは該ウイルスがＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を安定 に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、 ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうこと が示された。 ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０２７ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。ＩＢＤＶプロテインに対するラット抗血清ならびにＩＢＤＶ ＶＰ２に 対するモノクローナル抗体Ｒ６３を用いてＩＢＤＶ ＶＰ２プロテインの発現を 検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０２７感染細胞からの溶解物は、ＩＢＤＶ ＶＰ２プロ テインの予測されるサイズである４０ｋｄにおけるバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０２６およびＳ−ＳＰＶ−０２７はニワトリにおける感染性包病 に対するワクチンとして、およびＩＢＤＶプロテインについての発現ベクターと しても有用である。組換え豚痘ウイルスは、以下の病気類または病気微生物から の外来性抗原が豚痘ウイルスベクターで発現されると、他の鳥類病に対するワク チンとして有用である：マレク病ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、ニュー カッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、およびニワトリ貧血ウイルス、 ひよこ貧血ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミキ ソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス 、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、サルモネラ(Salmonella)種イー・コ リ、パスツレラ（Pasteurella）種、ヘモフィラス（Haemophilus）種、クラミジ ア(Chlamydia)種、マイコプラズマ（Mycoplasma）種、カンピロバクター（Campy lobacter）種、ボルデテラ(Bordetella)種、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／ シラミ、家禽原虫（エイメリア(Eimeria)種、ヒストモナス（Histomona）種、ト リコモナス（Trichomonas）種）。実施例２３ ＳＰＶ−０３６ Ｓ−ＳＰＶ−０３６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）をＳＰ Ｖ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮ ｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子はヒト・サイトメガロウイルス 即時型（ＨＣＭＶ ＩＥ）プロモーターの制御下にある。。 Ｓ−ＳＰＶ−０３６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４１ −８０．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０３６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターからのｌａｃＺの発現は豚痘における外来性遺伝 子の発現のための強力なプロモーターを提供する。Ｓ−ＳＰＶ−０３６はポック スウイルスにおいて外来性遺伝子の発現を駆動するヘルペスウイルス・プロモー ターの新規で予期せぬ証明である。Ｓ−ＳＰＶ−０３６はヒト・ワクチンを処方 するのに有用であり、組換え豚痘ウイルスはヒト病原体からの抗原の中和の発現 で有用である。組換え豚痘ウイルスは、ＴＨＰヒト単球細胞系においてＳ−ＳＰ Ｖ−００３（ｌａｃＺ遺伝子を発現するプロモーター（ＥＰ１ＬＰ２））がβ− ガラクトシダーゼを発現したことから示されるように、ヒト細胞系で外来性遺伝 子を発現した。ＴＨＰヒト単球細胞に対する豚痘ウイルスの細胞障害効果は観察 されず、これは組換え豚痘ウイルスがヒト細胞系で外来性遺伝子を発現できるが 、ヒト細胞系において再現性よく感染せず複製されないことを示す。実施例２４ 相同性ベクター７３８−９４．４ 相同性ベクター７３８−９４．４は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイル スベクターである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）についての遺 伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレーム（配列番号：１１５）に挿入した。 ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。該相同性ベクター７３８ −９４．４は、Ｏ１Ｌ ＯＲＦの一部を示すヌクレオチド１６７９ないし２４５ ２（配列番号：１８９；図１７）からのＳＰＶ ＤＮＡの欠失を含む。 ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡ ＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡ ＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴ ＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって上流Ｓ ＰＶ配列を合成してＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得 た。Ｏ１Ｌプロモーターはこの断片上に存在する。ＤＮＡプライマー５’−ＣＣ ＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧ ＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡ ＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８ ８）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって下流ＳＰＶ配列を合成してＳａｌＩお よびＨｉｎＩＩＩ末端を持つ１１１３塩基対断片を得た。組換え豚痘ウイルスは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３８ −９４．４およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１（Kansza株）を利用して誘導した 。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」 （ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ス トックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は該組換えウイルス であった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニター した複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、お よびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察 された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外 来性遺伝子を発現することを示す。相同性ベクター７３８−９４．４から誘導さ れた組換え豚痘ウイルスは、外来性抗原を発現させるための発現ベクターとして 、および組換え豚痘ウイルスによって発現された外来性遺伝子に対して動物で保 護免疫応答を生起させるためのワクチンとして利用される。Ｏ１Ｌプロモーター に加えて、ＬＰ１、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、ＨＣＭＶ即時型を含めた他の プロモーターが欠失領域に挿入され、１以上の外来性遺伝子がこれらのプロモー ターから発現される。実施例２４Ｂ 相同性ベクター７５２−２２．１は２つの外来性遺伝子を発現させるのに利用 される豚痘ウイルスベクターである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）についての遺伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレーム（配列番号：１１ ５）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。第２の 外来性遺伝子は、ＬＰ２ＥＰ２プロモーター配列に従ってＥｃｏＲＩまたはＢａ ｍＨＩ部位に挿入されたＬＰ２ＥＰ２プロモーターから発現される。相同性ベク ター７５２−２２．１は、Ｏ１Ｌ ＯＲＦの一部を欠失するヌクレオチド１６７ ９ないし２４５２（配列番号：１８９；図１７）からのＳＰＶ ＤＮＡの欠失を 含む。相同性ベクター７５２−２２．１はＬＰ２ＥＰ２プロモーター断片の挿入 によって相同性ベクター７３８−９４．４から誘導された(材料および方法参照) 。相同性ベクター７５２−２２．１は、合成ＬＰ１プロモーターの制御下にある ｌａｃＺ遺伝子を入れることによってさらに改良される。該ＬＰ１プロモーター の結果、ＳＰＶ Ｏ１Ｌプロモーターと比較してより高いレベルのｌａｃＺ発現 となる。実施例２５ Ｓ−ＳＰＶ−０４１： Ｓ−ＳＰＶ−０４１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）についての遺伝子を７３８−９ ４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６ ７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は 豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は合成後期／ 初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４１はＳ-ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「 組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５２− ２９．３３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０４１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４１はウマにおいてＥＨＶ−１感染に対するワクチンとして有 用であって、ＥＨＶ−１糖蛋白質Ｂの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０４５： Ｓ−ＳＰＶ−０４５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）についての遺伝子を７３８−９ ４．４ＯＲＦ（ＳＰＸ７ ＯｌＬ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１ ６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子 は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子は合成後期／ 初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４６ −９４．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０４５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＩＢＲＶ糖蛋白質Ｅの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０４９： Ｓ−ＳＰＶ−０４９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質４８（ｇｐ４８）についての遺伝子を７ ３８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレ オチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃ Ｚ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇｐ４８遺伝子 は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７７１ −５５．１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４９はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用 であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質４８の発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０５０： Ｓ−ＳＰＶ−０５０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇｐ５３）についての遺伝子を７ ３８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレ オチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃ Ｚ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇＥ遺伝子は合 成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６７ −６７．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０５０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０５０はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用 であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。実施例２６ 各々ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）またはニワトリ骨髄単球成長因 子（ｃＭＧＦ）を発現する組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２またはＳ−Ｓ ＰＶ−０４３は、家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強す るのに有用である。ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物インター ロイキン−６蛋白質と相同であり、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）は 哺乳動物インターフェロンと相同である。特異的鳥類病に対するワクチンと組み 合わせて用いると、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ−０４３は、限定され るものではないが、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性咽頭 気管炎ウイルス、感染性気管支炎、感染性包病ウイルスを含めた鳥類を引き起こ すウイルスに対して増強された粘液性、体液性、または細胞媒介免疫を供する。実施例２６Ａ Ｓ−ＳＰＶ−０４２： Ｓ−ＳＰＶ−０４２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４ ８．１ ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換え た）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下に あり、ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下 にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１ −０７．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４２は細胞培養においてインターフェロン活性を有する。Ｓ− ＳＰＶ−０４２条件培地のニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞培養への添加は 、水泡性口内炎ウイルスによる、またはシチメンチョウのヘルペスウイルスによ るＣＥＦ細胞の感染を阻害する。Ｓ−ＳＰＶ−０４２は家禽の病気に対するワク チンに添加すると、免疫応答を増強するのに有用である。実施例２６Ｂ Ｓ−ＳＰＶ−０４３： Ｓ−ＳＰＶ−０４３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４８ ．１ ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換えた ）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあ り、ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１ −５６．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４３は家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を 増強させるのに有用である。実施例２７ 非必須部位の、豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の ２．０ｋｂＨｉｎｄＩＩＩないしＢｇｌＩＩ領域への挿入 豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の２．０ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩないしＢ ｇｌＩＩ領域は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入で有用である。外来性ＤＮＡは該 領域における唯一のＢｇｌＩＩ制限部位に挿入される（図１７；配列番号：１９ ５のヌクレオチド５４０）。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に 従って、外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを用いて外来性ＤＮＡを 含有するＳＰＶを得る。この手法が首尾よく行われるためには、挿入部位がＳＰ Ｖの複製に必須でない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡと の間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接す ることが重要である。豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の２．０ｋｂ Ｈｉ ｎｄＩＩＩないしＢｇｌＩＩ領域における唯一のＢｇｌＩＩ制限部位はＳＰＶＩ ４Ｌオーブンリーディングフレームの暗号領域内に位置する。該Ｉ４Ｌ ＯＲＦ はワクシニアウイルスおよび天然痘ウイルス・リボヌクレオチド・レダクターゼ （大サブユニット）遺伝子（５６−５８）に対して配列同様性を有する。該リボ ヌクレオチド・レダクターゼ（大サブユニット）遺伝子はワクシニアウイルスの ＤＮＡ複製に非必須であって、豚痘ウイルスにおける適当な挿入部位である。実施例２８ Ｓ−ＳＰＶ−０４７ Ｓ−ＳＰＶ−０４７は２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位（Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｍ断片の２．０ｋｂ ＢｇｌＩＩないしＨｉｎｄＩＩＩサブ断片内に あるＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカ ー）に挿入した。該ＢｇｌＩＩ挿入部位は、ワクシニアウイルス・リボヌクレオ シド二リン酸レダクターゼ遺伝子に対して有意な相同性を有するＳＰＶ １４Ｌ オープンリーディングフレーム内にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモータ ー（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期 プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９９ −９４．３１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０４７を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０４７プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０４７で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４７で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋 白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４７感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ糖 蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応 するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢはブタにおいて有意な免疫応答を刺 激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶｇＢ を組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得ら れる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＰＲＶ病に対し てブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワク チンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を 感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣ ｈｅｋＲ、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋＲおよびＣｌｉｎＥａｓｅＲ）と適合するで あろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５２ Ｓ−ＳＰＶ−０５２は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（Ｓ ＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｄｅＩ部位に挿入され たＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基 対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配 列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）についての遺 伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム 中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ 遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩ Ｉ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、 ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２） の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０５２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５２を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５２プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５２で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０５２で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲ Ｖ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５２感染細胞からの溶解物お よび上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤ および５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズ である４８ｋＤに対応するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢおよびｇＤはブタにおいて有意な免 疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、 ＰＲＶｇＢおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃か らの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０ ５２はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここ に記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それら はワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テス ト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａｓ ｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５３ Ｓ−ＳＰＶ−０５３は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（Ｓ ＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入された ＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基対 ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列 番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺 伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム 中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ 遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩ Ｉ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、 ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２ ）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０５３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５３プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５３で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＣ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０５３で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲ Ｖ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５３感染細胞からの溶解物お よび上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤ および５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズ である９２ｋＤに対応するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢおよびｇＣはブタにおいて有意な免 疫応答を刺激することが示されている（３７、３８:実施例８参照）。さらに、 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＣを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃 からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ− ０５３はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。こ こに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それ らはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テ スト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａ ｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５４ Ｓ−ＳＰＶ−０５４は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ ＳＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入され たＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基 対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配 列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）についての遺 伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム 中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ 遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩ ＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあって 、ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２ ）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０５４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５４を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５４プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５４で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０５４で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲ Ｖ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５４感染細胞からの溶解物お よび上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバ ンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバ ンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有意な免 疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、 ＰＲＶ ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃 からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ− ０５４はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。こ こに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それ らはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テ スト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａ ｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５５ Ｓ−ＳＰＶ−０５５は４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（Ｓ ＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入された ＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基対 ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列 番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）およびＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ ＯｌＬ オ ープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリン カー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下 にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成後期／初期プロ モーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子 は合成初期／後記プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．７３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０５５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５５プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５５で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ ＰＶ−０５５で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用い て、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用い てＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５５感染細胞からの溶 解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６ ７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド；ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズ である９２ｋＤに対応するバンド；およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズ である４８ｋＤに対応するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有 意な免疫応答を誘発することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さ らに、ＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰ ＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、 Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価 値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しな いので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行 ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^Rおよび ＣｌｉｎＥａｓｅ^R）と適合するであろう。実施例２９ ＳＰＶ−０５９ Ｓ−ＳＰＶ−０５９は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｋゲノム断片内にあるＳＰＶ Ｂ１８Ｒオープンリーディングフレー ム中の唯一のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初 期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ ６．５ｋｂ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｋ断片（配列番号）の３．２ｋｂ領域からの部分配列は、３つの可能 なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｂ１８Ｒ ＯＲＦはワクシニ アウイルスＢ１８Ｒ遺伝子、ウサギ線維腫ウイルスからの７７．２Ｋ蛋白質、ワ クシニアウイルスＣ１９Ｌ／Ｂ２５Ｒ ＯＲＦおよびヒト脳変異体からのアンキ リン反復領域に相同な配列を示す。該Ｂ１８Ｒ遺伝子は高親和性および広い特異 性を持つ可溶性インターフェロン受容体をコードする。ＳＰＶ Ｂ４Ｒオープン リーディングフレームはウサギ線維腫ウイルスのＴ５蛋白質に相同の配列を示す 。 Ｓ−ＳＰＶ−０５９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −５０．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−５０．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ６．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片中の唯一の ＥｃｏＲＩ部位（平滑末端化）への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺 伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってト ランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終 結果はＳ−ＳＰＶ−０５９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法 に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、こ のウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性に つきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 Ｓ−ＳＰＶ−０５９を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは７．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。ＳＰＶ−０６０ Ｓ−ＳＰＶ−０６０は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｎゲノム断片内にある唯一のＥｃｏＲＶ制限部位に挿入した。該ｕｉ ｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。Ｓ ＰＶ ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの 可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｉ７Ｌ ＯＲＦはワクシ ニアウイルスの蛋白質１７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ Ｉ４Ｌオープンリー ディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクタ ーゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ ＯＲＦおよびＩ７Ｌ ＯＲＦの間の、 ２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知で ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −７１．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−７１．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（図２９Ａ ）中の唯一のＥｃｏＲＶ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝 子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトラ ンスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結 果はＳ−ＳＰＶ−０６０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に 記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、この ウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につ きアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６０を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６１ Ｓ−ＳＰＶ−０６１は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｎゲノム断片内にある唯一のＳｎａＢＩ制限部位に挿入した。該ｕｉ ｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。Ｓ ＰＶ ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの 可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｉ７Ｌ ＯＲＦはワクシ ニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ Ｉ４Ｌオープンリー ディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクタ ーゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ ＯＲＦおよびＩ７Ｌ ＯＲＦの間の、 ２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知で ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −７１．４１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−７１．４１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の唯一の ＳｎａＢＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する 組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０６１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイ ルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６１を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片内のＳｎａＢＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６２ Ｓ−ＳＰＶ−０６２は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｎゲノム断片内にある唯一のＢｇｌＩＩ制限部位に挿入した。該ｕｉ ｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。Ｓ ＰＶ ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの 可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｉ７Ｌ ＯＲＦはワクシ ニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ Ｉ４Ｌオープンリー ディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクタ ーゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ ＯＲＦおよびＩ７Ｌ ＯＲＦの間の、 ２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知で ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −７１．５１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−７１．５１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の唯一の ＢｇｌＩＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する 組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０６２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイ ルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６２を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片内のＢｇｌＩＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。実施例３０： 合成初期または合成痘プロモーターの制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシ ダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する組換え豚痘ウイルス 各々、合成痘プロモーターＬＰ１、ＬＰ２、およびＥＰ１の制御下にあるイー ・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する３つの組換え豚痘ウイルス Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７、およびＳ−ＳＰＶ−０５８を構築し た。 Ｓ−ＳＰＶ−０５６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９１ −６３．１９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５７はＳ−ＳＰＶ −００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相 同組換え法」において相同性ベクター７９１−６３．４１（材料および方法参照 ）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシ ダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬお よびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニ ングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した 。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクタ ー７９６−１８．９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１ を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについ てのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトラ ンスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結 果はＳ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７およびＳ−ＳＰＶ−０５８と命名 した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセ イによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダ ーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウ ンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋 で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系においてイー・コリβ−ガラクトシダーゼの ごとき外来性遺伝子を発現するが、ヒト細胞系において複製しない。外来性遺伝 子の発現を最適化するために、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７および Ｓ−ＳＰＶ−０５８を用いて、初期または後期合成ポックスウイルス・プロモー ターの制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシダーゼの最適発現レベルを比較す る。組換え豚痘ウイルスの発現が欠失されているヒト細胞系は、限定されるもの ではないが、１４３Ｂ（骨肉腫）、Ａ４３１（類表皮癌）、Ａ５４９（肺癌）、 Ｃａｐａｎ−１（肝臓癌）、ＣＦ５００（包皮繊維芽細胞）、Ｃｈａｎｇ Ｌｉ ｖｅｒ（肝臓）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（ダウン包皮繊維芽細胞）、ＨＥＬ−１９９（ 胚性肺）、ＨｅＬａ（子宮頸部癌）、ＨＥｐ−２（表皮咽頭癌）、ＨＩＳＭ（腸 平滑筋）、ＨＮＫ（新生児腎臓）、ＭＲＣ−５（胚性肺）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ 肺粘膜表皮癌）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）、ＲＤ（横紋筋肉腫）、ＴＨＦ（単 球白血球）、ＷＩＬ２−ＮＳ（Ｂリンパ球系、非分泌）、ＷＩＳＨ（羊膜）を含 む。実施例３１ Ｓ−ＳＰＶ−０５１ Ｓ−ＳＰＶ−０５１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇ５３）についての遺伝子をＳＰ Ｖ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮ ｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター(ＬＰ １)の制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子は合成後期／初期プロモーター(Ｌ Ｐ２ＥＰ２)の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８３ −３９．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０５１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５１を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ＢＶＤＶ ｇ５３に対するマウス・モノクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ −０５１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５１で観察された プラークはＢＶＤＶ ｇ５３に対するモノクローナル抗体と反応し、これは該ウ イルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載した アッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はｓＰＶ組換えワクチンの生 産のために適した基礎となろうことが示された。 ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５１ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。ＢＶＤＶ ｇ５３に対するモノクローナル抗体を用いてＢＶＤＶ特異的 蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５１感染細胞からの溶解物および上清 は、ＢＶＤＶ ｇ５３蛋白質の糖鎖付加および非糖鎖付加形態を示す５３ｋｄお よびそれを超えるバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０５１はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用 であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。実施例３２： Ｓ−ＳＰＶ−０４４： Ｓ−ＳＰＶ−０４４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ蛋白質についての遺伝子を６１７ −４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限 部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御 下にあり、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４９ −７５．７８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質の発現に有用である。Ｓ− ＳＰＶ−０４４は組換えＩＢＤＶ弱毒化ワクチンに対するイン・ビトロのアプロ ーチで有用である。Ｔ３またはＴ７プロモーター(pBlueScriptプラスミド；Stra tagene,Inc.)を用いて弱毒化ＩＢＤＶ株からのＲＮＡ鎖を細菌発現系で合成して 、ＩＢＤＶゲノムの二本鎖短鎖および長鎖セグメントを合成する。豚痘ウイルス はＩＢＤＶポリメラーゼを発現するが、ＣＥＦ細胞中で複製しない。Ｓ−ＳＰＶ −０４４から産生されたＩＢＤＶポリメラーゼは、二本鎖ＲＮＡゲノム鋳型から 感染性弱毒化ＩＢＤＶウイルスを合成する。得られた弱毒化ＩＢＤＶウイルスは ニワトリにおいて感染性包病に対するワクチンとして有用である。実施例３３： Ｓ−ＳＰＶ−０４６ Ｓ−ＳＰＶ−０４６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇプロテアーゼ（ｇａｇ）についての遺伝 子を７３８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの７７３塩基対欠失； ヌクレオチド１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。 ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６１ −７５．Ｂ１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利 用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについての スクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランス フェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は Ｓ−ＳＰＶ−０４６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載 した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイ ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきア ッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４６で 感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブ ロットし、分析した。ネコ抗−ＦＩＶ（ＰＰＲ株）血清を用いてＦＩＶ特異的蛋 白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４６感染細胞からの溶解物および上清は 、ＦＩＶ ｇａｇ蛋白質の予測されたサイズである２６ｋｄおよび１７ｋｄにお けるバンドを呈した。組換え豚痘ウイルスにより発現されたＦＩＶ ｇａｇ蛋白 質は適当に加工され、培地に分泌された。Ｓ−ＳＰＶ−０４８ Ｓ−ＳＰＶ−０４８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）についての遺伝子をＳ ＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一の ＮｃｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（Ｌ Ｐ１）の制御下にあり、ＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子は合成後期／初期プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８１ −８４．Ｃ１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利 用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについての スクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランス フェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は Ｓ−ＳＰＶ−０４８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載 した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイ ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきア ッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 Ｓ−ＳＰＶ−０４６およびＳ−ＳＰＶ−０４８は単独でまたはネコにおけるＦ ＩＶ感染に対するワクチンとしての組合せにおいて有用であって、ＦＩＶ ｅｎ ｖおよびｇａｇ蛋白質の発現に有用である。ＦＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質 双方を発現する組換え豚痘ウイルスはネコにおいてＦＩＶ感染に対するワクチン として有用である。 ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスＦおよびＧ蛋白質を発現する組換え豚痘ウ イルスはヒトの病気に対するワクチンとして有用である。実施例３４ 組換えポックスウイルスで発現されたニワトリＩＦＮのイン・ビトロ特性 細胞培養における組換えウイルスの増殖特性。野生型豚痘ウイルスと比較して 、Ｓ−ＳＰＶ−０４２は胚性ブタ腎臓細胞（ＥＳＫ−４）において増殖しなかっ た。 ＳＰＶ／ｃＩＦＮ組換えウイルスで感染させた細胞からの上清につきウェスタ ンブロット分析を行った。ウサギおよびマウス抗血清を、濃縮ＳＰＶ／ｃＩＦＮ 感染不和済みからのｃＩＦＮに対して生起させ、ウェスタン分析用の調製におい て、野生型ＳＰＶで感染させたＥＳＫ−４細胞に対して予め清澄化させた。ウサ ギおよびマウス抗−ｃＩＦＮ抗血清は、組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮおよびＳＰＶ野 生型ウイルス感染上清からのニトロセルロース上の変性蛋白質と反応した。１７ −２０キロダルトンの推定分子量サイズ範囲を持つ反応性バンドがＳＰＶ／ｃＩ ＦＮレーンに存在し、ＳＰＶ野生型対照レーンでは存在しなかった。水泡性口内炎ウイルスの増殖に対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ（Ｓ−ＳＰＶ−０４２） 、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ、およびＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ感染細胞からの上清で発 現されたｃＩＦＮの効果 ＳＰＶ／ｃＩＦＮ、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ｃＩＦＮ感染細胞からのビリオン清澄 化上清をウイルス阻害活性の存在につきテストし、結果を表１に示す。略言すれ ば、ＣＥＦ細胞を系列希釈したウイルス上清と共にインキュベートした。引き続 いて、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の４０,０００プラーク形成単位（ｐｆ ｕ）／ウェルを添加し、４８時間後にＶＳＶ細胞障害効果（ＣＰＥ）につきウェ ルをスコア取りした。ｃＩＦＮを含有する組換えウイルス上清はＶＳＶ誘導ＣＰ Ｅを阻害することが示され、他方、対照ウイルス上清は阻害しなかった。ＶＳＶ 誘導細胞障害効果はウサギ抗−ｃＩＦＮ血清の存在下では逆になったであろう。 表１ 組換えウサギ上清 ｃＩＦＮ活性（単位／ｍｌ）^a ＳＰＶ／ＩＦＮ ２，５００，０００ ＳＰＶ ＜１００ ＦＰＶ／ＩＦＮ ２５０，０００ ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ ２５０，０００ ＦＰＶ ＜１００ ａ １単位の活性は、１００％ＶＳＶ ＣＰＥが阻害されるポックスウイ ルス上清の希釈であると定義される。シチメンチョウのヘルペスウイルスに対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞の上清か ら発現されたｃＩＦＮの効果 ＳＰＶ／ｃＩＦＮウイルスで感染したＥＳＫ−４細胞からの組換えｃＩＦＮを 含有する上清を、ＣＥＦ細胞におけるシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶ Ｔ）の増殖を阻害するその活性につきテストし、結果を表２に示す。略言すれば 、系列希釈上清をＣＥＦ細胞と共にインキュベートし、次いで、１００ｐｆｕ／ ウ ェルの野生型ＨＶＴで感染させた。４８時間後に全てのウェルでプラークを計数 した。１０−１００単位のｃＩＦＮ活性はＨＶＴ（１００ｐｆｕ／ウェル）のプ ラーク形成を阻害した。野生型ＳＰＶからの上清はＨＶＴプラーク形成を阻害し なかった。 表２ ＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清 ＨＶＴプラークの数 （単位／ｍｌ^a） ０ ９９ １０００ ０ １００ ０ １０ ４５ a １単位のｃＩＦＮ活性は１００％のＶＳＶ ＣＰＥが阻害され るポックスウイルス上清の希釈であると定義される。ＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたｃＩＦＮでの処理の後におけ るニワトリ・マクロファージによるＮＯの誘導 ＨＤ１１細胞または骨髄接着性細胞をＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清からの１０００単 位／ｍｌのｃＩＦＮ、リポ多糖（ＬＰＳ）（９ｎｇ／ｍｌ）またはｃＩＦＮおよ びＬＰＳ双方と共にインキュベートし、結果を表３に示す。２４時間後、上清流 体を収集し、亜硝酸塩レベルを測定した。これらのデータは、ＳＰＶ／ｃＩＦＮ 上清から発現されたｃＩＦＮがＬＰＳの存在下でニワトリ・マクロファージを活 性化する能力を有することを示す。 表３ 以下のもので刺激した後における亜硝酸塩レベル （マイクロ／モル） 細胞源 ＬＰＳ ＳＰＶ／ｃＩＦＮ ＬＰＳ＋ＳＰＶ／ｃＩＦＮ ＨＤ１１ １０．７６ ６．４ ３５．２９ ＢＭＡＣ １３．１ ５．８ ３５．１０ 結論： １．組換え豚痘ウイルスは、ＶＳＶ感染からのＣＥＦ細胞の保護によって測定 して、生物学的に活性なニワトリ・インターフェロンを感染細胞の上清中に発現 する。 ２．組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたニワトリ・イン ターフェロンは用量依存的にＨＶＴでの感染に対してＣＥＦ細胞を保護すること が示された。 ３．ＳＰＶ／ｃＩＦＮから発現されたニワトリ・インターフェロンはＰＬＳと 相乗的に作用して、一酸化窒素誘導によって検出して、ニワトリ・マクロファー ジを活性化する。 ４．前記データは、ニワトリＩＦＮを発現する組換え豚痘ウイルスがイン・ビ トロ、イン・ビボおよびイン・オボにおいて免疫変調剤として遊離な適用を有し 得ることを示す。実施例３５ ウイルスベクターによる送達系および／またはサブユニット・アプローチを用 いるＩＢＤワクチンの構築の別法として、ＩＢＤウイルスＲＮＡを直接操作して 、大（セグメントＡ）および小（１７グメントＢ）二本鎖ＲＮＡサブユニット双 方を表すｃＤＮＡクローンから誘導された全長ＲＮＡを用いてウイルスを再構築 する。ＩＢＤウイルスの生成はこのようにして最初の２つのアプローチよりも優 れたいくつかの利点を与える。まず、もしＩＢＤウイルスをＲＮＡ鋳型を用いて 再度生成すれば、転写（ＲＭＡの生成）に先立ってウイルス・ゲノムのクローン 化ｃＤＮＡコピーを操作することができる。このアプローチを用い、ビルレント ＩＢＤ株を弱毒化するか、あるいは弱毒化ワクチン骨格のＶ２可変領域をビルレ ント株のそれで置き換えることができる。そうする場合において、本発明は、ワ クチン株の安全性および効率を供しつつ、ビルレントＩＢＤ株に対する保護を提 供する。 さらに、このアプローチを用い、本発明により、関連ビルナウイルス感染性膵臓 壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）から誘導されたＲＮＡポリメラーゼおよびＩＰＮＶか ら誘導されたポリプロテインを用いて生成した温度感受性ＩＢＤウイルスが構築 されテストされる。ＩＰＮＶポリメラーゼはＩＢＤＶのそれよりも低い温度で最 適活性を有する。もしＩＰＮＶポリメラーゼがＩＢＤＶ上に存在する調節シグナ ルを認識すれば、ハイブリッド・ウイルスはニワトリに存在する高温で弱毒化さ れることが期待される。別法として、ＩＢＤＶ血清型２ウイルスから誘導された ＲＮＡポリメラーゼおよびＩＢＤＶ血清型１ウイルスから誘導されたポリプロテ インを用いて生成されたＩＢＤウイルスを構築しテストできる。 最初にBursaVacワクチン株(Sterwin Labs)を用いて、ＩＢＤＶの完全なゲノム （二本鎖ＲＮＡセグメントＡおよびＢ）を表すｃＤＮＡクローンを構築する。一 旦セグメントＡおよびＢの全長コピーを表すｃＤＮＡクローンが構築されたなら ば、鋳型ＲＮＡが調製される。ＩＢＤＶは二セグメント化二本鎖ＲＮＡウイルス として存在するので、pBlueScriptプラスミド(Stratagene,Inc.)を用いて、各セ グメントのセンスおよびアンチセンス両ＲＮＡ鎖を得る。これらのベクターは、 イン・ビトロで実質量のＲＮＡを得るために高度に特異的なファージ・プロモー ターを利用する。唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を３’ＰＣＲプライマーに 作成して、転写の間にラン−オフ転写体の生成のためにＤＮＡを線状化する。 精製されたＲＮＡ転写体（４鎖）をニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）にトラン スフェクトして該ＲＮＡが感染性であるか否かを判断する。ＩＢＤＶ特異的Ｍａ ｂｓを用いる黒色プラーク・アッセイによって判断してもしＩＢＤウイルスが生 成すれば、さらなる操作は必要ではなく、ワクチン株の作成を開始できる。この 方法の利点は、このようにして作成されたＩＢＤウイルスは純粋でほとんど／全 く精製を要せず、新しいワクチンを創製するのに要する時間を大幅に減少させる ということである。もし精製されたＲＮＡを用いて陰性結果が得られれば、ヘル パーウイルスの使用による機能的ウイルスＲＮＡポリメラーゼが必要である。ビ ルナウイルスは鎖置き換え（半保存的）メカニズムによってその核酸を複製し、 ＲＮＡポリメラーゼは二本鎖ＲＮＡ分子の末端に結合し、環化された環構造を形 成する(Muller & Nitschke,Virology 159,174-177,1987)。豚痘ウイルスにおけ る約８７８アミノ酸のＲＮＡポリメラーゼ・オープンリーディングフレームを発 現させ、この組換えウイルス（Ｓ−ＳＰＶ−０４４）を用いて、イン・トラント にて機能的ＩＢＤＶ ＲＮＡを得る。ウイルス・ベクターの生成的複製の徴候が ない場合、豚痘ウイルスは免疫学的に認識可能な外来性抗原を鳥類細胞（ＣＥＦ 細胞）にて発現した。本発明においては、ＳＰＶ複製で細胞を汚染することくな く、豚痘ベクターを用いてＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質をトリンスフェクトした ＲＮＡとしで同一細胞内で発現させる。 ゲノムＲＮＡを用いてＩＢＤウイルスはイン・ビトロで生成されるということ が証明されれば、感染性包病に対する改良された弱毒化ウイルス生ワクチンが開 発される。生成するＩＢＤウイルスの新しく規定された系と共に組換えＤＮＡ技 術を用いて、弱毒化ウイルスの構築を容易とするウイルス・ゲノム内の特異的欠 失が作成される。この技術を用い、病原性の原因となるＩＢＤＶの領域および弱 毒化された免疫原性ＩＢＤＶワクチンが同定される。本発明はビルレントＩＢＤ 株または弱毒化ワクチン骨格のＶＰ２可変領域のビルレント株のそれでの置き換 えを提供し、かくして、ワクチン株の安全性および効果を供しつつ、ビルレント 株に対して保護する。実施例３６ シチメンチョウのヘルペスウイルスの増殖に対するウサギ抗ーニワトリ・イン ターフェロン（ｃＩＦＮ）抗体の効果 ＳＰＶ／ｃＩＰＮ（ＳＰＶ０４１）感染ＥＳＫ−４細胞からの上清を感染４８ 時間後に収穫し、次いで、Centricon 10カラム（Amicon）によって５−１０倍濃 縮した。１ｍｌの濃縮上清をウサギに３週間間隔で３回注射し、次いで、血液採 取した。次いで、このウサギ抗血清を培養で用いて、ＨＶＴの増殖に対するイン ターフェロンの効果を調べた。抗−ｃＩＦＮはプラーク・アッセイにおいてｃＩ ＦＮの添加によって誘導されたＨＶＴ（１：２００）およびＶＳＶ（１：８０） に対するブロックを逆行させることが示された。さらに、ＨＶＴウイルスＤＮＡ のサブ−プラーキング・レベルで一時的にトランスフェクトしたＣＥＦの培地中 への抗−ｃＩＦＮの添加（１：１００）は、ＨＶＴプラークの形成（２００プラ ーク／ウェル）を増強させることが示された。抗−ｃＩＦＮの不存在下でＨＶＴ ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＥＦはプラークを生じなかった。 ＨＶＴはＣＥＦから産生されたインターフェロンに高度に感受性であって、ｃ ＩＦＮをブロックした場合、ＨＶＴ増殖が増強された。 出願人は、（１）ワクチン・ストックにおいてＨＶＴ力価を増加させるための 添加剤としてのｃＩＦＮに対する抗体の使用；（２）コスミド再構築を介する新 しい組換えＨＶＴウイルスの形成を容易とするための添加剤としてのｃＩＦＮに 対する抗体の使用を含める。実施例３７ Ｓ−ＳＰＶ−０６３ Ｓ−ＳＰＶ−０６３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＰ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を ＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一 のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター( ＬＰ１)の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＰ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −４１．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０６３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６３を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリクローナ ル血清はＳ−ＳＰＶ−０６３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１ 陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ− ０６３で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清またはヤギ抗−ＮＰ血清と反 応し、これは該ウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す 。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組 換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 ＳＩＶ ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６３で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリ クローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ６３感染細胞からの溶解物および上清は、ＳＩＶ ＮＰ蛋白質の予測されるサイ ズである５６ｋｄに対応するバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０６３はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＮＡを発現す るＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ ＨＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６５と組み 合わせたワクチンとして有用である。 Ｓ−ＳＰＶ−０６４ Ｓ−ＳＰＶ−０６４は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子を６．９ｋｂ Ｓ ＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊゲノム断片内の唯一のＸｈｏＩ制限部位に挿入した。 該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあ る。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊゲノム断片はＡ５０Ｒ ＯＲＦの一部（ａａ２２７ない し５５２）を含有する。唯一のＸｈｏＩ部位はＡ５０Ｒ ＯＲＦ内にはない。Ｘ ｈｏＩ部位は豚痘ウイルス・ゲノムの３’末端から２５ｋｂにある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −４２．２８およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター８０７−４２．２８は、プラスミド５５１−４７．２３からのＬＰ２Ｅ Ｐ２プロモーターｕｉｄＡ遺伝子カセットを含有するＮｏｔＩ断片（材料および 方法参照）の、６．９ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片中のＮｏｔＩ部位（ＤＮＡ リンカーによって唯一のＸｈｏＩ部位はＮｏｔＩに変換した）への挿入によって 生成した。「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについて のスクリーニングスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックを スクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６４と命名 した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセ イによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダ ーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウ ンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安 定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６４を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは６．９ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片内のＸｈｏＩ部位がウイルス 増殖に必須でない部位であって外来性遺伝子のための安定な挿入部位であること を示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、 病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対して抗体を生 起させるための発現ベクターとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６５ Ｓ−ＳＰＶ−０６５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を ＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一 のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター( ＬＰ１)の制御下にあり、ＳＩＶ ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −８４．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシグーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０６５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６５を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナ ル血清はＳ−ＳＰＶ−０６５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１ 陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ− ０６５で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清と反応した。ＳＩＶ外来性遺 伝子。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰ Ｖ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 ＳＩＶ ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６５で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリ クローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ６５感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ ＨＡ蛋白質の予測される サイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０６５はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＮＡを発現す るＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み 合わせたワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６６ Ｓ−ＳＰＶ−０６６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を ＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した(唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一 のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた)。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター(Ｌ Ｐ１)の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（Ｌ Ｐ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −８４．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０６６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 ＳＩＶ ＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６６で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＡポリ クローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ６６感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ ＨＡ蛋白質の予測される サイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０６６はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＨＡを発現す るＳ−ＳＰＶ−０６５およびＳＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み 合わせたワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１ Ｓ−ＳＰＶ−０７１は少なくとも４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ １）についての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一の ＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は 合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＨＡ、およびＮＡ遺 伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７ −８６．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０７１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７１を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０７１プラークと特 異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しない ことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０７１で観察されたプラークはヤギ抗−Ｈ Ａ血清と反応し、これはウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたこ とを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞は ＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 ＳＩＶ ＨＡおよびＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０７１で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗 −ＨＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ− ＳＰＶ−０７１感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ ＨＡおよびＮ Ａ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄおよび５２ｋｄに対応ずるバンドを 呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０７１はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ ＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用で ある。Ｓ−ＳＰＶ−０７４ Ｓ−ＳＰＶ−０７４は少なくとも４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。ィー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ １）についての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一の ＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｕｉｄＡ遺伝子は 合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ ＨＡお よびＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある 。 Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７ −１４．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０７４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７４を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＳＩＶ血清はＳ−ＳＰＶ−０７４プラークと特異的に反応す るがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示され た。全てのＳ−ＳＰＶ−０７４で観察されたプラークはヤギ抗−ＨＡ血清と反応 し、これはウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。こ こに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換え ワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 Ｓ−ＳＰＶ−０７４はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳ ＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用で ある。Ｓ−ＳＰＶ−０６９ Ｓ−ＳＰＶ−０６９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）蛋白質についての遺 伝子をＳＰＶ ７２８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの７７３塩 基対欠失；ヌクレオチド１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に 挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＨＲＳ Ｖ Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１０ −２１９．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利 用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについての スクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランス フェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は Ｓ−ＳＰＶ−０６９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載 した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイ ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきア ッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６９を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ＨＲＳＶ Ｆに対するモノクローナル抗体６２１（Biodesign,Inc.) はＳ−ＳＰＶ−０６９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対 照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６９ で観察されたプラークはモノクローナル抗体６２１と反応し、これはウイルスが ＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイ をＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のため に適した基礎となろうことが示された。Ｓ−ＳＰＶ−０７８ Ｓ−ＳＰＶ−０７８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）蛋白質についての遺 伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位 は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期／初期プ ロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子は合成後期／ 初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８２２ −５２Ｇ．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０７８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６９およびＳ−ＳＰＶ−０７８はブタにおいてヒト呼吸器系シ ンシチウムウイルス感染に対するワクチンとして個々にまたは組み合わせて有用 であって、ＨＲＳＶ ＦおよびＧ遺伝子の発現に有用である。 相同性ベクター８１０−２９．Ａ２ プラスミド８１０−２９．Ａ２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築 した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子 およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）遺伝子が組み 込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流 にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳ ＰＶ ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するため の相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードす るＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌマーカー遺伝子プロモーターの制御下 にあり、ＨＲＳＶ Ｆ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御 下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を 合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３ ０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）の ほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片 １は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得るための、Ｄ ＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴ ＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡ ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡ Ｇ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳ ＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ断片である。 断片２はイー・コリｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９） から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片３は 、ＨＲＳＶ株Ａ２（ＡＴＣＣ ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写酵 素およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ１ ７２８塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴ Ｃ ＧＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＴ−３’；４／９５．２３） （配列番号）はＨＲＳＶ Ｆ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端の ＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＧＴ ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴ −３’；４／９５．２４）（配列番号）はＦ遺伝子の３’末端から合成し、逆転 写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し て、ＨＲＳＶ Ｆ遺伝子に対応する長さの断片１７２８塩基対を得た。断片４は 、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端をもつ１１１３塩基対断片を得るための、 プライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡ ＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴ ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ− ３'(配列番号:１８８)を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ Ｈ ｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１１３塩基対サブ断片である。 相同性ベクター８２２−５２Ｇ．７． プラスミド８２２−５２Ｇ．７は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築 した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子 およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）遺伝子が組み 込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流 にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ１４８４塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流には ＳＰＶ ＤＮＡのほぼ２１４９塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するた めの相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコード するＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御 下にあり、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２） の制御下にあることに注意されたい。それは、以下の源からの制限断片を連結す ることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築 した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対 ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ Ｈ ｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＡｃｃＩないしＢｇｌＩＩ制 限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３００６塩 基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＨＲＳＶ株Ａ２（ ＡＴＣＣ ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写およびポリメラーゼ鎖 反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ８９９塩基対ＥｃｏＲＩ制 限断片である。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧ ＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣ−３’；４／９５．２５）（配列番号）はＨＲＳＸＴ Ｆ 遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ 停止コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧ ＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧ−３’；４／９５．２６）（配列番号）はＨＲＳＶ Ｇ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用 いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子に対応する長さ の断片８９９塩基対を得た。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２ ３）のほぼ２１４９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＡｃｃＩ制限部位亜断片である 。 相同性ベクター８０７−４１．３ プラスミド８０７−４１．３は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築し た。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お よびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）核蛋白質（ＮＰ）遺伝子が組み込 まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製 するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子を コードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ （ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあ り、ＳＩＶ ＮＰ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制 御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片 を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２ ２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロ メガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘 導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基 対ＢｇｌＩＩないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株 （ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ Ｐ ＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ ＮＰ遺伝子のほぼ１５０１塩基 対ＥｃｏＲＩないしＥｃｏＲＩ断片である。プライマー（５’−ＣＡＴＧＡＡＴ ＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣ−３’；６／９５ ．１３）（配列番号）はＳＩＶ ＮＰ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５ ’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用 いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで臭化してＳＩＶ ＮＰ遺伝子に対応する長さの 断片１５０１塩基対を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｕｖＩＩ制限断片である。断片４はＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｎ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎ ｄＩＩＩ制限亜断片である。 相同性ベクター８０７−８４．８ プラスミド８０７−８４．８は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた 。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およ びブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子が組み込 まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製 するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子を コードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩ Ｖ ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある ことに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合 成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３ ０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）の ほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断 片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩ ＩないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（ １５、４２）によって合成したＳＩＶ ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対Ｂａｍ ＨＩないしＢａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧ ＧＣＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５ ．５）(配 列番号)はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａ ｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＴＴＡ ＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＳ−３’；６／９５．６）(配列番号 ：)はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖 反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＨＡ遺伝子に 対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（ １１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片 ４はほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないし断片Ｍ（２３）である。 相同性ベクター８０７−８４．３５ プラスミド８０７−８４．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用い た。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お よびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子 が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。「組換えＳＰ Ｖを創製するための手法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子 をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、Ｓ ＩＶ ＮＡ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に あることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当 な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２およ び３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社 ）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した 。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対Ｂｇ ｌＩＩないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶ ＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対Ｅ ｃｏＲＩないしＢｇｌＩＩ断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣ ＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／ ９５．１２）（配列番号；）はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝 子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴ Ｃ ＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＨＨＴＨＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５ ．１３）（配列番号；）はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の ３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために 用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＮＡ遺伝子に対応する長さ の断片１４１４塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉ ｎｄＩＩＩ制限亜断片である。 相同性ベクター８０７−８６，３５ プラスミド８０７−８６．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用い た。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お よびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子および ノイラミラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰ Ｖ ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこ のプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイル スが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プ ロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各々 、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意さ れたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列 連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用し て構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２ 塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰ ＶＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩないしＡｃｃ Ｉ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡ を用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）に よって合成したＳＩＶ ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩないしＢａ ｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＡＣ ＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）(配列番 号：)はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍ ＨＩ部 位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡ ＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’；６／９５．６）（配列番号： ）はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ 部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物を ＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を 得た。断片３は、ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写 （ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成した ＳＩＶ ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌＩＩ断片であ る。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡ ＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号：）はＳＩ ＶＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入 する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡ ＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号：）はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し 、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで 消化してＳＩＶ ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た。断片 ４はプラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰ ｖｕＩＩ制限断片である。断片５はＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３） のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。 相同性ベクター８１７−１４．２ プラスミド８１７−１４．２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた 。それには、イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およ びブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミ ラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮ Ａがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラス ミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得ら れる。βグルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロ モーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、 各々、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注 意され たい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に 連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用し て構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２ 塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰ Ｖ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩないしＡｃ ｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮ Ａを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２） によって合成したＳＩＶ ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩないしＢ ａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＡ ＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）（配列 番号：）はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａ ｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴ ＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’：６／９５．６）（配 列番号：）はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢ ａｍＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣ Ｒ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２ １塩基を得た。断片３は、ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い 、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって 合成したＳＩＶ ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌＩＩ 断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴ ＡＡＴＡＡＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号：） はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部 位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧ ＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号：）は ＳＩＶ ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位 を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃ ｏＲＩで消化してＳＩＶ ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得 た。断片４はプラスミドｐＲＡＪ２６０(Clonetech)のほぼ１８２３塩基対Ｎｃ ｏＩ制限断片である。断片５はＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほ ぼ２ １４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。単一または複数のＰＲＲＳ遺伝子（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、 ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７を含有するＰＲＲＳ相同性ベクター ＰＲＲＳ相同性ベクターは外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。そ れには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブ タ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲ Ｆ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７遺伝子が組み込まれており、それの 側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの ほぼ８５５塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ１ １１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従 ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有する ウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウ イルスＯｌＬ遺伝子プロモーターの制御下にあり、ＰＲＲＳ遺伝子は後期／初期 プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベ クターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に連結することによ って、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プ ラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄＩ ＩＩないしＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩ Ｉ末端を持つ８５５塩基対断片を生じさせるための、ＤＮＡプライマー５’−Ｇ ＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡ ＴＡー３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴ ＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１ ８６）を用いるポリマラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制 限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ−断片である。断片２は、イー・コリ ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００ ２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、ＮＶＳＬ（参照株 ）から得られたＰＲＲＳのＵ．Ｓ．単離体からのゲノムＲＮＡを用いて逆転写お よびポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成したＥｃｏＲＩないしＢａｍＨ Ｉ制限断片である。各相同性ベクターは１または複数のＰＲＲＳウイルスＯＲＦ ２ ないし７を含有する。ＰＲＲＳ ＯＲＦ２を合成するために、プライマー（５’ −ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＧＧＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＴ ＴＧ−３’；１／９６．１５）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ２遺伝子の５ ’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー (５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡＧ ＴＴＣＧ−３’；１／９６．１６)（配列番号）を逆転写およびＰＣＲのために 使用し、ＰＲＲＳ ＯＲＦ２遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃ ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ２遺伝子に対応する長さの 断片７７１塩基対を得た。ＯＲＦ３を合成するために、プライマー（ＴＴＣＧＡ ＡＴＴＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＴＴ−３’ ；１／９６．７）（配列番号）はＰＲＲＳ ＯＲＦ３遺伝子の５’末端から合成 し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＧ ＧＡＴＣＣ ＴＡＴＣＧＣＣＧＴＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧ−３’；１／９６． ８）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ３遺 伝子の３’末端から合成する。ＰＲＲＳ ＯＲＦ４を合成するために、プライマ ー（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＡ ＴＧＧ−３’；１／９６．１１）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ４遺伝子の ５’末端から合成し、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’ −ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＡ ＧＡＣ−３’；１／９６．１２）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために 用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ４遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏ ＲＩおよびＮａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ４遺伝子に対応する長さの断 片５３７塩基対を得る。ＰＲＲＳ ＯＲＦ５を合成するために、プライマー（５ ’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣ− ３’；１／９６．１３）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ５遺伝子の５’末端 から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’ −ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＧＣＴＧ− ３’；１／９６．１４）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、Ｐ ＲＲＳ ＯＲＦ５遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよ びＢａｍＨ Ｉで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ５遺伝子に対応する長さの断片６０３塩基対を得 る。ＰＲＲＳ ＯＲＦ６を合成するために、プライマー（５’−ＣＧＧＧＡＡＴ ＴＣ ＧＧＧＧＴＣＧＴＣＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’；１／９６ ．１７）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ６遺伝子を５’末端から合成し、遺 伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＣＧＧＡＴ ＣＣ ＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣ−３’； １／９６．１８）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ６遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａ ｍＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ６に対応する長さの５２５塩基対を得る。Ｐ ＲＲＳ ＯＲＦ７を合成するために、プライマー（５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧ ＣＣＡＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ−３’：１／９６． １９）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ７の５’末端から合成し、遺伝子の５ ’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣ ＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧ−３’；１／９６．２０）（ 配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために合成し、ＰＲＲＳ ＯＲＦ７遺伝子 の３’末端から合成する。断片４は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ １１１３塩基対を生じさせるための、ＤＮＡプライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣ ＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’ （配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧ ＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴ−３’）（配列番号：１８８）を用いる ポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１ １３塩基対サブ断片である。仮性狂犬病遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス Ｓ−ＳＰＶ−０８６は少なくとも３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＤおよびｇＩについての遺伝子をＳＰＶ ６１ ７−６８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限 部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御 下にあり、ＰＲＶ ｇＤおよびｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩについての遺伝子をＳＰＶ ６１７ ４８． １ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き 換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、 ＰＲＶ ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢについての遺伝子をＳＰＶ ６１７ ４８． １ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き 換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＳ− ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するた めの相同組換え法」において相同性ベクターおよびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１ を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについ てのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトラ ンスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結 果はＳ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９と命 名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッ セイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシ ダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラ ウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純 粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＰＲ Ｖ糖蛋白質の発現につき「黒色プラーク・アッセイ」および「ウェスタンブロッ ト」によってテストした。 Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はブタ においてＰＲＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＰＲＶ ｇＤ、ｇＩ またはｇＢの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ −ＳＰＶ−０１２、またはＳ−ＳＰＶ−０１３のごときＰＲＶ ｇＣを発現とす る組換え豚痘ウイルスと組み合わせたワクチンとして有用である。 １４３Ｂ 骨肉腫＊ Ａ４３１ 類表皮癌＊ Ａ５４９ 肺癌＊ Ｃａｐａｎ−１ 肝臓癌＊ ＣＦ５００ 包皮繊維芽細胞 Ｃｈａｎｇ肝臓 肝臓 Ｄｅｔｒｏｉｔ ダウン包皮繊維芽細胞 ＨＥＬ−１９８ 胚性肺 ＨｅＬａ 子宮頸部癌＊ Ｈｅｐ−２ 表皮咽頭癌＊ ＨＩＳＭ 腸平滑筋 ＨＮＫ 新生児腎臓 ＭＲＣ−５ 胚性肺 ＮＣＩ−Ｈ２９２ 肺粘液性類表皮癌＋ ＯＶＣＡＲ−３ 卵巣癌＊ ＲＤ 横紋筋肉腫＋ ＴＨＰ 単球（白血病）＊ ＷＩＬ２−ＮＳ Ｂリンパ球系、非分泌 ＷＩＳＨ 羊膜 ＰＢＬ 末梢血液リンパ球実施例３８ ＰＲＲＳ遺伝子ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、およびＯＲＦ６を 発現する組換え豚痘ウイルス Ｓ−ＳＰＶ−０８０少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスで ある。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブ タ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２についての遺伝子 をＳＰＸ７ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ２遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ３についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ３遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ４についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ４遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃｚ遺伝子は豚痘ＰＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ５遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ６遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ７についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ ＯｌＬ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃｚ遺伝子は豚痘ＰＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ７遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ −０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導 した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベ クター材料および方法（ＰＲＲＳ相同性ベクター）およびウイルスＳ−ＳＰＶ− ００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現ずる組換えＳＰＶ についてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によっ てトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の 最終結果はＳ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ −ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５と命名した組換えウイルスであった 。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数 継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびイン サートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全 てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝 子 を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ −０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はブタにおいてＰＲＲＳ感染に対するワクチ ンとして個々にまたは組み合わせて有用であって、ＰＲＲＳ ＯＲＦ２、ＯＲＦ ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７の発現で有用である。実施例３９ 以下の実験を行って、培養においてヒト細胞に感染する、およびｌａｃＺのご とき外来性ＤＮＡを発現する豚痘ウイルスの能力を測定した。 Ｓ−ＳＰＶ−００３をＭＯＩ＝０．１にて後記標記にリストしたヒト細胞系に ２ないし３時間吸着させた。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、増殖培地を添加し、細 胞を３７℃で４日間インキュベートした。細胞を収穫し、３回の凍結／解凍によ って２００マイクロリットルのＰＢＳ中に溶解物を調製した。細胞夾雑物をペレ ット化し、１０マイクロリットルの上清をＯＮＰＧアッセイによって、３７℃に て、ガラクトシダーゼ活性につき１／２時間アッセイした。表はＳ−ＳＰＶ−０ ０３での種々のヒト細胞系の感染および細胞障害効果の相対的レベルおよびｌａ ｃＺの発現の結果を示す。 結果は、種々の細胞系はＳ−ＳＰＶ−００３を摂取し、ｌａｃＺを発現する能 力が変化することを示す。ＣＰＥは全ての場合において最小であって、ウイルス 複製の結果とはならなかった。１つの例外はＡ５４９細胞であり、これは、１つ の例で、数ラウンドの細胞周期およびプレートからの剥がれを示さず、もう１つ の例は継代の間の力価の１０倍増加であり、これは限定的ウイルス複製を示唆し た。いくつかの細胞系は、細胞障害効果を持たない有意なｌａｃＺ活性を示す。 異なる痘プロモーターは、多数のヒト細胞系で組換え豚痘ウイルスからのｌａ ｃＺを発現する。ＥＰ１、ＬＰ１、ＬＰ２、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、また はＳＰＶ ＰＯｌＬプロモーターからのｌａｃＺを発現した６種の異なる豚痘ウ イルスを構築した。ウイルスを各々用いて、Ａ５４９、Ｃｈａｎｇ肝臓、または １４３Ｂ細胞を０．１ｍｏｉにて感染させ、細胞を２および３時間後にすすぎ、 次いで、３７℃で４日間インキュベートした。各細胞系はプロモーター活性の異 なる階層を維持し、これは以下の実験で再現性があった。例えば、ＥＰ１、ＬＰ ２ＥＰ２、およびＰＯｌＬプロモーターは１４３Ｂ細胞で最大の発現を与え、他 方、ＬＰ２はＣｈａｎｇ肝臓細胞で最も強力であり、ＥＰ１ＬＰ２はＡ５４９で 最も強力であった。Ｃｈａｎｇ肝臓およびＡ５４９細胞において、ＰＯｌＬプロ モーターからの発現は最も貧弱であり、他方、１４３Ｂにおいては、ＬＰ２から の発現が貧弱であった。従って、異なるヒト細胞系は異なる方法で痘プロモータ ーを利用する。これは、異なる細胞系で複製経路に沿ってどれ位遠くまで豚痘ウ イルスが進行できるかを反映し得る。 これらの初期および後期プロモーターは、組換え豚痘ウイルスによって感染さ れたヒト細胞型に応じてより低いまたはより高いｌａｃＺ活性を呈した。異なる 標的組織に対して異なるプロモーターを選択することによって、豚痘ウイルスか ら標的組織に送達される外来性遺伝子産物の量を調節することができる。 組換え豚痘ウイルスはヒト感染性病気に対するワクチンとして、および治療剤 をヒトに送達するのに有用である。組換え豚痘ウイルスはヒトにおいてウイルス または細菌感染に対するワクチンとして、および抗生物質、腫瘍抗原、細胞表面 リガンドおよび受容体、サイトカインのごとき免疫変調分子を送達するための癌 または遺伝病のための治療剤として有用である。実施例４０ ヒト細胞系におけるｌａｃＺのＳ−ＳＰＶ−００３発現 細胞障害効果およびｌａｃＺ発現の測定 細胞型 細胞障害効果＊ ｌａｃＺ発現＊＊ Ａ４３１ − − 類表皮癌＊ Ａ５４９ ＋＋ ＋＋＋ 肺癌＊ Ｃａｐａｎ−１ − − 肺癌＊ ＣＦ５００ ＋ ＋ 包皮繊維芽細胞 Ｃｈａｎｇ肝臓 ＋ ＋＋＋ Ｄｅｔｒｏｉｔ ＋／− − ガウン包皮繊維芽細胞 ＨＥＬ−１９９ ＋／− ＋＋＋ 胚性肺 ＨＥｐ−２ − ＋ 表皮咽頭癌＊ ＨＩＳＮ ＋ ＋ 腸平滑筋 ＨＮＫ − ＋＋ 新生児腎臓 ＭＲＣ−５ ＋／− ＋ 胚性肺 ＮＣＩ−Ｈ２９２ − ＋＋＋ 肺粘液性類表皮癌＊ ＯＶＣＡＲ−３ − ＋＋＋ 卵巣癌＊ ＲＤ − ＋ 横紋筋肉腫＋ ＴＨＰ − ＋ 単球（白血病）＊ ＷＩＬ２−ＮＳ − −−−− Ｂリンパ球系、非分泌 ＷＩＳＨ ＋／− 羊膜 ＨｅＬａ − ＋＋＋ ＰＢＬ − − 末梢血液リンパ球 ＊ヒト細胞をＳＰＶで感染させた場合、細胞障害効果が時々観察され る。ほとんどの細胞系において、この細胞障害効果は細胞の出現の 変化によって示され、細胞は薄くなり、エッジに沿ってより凸凹に なり；細胞は緊張しているように見える。この現象は以下のごとく に評価される。 −は感染および非感染細胞の間に差異のないことを示す。 ＋／−は、ほとんどの細胞が正常に見えるにも拘わらず、単層が非感 染のものと視覚的に異なることを示す。 ＋は、単層が明らかに侵されており、ほとんどの細胞が緊張して見え ることを示す。系列的継代後に力価が得られたある種の細胞（Ｈｅ Ｌａ、ＣＦ５００、１４３Ｂ）においては、１つの例外を除き、Ｓ ＰＶの複製の証拠がなかったことに注意すべきである。 Ａ５４９は、細胞が感染の間に丸くなってプレートから剥がれた場合に、１つ の例において細胞障害効果につき＋＋を与えたが、この観察は反復されなかった 。また、Ａ５４９は継代の間に１０倍増加の力価の証拠をもう１つの例で示し、 これは限定的ウイルス複製を支持し得ることを示す。 ＊＊ ３５ｍｍ皿の１／２０からの細胞溶解物当たりのＡ₂₆₀単位で表 したβ−ガラクトシダーゼ活性 − 活性無し ＋ ０．２−０．９Ａ₂₆₀単位 ＋＋ ０．９−１．６Ａ₂₆₀単位 ＋＋＋ １．６Ａ₂₆₀単位より大

【手続補正書】 【提出日】平成９年１０月２４日（１９９７．１０．２４） 【補正内容】 （１）明細書の全文を別紙の通りに訂正する。 （２）請求の範囲を別紙の通りに訂正する。 （３）図面の図２Ａ〜図２Ｂ、図６〜図１１Ｄ、図１３Ａ〜図１６、図１８Ａ〜 図１８Ｄ、および図２０Ａ〜図２５Ｄを削除します。 明細書 組替え豚痘ウイルス 本出願は、1995年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/480,640号、1995 年６月７日に提出された合衆国特許出願第08/488,237号、1995年６月７日に提出 された合衆国特許出願第08/472,679号および1995年１月１９日に提出された合衆 国特許出願第08/375,992号の一部継続出願の一部継続出願である。これら親出願 の内容は、本明細書の一部をなす参照文献として本願に組み込まれる。 本願の中には、括弧内のアラビア数字によって、幾つかの出版物が参照される 。これら文献の完全な書誌的引用は明細書の最後、即ち、請求の範囲の直前に見 られる。これらの文献の開示は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込 まれる。 〔発明の背景〕 豚痘ウイルス（ＳＰＶ）はポックスウイルス族（Poxviridae）に属している。 このグループに属しているウイルスは、宿主細胞中の細胞質中で特徴的に発育す る大型の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＳＰＶは、スイポックスウイルス（Suip oxvirus）属の唯一のメンバーである。ＳＰＶは、幾つかの特徴によって、他の ポリウイルスから区別される。ワクシニア等の他のポックスウイルスが宿主範囲 が広いのに比較して、ＳＰＶは種特異性を示す（１８）。組識培養細胞系にＳＰ Ｖを感染させたものと、他のポックスウイルスを感染させたものとでは劇的に異 なる（２４）。ＳＰＶは、ワクシニア・ウイルスと抗原交叉反応を示さず、また オルソ、レポリ、アヴィ、昆虫ポックスグループとＤＮＡレベルで、検出可能な 総体的相同性を示さない（２４）。従って、従来技術において、他のポックスウ イルスに関して知られ、記載されていることは、豚痘ウイルスの先行技術とはな らない。ＳＰＶは、肌および局部的リンパ節においてのみ検出される病巣を持っ た自己規制感染を特徴とする、唯一穏やかな病原菌である。ＳＰＶの感染は非常 に制限されているけれども、ＳＰＶから回復したブタは、ＳＰＶの感作に対して 免疫性があり、活性免疫が発生したことがわかる（１８）。 本発明は、ワクチン抗原およびブタに対する治療剤のデリバー用ベクターとし てＳＰＶを使用することに関する。この原理は、ＳＰＶの下記特質によって支持 される。ＳＰＶは、ブタにおいて唯一穏やかな病原菌であり、種特異的あり、防 御免疫反応を誘導する。よって、ＳＰＶは、ベクターのワクチンおよび治療的特 質によって与えられるその有益性とバランスさせなくてはならない本質的危険が 少ない、ウイルス性ベクターデリバリーシステムの優れた候補である。 本発明の従来技術としては、バクテリア性プラスミド中でのＤＮＡクローン化 および分析の技術がまずあげられる。利用される技術は、マニアチス等１９８３ 年の大部分およびサンブロック等１９８９年に詳述されている。これらの文献に は、一般的組替えＤＮＡ技法の従来技術の状態が教示されている。 ポックスウイルスの中から５つ（ワクシニア、家禽ポックス、カナリアポック ス、鳩およびアライグマポックス）が、本開示の前に、外来ＤＮＡ配列を含む様 に加工された。ワクシニアウイルスは、外来遺伝子のベクターとして広範に使用 されてきており（２５）、これは合衆国特許4,603，112および4,722,848の主題 である。同様に、家禽ポックスが外来遺伝子のベクターとして使用されており、 これは幾つかの特許出願、ＥＰＡ 0 284 416、PCT WO89/03429、およびPCT WO89 /12684の主題である。アライグマ・ポックス（１０）およびカナリアポックス（ ３１）は、狂犬病ウイルス起源の抗原を発現するために使用されてきた。ポック スウイルス中へ挿入する外来遺伝子挿入物の例としては、スイポックスウイルス 属由来の例は含まれない。このように、豚痘ウイルスを遺伝子工学的に加工する 方法、即ち、どこに挿入するか、又どのようにブタポックス中の発現物を得るか という方法は教示されていない。 抗原のデリバリーシステムとして生ウイルスを使用するアイデアは、最初の生 ウイルスワクチンまで立ち戻ると、大変長い歴史を有している。デリバーされた 抗原は、外来性でなく、生ウイルスによってワクチン中に自然に発現されもので あった。外来抗原をデリバーするにウイルスを使用することについては、組替え ワクシニアウイルスの研究によって、現在では容易になってきた。ワクシニアウ イルスはベクターであり、伝染性を引き起こす他の疾患起源の様々な抗原は外来 抗原であり、該ワクチンは遺伝子工学によって作成される。これらの開示によっ てこれらの概念が明らかになる一方、明らかにならなかったのは、何によって最 良のウイルスベクター候補が作られるかというより実践的疑問に対する答えであ った。この質問に答えるにあたっては、ウイルスの病原性の詳細、複製部位、そ れが誘導する免疫反応の種類、ウイルスが外来抗原を発現する可能性、遺伝子工 学の適合性、規制当局によって認可される可能性など、選択にあたっての全ての 因子である。これらの実用上の問題については、先行技術は何等教示していない 。 治療剤をデリバーするためにポックスウイルスを使用することに関わる先行技 術としては、インターロイキン２（１２）をデリバリーするワクシニア・ウイル スの使用があげられる。この場合、インターロイキン２は、ワクシニア・ウイル ス上で弱毒性効果を示したけれども、宿主における治療剤効果は実証されなかっ た。 本発明のウイルス性ベクターによってデリバーされる治療剤は、生物学的分子 すなわち、ブタウイルス複製の副産物でなくてはならない。これによって、治療 剤はまず、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白に限られる。これらの化合物クラスに由来す る治療剤の例として、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（１６）、リボ ソーム（３４）、サプレサーｔＲＮＡｓ（２）、インタフェロンに誘発される二 本鎖ＲＮＡの形があげられ、また、インシュリン等のホルモンから、インターフ ェロンおよびインターロイキン等のリンホカイン、天然麻酔剤までの数多くの蛋 白質治療剤の例があげられる。これらの治療剤の発見およびその構造および作用 の解明によって、ウイルスベクターデリバリーシステムにおけるそれを使用する 技量が容易になることはない。 〔発明の概要〕 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入される外来ＤＮＡ配列を含む組替 え豚痘ウイルスであって、該外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindII IN断片内に挿入され、またブタウイルスに感染した宿主細胞中で発現することが できる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 本発明は、更に相同性ベクター、ワクチンおよび免疫感作の方法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕図１Ａ−１Ｂ： 特徴的な長いターミナル・リピート(ＴＲ)領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ(kasza 株)の詳細な図が示される。酵素Hind IIIが制限マップが示される（２３）。断 片は、サイズの減っていく順番に文字で表示される。ターミナル・リピートのサ イズは、2.1Kbより大きいが、9.7Kbより小さい。 （図２Ａ−２Ｂ削除）図３Ａ−３Ｃ： 515-85.1 ORFと、ワクシニア・ウイルス０１ＬＯＲＦの間の相同関係を示す。 図３Ａには、二つのマップが示されている。図３Ａの第一のラインは、SPV Hind III M断片の制限マップであり、第二のラインは、プラスミド515-85.1中のＤＮ Ａ挿入物の制限マップである。515-85.1[VV 01L様]ORFの位置もまた、該マップ 中に示されている。図３Ｂおよび３Ｃに示されたＤＮＡ配列の位置は、図３Ａで は地図の下に太棒で示されている。図３Ｂは、その夫々のＮ末端におけるＶＶ０ １ＬＯＲＦ(配列認識番号５)と515-85.1ORF(配列認識番号６)の間にある相同関 係を示す。図３Ｃは、その夫々のＣ末端におけるＶＶ０１ＬＯＲＦ(配列認識番 号７)と515-85.1ORF(配列認識番号８)の間にある相同関係を示す。４Ａ−４Ｄ 相同性ベクター520-17.5におけるＤＮＡ挿入物が記載されている。図４Ａは、 プラスミド520-17.5に会合するＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を 示す表が含まれている。図４Ｂには、断片の間にある連結部ＡおよびＢの各々に 位置する配列が示される。図４Ｃには、連結部ＣおよびＤ(配列認識番号９、１ ０、１３および１６)に位置する配列が示される。図４Ｂおよび４Ｃには更に、 各断片を生成する制限部位が記載されているのみならず断片を繋ぎ合せるために 使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。合成リンカ ー配列には、太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子をコードしている配列 の位置、調整要素もまた提示されている。下記二つの取り決めが使用された。括 弧( )中の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[]中の制限部位は、構築の最中に破 壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス （ＳＰＶ）、初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター（ＬＰ２）、ラク トースオペロンＺ遺伝子（lacZ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。図５Ａ−５Ｄ 相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。 図５Ａには、プラスミド538-46.16に会合したＤＮＡ断片の配向を示す図および 各断片の起源を示す表が含まれている。図５Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢ に位置する配列が示される。図５Ｃには、連結部Ｃに位置する配列が示され、お よび図５Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列（配列認識番号１７、１８、 ２１、２６および２８）が示される。図５Ｂから５Ｄには、各断片を生成するた めに使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リン カー配列が、各連結部について記載されている。該合成リインカー配列には、太 棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もま た与えられている。下記二つの取り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ 酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示 している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウ イルス（ＰＲＶ），ｇ５０（ｇＤ）、糖蛋白６３（ｇ６３），初期プロモーター （ＥＰ１）、後期プロモーター１（ＬＰ１）（配列認識番号４６）、後期プロモ ーター２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）、および大腸菌（E ．coli）． （図６−図１１Ｄ削除）図１２Ａ−１２Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ 挿入物が詳細に記載されている。図12Aには、プラスミド570-91.64に会合したＤ ＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図12Ｂに は、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図12Cには、連結部 Ｃに位置する配列が、および図１２Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列 (配列認識番号６１、６２、６３、６４、６５)が示される。１２Ｂから１２Ｄに は、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するた めに使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つか の遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取 り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位 は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されて いる：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E．col i）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ ー２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）(配列認識番号４４)，ｇＩＩＩ（ｇＣ） 、塩基対（ＢＰ）。 （図１３Ａ−図１６削除）図１７： 5.6キロ塩基対Hind III M豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片を示すマップ。オー プンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）は、各オープンリーデイングフレームにお けるアミノ酸コードの数と共に示される。豚痘ウイルスのＯＲＦｓは、ワクシニ アウイルスＯＲＦｓと著しい配列の同一性を示し、ワクシニアウイルスの命名法 (５６および５８)によってラベルされている。Ｉ４ＬＯＲＦ(配列認識番号１９ ６)は、リボヌクレオチド・リダクターゼの大型ユニット（５７）とアミノ酸配 列相同性を示し、また０１ＬＯＲＦ（配列認識番号１９３）は、ある真核生物の 翻訳調節蛋白（１３）に特徴的なロイシン・ジッパー・モチーフに対するアミノ 酸配列相同性を示す。Ｉ４ＬＯＲＦ中のＢｇｌII部位および０１ＬＯＲＦ中のＡ ｃｃＩ部位は、ブタポックスゲノムの非必須領域中への外来ＤＮＡの挿入部位で ある。相同性ベクター738-94.4は、ヌクレオチド１６７９から２４５２(配列番 号１８９)のＳＰＶ ＤＮＡの欠損を含む。底部の黒棒は、ＤＮＡ配列が既知であ る領域を示し、配列番号１８９および１９５を示す。制限部位ＡｃｃＩ，Ｂｇｌ II，およびHind IIIの位置が示されている。Ｉ３ＬＯＲＦ（配列認識番号１９０ ）、Ｉ２ＬＯＲＦ(配列認識番号１９１)、Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（配列認識番号１９ ４）が 示される。配列認識番号２２１は、Hind III M断片の完全な５７８５塩基対配列 を含んでいる。SPV Hind IIIM断片内のオープンリーデイングフレームは、部分 的なＩ４ＬＯＲＦ（４４５ＡＡ；ヌクレオチド２から１３３６）；Ｉ３ＬＯＲＦ （２７５ＡＡ；ヌクレオチド１３８７から２２１１）；Ｉ２ＬＯＲＦ（７５ＡＡ ；ヌクレオチド２２１５から２４３９）；Ｉ１ＬＯＲＦ（３１３ＡＡ；ヌクレオ チド２４４３から３３８１）；０１ＬＯＲＦ（６７７ＡＡ；ヌクレオチド３５２ ０から５５５０）；部分的ＥＩＯＲＯＲＦ（６４ＡＡ；ヌクレオチド５７８７− ５５９６）。 （図１８Ａ−１８Ｄ削除）図１９Ａ−１９Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤ ＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図19Aには、プラスミド727-54.60に会合し たＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図19 Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図19Cには、連結 部Ｃに位置する配列が、および図19Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が 示される。１９Ｂから１９Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位 のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部に ついて記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた 与えられている。下記二つの取り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ酸 を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示し ている。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（Ｐ ＲＶ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポッ クス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｂ（ｇＢ ）、塩基対（ＢＰ）。 （図２０Ａ−図２５Ｄ削除）図２６Ａ−２６Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図には751-07A1に会合したＤＮＡ断片の配向が示される 。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示 されている。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結 合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている 。図２６Ａから２６Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号１９７)、（配列認 識番号１９８）Ｃ（配列認識番号１９９）、Ｄ(配列認識番号２００)およびＥ( 配列認識番号２０１)に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される 。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記 二つの取り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中 の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が 使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、チキン・インターフェロン（ｃＩＦ Ｎ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポック ス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェ イン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２７Ａ−２７Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56A1におけるＤＮＡ挿 入物の詳細な記載。図にはプラスミド751-56A1に会合したＤＮＡ断片の配向が示 される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配 列も示されている。図２７Ａから２７Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番号2 02)、（配列認識番号203）Ｃ（配列認識番号204）、Ｄ(配列認識番号205)および Ｅ(配列認識番号206)に位置する配列、および連結部に位置ずる配列が示される 。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず幾つかの遺伝子コード 領域を結合するために使用される合成リンカー配列、および調節要素もまた与え られている。下記二つの取り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ酸を示 し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示してい る。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、チキン・骨髄単球 性成長ファクター（ｃＭＧＦ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プ ロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモーク２(ＬＰ Ｅ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２８Ａ−２８Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ 挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド752-22.1に会合したＤＮＡ断片の配向が 示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する 配列も示されている。図２８Ａから２８Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番 号207)、（配列認識番号208）Ｃ（配列認識番号209）、およびＤ(配列認識番号2 10)位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成する ために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リ ンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域お よび調節要素もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。( )内 の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊され た部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰ Ｖ）、大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。図２９Ａ−２９Ｂ： 図２９Ａ：SPV Hind III N断片およびＳＰＶ Ｈｉｎｄ III Ｍ断片の一部にお ける制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム。豚 痘ウイルスHind III NおよびHind III MゲノムＤＮＡの非必須部位への外来遺伝 子の挿入物には、EcoR V部位(S-SPV-060)、SnaBI部位(S-SPV-061)、Hind III N( S-SPV-062)におけるBgl II部位、Hind III M(S-SPV−047)におけるBgl II部位が ある。Ｉ７ＬＯＲＦ(配列認識番号２３０)およびＩ４ＬＯＲＦ(配列認識番号２ ３１)への外来遺伝子の挿入物によって、全オープンリーデングフレームは、豚 痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適である事 が示唆される。外来遺伝子のその他の挿入部位には、二つのHind III部位および AvaIおよびBamHIがあるがこれに限定されない。図２９Ｂ：ＳＰＶ Ｈｉｎｄ III Ｋ断片における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイング フレーム。豚痘ウイルスHind III KゲノムＤＮ Ａの非必須部位に挿入された外来遺伝子の挿入物には、EcoR I部位（S-SPV-059 ）があるがこれには限定されない。SPV Hind III K断片の3.2kB領域内では、３ つのオープンリーデイングフレームが確認されている。Ｂ１８ＲＯＲＦ(配列認 識番号２２８)への外来遺伝子の挿入によって、全オープンリーデングフレーム は、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適で ある事が示唆される。また、Ｂ４ＲＯＲＦ（配列認識番号２２９）が外来遺伝子 の挿入部位として確認された。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ワクシニアウイルス（ ＶＶ）Ｂ１８ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ラビット繊維 腫ウイルス（ＲＦＶ）の77.2kd蛋白よりも相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲＦは 、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ４ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲ Ｆは、ラビット繊維腫ウイルス(ＲＦＶ)のＴ５蛋白とより相同性である。確認さ れたオープンリーデイングフレームは、SPV Hind III K断片の約３２００塩基対 の内にある。SPV Hind III K断片の残りの約３５００塩基対は、先にシークエン スされている（R．F．Massung et al．Virology 197，511-528(1993)）。図30Ａ−30Ｃ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤ ＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド779-94.31に会合したＤＮＡ断片の 配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位 置する配列も示されている。図30Ａから30Ｃには、断片間の連結部Ａ(配列認識 番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)およ びＥ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示され る。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するた めに使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つか の遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取 り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部 位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用され ている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、 ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合 成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。図３１Ａ−３１Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.7に会合したＤＮＡ断片の配向 が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置す る配列も示されている。図３１Ａ−３１Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識番 号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（ 配列認識番号：）およびＦ（配列認識番号：）に位置する配列、および連結部に 位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみなら ず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記 載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられ ている。下記二つの取り決めが使用される。( )内の数字は、アミノ酸を示し、 角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。 下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ）， 大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、 ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。図３２Ａ−３２Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.27に会合したＤＮＡ断片の配 向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置 する配列も示されている。図３２Ａ−３２Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識 番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ （配列認識番号：），Ｆ（配列認識番号：）およびＧ（配列認識番号：）に位置 する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使 用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配 列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節 要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。( )内の 数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された 部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ ）、擬 狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プ ロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２ （ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ） 。図３３Ａ−３３Ｄ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.47に会合したＤＮＡ断片の配 向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片問の連結部の夫々に位置 する配列も示されている。図３３Ａ−３３Ｄには、断片間の連結部Ａ(配列認識 番号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ （配列認識番号：），Ｆ（配列認識番号：）およびＧ（配列認識番号：）に位置 する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使 用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配 列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節 要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。( )内の 数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の最中に破壊された 部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成初期プロモータ１ 後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１） 、塩基対（ＢＰ）。図３４Ａ−３４Ｅ： 豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５５および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮ Ａ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.73に会合したＤＮＡ断片の配 向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置 する配列も示されている。図３４Ａ−３４Ｅは、断片間の連結部Ａ(配列認識番 号：)、（配列認識番号：）Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ(配列認識番号：)、Ｅ（ 配列認識番号：），Ｆ（配列認識番号：）、Ｇ（配列認識番号：）およびＨ（配 列認識番号：）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断 片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用 される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子 コ ード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使 用される。( )内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧[ ]中の制限部位は、構築の 最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘 ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（E．coli）、ポックス合成 後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモ ータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ１（Ｌ Ｐ１）、塩基対（ＢＰ）。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組 み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮ ＡのHindIII K断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で 発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 一態様において、この組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの 前記HindIII N断片における略２ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内に挿入された前 記外来ＤＮＡを含んでいる。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウ イルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片における略２ＫｂのHindIII〜BamHI亜断片 内のオープンリーディングフレーム内に挿入される。他の態様において、該オー プンリーディングフレームはＩ７Ｌ遺伝子をコードする。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に 挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤ ＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるSnaBI制限エンドヌクレアー ゼ部位内に挿入される。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記 HindIII N断片における略1.2ＫｂのBamHI〜HindIII亜断片内に挿入される。他の 態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N 断片の略1.2ｋＢのBamHI〜HindIII亜断片内のオープンリーディングフレーム中 に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、Ｉ４Ｌ遺伝子をコ ードするオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、前 記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記略1.2ｋＢのBamHI〜Hind III亜断片内のBglII制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される。 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組 み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮ ＡのHindIII M断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で 発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 一態様において、この組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの 前記HindIII M断片における略２ＫｂのBglII〜HindIII亜断片内に挿入された前 記外来ＤＮＡ配列を有する。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウ イルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片の略２ＫｂのBglII〜HindIII亜断片内 のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、該オープ ンリーディングフレームは、Ｏ１Ｌ遺伝子をコードする。好ましい態様において 、前記外来遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ｋＢのBglII〜HindIII亜 断片内におけるBglII制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。 他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ の前記HindIII M断片における略3.6ｋＢの大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に 挿入される。他の態様において、前記外来配列は、略3.6ｋＢの大きい方のHindI II〜BglII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様 において、このオープンリーディングフレームは、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードする。 一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、前記HindIII M断片の非必須の オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に挿入される。ＯＲＦの例には、Ｉ ４Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｏ１ＬおよびＥ１０Ｌが含まれるが、これらに限定されるもので はない。 他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスの外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイ ルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断 片内に挿入される。好ましい態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイル スゲノムＤＮＡの前記略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断片内に位置するBglII部位 内に挿入される。 他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前 記HindIII M断片における大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に挿入される。好 ましい態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記 大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に位置するAccI部位内に挿入される。 他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、更に、豚痘ウイルスチミジ ンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に挿入された外来ＤＮ Ａ配列を具備する。一つの態様において、この外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルス チミジンキナーゼをコードしているオープンリーディングフレーム内に位置した ＮｄｅＩ部位中に挿入される。 本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組 み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮ ＡのHindIII K断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で 発現することができる組み換え豚痘ウイルスと提供する。 一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前 記HindIII K断片における略3.2Ｋｂの亜断片内に挿入される。他の態様において 、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII K断片にお ける略3.2Ｋｂの亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他 の態様において、該オープンリーディングフレームはＢ１８Ｒ遺伝子をコードす る。他の態様において、該オープンリーディングフレームはＢ４Ｒ遺伝子をコー ドする。 本発明の目的において、「複製できる組み換え豚痘ウイルス」とは、当業者に 周知の組み換え法、例えば、＜材料および方法＞の項の組み換えＳＰＶを作成す るための相同組み換え法に記載した方法によって作成され、組み換え豚痘ウイル スの複製に不可欠の遺伝子物質を欠失されていない生の豚痘ウイルスである。 本発明の目的において、「豚痘ウイルスの複製に不可欠でない挿入部位」とは 、ＤＮＡの配列がウイルスの複製のために必要とされない豚痘ウイルスゲノムに おける位置、例えば、複合タンパク結合配列、逆転写酵素または必須糖タンパク をコードする配列、パッケージングに必要なＤＮＡ配列等である。 本発明の目的において、「プロモータ」とは、外来ＲＮＡポリメラーゼが付着 し、そこで外来ＲＮＡの複製が開始されるＤＮＡ分子上の特定のＤＮＡ配列であ る。 本発明の目的において、「オープンリーディングフレーム」とは、ＲＮＡに転 写されてアミノ酸配列に翻訳されるコドンを含み、且つ終始コドンを含まないＤ ＮＡ切片である。 加えて、本発明は、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物中で複製でき る組み換え豚痘ウイルス（ＳＰＶ）であって、豚痘ウイルスＤＮＡと、前記組み 換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来存在しないＲＮＡをコードする外来 ＤＮＡとを具備し、該外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスの複製に不可欠ではない部位 で豚痘ウイルスＤＮＡ中に挿入されており、且つプロモータの制御下にある組み 換え豚痘ウイルスを提供する。 本発明は更に、ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列または外来ＲＮＡを 提供する。好ましくは、このポリペプチドは動物において抗原性である。好まし くは、この抗原性ポリペプチドは、10個を越えるアミノ酸がペプチド結合によっ て結合された線形ポリマーであり、動物を刺激して抗体を産生させる。 本発明は更に、検出マーカーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含 んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。好ましくは、この検出マー カーはポリペプチドである大腸菌βガラクトシダーゼまたは大腸菌βグルクロニ ダーゼである。好ましくは、大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡ の挿入部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片内に位置ずるAccI制限エン ドヌクレアーゼである。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ −００３（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335）と称するものである。このＳ−ＳＰＶ− ００３豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダ ペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335の下に、アメリカ合衆国郵便番 号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されて いる。 本発明の目的において、「検出マーカーであるポリペプチド」には、ポリペプ チドの形の二量体、三量体および四量体が含まれる。大腸菌βガラクトシダーゼ は、四つのポリペプチドまた亜はモノマーサブユニットで構成される四両体であ る。 本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイル ス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇ Ｂ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐ ＲＶ）糖タンパクＨ、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＥ、遺伝性胃腸 炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク 、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、サー プリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシ・ウイ ルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ） 赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、もしくは豚ｆｌｕノ イラミニダーゼである抗原性ポリペプチド、またはこれらに由来する抗原性ポリ ペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイルスを提供する。好 ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク ５０（ｇＤ）である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、ニューキャッスル 病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼである。 本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイル ス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイ ルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのよ うな検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができ る。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来Ｄ ＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルス ＤＮＡのHindIII M断片内のAccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウ イルスは、Ｓ−ＳＰＶ−００８（ＡＴＣＣ受付番号2339）と称するものである。 このＳ−ＳＰＶ−００８豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339の下に、アメ リカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ123 01に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー 寄託施設に寄託されている。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）をコードする 外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換 え豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする 外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶ Ｃおよび大腸菌 βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウイルスゲ ノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片内のAccI部位で ある。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ−Ｓ ＰＶ−０１２、またはＳ−ＳＰＶ−０１３と命名されたものである。Ｓ−ＳＰＶ −０１３と命名された豚痘ウイルスは、1993年６月16日に、特許手続き上の微生 物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ 2418の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パーク ローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 特許カルチャー寄託施設に寄託された。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外 来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え 豚痘ウイルスは、大腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外 来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる。ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）お よび大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘 ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片内のA ccI部位である。好ましくは、この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０１５ （ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2466）と命名されたものである。このＳ−ＳＰＶ−０１ ５豚痘ウイルスは、1994年７月22日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2466の下に、アメリ カ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301 に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施 設に寄託された。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）および仮性狂犬 病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製 可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大 腸菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むよう に、更に加工することができる。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ ）および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、 豚痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片 内のAccI部位である。 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）および仮性狂犬 病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可 能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸 菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように 、更に加工することができる。ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ）お よび大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘 ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片内のA ccI部位である 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＣ）および仮性狂犬 病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可 能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸 菌βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように 、更に加工することができる。ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ） および大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚 痘ウイルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片内 のAccI部位である 本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウ イルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩ（ｇＣ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ （ｇＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを 提供する。この組み換え豚痘ウイルスもまた、大腸菌βガラクトシダーゼのよう な検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含むように、更に加工することができる 。 ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶｇＩＩ（ｇＢ）およ び大腸菌βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡを挿入するための、豚痘ウ イルスゲノム内の好ましい部位は、豚痘ウイルスＤＮＡのHindIII M断片内のAcc I部位である 本発明は更に、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素-ノイラ ミニダーゼをコードするＲＮＡをコードする外来ＤＮＡを含み、更に検出マーカ ーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む、複製可能な組み換え豚痘 ウイルスを提供する。この組み換え豚痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−００９（ＡＴＣ Ｃ受付番号ＶＲ2344）と命名されたものである。このＳ−ＳＰＶ−００９豚痘ウ イルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に 従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2344の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリ ーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されている。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性ウシ鼻腔 気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイル スに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する 。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タン パクＥおよび糖タンパクＧである。本発明の好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０１ ７およびＳ−ＳＰＶ−０１９と称する組み換え豚痘ウイルスである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性咽頭気管 炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに 感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。こ のような抗原性ポリペプチドの例は、感染性咽頭気管支炎ウイルス糖タンパクＧ および糖タンパクＩである。本発明の好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０１４およ びＳ−ＳＰＶ−０１６と称する組み換え豚痘ウイルスである。 上記組み換え豚痘ウイルスの一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列はサイ トカインである。他の態様において、該サイトカインはニワトリ骨髄単球増殖因 子（ｃＮ４ＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）である。サイト カインには下記のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：即ち、 形 質転換増殖因子ベータ、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増 殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体拮抗剤、イン ターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン ５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インタ ーロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン １１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンジオジェニン、ケモ カイネス(chemokines)、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ・コロニー 刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、ｃ −ｋｉｔリガンド、白血球阻害因子、オンコスタチンＭ(oncostatin M)、プライ オトロピン(pleiotrophin)、分泌性は血球プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子、腫 瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体である。これらのサイトカイン類はヒト 、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタまたは鳥類に由来するものである。このような 組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ−０ ４３である。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原体由来 の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子 中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 サイトカイン類を発現する組み換えＳＰＶは、単独で、もしくは疾病を起こす 微生物のサイトカイン類または抗原遺伝子を含むワクチンと組み合わせて、免疫 応答性を高めるために用いられる。 ヒトヘルペスウイルスから誘導されるヒト病原体の抗原性ポリペプチドには、 Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面およびコア抗 原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単 純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイ ルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウ イルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス(Hanta anvirus)、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器シンシ チアウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、狂犬病ウイルス、 ム ンプスウイルス、マラリア(Plasmodium falciparum)、百日咳菌、ジフテリア菌 、発疹チフスリケッチア、ボレリア・ベルフドルフェリ(Bolrrelia berfdorferi )、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原が含まれるが、こられに限定されるもので はない。 本発明の一態様において、組み換え豚痘ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスコアタ ンパクをコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる。好ましくは、このような組み 換えウイルスはＳ−ＳＰＶ−０３１と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚 痘ウイルスに感染した宿主子において免疫を刺激することができるサイトカイン をコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができ る組み換え豚痘ウイルスを提供する。 本発明の一つの態様において、組み換え豚痘ウイルスは、ヒト・インターロイ キン−２をコードする外来ＤＮＡ配列を含む。好ましくは、このような組み換え ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０３５と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体から 誘導された抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染し た宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルスまたはウマ ヘルペスウイルスから誘導することができる。一態様において、この抗原性ポリ ペプチドは、ウマインフルエンザ・ノイラミニダーゼまたは赤血球凝集素である 。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク ５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイ ラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミ ニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー９２ノイラミニダ ーゼ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖タンパクＢ、ウマ・ヘルペスイウルス１型 糖タンパクＤ、ストレプトコッカス．エクイ(Streptocoddus equi)、ウマ感染性 貧 血ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ウマ・ライノウイルス、およびウマ・ロタウイ ルスである。このような組み換え豚痘ウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ− ０３３、Ｓ−ＳＰＶ−０３４、Ｓ−ＳＰＶ−０３８、Ｓ−ＳＰＶ−０３９および Ｓ−ＳＰＶ−０４１と命名されたものである。 更に、本発明は抗原性ポリペプチドを提供する。該抗原性ポリペプチドには豚 コレラウイルスｇＥ１、豚コレラウイルスｇＥ２、豚インフルエンザウイルス赤 血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク、仮性狂犬病ウ イルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、並びにＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７からなる群から 誘導される組み換え豚痘ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではな い。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウィルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器シン シチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスから誘導された抗原性 ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現す ることができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。 例えば、上記の抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、 ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウマ病原体、ウマインフルエンザウイルス、齲 歯呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシ チアウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核 キャプシドタンパク（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型 融合タンパクおよびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラ ミニダーゼから誘導することができる。好ましい態様において、この組み換え豚 痘ウイルスはＳ−ＳＰＶ−０４５と命名されたものである。 ウシ呼吸器シンシチアウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来Ｄ ＮＡを含む組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２０、Ｓ−ＳＰ Ｖ−０２９、およびＳ−ＳＰＶ−０３０と命名されたものである。また、ウシ・ パラインフルエンザウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ を含む組み換えウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０２８と命名されたも のである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ・ウイルス 性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク４８または糖タンパク５３をコードし、 また前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現 することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ま しい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０３２、Ｓ１−ＳＰＶ−０４０、Ｓ−ＳＰＶ−０４９ 、およびＳ−ＳＰＶ−０５０と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢症ウイ ルスから誘導される抗原性ポリペプチドをコードし、また前記外来ＤＮＡ配列は 、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え 豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢症ウ イルスポリタンパクおよびＶＰ２である。このようなウイルスの好ましい態様は 、Ｓ−ＳＰＶ−０２６、およびＳ−ＳＰＶ−０２７と命名されたものである。 本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列 を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が抗原性ポリペプチ ドをコードする組み換え豚痘ウイルスを提供する。該抗原性ポリペプチドには下 記のものが含まれるが、これらに限定されることはない：即ち、ＭＤＶ ｇＡ、 ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ Ｄ、ＮＤＶ ＨＮ、ＮＤＶ Ｆ、ＩＬＴ ｇＢ、ＩＬＴ ｇＩ、ＩＬＴ ｇＤ、ＩＢＤＶ ＶＰ２、ＩＢＤＶ ＶＰ３、ＩＢＤＶ ＶＰ ４、ＩＢＤＶポリタンパク、ＩＢＶスパイク、ＩＢＶマトリックス、鳥類脳脊髄 炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類ロタウイルス、 ニワトリ貧血ウイルス、サルモネラｓｐｐ．、大腸菌、パスツレラｓｐｐ．、百 日咳菌ｓｐｐ．(Bordetella spp.)、エイメリアｓｐｐ．(Eimeria spp.)、ヒス トモナスｓｓｐ．、トリコモナスｓｓｐ．、家禽線虫、条虫、吸虫、鳥類ダニ／ シラミ、鳥類原生動物である。 本発明は更に、前記挿入された外来ＤＮＡ配列がプロモータの制御下にある組 み換え豚痘ウイルスを提供する。一態様において、該プロモータは豚痘ウイルス プロモータである。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、内因性の上流豚 痘ウイルスプロモータの制御下にある。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列 は、異種上流プロモータの制御下にある。 本発明の目的において、前記プロモータには、合成豚痘ウイルスプロモータ、 ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２、初期プロモー タ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌ プロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１Ｌプロモータ、ポックス Ｅ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初 期、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、ＩＬＴ ｇＢ、ＢＨＶ−1.1 ＶＰ８およびＩＬＴ ｇＤが含まれるが、これらに限定されるものではない。 別のプロモータは、当業者に周知の方法、例えば、材料と方法の項における「合 成ポックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法」に記載した方法に 上って作成される。 本発明は、豚痘ウイルスのゲノムＤＮＡ中に外来ＤＮＡを挿入することにより 組み換え豚痘ウイルスを製造するための、相同性ベクターを提供する。 この相同性ベクターは、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来 的に存在しない実質的に二本鎖の外来ＤＮ（ＲＮＡ）配列からなる二本鎖ＤＮＡ 分子を具備し、該外来二本鎖ＤＮＡの一端には、豚痘ウイルスの複製に不可欠で ないゲノムＤＮＡの一方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性であ る二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有し、前記外来ＤＮＡの他端には、前記豚痘ウイ ルスゲノムの他方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本 鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有する。好ましくは、前記ＲＮＡはポリペプチドをコー ドする。 本発明の他の態様において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡ は、HindIII M断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。他の対応 において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、略２ｋＢのHind III〜BglII亜断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましい態 様において、前記二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、このHindIII〜BglII亜断片の中 に位置したBglII部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。 他の態様において、この二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方のHindIII〜 BglII亜断片に含まれたオープンリーディングフレーム内に存在ずるゲノムＤＮ Ａに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい 方のHindIII〜BglII亜断片に位置したAccI制限エンドヌクレアーゼ部位内に存在 ずるゲノムＤＮＡに対して相同性である。 好ましい態様において、当該相同性ベクターは、752-29.33、751-07.A1、751- 56.A1、751-22.1、746-94.1、767-67.3、738-94.4、および771-55.11と命名され たものである。 一つの態様において、前記ポリペプチドは検出マーカーである。好ましくは、 検出マーカであるポリペプチドは、大腸菌βガラクトシダーゼである。 一つの態様において、前記ポリペプチドは動物において抗原性である。好まし くは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０ （ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、遺伝性 胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、遺伝性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタン パク、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、 サープリナ・ヒドジセンテリエ(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシ・ ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５およびｇ４８、ニューキャッスル病ウ イルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、も しくは豚ｆｌｕノイラミニダーゼ、またはこれらに由来する。好ましくは、該抗 原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）で ある。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、セルプリナ・ヒオディセンテリエ (Serpulina Hyodysenteriae)、口蹄疫ウイルス、豚これらウイルスｇＥ１および ｇＥ２、豚インフルエンザウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラズ マ・ハイポニュモニエ、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダ ーゼおよびマトリックスおよび核タンパク、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７、および Ｂ型肝炎ウイルス核タンパク、またはこれらから誘導されたものである。 本発明の一つの態様において、相同性ベクター中の二本鎖外来ＤＮＡ配列は、 ヒト病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。 例えば、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒト・ヘルペスウイルス、単純 ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイル ス、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイ ルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全 ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウ イルスからなる群から誘導される。更に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、 プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)、ボルデテリア・ペ ルトウスシス（Bordetelia pertussis）および悪性腫瘍からなる群から選択され る、マラリアまたは悪性腫瘍に関連していてもよい。 本発明の一態様において、前記相同性ベクターにおける二本鎖外来ＤＮＡ配列 は、ヒト免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードする。一つの態 様において、このサイトカインは、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）また はニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である。例えば、該サイトカインは インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、イン ターフェロン、顆粒球−マクロフアージ・コロニー刺激因子、およびインターロ イキン受容体であることができるが、これに限定されるものではない。 本発明の一態様において、相同性ベクターにおける前記二本鎖外来ＤＮＡ配列 は、ウマ病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。 ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルスまたはウ マ・ヘルペスウイルスから誘導することができる。このような抗原性ポリペプチ ドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ 、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・ インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフル エンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイ ルス１型糖タンパクＢ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤからな る群から選択される組み換え豚痘ウイルスである。 本発明の一態様において、前記相同性ベクターの二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ウ シ呼吸器シンシチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスをコード する。 例えば、該抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ 呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチ アウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キ ャプシドタンパク（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融 合タンパク、およびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラ ミニダーゼから誘導される。 本発明の一態様において、前記相同性ベクターの前記二本鎖外来ＤＮＡ配列は 、感染性嚢症ウイルスから誘導される。このような抗原性ポリペプチドの例は、 感染性嚢症ウイルスポリペプチドおよび感染性嚢症ウイルスＶＰ２、ＶＰ３また はＶＰ４である。 本発明の目的において、「相同性ベクター」とは、豚痘ウイルスゲノムの特定 の部位に外来ＤＮＡを挿入するために構築されたプラスミドである。 本発明の一つの態様において、上記で述べた相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイ ルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレー ム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘 ウイルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフ レーム中に位置するNdeI制限エンドヌクレアーゼ内に存在するゲノムＤＮＡに対 して相同性である。 本発明は更に、上記の相同性ベクターであって、その外来ＤＮＡ配列が、前記 外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの制御下にある相同性ベクターを提 供する。該プロモータは、内因性豚痘ウイルスプロモータまたは外因性プロモー タであることができる。プロモータには、合成ポックスウイルスプロモータ、ポ ックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２ 、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌプロ モータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１Ｌプロモータおよびポックス Ｅ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１・アルファ４、ＨＣＭＶ即時型 初期、ＢＨＶ−１．１ ＶＰ８、感染性咽頭気管炎ウイルス糖タンパクＢ、感染 性咽頭気管炎ウイルスｇＤ、マレック病ウイルス糖タンパクＡ、マレック病ウイ ルス糖タンパクＢ、マレック病ウイルス糖タンパクＤが含まれるが、これらに限 定されるものではない。 本発明は、Ｓ−ＳＰＶ−０４４、Ｓ−ＳＰＶ−０４６、Ｓ−ＳＰＶ−０４７、 Ｓ−ＳＰＶ−０４８、Ｓ−ＳＰＶ−０５２、Ｓ−ＳＰＶ−０５１、Ｓ−ＳＰＶ− ０５３、Ｓ−ＳＰＶ−０５４、Ｓ−ＳＰＶ−０５５、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ− ＳＰＶ−０５７、Ｓ−ＳＰＶ−０５８、Ｓ−ＳＰＶ−０５９、Ｓ−ＳＰＶ−０６ ０、Ｓ−ＳＰＶ−０６１、Ｓ−ＳＰＶ−０６２と命名された組み換え豚痘ウイル スを提供する。 本発明は更に、有効免疫量の本発明の組み換え豚痘ウイルスと、適切なキャリ アとを含有するワクチンを提供する。 豚痘ウイルスのための適切なキャリアは当該技術において周知であり、タンパ ク、糖などが含まれる。このような適切なキャリアの一例は、安定化された加水 分解タンパク、ラクトース等のような１以上の安定家財を含有する、生理学的に バランスされた培養培地である。 本発明の目的において、「有効免疫量」の本発明の組み換え豚痘ウイルスは、 １０³〜１０⁹ＰＦＵ／投与量の範囲である。 本発明はまた、動物を免疫化する方法であって、該動物がヒト、豚、牛、ウマ ヤギ(caprne)またはヒツジ(ovine)である方法を提供する。本発明の目的におい て、この方法には、疾患を生じるウイルス（類）に対して動物を免疫化すること が含まれ、これらウイルス（類）には、仮性狂犬病ういるす、遺伝性胃腸炎（Ｔ ＧＥ）ウイルス、豚ロタウイルス、豚パルボウイルス、サープリナ・ヒドジセン テリエ(Serpulina hydodysenteriae)、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイル ス、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、豚インフルエンザウイルス、ＰＲ ＲＳ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型 、口蹄病ウイルス、豚コレラウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラ ズマ・ハイポニュモニエが含まれる。本発明の目的において、この免疫化方法に はまた、ヒト病原体、ウシ病原体、ウマ病原体、鳥類病原体に対して動物を免疫 化することが含まれる。 この方法には、動物に対して、有効免疫投与量の本発明のワクチンを投与する ことが含まれる。このワクチンは、当業者に周知の何れかの方法、例えば筋肉内 注射、皮下注射、副空内注射または静脈内注射によって投与すればよい。或いは 、 このワクチンは、鼻腔内または経口的に投与してもよい。 本発明はまた、豚が本発明のワクチン、特に組み換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ −００８（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339）を含有する実施例で予防接種されている かどうか、または天然に存在する野生型の仮性狂犬病ウイルスに感染しているか どうかを決定するために、豚を試験する方法を提供する。この方法は、試験すべ き豚から適切な体液のサンプルを取得することと、該サンプル中において仮性狂 犬病ウイルスに対する抗体の存在を検出する（このような抗体が存在しないこと によって、前記豚が予防接種も感染もされていないことが示される）ことと、仮 性狂犬病ウイルスに対する抗体が存在する豚について、前記サンプル中において 、天然に存在する仮性狂犬病ウイルスに感染した豚の体液中には通常存在するが 、予防接種された豚には存在しない仮性狂犬病ウイルス抗原に対する抗体が存在 していないことを検出することにより、該豚が予防接種されていることまたは感 染していないことが示されることとを具備する。 本発明は、外来ＤＮＡ配列または遺伝子と共に挿入されると、診断試験として 用い得る組み換えＳＰＶを提供する。一つの態様においては、ＦＩＶｅｎｖおよ びｇａｇ遺伝子類、並びにＤ．イミティス(immitis)ｐ３９および２２ｋｄが、 ＦＩＶによって起こされたネコ免疫不全を検出し、またＤ．イミティスによって 起こされたイヌ糸状虫を検出するための診断試験に用いられる。 本発明はまた、複製できる組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主細胞を提供す る。一つの実施例において、宿主細胞は哺乳類細胞である。好ましくは、この哺 乳類細胞はベロ細胞(Vero cell)である。好ましくは、前記哺乳類細胞はＥＳＫ −４細胞、ＰＫ−１５細胞またはＥＭＳＫ細胞である。 本発明の目的において、「宿主細胞」とは、ベクターおよびその挿入物を増殖 させるために用いられる細胞である。害細胞の感染は、当業者に周知の方法、例 えば、＜材料と方法＞の項における「感染−トランスフェクション法」に記載し た方法によって達成された。 上記の組み換え豚痘ウイルスを構築し、選択し、精製するための方法は、下記 の＜材料と方法＞の項で詳述する。 〔実験の詳細〕 ＜材料と方法＞ 豚痘ウィルスストック試料の調製 豚痘ウィルス(SPV)試料はイスコーブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modif ied Dulbecco's Medium)(IMDM)と２mMのグルタミン，100units/mlのペニシリン ，100units/mlのストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地の1:1混合溶液中(これ らの構成成分はシグマ社もしくは相当の供給元から得られ，そしてこれ以後EMSK 陰性培地(negative medium)と呼ぶ)でブタ胎児腎臓(EMSK)細胞，ESK-4細胞，PK- 15細胞もしくはベロ細胞を，0.01PFU/細胞の感染多重度で感染させることにより 調製された．感染に先立ち，細胞単層は微量のウシ胎児血清を除去するためEMSK 陰性培地を用いて１回洗浄された．その後，最初の接種原(10cmのプレートに対 しては0.5ml；T175cmのフラスコに対しては10ml)に含まれるSPVは，30分間ごと に繰り返し拡散させつつ(redistributed)，２時間細胞単層中へ吸収させられた ．この期間の後，最初の接種原は規定の(recommended)容量まで完全EMSK培地(5% のウシ胎児血清を加えたEMSK陰性培地)を加えられた．プレートは細胞変性の効 果が完全となるまで，5% CO₂中37℃でインキュベートされた．培地と細胞は回収 され，50mlのスクリューキャプ付き円錐管(conical screw cap tube)中で-70℃ で凍結された．37℃で解凍されるとすぐに，ウィルスストックは1.0mlバイアル に分注され，-70℃にて再凍結された．力価は通常約106PFU/mlであった． SPV DNA の調製 豚痘ウィルスDNAを単離するために，T175cm2フラスコ中の集密的EMSK細胞単 層は多重度0.1で感染させられ，細胞が100%細胞変性の効果を示すまで４から６ 時間インキュベートされた．感染細胞はその後，培地中に細胞をこすり落とされ ，臨床的な遠心分離(clinical centrifuge)にて300rpmで５分間遠心分離するこ とにより回収された．培地は別の容器に移され，細胞ペレットはリン酸緩衝溶液 1.0ml(PBS:水1L中に1.5gのリン酸二ナトリウム，0.2gのリン酸二水素カリウム， 0.8gの塩化ナトリウム及び0.2gの塩化カリウムを含む)(T175あたり)中で穏やか に再懸濁され，連続２回の凍結−解凍処理(-70℃か ら37℃まで)を受けた．最後の解凍の際，細胞(氷上で)は30秒間２回の超音波処 理を施され，１回目と２回目の間には45秒間の冷却時間をおいた．その後，細胞 の残骸はHB4ローターで4℃下，3000rpm，５分間の遠心分離(ソーヴアル RC-5B 超高速遠心機)(Sorvall RC-5B superspeed centrifuge)により取り除かれた．上 清中に存在するSPVウィルス粒子(virions)は，その後SS34ローター(ソーヴァル) (Sorvall)で４℃下，15,000rpm，20分間の遠心分離によりペレット化され，10mM のトリス(pH7.5)中に再懸濁された．その後，この画分は36%ショ糖の密度勾配(1 0mMトリスpH7.5中でのw/v)中へ層状化され，SW41ローター(ベックマン)で4℃下 ，18,000rpm，60分間遠心分離(ベックマンL8-70M超遠心機)(Beckman L8-70M ult racentrifuge)された．ウィルス粒子ペレットは10mMのトリス緩衝溶液pH7.5中に 再懸濁され，氷上で30秒間超音波処理を施された．この画分は20%から50%の連続 的ショ糖密度勾配(continuous sucrose gradient)で層状化され，SW41ローター で4℃下，16,000rpm，60分間遠心分離された．その勾配の下方約４分の３に位置 するSPVウィルス粒子のバンドが回収され，20%ショ糖溶液で希釈され，SW41ロー ターで4℃下，18,000rpm，60分間の遠心分離によりペレット化された．生成され たペレットは，その後微量のショ糖を除去するために10mMのトリス緩衝溶液pH7. 5を用いて１回洗浄され，最終的に10mMのトリス緩衝溶液pH7.5中で再懸濁された ．その後，EDTA，SDS及びプロテイナーゼKをそれぞれ20mM，0.5%及び0.5mg/mlの 最終濃度になるように添加して誘導された溶解(lysis)(60℃，４時間)により精 製されたウィルス粒子から，SPV DNAが抽出された．消化(digestion)の後，フェ ノール:クロロホルム(1:1)抽出が３回実施され，２倍量の100%エタノールの添加 と-20℃，30分間のインキュベートにより試料は沈殿させられた．その後，試料 はエッペンドルフミニフュージ(eppendorf minifuge)にて５分間，最高速度(ful l speed)で遠心分離された．上清は他の容器に移され,ペレットは風乾され，4℃ にて1mM EDTAを含む0.01Mのトリス緩衝溶液pH7.5中で再水和された． 感染細胞溶解物(infected cell lysates)の調製 細胞溶解物の調製用に，血清を含まない培地が用いられた．25cm2フラスコ または60mmペトリ皿中で集密的細胞単層(SPVに対しEMSK，ESK-4，PK-15また はVero，またはPRVに対してVERO)は100μｌのウィルス試料で感染させられた． 細胞変性の効果が完全となった後，培地と細胞は回収され，細胞は3000rpm，５ 分間の臨床的な遠心分離(clinical centrifuge)でペレット化された．細胞ペレ ットは250μｌの破壊緩衝液(disruption buffer)(2%のドデシル硫酸ナトリウム ，2%のβ-メルカプトエタノール)中に再懸濁された.試料は氷上で30秒間の超音 波処理を施され，-20℃で保存された． ウェスタンブロッティング法 細胞溶解物試料と標準タンパク質はラエムンリ(Laemnli)(1970)の方法に従 ってポリアクリルアミドゲル上で泳動された．ゲル電気泳動後，タンパク質は変 性され，サムブルックら(Sambrook et al.)(1982)の方法に従って処理された． １次抗体はトリスナトリウム塩化物及びアジ化ナトリウム(TSA:水1L中に6.61gの トリス塩酸，0.97gのトリス塩基，9.0gの塩化ナトリウム及び2.0gのアジ化ナト リウムを含む)中にて5%の無脂肪乾燥ミルクで1:100の割合に希釈されたブタ抗PR V血清(Shope strain;lot370，PDV8201，NVSL，Ames，IA)であった．２次抗体はT SAで1:1000の割合に希釈されたヤギ抗ブタアルカリ性フォスファターゼ抱合体(g oat anti-swine alkaline phosphatase conjugate)であった． 分子生物学的手法 制限エンドヌクレアーゼを用いた消化，ゲル電気泳動，ゲルからのDNAの抽 出，ライゲーション，キナーゼを用いたリン酸化，ホスファターゼを用いた処理 ，細菌培養の成長，DNAを用いた細菌の形質転換法などを含む，細菌とDNAの操作 に関する技術及びその他の分子生物学的方法はマニアティスら(Maniatis et al. )(1982)及びサムブルックら（Sambrook et al.）(1989)により示されている．例 外として，これらの方法には若干の修正が加えられた． DNA シークエンシング シークエンシングはUSBシークエナーゼキット(USB Sequnenase Kit)と35S-d ATP(NEN)を用いて行われた．圧縮された領域(areas of compression)を解明する ためdGTP混合物とdITP混合物の両方を用いる反応が実行された．あるいは，圧縮 された領域(compressed areas)はフォルムアミドゲルで解析された．テンプレー トにはダブルストランドのプラスミドサブクローンもしくはシングルス トランドM13サブクローンを用い，プライマーはシークエンスされるべき挿入断 片のずぐ外側のベクターに対して，あるいは以前に得られた配列に対して作成さ れた．得られた配列は編集され，ドナスターソフトウエアー(Dnastar software) を用いて比較された．得られた配列の取り扱いや比較はコラルソフトウェア(Cor al Software)のスーパークローンTM(Superclone TM)とスーパーシーTMプログラ ム(SuperseeTM programs)を用いて行れた． 複製連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)を用いたクローニング 種々のDNAの繰作に都合のよい制限（酵素）部位を導入するために複製連鎖 反応(Polymerase Chain Reaction)(PCR)が用いられた．用いられた方法はインニ スら(Innis，et al．)(1990)により示されている．一般に，増幅された断片はサ イズ的には500塩基対より小さく，増幅された断片の臨界領域(critical region) はDNAシークエンシングにより確かめられる.それぞれの場合において用いられた プライマーは，以下に示す相同性ベクターの構築についての記述で詳しく述べら れている． 組み換えSPV生成のための相同的組み換え法(Homologous Recombination Prode cure) この方法は，豚痘ウィルスDNAとトランスフェクションされたプラスミド相 同性ベクターの両方を含む組織培養細胞中に生じた，豚痘ウィルスDNAとプラス ミド相同性ベクターDNA間の相同的組み換えに依拠する．相同的組み換えを生じ させるために，EMSK細胞単層はこれらの細胞中へのSPVの複製(すなわちDNA合成) を誘導するべく，感染多重度0.01PFU/細胞でS-SPV-001(カスザ SPV株，17)(Kas za SPV strain，17)に感染させられる．その後，プラスミド相同性ベクターDNA は感染−トランスフェクション法(Infection-Transfected Procedure)に従い， これらの細胞にトランスフェクションされる．本方法で用いた相同性ベクターの 構築は以下に示される． 感染−トランスフェクション法 EMSK細胞の６cmプレート(集密度約80%)はEMSK陰性培地中にて感染多重度0.0 1PFU/細胞でS-SPV-001に感染させられ，CO₂濃度5%の加湿された環境下で37℃に て５時間インキュベートされた．用いられたトランスフェクション法は基 本的にはリポフェクチンTM試薬(LipofectinTM Reagent)(BRL)の使用説明書に示 された方法である．簡単に説明すると，６cmプレートのそれぞれにつき，15μg のプラスミドDNAが水で100μｌまで希釈された．これとは別に50μgのリポフェ クチン試薬が水で100μｌまで希釈された．その後，ポリスチレン製の５mlのス ナップキャップ付き試験管中の希釈されたプラスミドDNAに，希釈されたリポフ ェクチン試薬100μｌが滴下的に加えられ，穏やかに混合された．その後，混合 物は室温にて15から20分間インキュベートされた．この間に，ウィルスの接種原 は６cmプレートから除去され，細胞単層はEMSK陰性培地を用いて１回洗浄された ．その後，３mlのEMSK陰性培地がプラスミドDNA/リポフェクチン混合物に加えら れ，その内容物は細胞単層上にピペットで移された．細胞は一晩(約16時間)，CO₂ 濃度5%の加湿された環境下で37℃にてインキュベートされた．翌日，３mlのEMS K陰性培地は取り除かれ，５mlのEMSK完全培地に置き換えられた．細胞はウィル スによる細胞変性の効果が80%から100%になるまで，CO₂濃度5%下37℃で３日間か ら７日間インキュベートされた．ウィルスはウィルスストックの調製で上記した ようにして回収された．このストックはトランスフェクションストック(transfe ction stock)と呼ばれ，引き続いて組み換え豚痘ウィルス検出用のブルオガルス クリーン(Bluogal Screen)もしくは組み換え豚痘ウィルス検出用CPRGスクリーン (CPRG Screen)により，組み換えウイルスの検出がなされた． β−ガラクトシダーゼを発現している組み換えSPVの検出(Screen) （ブルオガル(Bluogal)及びCPRG分析） 組み換えウィルスに大腸菌(E．coli)のβ−ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカ ー遺伝子が組み込まれた場合，組み換え体を含んでいるプラークは，２つの簡単 な方法のうちのどちらか１つによって視覚化された．１番目の方法では，プラー ク分析の間ブルオガル(BluogalTM)試薬(ベテスダ研究所)(Bethesda Research La bs)がアガロース上層(agarose overlay)に組み込まれ(200μg/ml)，β−ガラク トシダーゼ活性を発現しているプラークは青になる．青いプラークはその後，新 しい細胞(EMSK)上に選び取られ，青いプラークのさらなる単離により精製された ．２番目の方法では，プラーク分析の間CPRG(ベーリンガー マンハイム)(Boehr inger Mannheim)がアガロース上層(agarose overlay)に組み込まれ(400 μg/ml)，β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているプラークは赤になる．赤い プラークはその後，新しい細胞(EMSK)上に選び取られ，赤いプラークのさらなる 単離により精製された．どちらの場合においてもウィルスは，典型的には，３回 のプラーク精製で精製された． ブラックプラーク分析(Black Plaque Assays)を用いた 組み換えSPV中における外来遺伝子発現の検出(screen) 組み換え豚痘ウィルスにより発現した外来抗原の発現を分析するために，EM SK細胞単層は組み換えSPVで感染させられ，アガロース栄養培地に重層され(over layed)，プラーク成長(plaque development)が生じるまで37℃で６日間から７日 間インキュベートされた．その後，アガロース上層(overlay)はペトリ皿から除 かれ，細胞は100%メタノールによりで室温で10分間固定され，風乾された．細胞 の固定により表面抗原と同様に細胞質抗原も検出されるようになるが，未固定の 細胞を用いることにより特異的な表面抗原の発現が検出可能である．その後，１ 次抗体はPBSを用いて適当な希釈倍率まで希釈され，細胞単層上に室温で２時間 インキュベートされた．S-SPV-008由来のPRV g50（gD）の発現を検出するために ，ブタ抗PRV血清(ショープ株;ロット370，PDV8201，NVSL，エームズ，IA)(shope strain;lot370，PDV8201，NVSL，Ames，IA)が用いられた(1:100希釈)．S-SPV-0 09由来のNDV HNの発現を検出するために，HNタンパク質に特異的なウサギ抗血清 (rabbit anti-NDV#2)が用いられた(1:1000希釈)．その後結合していない抗体は ，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除かれた．２次抗体とし ては，ヤギ抗ブタ(PRV g50(gD);S-SPV-008)もしくはヤギ抗ウサギ(ND VHN;S-SPV -009)のいずれかと西洋ワサビパーオキシダーゼの抱合体がPBSを用いて1:250に 希釈され，室温下で２時間，細胞とともにインキュベートされた．その後，結合 していない２次抗体は，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除 去された.その後,細胞は新しく調製された基質溶液(substrate solution)(PBS中 に100μg/mlの４クロロ-1-ナフトール(4-chloro-1-naphthol)，0.003%の過酸化 水素を含む)とともに室温で15分間から30分間インキュベートされた．正しい抗 原性を発現するプラークは黒く染色される． 診断法として使用されるためのウィルス性糖タンパク質の精製に関する方法 ウィルス性糖タンパク質は抗体アフィニティカラムを用いて精製される．モ ノクローナル抗体を生成するために，８週から10週齢のBALB/c雌マウスはS-SPV- 009，-014,-016，-017，-018もしくは-019の107PFUを２週から４週間隔で７回， 腹膜内にワクチン接種(vaccinated)される．最後のワクチン接種から３週間後， マウスは相応のウィルス性糖タンパク質40mgを腹膜内に注射される．最後の抗原 投与から３日後に脾臓が取り出される． オイとハーゼンバーグ(Oi and Herzenberg)(41)の手法を改良した方法により ，脾細胞はマウスNS1/Ag4プラスマ細胞腫細胞と融合される.脾細胞とプラスマ細 胞腫細胞は10分間300xgの遠心分離で一緒にペレット化される．ポリエチレング リコール(分子量1300から1600)の50%溶液１mlが，１分間攪拌されながら細胞ペ レットに加えられる．ダルベッコ改良イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle s's Medium)(5ml)が３分間にわたり細胞に加えられる．細胞は300xg，10分間の 遠心分離によりペレット化され，10%のウシ胎児血清と100mMヒポキサンチン，0. 4mMアミノプテリン及び16mMチミジンを含む培地(HAT)中に再懸濁される．100ml の標準の脾臓支持細胞層細胞(normal spleen feeder layer cells)を含有する８ から10個の96穴の組織培養プレートに細胞(100ml)が加えられ，37℃でインキュ ベートされる．細胞には３日間から４日間ごとに新しいHAT培地が供給される． ハイブリドーマ培養上清は，100ngのウィルス性糖タンパク質がコートされた9 6穴マイクロタイタープレート(96-well microtiter plates)中でのエリサ（ELIZ A）分析により検査される．活性ハイブリドーマ由来の上清はさらにブラックプ ラーク分析(black-plaque assay)とウェスタンブロット(Western Blot)により解 析される．選抜されたハイブリドーマは限界希釈(limiting dilution)により二 度クローニングされる．プリスタン処理されたBALB/ｃマウスに5x106ハイブリド ーマ細胞を腹膜内注射することにより腹水液(ascetic fluid)が生成される． S-SPV-009，-014，-016，-017，-018もしくは-019由来の細胞溶解物は感染細 胞溶解物の調製で示されたようにして得られる．糖タンパク質を含む細胞溶解物 (100mls)は，2mlのアガロース親和性樹脂を通される．製造元(AFC培地，ニュー ブランズウィックサイエンティフィック，エディソン，ニュージャージー)(AFC Medium，New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)の使用説明に従うと，その カラムでは20mgの糖タンパク質モノクローナル抗体が固定化されている．カラム は非特異的に結合した物質を除くために，0.1%のノニデットP-40(Nonidet P-40) を含むリン酸緩衝溶液(PBS)100mlを用いて洗浄された．結合した糖タンパク質は 100mM炭酸緩衝液(carbonate buffer)，pH 10.6(40)で溶出される．溶出前後の画 分(pre-posteluted fractions)は，エリサ(ELISA)システム中でのSPVモノクロー ナル抗体に対する活性により純度(purity)がモニターされる． エリサ検定（ELISA ASSAY） ワクチン接種と抗原投与に引き続いておこる畜牛の免疫状態を測定するため に，標準的な酵素結合免疫吸着剤検定法(ELISA)の手順が用いられる． 糖タンパク質抗原溶液(PBS中にng/mlにて100ml)(100ml at ng/ml in PBS)はマ イクロタイター皿の穴に4℃下18時間吸着させられる.コートされた穴はPBSを用 いて１回リンスされる．穴は1%のBSA(シグマ)(Sigma)を含むPBSを250ml加えるこ とによりブロックされ，37℃で１時間インキュベートされる．ブロックされた穴 は0.02%のツィーン20(Tween20)を含むPBSで１回リンスされる．50mlの供試血清( 前もって1%BSAを含むPBS中で1:2に希釈された)が穴に添加され，37℃で１時間イ ンキュベートされる．抗血清は除去され，穴は0.02%のツィーン20(Tween20)を含 むPBSで３回洗浄される.特異的な抗原に対する抗体を含んでいる穴を視覚化する ために，西洋ワサビパーオキシダーゼ(1% BSAを含むPBS中で1:500に希釈された もの，キッケガードとペリー研究所社(Kirkegaard and Perry Laboratories，In c.))に結合した抗ウシIgGを含む50mlの溶液が添加される．溶液は37℃で１時間 インキュベートされ，その後溶液は除去され，0.02%のツィーン20(Tween20)を含 むPBSで３回洗浄される．それぞれの穴に100mlの基質溶液(ATBS，キッケガード とペリー研究所社)(ATBS，Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.)が加えら れ，15分間発色させられ．反応は0.1Mのシュウ酸の添加により終止させられた． 色は自動プレート読みとり機(automatic plate reader)にて吸光度410nmで読み とられた． 合成ポックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法 組み換え豚痘ベクターに関して，合成痘プロモーター(synthetic pox promoters)は，外来遺伝子発現の強度とタイミングを制御する能力を含むいくつ かの利点を供する.ワクシニアウィルス(1,7及び8)中で決定されたプロモーター に基づいた３つのプロモーターカセットLP1，EP1及びLP2が設計された．それぞ れのカセットはワクシニア中で決定されたDNA配列に制限酵素部位を配したもの を含むように設計された．この制限酵素部位により，カセットはいかなる順番に でも，いかなる組み合わせにでも結合させて利用できるようになる．EcoRIもし くはBamHIサイトでフレーム内融合(inframe fusion)ができるように，イニシエ ーターメチオニンもそれぞれのカセット中に設計された．３つのリーディングフ レームすべてに含まれる一連の翻訳終了コドンと初期(early)転写終止シグナル （early transcriptional termination signal）(9)もフレーム内融合(inframe fusion)サイトの下流に組み込まれた.それぞれのカセットをコードするDNAは標 準的な手法に従って合成され，適当な相同性ベクターへクローニングされた(図4 ,5及び８参照)． 仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルス糖タンパク質遺伝子を含む 組み換え豚痘ウィルスを用いたブタにおけるワクチン接種実験： 仮性狂犬病(Pseudorabies)非感染群からの離乳した幼ブタが，１つまたはそ れ以上の仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルス糖タンパク質遺伝子(SPV/PRV)を有 する組み換え豚痘ウィルスの効力を検査するために用いられる．約103から107プ ラーク形成単位(PFU)の組み換えSPV/PRVウィルスが筋肉内，皮下，あるいは経口 的に幼ブタに接種される． 免疫性はPRV血清抗体のレベルを測定することと，ワクチン接種されたブタに 仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルスの病原性株を抗原投与(challenge)すること により決定される．ワクチン接種の３から４週間後，ブタの接種したグループと 接種していないグループはともに仮性狂犬病(Pseudorabies)ウィルスの病原性株 (VDL4892)を抗原投与(challenge)される．抗原投与(challenge)後，ブタは14日 間毎日，仮性狂犬病(Pseudorabies)の臨床的兆候を観察される． ワクチン接種した時点，抗原投与の時点，及び接種後２から３週の間１週おき に血清試料が得られ，血清中和抗体を検査された．ウシウィルス性下痢ウイルス(Bovine Viral Diarrhea Virus)g48とg53遠伝子 のクローニング カッツら(Katz et al.)(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関 して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシウィルス性下 痢ウィルスg48とg53遺伝子はクローニングされた．マーデン-ダービイ（Madin-D arby）ウシ腎臓(MDBK)細胞中で成長したBVDウィルスシンガー株(BVD Virus Sing er strain)から調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴ ヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた．その後，cDNAは複製連鎖 反応(PCR)クローニング(15)のためのテンプレートとして用いられた．PCRプライ マーは,SPV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコ ード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計され た．コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必 要であった．BVDVシンガー株(BVDV Singer strain)(49)由来のg48遺伝子をコー ドしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．BVDVウィルスシンガー株(BVDV Singer strain)（49）由来 のg53遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以下 のプライマー: 5'-CGTGGATCCTCAATTACAAGAGGTATCGTCTAC-3'（SEQ ID NO:136)を用いてクロ ーニングされ，PCRのために 5'-CATAGATCTTGTGGTGCTGTCCGACTTCGCA-3'（SEQ ID NO:137） と結合させられた.この一般的な手法は,BVDVの他の株からg48遺伝子とg53遺伝子 をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい．BVDV g48に対応するDNA断片は,678bpの断片を得るためにBamHIで消化された． BVDV g53に対応するDNA断片は，1187bpの断片を得るためにBglIIとBamHIを用い て消化された.BVDV g48とg53 DNA断片は，それぞれ相同性ベクター727-78.1と73 8-96を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサ イトにクローニングされた． ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合(Bovine Respiratory Syncytial Virus Fusion ) ，ヌクレオカプシド(Nucleocapsid)及び糖タンパク質遺伝子のクローニング カッツら(Katz et al.)(42)がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関 して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシ呼吸器合胞体 ウイルス融合(Bovine respiratory syncytial virus fusion)(F)，ヌクレオカプ シド(Nucleocapsid)(N)及び糖タンパク質(G)遺伝子がクローニングされた．ウシ 鼻甲介(nasal turbinate)(BT)細胞中で成長させたBRSVから調製されたウィルスR NAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcD NAに変えられた．その後，cDNAは複製連鎖反応(PCR)クローニング(15)のための テンプレートとして用いられた.PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当 なシグナル含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする 制限酵素サイトを組み込むように設計された．コードする領域のそれぞれにつき １対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった．BRSV株375（VR-1339）由 来のＦ遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング(priming)のため以 下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのためにと結合させられた．BRSV株375(VR-1339)由来の領域をコードしているN遺伝子は ，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー： を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．BRSV株375(VR-1339)由来のG遺伝子をコードしている領域は ，cDNAのプライミング(priming)のため以下のプライマー: を用いてクローニングされ，PCRのために と結合させられた．この一般的な手法は,BRSVの他の株からF遺伝子，N遺伝子及 びG遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意された い．BRSVのF,N及びGに対応するDNA断片は，それぞれ1722bp，1173bp及び771bpの 断片を得るためにBamHIで消化された．BRSVのF，N,及びGのDNA断片は，相同性ベ クター727-20.10，713-55.37，及び727-20.5を得られようにSPV相同性ベクター のLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにそれぞれクローニングされた コンカナバリンA(Concanavalin A)で処理されたニワトリ脾臓細胞から単離さ れたRNA ニワトリ脾臓は３週齢のSPAFAS孵化ヒナから解剖して取り出され,洗浄され ，細胞を解離するために注射筒/針を通して粉砕された.細胞質と残渣が除かれた 後，細胞はペレット化され，PBSで二回洗浄された．細胞ペレットは赤血球細胞 を溶血させるために低張性溶解緩衝液で処理され，脾細胞は回収され，PBSで二 回洗浄された．脾細胞は5% FBSと５μg/mlのコンカナバリンA(concanavalin A) を含むRPMI中に5x106細胞/mlにて再懸濁され，39℃下で，48時間インキュベート された.総RNAはグアニジンイソチオネート溶解剤(guanidine isothionatelysis reagents)とプロメガRNA単離キット(プロメガ社RNA isolation Kit)(プロメガ社 マディソン ウィスコンシン)(プロメガ社Corporation，Madison WI)による手 順を用いて細胞から単離された．４μgの総RNAが，適当なアンチセンスプライマ ーとAMV逆転写酵素(プロメガ社 マディソン ウィスコンシン)(プ ロメガ社Corporation，Madison WI)を含むそれぞれの第一鎖(1st strand)反応に 用いられた．逆転写酵素反応に続いてcDNA合成が同じ試験管内で，適当なセンス プライマー(sense primers)とVentR DNAポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ社 ，ベテスダ，メリーランド）(Life technologies，Inc．Bethesda，MD)を用いて 行われた． 酵素のマーカー遺伝子を発現させる組み換えヘルペスウィルスの検出(Screen) 大腸菌β−ガラクトシダーゼ(uidA)マーカー遺伝子が組み換えウィルスに組 み込まれた時，組み換え体を含むプラークは簡単な分析により視覚化された．プ ラーク分析の間，アガロース上層(agarose overlay)に酵素基質が組み入れられ た(300μg/ml)．uidAマーカー遺伝子に関しては，基質X-グルクロChx(X-Glucuro Chx)(5-プロモ-4クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニック酸シクロヘキシルア ンモニウム塩，バイオシンスAG)(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid Cyclohexylammonium salt，Biosynth AG)が用いられた．マーカー酵素活 性を示したプラークは青に変わった．その後，青いプラークは新しいESK-4細胞 上に選び取られ，青いプラークをさらに単離することにより精製された．酵素マ ーカー遺伝子が除去された場合の組み換えウィルス手法では分析に際し，親（世 代）の青いプラークのバックグランドから白いプラークを精製したものが用いら れた．どちらの場合においても，典型的には，３回のプラーク精製によりウィル スは精製された． 相同性ベクター515-85.1 プラスミド515-85.1は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された.このプラ スミドは外来DNAが挿入されうる特異なAccI制限酵素サイトを含んでいる．AccI サイトに外来DNA挿入（断片）を有しているプラスミドが「組み換えSPV生成のた めの相同的組み換え法」に従って使用されると，外来DNAを有するウィルスが生 じるだろう．相同性ベクター515-85.1内のDNA挿入（断片）の制限酵素地図を図4 A-4Dに示す．このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用い(22と29)，以下 に示す供給源からの２つ制限酵素（切断）断片を結合させることで構築される． １つめの断片はpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHIまでの約2972 塩基対の制限酵素切断断片である．２番目の断片はSPV HindIII消 化断片M(23)のHindIIIからBglIIまでの約3628塩基対の亜断片(sub-fragment)で ある． 相同性ベクター520-17.5 プラスミド520-17.5は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．このプラ スミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子を もつ．マーカー遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．マーカー遺 伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．このプラスミドが「組み換えS PV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，マーカー遺伝子をコ ードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マー カー遺伝子は合成初期/後期(early/late)痘プロモーターの制御下にあることに 留意されたい．プラスミドの詳細を図4A-4Dに示す．このプラスミドは標準的な 組み換えDNA技術を用いて(22と30),以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限 酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図4A-4Dに示す ．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIからBamHI までの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片１はSPV HindIII消 化断片M(23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fragment)であ る.断片２はプラスミドpJF751(11)のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限 酵素断片である．断片３はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからBglIIまでの約1 484塩基対の亜断片(sub-fragment)である． 相同性ベクター538-46.16 プラスミド538-46.16は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．このプ ラスミドはSPV DNAに隣接して，大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝 子とPRV g50(gD)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片 である．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である．このプラスミ ドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外 来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう．β-ガラクトシダー ゼ(lacZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，g50 (gD)遺伝子は合成初期/後期(early/late)痘プロモーター(EP1Lp1)の制御下にあ ることに留意されたい．プラスミドの詳細を図5A-5Dに示す．この プラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて(22と30),以下の合成DNA配列を もつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この 配列を図5A-5Dに示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社) のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする．断片 １はSPV HindIII消化断片M(23)のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片( sub-fragment)である．断片２はプラスミドpJF751（II）のBamHIからPvuIIまで の約3006塩基対の制限酵素断片である．断片３はPRV BamHI消化断片7(21)のEcoR IからStuIまでの約1571塩基対の亜断片(sub-fragment)である．EcoRIサイトはPC Rクローニングによりこの断片に導入されたことに留意されたい．この手法にお いて，以下に示されたプライマーはpSP64にサブクローニングしたPRV BamHI #7 断片からなるテンプレートとともに用いられた．１つめのプライマー87.03（5'- CGCGAATTCGCTCGCAGCGCTATTGGC-3')(SEQ ID NO:41)は，PRV g50(gD)配列(26)上で ，遺伝子の3'末端方向にプライミング(priming)しながら略アミノ酸３の位置に バインド(sit down)する．２つめのプライマー87.06（5'-GTAGGAGTGGCTGCTGAAG- 3'）(SEQ ID NO:42)は，逆鎖上で，遺伝子の5'末端方向にプライミング(priming )しながら略アミノ酸174の位置にバインド(sit down7)する．PCR産物は，約509 塩基対の断片を得るために，EcoRIとSalIで消化されてもよい．PRV BamHI #7のS alIからStuIまでの約1049塩基対の亜断片(sub-fragment)はその後，EcoRIからSt uIまでの約1558塩基対の断片３を得るために約509塩基対のEcoRIからSalIまでの 断片にライゲーションされてもよい.断片４はSPV HindIII消化断片M(23)のAccI からBglIIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)である． 断片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限 酵素断片である．断片３はPRV BamHI#2と#9の亜断片(sub-fragment)である，プ ラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である．この断片の 末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された．断片４はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(sub-fra gment)である.断片１と断片４中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに 転換された．相同性ベクター570-91.64 プラスミド570-91.64は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された．プラス ミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子とPR V gIII(gC)遺伝子をもつ．外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片であ る．外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である．このプラスミドが 「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺 伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう.β-ガラクトシダーゼ(la cZ)マーカー遺伝子は合成後期(late)痘プロモーター(LP1)の制御下に，gIII(gC) 遺伝子は合成後期初期(late early)痘プロモーター(Lp2EP2)の制御下にあること に留意されたい．プラスミドの詳細を図12A-12Dに示す．このプラスミドは標準 的な組み換えDNA技術を用いて(22と30),以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の 制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう．この配列を図12A-12D に示す．このプラスミドベクターはpSP64(プロメガ)(プロメガ社)のHindIIIから BamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする.断片１はSPV HindII I消化断片M(23)のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片(sub-fragment)で ある.断片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の 制限酵素断片である．断片３はPRV BamHI #2と#9の亜断片(sub-fragment)であ る,プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である．この 断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された.断片４ はSPV HindIII消化断片M(23)のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片(su b-fragment)である．断片１と断片４中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いて PstIに転換された。 相同性ベクター７２７−５４．６０ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために、プラスミド７２７−５４．６０を構 築した。これにより、ＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ） ｇII（ｇＢ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取 込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断 片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対 断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え 手順」に従って用いることにより、上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有す るウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合 成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合 成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される 。本プラスミドの詳細は第１９Ａ−１９Ｄ図に示されている。本プラスミドは、 標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第１９Ａ−１９Ｄ図に示す合成Ｄ ＮＡ塩基配列を有する下記の起源に由来する制限断片を相互に結合させることに より構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社） から入手可能な略２９７２塩基対のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導 した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対 のＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡのＫ ｐｎＩ Ｃ断片（２１）内にあるＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略 ３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む 略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対 ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０ 塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミド ｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である 。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−Ｈｉｎ ｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用 いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７５１−０７．Ａ１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−０７．Ａ１を用いた 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ） 遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。こ のプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用い ることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる 。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター (ＬＰ１)の制御下にあり、上記ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター (ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組 換 えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源 由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは 、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対Ｈｉｎｄ−ＢａｍＨＩ制限断片 から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１１４ ６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺 激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並にポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＩＦＮ遺伝子（５ ４）をコードする略５７７塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ断片である。逆転写とＰ ＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．１３）は５’−ＣＧＡ ＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’(配列 番号：２１１)であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９４．１ ２）は５’−ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣ ＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号：２１２）であった。逆転写とＰＣＲにより得ら れたＢａｍＨＩ断片はゲル精製され、５’末端に非反復ＥｃｏＲＩ部位を導入し ３’末端に非反復ＢｇｌII部位を導入するための第２ＰＣＲ反応用鋳型として用 いられた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．２２（５’−Ｃ ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧ−３ ’、配列番号：２１３）を用い、３’末端でプライマー６／９４．３４（５’− ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’、 配列番号：２１４）を用いて略５７７塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は 、ニワトリインターフェロンをコードする成熟タンパク質の１６２個アミノ酸と アミノ末端の３１個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるニワトリインターフェ ロンタンパク質（５４）の第１番目アミノ酸から第１９３番目アミノ酸までをコ ードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０ ０２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ Ｈｉｎｄ III断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である 。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡＣＣＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７５１−５６．Ａ１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−５６．Ａ１を用いた 。 これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）遺 伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。この プラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いる ことにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。 上記β−ガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)標識遺伝子は合成後期痘プロモーター(Ｌ Ｐ１)の制御下にあり、上記ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター(Ｌ Ｐ２ＥＰ２)の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換 えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源 由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは 、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限 断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１ １４６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリン Ａ刺激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並にポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＭＧＦ遺伝子 （５５）をコードする略６４０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片である。逆転 写とＰＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．２０）は５’− ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３ ’（配列番号：２１５）であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／ ９４．５）は５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧ ＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：２１６）であった。ＰＣＲより誘導されたＢａｍ ＨＩ断片はサブクローニングを行ってプラスミドとし、第２ＰＣＲ反応用鋳型と して用いた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．１６（５’− ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’、 配列番号：２１７）を用い、３’末端でプライマー６／９４．２０（５’−ＣＧ ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’、 配列番号：２１８）を用いて略６４０塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は 、ｃＭＧＦをコードする成熟タンパク質の１７８個アミノ酸とアミノ末端の２３ 個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるｃＭＧＦタンパク質（５５）の第１番目 アミノ酸から第２０１番目アミノ酸までをコードする配列を含有する。断片３は 、プラスミド ｐＪＦ７５ｌ（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である 。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ −ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、 非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７５２−２２．１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２２．１を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５ 塩基対断片が配列し、本外来遣伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１１３塩基 対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換 え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有す るウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚 痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあることが注目される。本相同 性ベクターはまた第２の外来遺伝子が非反復ＢａｍＨＩあるいはＥｃｏＲＩ部位 に挿入された合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）を含有する。本プラ スミドの詳細は第２８Ａ−２８Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ 技術（２２、３０）を用い、第２８Ａ−２８Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有 する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミド ベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−Ｓｐ ｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３ ）の略８５５塩基対亜断片である。すなわちＤＮＡプライマーである５’−ＧＡ ＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴ Ａ−３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴ ＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６） を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５ 塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪ Ｆ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片であ る。断片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。 即ち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧ ＡＣＴ ＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）と５’− ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡ ＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行いＳａｌ Ｉ並にＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。 相同ベクター７５２−２９．３３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２９．３３を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＢ遺伝子 と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺 伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺 伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１３塩基対断片が配列する。このプラスミ ドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることによ り上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β− ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモー ターの制御下にあり、上記ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は後期／早期プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にあることが注目される。ＬＰ２ＥＰ２プロモーター／ ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子カセットは同族ベクター７３８−９４．４のＮｏｔＩ部 位へ挿入された。同族ベクター７５２−２９．３３は、標準組換えＤＮＡ技術（ ２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互 に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメ ガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片 １は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である 。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴ ＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５） と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣ ＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応 を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２ は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導され た３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＰＣＲ反応生成 物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して 鎖長略２ ９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ −１ ｇＢ遺伝子を生成したものである。上記ＰＣＲ断片は、ＥＨＶ−１ゲノム ＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”断片内の３’末端に自然ＢａｍＨＩ部位を有しこの遺 伝子の５’末端に合成ＥｃｏＲＩ部位を有する略４２９塩基対断片である。上記 制限断片は、ＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“Ｉ”断片内のＢａｍＨＩか らＰｍｅＩに至る略２５１２塩基対断片である。５’末端ＰＣＲ断片を製造する 際、ＥＨＶ−１ ＢａｍＨＩ“ａ”並に“ｉ”断片から成る鋳型を用いて下記プ ライマーを適用した。第１プライマー５／９４．３（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣ ＴＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＧＴ−３’）（配列番号：１２８）は、ＥＨＶ−１ ｇ Ｂ配列上の第２番目アミノ酸の位置に座し、上記ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５’ 末端にＥｃｏＲＩ部位を導入しさらにＡＴＧ開始コドンを導入する。第２プライ マー５／９４.４(５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＴ−３’ )（配列番号：１２９）は、ＥＨＶ−１ ｇＢ配列上のプライマー５／９４．３ の反対鎖上の略１４４番目アミノ酸の位置に座し、上記遺伝子の５’末端方向に プライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化して 鎖長においてＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５’末端に対応する４２９塩基対断片を 生成した。上記のように、断片３は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ Ｉ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９ ７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子 を生成したものである。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩 基対亜断片である。即ち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡ Ｃ ＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配 列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴ ＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いてポリメラ ーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩ並にＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片 を合成した。 相同性ベクター７４６−９４．１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４６−９４．１を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク 質Ｅ（ｇＥ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取 込 まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し 、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列 する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従 って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが 得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ １Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子は後期／早 期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミ ドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有す る下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＩＢＲＶ ｇ Ｅ遺伝子（カルボキシ末端膜内外領域のアミノ酸１５８個が欠如）の第１番目ア ミノ酸から第４１７番目アミノ酸をコードする１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂａ ｍＨＩ断片を相同性ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の非反復 ＥｃｏＲＩ並にＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂ ａｍＨＩ断片は、ＩＢＲＶ（Ｃｏｏｐｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プ ライマー１０／９４．２３（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＡＡＣＣＣＡ ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＣ−３’；配列番号：２１９）をＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子 の５’末端（第１番目アミノ酸）で且つプライマー１０／９４．２２（５’−Ｇ ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＣＧＣＴ−３’；配 列番号：２２０）をＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子の第４１７番目アミノ酸で用いてポリ メラーゼ連鎖反応（１５）を行い合成した。 相同性ベクター７６７−６７．３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６７−６７．３を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパ ク質５３（ＢＶＤＶ ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５ ５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１ １３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための 相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡ を含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺 伝子 は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ ｇｐ ５３遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注 目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成 ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構 築した。ＢＶＤＶ ｇｐ５３をコードする１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片を相同 性ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部位 に挿入した。上記１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウ イルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖 反応（１５）により合成した。 相同性ベクター７７１−５５．１１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７１−５５．１１を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タン パク質４８（ＢＶＤＶ ｇｐ４８）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８ ５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１ １１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するため の相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮ Ａを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識 遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ ｇｐ４８遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあること が注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、 合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることによ り構築した。ＢＶＤＶ ｇｐ４８をコードする６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片を相 同ベクター７５２−２２．１（第２８Ａ−２８Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部位 に挿入した。上記６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウイ ルスｇｐ４８並にｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反 応（１５）により合成した。 相同性ベクター５５１−４７．２３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド５５１−４７．２３を構築し た。本プラスミドには大腸菌β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）標識遺伝子が 後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に取込まれる。上記標識遺 伝子をＳＰＶゲノムの部位に挿入し組換え豚痘ウイルスを産生することは有用で ある。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い下記源由来 の制限断片を結合して構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ 社）の略３００５塩基対ＨｉｎｄIII制限断片から誘導した。断片１は、プラス ミドｐＲＡＪ２６０（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の略１８２３塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｓ ｍａＩ断片である。ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位はＰＣＲクローニングにより導入 されたものであることが注目される。プラスミド５５１−４７．２３を用いて組 換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５９，Ｓ−ＳＰＶ−０６０，Ｓ−ＳＰＶ−０６ １並にＳ−ＳＰＶ−０６２を産生した。 相同性ベクター７７９−９４．３１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７９−９４．３１を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ ｇII）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれ る。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略５３８塩基対断片が配列 し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１８０塩基対断片が配 列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に 従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルス が得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プ ロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早 期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラス ミドの詳細は第３０Ａ−３０Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技 術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を 相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社） の略２９８６塩基対ＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ制限断片から誘導した。断片１は、 ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略５４２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂｇｌ II制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡのＫｐｎＩ Ｃ断片（２ １）内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片であ る。断片２は、 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ Ｋｐ ｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ Ｋ ｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片(２１) とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５ｌ（１１）の略３０１０塩基対 ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ の略１１８０塩基対ＢｇｌII−ＰｓｔＩ亜断片である。断片１と断片４のＢｇｌ II部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。 相同性ベクター７８９−４１．７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇ II）遺伝子とＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ Ｄ ＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを 発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコ ードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌ ａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下 にあり、上記ＰＲＶ ｇＤ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３１Ａ−３１Ｄ 図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成 ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プ ラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄII I−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片 Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は 、ＰＲＶ ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードす る配列を含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片であ る。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プラ イマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位 は通常、 ＰＲＶ ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始ま る全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は 、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片であ る。断片４は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ Ｃ断片内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片４は、Ｐ ＲＶｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ Ｋｐｎ ＩＣゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを 含有する。断片５は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対Ｂａ ｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片６は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略 １５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃ Ｉ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と 断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位 へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４ ５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片(ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４;配 列番号:)が欠失していた。 相同性ベクター７８９−４１．２７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．２７を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ ｇII）遺伝子とＰＲＶ ｇＣ（ｇII）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ Ｄ ＮＡの略１５６０塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを 発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコ ードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌ ａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下 にあり、上記ＰＲＶ ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター(ＥＰ１ＬＰ ２)の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３２Ａ−３２Ｄ 図に 示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、図示合成 ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プ ラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄII I−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの 略１５６０塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノ ムＰＲＶ ＤＮＡのＫｐｎＩ Ｃ断片（２１）内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコード する配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子の アミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由 来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片 由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片 ３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ II制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略４８塩基対Ａｃ ｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃２並に＃９の 亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−Ｎｃｏ Ｉ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した 。断片６は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対Ａｃ ｃＩ−ＢｇｌII制限亜断片である。断片１と断片４のＮｄｅＩ部位は、Ｈｉｎｄ IIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。断片４と断片６のＡｃ ｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。ＳＰＶ 断片４と６に広がる、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ− ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：）が欠失 していた。相同性ベクター７８９−４１．４７ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．４７を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＣ（ｇ III）遺伝子とＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ （ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶ を発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子を コード するＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲ Ｖ ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあ り、上記ＰＲＶ ｇＤ遺伝子も合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２） の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３３Ａ−３３Ｄ図に 示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮ Ａ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラス ミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII− ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ （２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、 ＰＲＶ ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする 配列を含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である 。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライ マーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は 通常、ＰＲＶ ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位 に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断 片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断 片である。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対Ｂａ ｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃２並に＃９ の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−Ｎｃ ｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換し た。断片６は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−Ｈｉ ｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを 用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、Ｈｉ ｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６ に広がる、ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜 断片（ヌクレオチド番号１５６０乃至２１０４；配列番号：）が欠失していた。 相同性ベクター７８９−４１．７３ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７３を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ ｇII）遺伝子とＰＲＶ ｇＣ（ｇIII）遺伝子とＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子 並に大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これら の外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これ らの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。 このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用 いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られ る。上記β−ガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)標識遺伝子は合成後期痘プロモーター (ＬＰ１)の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモー ター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＣ遺伝子は合成早期／後 期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ ｇＤ遺伝子は 合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目され る。本プラスミドの詳細は第３４Ａ−３４Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組 換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来 の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（ プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導し た。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌI I−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ ｇＤ遺伝子の第３番目アミ ノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始 コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応 から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ ｇＩ遺伝子３’−Ｐ ＲＶ ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフ レームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃２ 並に＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対Ｎｃｏ Ｉ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーによ り置換した。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ −ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ Ｃ断片内のＰＲＶ ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片 である。断 片５は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲ Ｖ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、Ｐ ＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断 片（２１）とを含有する。断片６は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０ １０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片７は、ＳＰＶ Ｈｉｎｄ III断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断 片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換し た。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復Ｈ ｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII Ｍ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０ 乃至２１０４；配列番号：）が欠失していた。 相同性ベクター７９１−６３．１９ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．１９を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４ ８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９ 塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同 組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含 有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子 は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラ スミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を 有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクター は、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制 限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略 １４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐ ＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。 断片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄI II亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて 非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。相同性ベクター７９１−６３．４１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．４１を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれろ。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４ ８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９ 塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同 組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含 有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子 は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラ スミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を 有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクター は、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制 限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略 １４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐ ＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。 断片３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄI II亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて 非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。相同性ベクター７９６−１８．９ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９６−１８．９を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８ ４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩 基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組 換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有 するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は 合成早期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラス ミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有 する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは 、 ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断 片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４ ８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片 ３は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜 断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反 復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７８３−３９．２ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８３−３９．２を構築した 。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパ ク質５３（ＢＶＤＶ ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４ ８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２ １４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するため の相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮ Ａを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識 遺伝子は後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＢＶＤＶ ｇｐ５３ 遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目さ れる。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮ Ａ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させ構築した。プラスミ ドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂ ａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（ ２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、Ｂ ＶＤＶ ｇｐ５３をコードする略１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片である。この１ １８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並にｇ ｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合 成した、断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対Ｂａｍ ＨＩ〜ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２ １４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ 部位は、Ｎｏｔ Ｉリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。 相同性ベクター７４９−７５．７８ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４９−７５．７８を構築し た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ポ リメラーゼ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込 まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１４８４塩基対断片 が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略２１４９塩基対断 片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手 順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウ イルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後 期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子 は合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目され る。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ 塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミ ドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−Ｂ ａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（ ２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、Ｉ ＢＤＶ ＲＮＡ鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とｃＤＮＡクローニ ングにより合成した略２７００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＡｓｃＩ制限断片である。ｃ ＤＮＡとＰＣＲプライマー（５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＡ ＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣ−３’；１２／９３．４）（配列番号：）並に （５’−ＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＧＣＣＡＧＧ−３’；９／９３． ２８）（配列番号：）を用いてＩＢＤＶポリメラーゼ遣伝子の５’末端に略１４ ００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を合成した。また、ｃＤＮＡとＰＣＲプラ イマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴ−３’； １２／９３．２）（配列番号：）並に（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＡＡ ＧＧＣＣＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧ−３’；１２／９３．３）（配列番号：）を用い てＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の３’末端に略１８００塩基対ＢｃｌＩ−Ａｓｃ Ｉ断片を合成した。これらの二個の断片をＢｃｌＩ部位で連結して略２７００塩 基対ＥｃｏＲ Ｉ−ＢｃｌＩ断片を産生した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略 ３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ Ｈｉ ｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１ と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変 換した。 相同性ベクター７６１−７５．Ｂ１８ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６１−７５．Ｂ１８を構築 した。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）プ ロテアーゼ（ｇａｇ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺 伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの略８５５塩基対断 片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡの略１１１３塩基対 断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え 手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有する ウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘 ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子 は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。 本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ 塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミ ドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−Ｓ ｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２ ３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’− ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡ ＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）と５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴ ＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１８ ６）を用いるポリメラーゼ連鎖反応を行いＳｐｈＩ並にＢｇｌII末端を有する８ ５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラス ミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII 断片である。断片３は、ＦＩＶ（ＰＰＲ株）（６１）由来のｃＤＮＡを用いるポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成した略１８７８塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂ ｇｌ II制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡＴＧ ＧＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴ−３’；１１／９４．９）（配列番号：）はＦＩ Ｖ ｇａｇ遺伝子の５’末端から合成され、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ 部位を更にＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＡＧＣＣＡＧＡ ＴＣＴ ＧＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣ−３’；１１／９４．１０）（配列 番号：）は、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産生物は、 ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化してＦＩＶ ｇａｇ遺伝子に対応する鎖長の１８７ ８塩基対断片を生成した。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３ 塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである５’−ＣＣＧＴＡＧＴ ＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３ ’（配列番号：１８７）と５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴ ＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８８）を用いるポ リメラーゼ連鎖反応を行いＳａｌＩとＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対 断片を合成した。 相同性ベクター７８１−８４．Ｃ１１ 外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８１−８４．Ｃ１１を用い た。これによりＳＰＶ ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エン ベロープ（ｅｎｖ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝 子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え 手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有する ウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成 後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子は合 成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される 。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合 成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。 プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII断片Ｍ （２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片３は、 「ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング」に従い合成したＦＩＶ ｅｎｖ遺 伝子 （６１）の略２５６４塩基対ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片である。このＰＣＲ反 応のための鋳型としてＦＩＶ ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡ（６１）を用いた。ＦＩ Ｖ ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡの６２６３番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ ｅｎ ｖ遺伝子の５’末端に対応する上流プライマー１０／９３．２１（５’−ＧＣＣ ＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣ−３';配列番号: ）を合成した。本法では５’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。このＢａｍＨ Ｉ部位は、ＰＣＲ断片のクローニングの際破壊された。ＦＩＶ ＰＰＲゲノムｃ ＤＮＡの８８２７番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子の３’末端に 対応する下流プライマー１０／９３．２０（５’−ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣ ＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’；配列番号：）を合成した。本法 では３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５ １（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は 、ＳＰＶ ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−Ｈｉ ｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復 ＮｏｔＩ部位へ変換した。 〔実施例〕実施例１ 相同性ベクター５１５−８５．１ 相同性ベクター５１５−８５．１は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入に有用なプ ラスミドである。プラスミド５１５−８５．１は、それに外来性ＤＮＡをクロー ン化し得る唯一のＡｃｃＩ制限部位を含有する。かかる外来性ＤＮＡインサート を含有するプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従っ て用いて、外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得ることができる。この方法を首尾 よく行うためには、挿入部位（ＡｃｃＩ）がＳＰＶの複製に必須ではない領域に あって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介する のに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。相同性 ベクター５１５−８５．１におけるＡｃｃＩ部位を用いて、外来性ＤＮＡを少な くとも３つの組換えＳＰＶに挿入する（実施例２−４参照）。 適当な挿入部位を規定するために、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のライブ ラリーを創製した。これらの制限断片のうちいつくかを（ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｇ 、ＪおよびＭ、図１Ａ−１Ｂ参照）制限マッピング解析に付した。可能な挿入部 位として２つの制限部位が各断片で同定された。これらの部位は断片Ｇにおける ＮｒｕＩ、断片ＪにおけるＢａｌＩおよびＸｂａＩ、および断片ＭにおけるＡｃ ｃＩおよびＰｓｔＩを含むものであった。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マ ーカー遺伝子を可能な部位の各々に挿入した。得られたプラスミドを「組換えＳ Ｐｖを創製ずるための相同組換え法」で利用した。組換えウイルスの創製は「β −ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶをスクリーニングずるアッセイ」に よって判断した。６つの部位のうち４つは組換えウイルスを生じることが判明し たが、これらの各ウイルスが親ＳＰＶから精製除去される能力は大きく変動した 。１つの場合において、ウイルスを１％のレベルを超えて精製できず、もう１つ の場合において、ウイルスを５０％のレベルを超えて精製できが、および第３の 場合において、ウイルスを９０％のレベルを超えて精製できなかった。これらの ウイルスを精製できないことは、挿入部位における不安定性を示す。これは対応 する部位を外来性ＤＮＡの挿入に不適当とする。しかしながら、１の部位(相同 性 ベクター５１５−８５．１のＡｃｃＩ部位)における挿入の結果、容易に１００ ％まで精製できたウイルスが得られ（実施例２参照）、これは外来性ＤＮＡの挿 入のための適当な部位を規定する。 相同性ベクター５１５−８５．１をＤＮＡ配列解析によってさらに特徴付けた 。相同性ベクターの２つの領域を配列決定した。第１の領域は、唯一のＡｃｃＩ 部位に隣接する５９９塩基対配列をカバーする（図２Ａおよび２Ｂ参照）。第２ の領域は唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流の８９９塩基対をカバーする（図２Ａ および２Ｂ参照）。第１の領域の配列はGoebelら,1990によって同定されたワク シニアウイルス（ＶＶ）ＯＩＬオープンリーディングフレームのアミノ酸１ない し１１５に対して相同性を示すオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコー ドする（図３Ａ−３Ｃ参照）。第２の領域の配列は同ワクシニアウイルスＯＩＬ オープンリーディングフレームのアミノ酸５６８ないし６６６に対して相同性を 示すオープンリーディングフレームをコードする（図３Ａ−３Ｃ参照）。これら のデータは、ＡｃｃＩ部位はほぼアミノ酸４１において推定ＶＶ ＯＩＬ−様Ｏ ＲＦを中断することを示し、これは、このＯＲＦがＳＰＶ複製につき必須でない 遺伝子をコードすることを示唆する。Goebelらは、ＶＶ ＯＩＬ ＯＲＦはある 種の真核生物転写調節蛋白質に特徴的なロイシンジッパー・モチーフを含有する ことを提案しているが、彼らはこの遺伝子がウイルス複製に必須か否かは知られ ていないことを示している。ＶＶ ＯＩＬ−様ＯＲＦの上流に位置するＤＮＡ配 列（図２Ａ参照）は豚痘ウイルスのプロモーターを含有することが予測されるで あろう。この豚痘ウイルスのプロモーターは豚痘ゲノムに導入された外来性ＤＮ Ａ対照要素として有用であろう。実施例２ Ｓ−ＳＰＶ−００３ Ｓ−ＳＰＶ−００３は外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イー・コ リ(E.coli)β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）をＳＰＶ ５１５−８５．１ ＯＲＦに導入した。外来性遺伝子（ｌａｃＺ）は合成初期／ 後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−００３はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５２０ −１７．５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−００３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現していたことを示す 。ここに記載するアッセイはＶＥＲＯ細胞ならびにＥＭＳＫ細胞で行い、これは ＶＥＲＯ細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産のための適当な基礎となろうことを 示す。Ｓ−ＳＰＶ−００３は受託番号２３３５の下でＡＴＣＣに寄託された。実施例３ Ｓ−ＳＰＶ−００８ Ｓ−ＳＰＶ−００８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）（２６）についての遺伝子をＳＰ Ｖ ５１５−８５．１ ＯＲＦに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモータ ー（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモー ター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−００８はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５３８ −４６．１６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−００８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−００８を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶ血清はＳ−ＳＰＶ−００８プラークと特異的に反応す るがＳ−ＳＰＶ−００９陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示され た。全てのＳ−ＳＰＶ−００８で観察されたプラークはブタ抗血清と反応し、こ れは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。また、 黒色プラーク・アッセイを固定されていない単層で行った。固定されていない単 層上のＳＰＶプラークもブタ抗−ＰＲＶ血清との特異的反応性を呈し、これはＰ ＲＶ抗原が感染細胞表面で発現されることを示す。 ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで 感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に 付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析 した。ブタ抗−ＰＲＶ血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。図６ に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−００８感染細胞からの溶解物はほぼ４８ｋｄの特異 的バンド、ＰＲＶｇ５０（ｇＤ）（３５）の報告されたサイズを示す。 ＰＲＶｇ ５０（ｇＤ）はＨＳＶ−１（２６）のｇ５０（ｇＤ）同族体である 。幾人かの研究者は、ＨＳＶ−１ ｇ５０（ｇＤ）を発現するＶＶはマウスをＨ ＳＶ−１での攻撃から保護することを示している（６および３４）。従って、Ｓ −ＳＰＶ−００８はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があ るはずである。 いくつかの他のＰＲＶ糖蛋白質がＰＲＶ病から保護するための組換え豚痘ワク チンの創製で有用であろうことが予想される。これらのＰＲＶ糖蛋白質はｇＩＩ （２８）、ｇＩＩＩ（２７）、およびｇＨ（１９）を含むっＰＲＶ ｇＩＩＩ暗 号領域はいくつかの合成ｐｏｘプロモーターの後に作成された。Ｓ−ＳＰＶ−０ ０８の創製で利用した技術は、全ての４つのこれらのＰＲＶ糖蛋白質遺伝子を発 現する組換え豚痘ウイルスを創製するのに使用されるであろう。かかる組換え 豚痘ウイルスはＰＲＶ病に対するワクチンとして有用であろう。ここに記載する ＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチ ン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａｓｅ^R）と適 合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−００８は受託番号ＶＲ２３３９の下でＡＴＣＣに 寄託された。 （実施例４−５削除）実施例６ Ｓ−ＳＰＶ−０１３ Ｓ−ＳＰＶ−０１３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０ −３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓ ｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１） の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期初期プロモーター （ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７０ −９１．６４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ −０１３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１２で観察された プラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝 子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞お よびＶＥＲＯ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した 基礎となろうことが示される。 ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。ヤギ抗−ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ 特異的蛋白質の発現を検出した。図１６に示すごとく、Ｓ−ＳＰＶ−０１３感染 細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告されたサイズで ある２つの特異的バンド−９２ｋｄ成熟形態および７４ｋｄプレ−ゴルジ形態を 示す。 組換体で発現されたＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有 意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰ ＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１ ３はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。 ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、そ れらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診 断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎ Ｅａｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０１３は受託番号２４１８の下 でＡＴＣＣに寄託された。 組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を 用いるアウエスキー病に対する保護 Ｓ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を含有するワクチン（１×１０ ６ＰＦＵ／ｍｌ）（２種のウイルスの１：１混合物の２ｍｌ）を皮内接種または 経口／咽頭スプレイによって、２群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５ 匹ブタの対照群には皮内および経口／咽頭接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂 取させた。ワクチン接種から３週間後に、鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ 株４９８２でブタを攻撃した。表は臨床的応答の要約を与える。該データは、Ｓ −ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較したＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ −０１３ワクチン接種体におけるアウエスキー病からの保護の増加を支持する。 実施例７ Ｓ−ＳＰＶ−０１５ Ｓ−ＳＰＶ−０１５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）についての遺伝子をＳＰＶ ６１ ７−４８．１ ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏｔＩ制限部位で 置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の 制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０１５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７ −５４．６０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０１５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０１５プラークと 特異的に反応ずるがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１５で観察されたプラークは該抗血清 と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを 示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰ Ｖ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。 ＰＲＶ ｇＩＩ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１５で 感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に 付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析 した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を 検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１５感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ ｇＩＩ糖蛋白 質の予測されたサイズである、１２０ｋｄ、６７ｋｄおよび５８ｋｄに対応ずる バンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタにおいて仮性狂犬病ウイルスに対するワクチンとし て有用である。優れたワクチンは、ブタにおいて仮性狂犬病に対する保護のため にＳ−ＳＰＶ−００８（ＰＲＶ ｇ５０）、Ｓ−ＳＰＶ−０１３（ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ）と戦うことによって処方される。 従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタをＰＲＶ病がら保護するためのワクチンと して価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶｇ Ｘまた はｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別する のに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R，ｇＩ Ｈｅ ｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０ １５は受託番号２４６６の下でＡＴＣＣに寄託された。実施例８ ＰＲＶ糖蛋白質の１種のみを発現する組換え豚痘ウイルスを用いることによっ て得ることができるものよりもＰＲＶ感染に対して保護する増強された能力を持 つ組換え豚痘ウイルスを得るために、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）に対する中 和抗体の産生を誘導できる、１種を超える仮性狂犬病糖蛋白質を発現する組換え 豚痘ウイルスを構築する。 １種を超えるＰＲＶ糖蛋白質を発現するかかる組換え豚痘ウイルスのいくつか の例がある：ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩＩ（ｇＤ）を発現する組換え 豚痘ウイルス、ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩ（ｇＢ）を発現する組換え 豚痘ウイルス；ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）およびｇＩＩＩ（ｇＣ）を発現する組換 え豚痘ウイルス；およびｇ５０（ｇＤ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇＩＩ（ｇＢ ）を発現する組換え豚痘ウイルスを発現する組換え豚痘ウイルス。前記引用ウイ ルスの各々は、組換え豚痘ウイルスのクローニングを容易とするであろうイー・ コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有させ発現させるようにも設 計される。 以下にリストするのは、ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ） 、ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）およびイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ） を発現する組換え豚痘ウイルスの３つの例である。 ａ）ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲ Ｖ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全て の４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片内の唯一のＡ ｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子 は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ(ｇＣ)遺伝子は合成初期プロモーター(ＥＰ２)の制御下にあり、ＰＲＶ ｇ ＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に あり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある 。 ｂ）ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲ Ｖ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全て の４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片内の唯一のＡ ｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子 は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下に あり、ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２Ｅ Ｐ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１ ）の制御下にある。 ｃ）ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲ Ｖ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全て の４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片内の唯一のＡ ｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）遺伝子 は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＩ ＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＥＰ２ＬＰ２）の制御下に あり、ＰＲＶ ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２Ｅ Ｐ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１ ）の制御下にある。 組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３および Ｓ−ＳＰＶ−０１５を用いるアウエスキー病に対する保護 Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ−０１５を含有 するワクチン（１×１０７ＰＦＵ／ｍｌウイルスの２ｍｌ）またはＳ−ＳＰＶ− ００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、およびＳ−ＳＰＶ−０１５の混合物（３種ウイル スの１：１：１混合物の２ｍｌ：１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）を筋肉内接種によっ て、４群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５匹ブタの対照群には筋肉内 接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂取させた。ワクチン接種から４週間後に、 鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ株４９８２でブタを攻撃した。仮性狂犬病 の臨床的徴候につき１４日間毎日ブタを観察し、表は臨床的応答の要約を与える 。該データは、Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ− ０１５でワクチン接種したブタは、Ｓ−ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較 して、仮性狂犬病ウイルスによって引き起こされたアウエスキー病に対する部分 的保護を有し、組合せワクチンＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ−０１３／Ｓ− ＳＰＶ−０１５でワクチン接種したブタは完全な保護を有したことを示す。 （実施例９−１６削除）実施例１７ 種々の病気を引き起こす微生物からの抗原を発現させるための豚痘ウイルスを 利用するワクチンの開発を企画することができる。 伝染性胃腸炎ウイルス 豚痘ウイルスベクターで使用する、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）の主要中 和抗原、糖蛋白質１９５をクローン化した。該中和抗原のクローンは１９８７年 ７月２７日に出願された米国特許出願第０７８,５１９号に開示されている。Ｐ ＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明 細書に開示した手法はＴＧＥに適用できると考えられる。 ブタ・パルボウイルス ブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）の主要キャプシド蛋白質を豚痘ウイルスベク ターで使用するためにクローン化した。該キャプシド蛋白質は１９９１年１１月 ２６日に発行された米国特許第５,０６８,１９２号に開示されている。ＰＲＶｇ ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開 示した手法はＰＰＶに適用できると考えられる。 ブタ・ロタウイルス ブタ・ロタウイルスの主要中和抗原、糖蛋白質３８を豚痘ウイルスベクターで 使用するためにクローン化した。糖蛋白質３８のクローンは１９９１年１１月２ ６日に発行された米国特許第５,０６８,１９２号に開示されている。ＰＲＶ ｇ ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開 示した手法はＳＲＶに適用できると考えられる。 ブタ・コレラウイルス ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルスの主要中和抗原を、１９８８年７月 ２７日に出願された米国特許出願第２２５，０３２号に開示されているごとくに クローン化した。ＢＶＤおよびブタ・コレラウイルスは交差保護性であるので( ３１)、ＢＶＤウイルス抗原は豚痘ウイルスベクターで使用するために標的化さ れている。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された 、および本明細書に開示した手法はＢＶＤに適用できると考えられる。 セルプリナ・ヒオディセンテリエ（Serpulina Hyodysenteriae） 豚痘ウイルスベクターで使用するためのSerpulina Hyodysenteriae（３）の保 護抗原はクローン化されている。ＰＲＶ ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現 させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はSerpulina Hyodysente riaeに適用できると考えられる。 以下の微生物からの抗原も動物ワクチンを開発するのに利用できる：ブタ・イ ンフルエンザウイルス、ロ蹄疫ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタ・コレ ラウイルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)、 ブタ生殖系および呼吸器系症候群／ブタ不妊症および呼吸器系症候群（ＰＲＲＳ ／ＳＩＲＳ）。 以下の微生物からの抗原も動物ワクチンで利用できる：イヌ−ヘルペスウイル ス、イヌ・ジステンパー、イヌ・アデノウイルス１型（肝炎）、アデノウイルス ２型（呼吸器系病）、パラィンフルエンザ、レプトスピラ・カニコラ(Leptospir a canicola)、イクテロヘモラジア(icterohemorragia)、パルボウイルス、コロ ナウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、イヌ・ヘル ペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronshiseptica) 、ディロフィラエ・イミティス(Dirofilaria immitis)(イヌ糸状虫)および狂犬 病ウイルス、２）ネコ−Ｆｉｖ ｇａｇおよびｅｎｖ、ネコ白血病ウイルス、ネ コ免疫不全ウイルス、ネコ・ヘルペスウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、イ ヌ・ヘルペスウイルス、イヌ・コロナウイルス、イヌ・パルボウイルス、(イヌ およびネコにおけるDirofilaria immitisを含めた)動物における寄生虫病、ウマ 感染性貧血、ストレプトコッカス・エキィ(Streptococcus equi)、球虫類亜綱(c occidia)、エメリア(emeria)、ニワトリ貧血ウイルス、ボレリア・ブルグドルフ ェリ(Borrelia burgdorferi)、ウシ・コロナウイルス、パステレラ・ヘマリティ カ(Pasteurella haemolytica)。 （実施例１８−２３削除）実施例２４ 相同性ベクター７３８−９４．４ 相同性ベクター７３８−９４．４は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイル スベクターでめる。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）についての遺 伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレーム（配列番号：１１５）に挿入した。 ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。該相同性ベクター７３８ −９４．４は、Ｏ１Ｌ ＯＲＦの一部を示すヌクレオチド１６７９ないし２４５ ２（配列番号：１８９；図１７）からのＳＰＶ ＤＮＡの欠失を含む。 ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡ ＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡ ＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴ ＡＡＧ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって上流Ｓ ＰＶ配列を合成してＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得 た。Ｏ１Ｌプロモーターはこの断片上に存在する。ＤＮＡプライマー５’−ＣＣ ＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧ ＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡ ＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１８ ８）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって下流ＳＰＶ配列を合成してＳａｌＩお よびＨｉｎＩＩＩ末端を持つ１１１３塩基対断片を得た。組換え豚痘ウイルスは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３８ −９４．４およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１（Kansza株）を利用して誘導した 。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」 （ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ス トックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は該組換えウイルス であった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニター した複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、お よびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察 された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外 来性遺伝子を発現することを示す。相同性ベクター７３８−９４．４から誘導さ れた組換え豚痘ウイルスは、外来性抗原を発現させるための発現ベクターとして 、および組換え豚痘ウイルスによって発現された外来性遺伝子に対して動物で保 護免疫応答を生起させるためのワクチンとして利用される。Ｏ１Ｌプロモーター に 加えて、ＬＰ１、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、ＨＣＭＶ即時型を含めた他のプ ロモーターが欠失領域に挿入され、１以上の外来性遺伝子がこれらのプロモータ ーから発現される。実施例２４Ｂ 相同性ベクター７５２−２２．１は２つの外来性遺伝子を発現させるのに利用 される豚痘ウイルスベクターである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）についての遺伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレーム（配列番号：１１ ５）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。第２の 外来性遺伝子は、ＬＰ２ＥＰ２プロモーター配列に従ってＥｃｏＲＩまたはＢａ ｍＨＩ部位に挿入されたＬＰ２ＥＰ２プロモーターから発現される。相同性ベク ター７５２−２２．１は、Ｏ１Ｌ ＯＲＦの一部を欠失するヌクレオチド１６７ ９ないし２４５２（配列番号：１８９；図１７）からのＳＰＶ ＤＮＡの欠失を 含む。相同性ベクター７５２−２２．１はＬＰ２ＥＰ２プロモーター断片の挿入 によって相同性ベクター７３８−９４．４から誘導された(材料および方法参照) 。相同性ベクター７５２−２２．１は、合成ＬＰ１プロモーターの制御下にある ｌａｃＺ遺伝子を入れることによってさらに改良される。該ＬＰ１プロモーター の結果、ＳＰＶ Ｏ１Ｌプロモーターと比較してより高いレベルのｌａｃＺ発現 となる。実施例２５ Ｓ−ＳＰＶ−０４１： Ｓ−ＳＰＶ−０４１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）についての遺伝子を７３８−９ ４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６ ７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は 豚痘Ｏ１Ｌプロモーターの制御下にあり、ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は合成後期／ 初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５２ −２９．３３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４１はウマにおいてＥＨＶ−１感染に対するワクチンとして有 用であって、ＥＨＶ−１糖蛋白質Ｂの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０４５： Ｓ−ＳＰＶ−０４５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）についての遺伝子を７３８−９ ４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６ ７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は 豚痘Ｏ１Ｌプロモーターの制御下にあり、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子は合成後期／初 期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４６ −９４．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０４５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＩＢＲＶ糖蛋白質Ｅの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０４９： Ｓ−ＳＰＶ−０４９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質４８（ｇｐ４８）についての遺伝子を７ ３８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレ オチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃ Ｚ遺伝子は豚痘Ｏ１Ｌプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇｐ４８遺伝子 は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７７１ −５５．１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４９はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用 であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質４８の発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０５０： Ｓ−ＳＰＶ−０５０は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇｐ５３）についての遺伝子を７ ３８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレ オチド１６７９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃ Ｚ遺伝子は豚痘Ｏ１Ｌプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇＥ遺伝子は合 成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６７ −６７．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０５０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０５０はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用 であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。実施例２６ 各々ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）またはニワトリ骨髄単球成長因 子（ｃＭＧＦ）を発現する組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２またはＳ−Ｓ ＰＶ−０４３は、家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強す るのに有用である。ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物インター ロイキン−６蛋白質と相同であり、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）は 哺乳動物インターフェロンと相同である。特異的鳥類病に対するワクチンと組み 合わせて用いると、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ−０４３は、限定され るものではないが、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性咽頭 気管炎ウイルス、感染性気管支炎、感染性包病ウイルスを含めた鳥類を引き起こ すウイルスに対して増強された粘液性、体液性、または細胞媒介免疫を供する。実施例２６Ａ Ｓ−ＳＰＶ−０４２： Ｓ−ＳＰＶ−０４２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４ ８．１ ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換え た）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下に あり、ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下 にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１ −０７．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４２は細胞培養においてインターフェロン活性を有する。Ｓ− ＳＰＶ−０４２条件培地のニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞培養への添加は 、水泡性口内炎ウイルスによる、またはシチメンチョウのヘルペスウイルスによ るＣＥＦ細胞の感染を阻害する。Ｓ−ＳＰＶ−０４２は家禽の病気に対するワク チンに添加すると、免疫応答を増強するのに有用である。実施例２６Ｂ Ｓ−ＳＰＶ−０４３： Ｓ−ＳＰＶ−０４３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４８ ．１ ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換えた ）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあ り、 ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある 。 Ｓ−ＳＰＶ−０４３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１ −５６．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４３は家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を 増強させるのに有用である。実施例２７ 非必須部位の、豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の ２．０ｋｂＨｉｎｄＩＩＩないしＢｇｌＩＩ領域への挿入 豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の２．０ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩないしＢ ｇｌＩＩ領域は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入で有用である。外来性ＤＮＡは該 領域における唯一のＢｇｌＩＩ制限部位に挿入される（図１７；配列番号：１９ ５のヌクレオチド５４０）。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に 従って、外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを用いて外来性ＤＮＡを 含有するＳＰＶを得る。この手法が首尾よく行われるためには、挿入部位がＳＰ Ｖの複製に必須でない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡと の間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接す ることが重要である。豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の２．０ｋｂ Ｈｉ ｎｄＩＩＩないしＢｇｌＩＩ領域における唯一のＢｇｌＩＩ制限部位はＳＰＶＩ ４Ｌオープンリーディングフレームの暗号領域内に位置する。該Ｉ４Ｌ ＯＲＦ はワクシニアウイルスおよび天然痘ウイルス・リボヌクレオチド・レダクター ゼ（大サブユニット）遺伝子（５６−５８）に対して配列同様性を有する。該リ ボヌクレオチド・レダクターゼ（大サブユニット）遺伝子はワクシニアウイルス のＤＮＡ複製に非必須であって、豚痘ウイルスにおける適当な挿入部位である。実施例２８ Ｓ−ＳＰＶ−０４７ Ｓ−ＳＰＶ−０４７は２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位（Ｈｉｎ ｄＩＩＩＭ断片の２．０ｋｂ ＢｇｌＩＩないしＨｉｎｄＩＩＩサブ断片内にあ るＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカー ）に挿入した。該ＢｇｌＩＩ挿入部位は、ワクシニアウイルス・リボヌクレオシ ドニリン酸レダクターゼ遺伝子に対して有意な相同性を有するＳＰＶ １４Ｌオ ープンリーディングフレーム内にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター （ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プ ロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９９ −９４．３１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０４７を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０４７プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０４７で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４７で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋 白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４７感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ糖 蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応 するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢはブタにおいて有意な免疫応答を刺 激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、ＰＲＶ ｇ Ｂを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得 られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＰＲＶ病に対 してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワ クチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物 を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ Ｈｅｒｄ ＣｈｅｋＲ、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋＲおよびＣｌｉｎＥａｓｅＲ）と適合する であろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５２ Ｓ−ＳＰＶ−０５２は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（Ｓ ＰＶ ＯＩＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｄｅＩ部位に挿入され たＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基 対ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配 列番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）についての遺 伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ Ｏ１Ｌオープンリーディングフレーム 中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ 遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩ Ｉ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、 ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２） の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０５２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５２を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５２プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５２で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０５２で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲ Ｖ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５２感染細胞からの溶解物お よび上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズでめる１２０ｋＤ、６７ｋＤ および５８ｋＤに対応ずるバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズ である４８ｋＤに対応するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢおよびｇＤはブタにおいて有意な免 疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃 からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ− ０５２はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。こ こに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それ らはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テ スト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａ ｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５３ Ｓ−ＳＰＶ−０５３は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（Ｓ ＰＶ Ｏ１Ｌオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入された ＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基対 ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列 番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺 伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ Ｏ１Ｌオープンリーディングフレーム 中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ 遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩ Ｉ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、 ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２ ）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０５３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５３プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５３で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＣ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０５３で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲ Ｖ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５３感染細胞からの溶解物お よび上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤ および５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズ である９２ｋＤに対応するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢおよびｇＣはブタにおいて有意な免 疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、 ＰＲＶ ｇＢおよびｇＣを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃 からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ− ０ ５３はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここ に記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それら はワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テス ト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａｓ ｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５４ Ｓ−ＳＰＶ−０５４は３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＣ(ｇＩＩＩ)についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位(Ｓ ＰＶ Ｏ１Ｌオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入された ＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基対 ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列 番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）についての遺伝 子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ Ｏ１Ｌオープンリーディングフレーム中 の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺 伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩ Ｉ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあって、 ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２） の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０５４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５４を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５４プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５４で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０５４で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲ Ｖ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５４感染細胞からの溶解物お よび上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバ ンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバ ンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有意な免 疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さらに、 ＰＲＶ ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃 からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ− ０５４はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。こ こに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それ らはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テ スト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^RおよびＣｌｉｎＥａ ｓｅ^R）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０５５ Ｓ−ＳＰＶ−０５５は４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病 ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（Ｓ ＰＶ Ｏ１Ｌオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入された ＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片のほぼ５４５塩基対 ＮｄｅＩないしＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０ないし２１０４；配列 番号）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）およびＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ オープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリ ンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御 下にあり、ＰＲＶ ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成後期／初期プ ロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝 子は合成初期／後記プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９ −４１．７３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０５５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５５プラークと 特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しな いことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５５で観察されたプラークはブタ抗− ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現して いたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４ 細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された 。 ＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ ＰＶ−０５５で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用い て、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用い てＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５５感染細胞からの溶 解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６ ７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド；ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズ である９２ｋＤに対応するバンド；およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズ である４８ｋＤに対応するバンドを呈した。 ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有 意な免疫応答を誘発することが示されている（３７、３８；実施例８参照）。さ らに、ＰＲＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰ ＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（実施例６および８参照）。従って、 Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価 値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ ｇＸまたはｇＩを発現しな いので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行 ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^R、ｇＩ ＨｅｒｄＣｈｅｋ^Rおよび ＣｌｉｎＥａｓｅ^R）と適合するであろう。実施例２９ ＳＰＶ−０５９ Ｓ−ＳＰＶ−０５９は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｋゲノム断片内にあるＳＰＶ Ｂ１８Ｒオープンリーディングフレー ム中の唯一のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初 期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ ６．５ｋｂ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｋ断片（配列番号）の３．２ｋｂ領域からの部分配列は、３つの可能 なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｂ１８Ｒ ＯＲＦはワクシニ アウイルスＢ１８Ｒ遺伝子、ウサギ線維腫ウイルスからの７７．２Ｋ蛋白質、ワ クシニアウイルスＣ１９Ｌ／Ｂ２５Ｒ ＯＲＦおよびヒト脳変異体からのアンキ リン反復領域に相同な配列を示す。該Ｂ１８Ｒ遺伝子は高親和性および広い特異 性を持つ可溶性インターフェロン受容体をコードする。ＳＰＶ Ｂ４Ｒオープン リーディングフレームはウサギ線維腫ウイルスのＴ５蛋白質に相同の配列を示す 。 Ｓ−ＳＰＶ−０５９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −５０．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−５０．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ６．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片中の唯一の ＥｃｏＲＩ部位（平滑末端化）への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺 伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってト ランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終 結果はＳ−ＳＰＶ−０５９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法 に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、こ のウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性に つきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 Ｓ−ＳＰＶ−０５９を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは７．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。ＳＰＶ−０６０ Ｓ−ＳＰＶ−０６０は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｎゲノム断片内にある唯一のＥｃｏＲＶ制限部位に挿入した。該ｕｉ ｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。Ｓ ＰＶ ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの 可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｉ７Ｌ ＯＲＦはワクシ ニアウイルスの蛋白質１７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ Ｉ４Ｌオープンリー ディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシドニリン酸レグクタ ーゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ ＯＲＦおよびＩ７Ｌ ＯＲＦの間の、 ２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知で ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −７１．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−７１．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（図２９Ａ ）中の唯一のＥｃｏＲＶ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝 子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトラ ンスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結 果はＳ−ＳＰＶ−０６０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に 記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、この ウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につ きアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６０を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６１ Ｓ−ＳＰＶ−０６１は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｎゲノム断片内にある唯一のＳｎａＢＩ制限部位に挿入した。該ｕｉ ｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。Ｓ ＰＶ ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの 可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｉ７Ｌ ＯＲＦはワクシ ニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ Ｉ４Ｌオープンリー ディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクタ ーゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ ＯＲＦおよびＩ７Ｌ ＯＲＦの間の、 ２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知で ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −７１．４１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−７１．４１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の唯一の ＳｎａＢＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する 組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０６１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイ ルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６１を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片内のＳｎａＢＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６２ Ｓ−ＳＰＶ−０６２は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｎゲノム断片内にある唯一のＢｇｌＩＩ制限部位に挿入した。該ｕｉ ｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。Ｓ ＰＶ ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの 可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ Ｉ７Ｌ ＯＲＦはワクシ ニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ Ｉ４Ｌオープンリー ディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクタ ーゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ ＯＲＦおよびＩ７Ｌ ＯＲＦの間の、 ２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知で ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６ −７１．５１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター７９６−７１．５１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法 参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化 されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の唯一の ＢｇｌＩＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する 組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクシ ョン・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰ Ｖ−０６２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色 プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、 β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイし た。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイ ルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６２を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは３．２ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片内のＢｇｌＩＩ部位が外来性 遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換 え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または 発現された外来性遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有 用である。実施例３０： 合成初期または合成痘プロモーターの制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシ ダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する組換え豚痘ウイルス 各々、合成痘プロモーターＬＰ１、ＬＰ２、およびＥＰ１の制御下にあるイー ・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する３つの組換え豚痘ウイルス Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７、およびＳ−ＳＰＶ−０５８を構築し た。 Ｓ−ＳＰＶ−０５６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９１ −６３．１９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５７はＳ−ＳＰＶ −００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相 同組換え法」において相同性ベクター７９１−６３．４１（材料および方法参照 ）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシ ダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬお よびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニ ングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した 。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクタ ー７９６−１８．９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１ を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについ てのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトラ ンスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結 果はＳ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７およびＳ−ＳＰＶ−０５８と命名 し た組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイ によってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダー ゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした、最初の３ラウン ドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で 、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系においてイー・コリβ−ガラクトシダーゼの ごとき外来性遺伝子を発現するが、ヒト細胞系において複製しない。外来性遺伝 子の発現を最適化するために、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７および Ｓ−ＳＰＶ−０５８を用いて、初期または後期合成ポックスウイルス・プロモー ターの制御下にあるイー・コリβ−ガラクトシダーゼの最適発現レベルを比較す る。組換え豚痘ウイルスの発現が欠失されているヒト細胞系は、限定されるもの ではないが、１４３Ｂ（骨肉腫）、Ａ４３１（類表皮癌）、Ａ５４９（肺癌）、 Ｃａｐａｎ−１（肝臓癌）、ＣＦ５００（包皮繊維芽細胞）、Ｃｈａｎｇ Ｌｉ ｖｅｒ（肝臓）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（ダウン包皮繊維芽細胞）、ＨＥＬ−１９９（ 胚性肺）、ＨｅＬａ（子宮頸部癌）、ＨＥｐ−２（表皮咽頭癌）、ＨＩＳＭ（腸 平滑筋）、ＨＮＫ（新生児腎臓）、ＭＲＣ−５（胚性肺）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ 肺粘膜表皮癌）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）、ＲＤ（横紋筋肉腫）、ＴＨＦ（単 球白血球）、ＷＩＬ２−ＮＳ（Ｂリンパ球系、非分泌）、ＷＩＳＨ（羊膜）を含 む。実施例３１ Ｓ−ＳＰＶ−０５１ Ｓ−ＳＰＶ−０５１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇ５３）についての遺伝子をＳＰ Ｖ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮ ｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ １）の制御下にあり、ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子は合成後期／初期プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２)の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０５１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８３ −３９．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０５１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５１を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ＢＶＤＶ ｇ５３に対するマウス・モノクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ −０５１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークと は特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５１で観察された プラークはＢＶＤＶ ｇ５３に対するモノクローナル抗体と反応し、これは該ウ イルスがＰＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載した アッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生 産のために適した基礎となろうことが示された。 ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５１ で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分 析した。ＢＶＤＶ ｇ５３に対するモノクローナル抗体を用いてＢＶＤＶ特異的 蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５Ｌ感染細胞からの溶解物および上清 は、ＢＶＤＶ ｇ５３蛋白質の糖鎖付加および非糖鎖付加形態を示す５３ｋｄお よびそれを超えるバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０５１はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用 であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。実施例３２： Ｓ−ＳＰＶ−０４４： Ｓ−ＳＰＶ−０４４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ蛋白質についての遺伝子を６１７ −４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部・位は唯一のＮｏｔＩ制 限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制 御下にあり、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４９ −７５．７８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０４４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質の発現に有用である。Ｓ− ＳＰＶ−０４４は組換えＩＢＤＶ弱毒化ワクチンに対するイン・ビトロのアプロ ーチで有用である。Ｔ３またはＴ７プロモーター(pBlueScriptプラスミド；Stra tagene,Inc.)を用いて弱毒化ＩＢＤＶ株からのＲＮＡ鎖を細菌発現系で合成して 、ＩＢＤＶゲノムの二本鎖短鎖および長鎖セグメントを合成する。豚痘ウイルス はＩＢＤＶポリメラーゼを発現するが、ＣＥＦ細胞中で複製しない。Ｓ−ＳＰＶ −０４４から産生されたＩＢＤＶポリメラーゼは、二本鎖ＲＮＡゲノム鋳型から 感染性弱毒化ＩＢＤＶウイルスを合成する。得られた弱毒化ＩＢＤＶウイルスは ニワトリにおいて感染性包病に対するワクチンとして有用である。実施例３３： Ｓ−ＳＰＶ−０４６ Ｓ−ＳＰＶ−０４６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇプロテアーゼ（ｇａｇ）についての遺伝 子を７３８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７７３塩基対欠失； ヌクレオチド１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。 ｌａｃＺ遺伝子は豚痘Ｏ１Ｌプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６１ −７５．Ｂ１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利 用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについての スクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランス フェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は Ｓ−ＳＰＶ−０４６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載 した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイ ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきア ッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４６で 感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブ ロットし、分析した。ネコ抗−ＦＩＶ（ＰＰＲ株）血清を用いてＦＩＶ特異的蛋 白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４６感染細胞からの溶解物および上清は 、ＦＩＶ ｇａｇ蛋白質の予測されたサイズである２６ｋｄおよび１７ｋｄにお けるバンドを呈した。組換え豚痘ウイルスにより発現されたＦＩＶ ｇａｇ蛋白 質は適当に加工され、培地に分泌された。Ｓ−ＳＰＶ−０４８ Ｓ−ＳＰＶ−０４８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）についての遺伝子をＳ ＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一の ＮｃｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター(Ｌ Ｐ１)の制御下にあり、ＦＩＶ ｅｎｖ遺伝子は合成後期／初期プロモーター(Ｌ Ｐ２ＥＰ２)の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０４８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８１ −８４．Ｃ１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利 用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについての スクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランス フェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は Ｓ−ＳＰＶ−０４８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載 した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイ ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきア ッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 Ｓ−ＳＰＶ−０４６およびＳ−ＳＰＶ−０４８は単独でまたはネコにおけるＦ ＩＶ感染に対するワクチンとしての組合せにおいて有用でめって、ＦＩＶ ｅｎ ｖおよびｇａｇ蛋白質の発現に有用である。ＦＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質 双方を発現する組換え豚痘ウイルスはネコにおいてＦＩＶ感染に対するワクチン として有用である。 ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスＦおよびＧ蛋白質を発現する組換え豚痘ウ イルスはヒトの病気に対するワクチンとして有用である。実施例３４ 組換えポックスウイルスで発現されたニワトリＩＦＮのイン・ビトロ特性 細胞培養における組換えウイルスの増殖特性。野生型豚痘ウイルスと比較して 、Ｓ−ＳＰＶ−０４２は胚性ブタ腎臓細胞（ＥＳＫ−４）において増殖しなかっ た。 ＳＰＶ／ｃＩＦＮ組換えウイルスで感染させた細胞からの上清につきウェスタ ンブロット分析を行った。ウサギおよびマウス抗血清を、濃縮ＳＰＶ／ｃＩＦＮ 感染不和済みからのｃＩＦＮに対して生起させ、ウェスタン分折用の調製におい て、野生型ＳＰＶで感染させたＥＳＫ−４細胞に対して予め清澄化させた。ウサ ギおよびマウス抗−ｃＩＦＮ抗血清は、組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮおよびＳＰＶ野 生型ウイルス感染上清からのニトロセルロース上の変性蛋白質と反応した。１７ −２０キロダルトンの推定分子量サイズ範囲を持つ反応性バンドがＳＰＶ／ｃＩ ＦＮレーンに存在し、ＳＰＶ野生型対照レーンでは存在しなかった。水泡性口内炎ウイルスの増殖に対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ（Ｓ−ＳＰＶ−０４２） 、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ、およびＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ感染細胞からの上清で発 現されたｃＩＦＮの効果 ＳＰＶ／ｃＩＦＮ、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ｃＩＦＮ感染細胞からのビリオン清澄 化上清をウイルス阻害活性の存在につきテストし、結果を表１に示す。略言すれ ば、ＣＥＦ細胞を系列希釈したウイルス上清と共にインキュベートした。引き続 いて、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の４０,０００プラーク形成単位（ｐｆ ｕ）／ウェルを添加し、４８時間後にＶＳＶ細胞障害効果（ＣＰＥ）につきウェ ルをスコア取りした。ｃＩＦＮを含有する組換えウイルス上清はＶＳＶ誘導ＣＰ Ｅを阻害することが示され、他方、対照ウイルス上清は阻害しなかった。ＶＳＶ 誘導細胞障害効果はウサギ抗−ｃＩＦＮ血清の存在下では逆になったであろう。 表 １ 組換えウサギ上清 ｃＩＦＮ活性（単位／ｍｌ）^a ＳＰＶ／ＩＦＮ ２，５００，０００ ＳＰＶ ＜１００ ＦＰＶ／ＩＦＮ ２５０，０００ ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ ２５０，０００ ＦＰＶ ＜１００ ａ １単位の活性は、１００％ＶＳＶ ＣＰＥが阻害されるポックスウイ ルス上清の希釈であると定義される。シチメンチョウのヘルペスウイルスに対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞の上清か ら発現されたｃＩＦＮの効果 ＳＰＶ／ｃＩＦＮウイルスで感染したＥＳＫ−４細胞からの組換えｃＩＦＮを 含有する上清を、ＣＥＦ細胞におけるシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶ Ｔ）の増殖を阻害するその活性につきテストし、結果を表２に示す。略言すれば 、系列希釈上清をＣＥＦ細胞と共にインキュベートし、次いで、１００ｐｆｕ／ ウェルの野生型ＨＶＴで感染させた。４８時間後に全てのウェルでプラークを計 数した。１０−１００単位のｃＩＦＮ活性はＨＶＴ（１００ｐｆｕ／ウェル）の プラーク形成を阻害した。野生型ＳＰＶからの上清はＨＶＴプラーク形成を阻害 しなかった。 表 ２ ＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清 ＨＶＴプラークの数 （単位／ｍｌ^a） ０ ９９ １０００ ０ １００ ０ １０ ４５ ａ １単位のｃＩＦＮ活性は１００％のＶＳＶ ＣＰＥが阻害され るポックスウイルス上清の希釈であると定義される。ＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたｃＩＦＮでの処理の後におけ るニワトリ・マクロファージによるＮＯの誘導 ＨＤ１１細胞または骨髄接着性細胞をＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清からの１０００単 位／ｍｌのｃＩＦＮ、リポ多糖（ＬＰＳ）（９ｎｇ／ｍｌ）またはｃＩＦＮおよ びＬＰＳ双方と共にインキュベートし、結果を表３に示す。２４時間後、上清流 体を収集し、亜硝酸塩レベルを測定した。これらのデータは、ＳＰＶ／ｃＩＦＮ 上清から発現されたｃＩＦＮがＬＰＳの存在下でニワトリ・マクロファージを活 性化する能力を有することを示す。 表 ３ 以下のもので刺激した後における亜硝酸塩レベル （マイクロ／モル） 細胞源 ＬＰＳ ＳＰＶ／ｃＩＦＮ ＬＰＳ＋ＳＰＶ／ｃＩＦＮ ＨＤ１１ １０．７６ ６．４ ３５．２９ ＢＭＡＣ １３．１ ５．８ ３５．１０ 結論： １．組換え豚痘ウイルスは、ＶＳＶ感染からのＣＥＦ細胞の保護によって測定 して、生物学的に活性なニワトリ・インターフェロンを感染細胞の上清中に発現 する。 ２．組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたニワトリ・イン ターフェロンは用量依存的にＨＶＴでの感染に対してＣＥＦ細胞を保護すること が示された。 ３．ＳＰＶ／ｃＩＦＮから発現されたニワトリ・インターフェロンはＰＬＳと 相乗的に作用して、一酸化窒素誘導によって検出して、ニワトリ・マクロファー ジを活性化する。 ４．前記データは、ニワトリＩＦＮを発現する組換え豚痘ウイルスがイン・ビ トロ、イン・ビボおよびイン・オボにおいて免疫変調剤として遊離な適用を有し 得ることを示す。実施例３５ ウイルスベクターによる送達系および／またはサブユニット・アプローチを用 いるＩＢＤワクチンの構築の別法として、ＩＢＤウイルスＲＮＡを直接操作して 、大（セグメントＡ）および小（セグメントＢ）二本鎖ＲＮＡサブユニット双方 を表すｃＤＮＡクローンから誘導された全長ＲＮＡを用いてウイルスを再構築す る。ＩＢＤウイルスの生成はこのようにして最初の２つのアプローチよりも優れ たい くつかの利点を与える。まず、もしＩＢＤウイルスをＲＮＡ鋳型を用いて再度生 成すれば、転写（ＲＭＡの生成）に先立ってウイルス・ゲノムのクローン化ｃＤ ＮＡコピーを操作することができる。このアプローチを用い、ビルレントＩＢＤ 株を弱毒化するか、あるいは弱毒化ワクチン骨格のＶ２可変領域をビルレント株 のそれで置き換えることができる。そうする場合において、本発明は、ワクチン 株の安全性および効率を供しつつ、ビルレントＩＢＤ株に対する保護を提供する 。さらに、このアプローチを用い、本発明により、関連ビルナウイルス感染性膵 臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）から誘導されたＲＮＡポリメラーゼおよびＩＰＮＶ から誘導されたポリプロテインを用いて生成した温度感受性ＩＢＤウイルスが構 築されテストされる。ＩＰＮＶポリメラーゼはＩＢＤＶのそれよりも低い温度で 最適活性を有する。もしＩＰＮＶポリメラーゼがＩＢＤＶ上に存在する調節シグ ナルを認識すれば、ハイブリッド・ウイルスはニワトリに存在する高温で弱毒化 されることが期待される。別法として、ＩＢＤＶ血清型２ウイルスから誘導され たＲＮＡポリメラーゼおよびＩＢＤＶ血清型１ウイルスから誘導されたポリプロ テインを用いて生成されたＩＢＤウイルスを構築しテストできる。 最初にBursaVacワクチン株(Sterwin Labs)を用いて、ＩＢＤＶの完全なゲノム （二本鎖ＲＮＡセグメントＡおよびＢ）を表すｃＤＮＡクローンを構築する。一 旦セグメントＡおよびＢの全長コピーを表すｃＤＮＡクローンが構築されたなら ば、鋳型ＲＮＡが調製される。ＩＢＤＶは二セグメント化二本鎖ＲＮＡウイルス として存在するので、pBlueScriptプラスミド(Stratagene,Inc.)を用いて、各セ グメントのセンスおよびアンチセンス両ＲＮＡ鎖を得る。これらのベクターは、 イン・ビトロで実質量のＲＮＡを得るために高度に特異的なファージ・プロモー ターを利用する。唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を３’ＰＣＲプライマーに 作成して、転写の間にラン−オフ転写体の生成のためにＤＮＡを線状化する。 精製されたＲＮＡ転写体（４鎖）をニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）にトラン スフェクトして該ＲＮＡが感染性であるか否かを判断する。ＩＢＤＶ特異的Ｍａ ｂｓを用いる黒色プラーク・アッセイによって判断してもしＩＢＤウイルスが生 成ずれば、さらなる操作は必要ではなく、ワクチン株の作成を開始できる。この 方法の利点は、このようにして作成されたＩＢＤウイルスは純粋でほとんど／全 く精製を要せず、新しいワクチンを創製するのに要する時間を大幅に減少させる ということである。もし精製されたＲＮＡを用いて陰性結果が得られれば、ヘル パーウイルスの使用による機能的ウイルスＲＮＡポリメラーゼが必要である。ビ ルナウイルスは鎖置き換え（半保存的）メカニズムによってその核酸を複製し、 ＲＮＡポリメラーゼは二本鎖ＲＮＡ分子の末端に結合し、環化された環構造を形 成する(Muller & Nitschke,Virology 159，174-177，1987)。豚痘ウイルスにお ける約８７８アミノ酸のＲＮＡポリメラーゼ・オープンリーディングフレームを 発現させ、この組換えウイルス（Ｓ−ＳＰＶ−０４４）を用いて、イン・トラン トにて機能的ＩＢＤＶ ＲＮＡを得る。ウイルス・ベクターの生成的複製の徴候 がない場合、豚痘ウイルスは免疫学的に認識可能な外来性抗原を鳥類細胞（ＣＥ Ｆ細胞）にて発現した。本発明においては、ＳＰＶ複製で細胞を汚染することく なく、豚痘ベクターを用いてＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質をトリンスフェクトし たＲＮＡとして同一細胞内で発現させる。 ゲノムＲＮＡを用いてＩＢＤウイルスはイン・ビトロで生成されるということ が証明されれば、感染性包病に対する改良された弱毒化ウイルス生ワクチンが開 発される。生成するＩＢＤウイルスの新しく規定された系と共に組換えＤＮＡ技 術を用いて、弱毒化ウイルスの構築を容易とするウイルス・ゲノム内の特異的欠 失が作成される。この技術を用い、病原性の原因となるＩＢＤＶの領域および弱 毒化された免疫原性ＩＢＤＶワクチンが同定される。本発明はビルレントＩＢＤ 株または弱毒化ワクチン骨格のＶＰ２可変領域のビルレント株のそれでの置き換 えを提供し、かくして、ワクチン株の安全性および効果を供しつつ、ビルレント 株に対して保護する。実施例３６ シチメンチョウのヘルペスウイルスの増殖に対するウサギ抗−ニワトリ・イン ターフェロン（ｃＩＦＮ）抗体の効果 ＳＰＶ／ｃＩＰＮ（ＳＰＶ０４１）感染ＥＳＫ−４細胞からの上清を感染４８ 時間後に収穫し、次いで、Centricon 10カラム（Amicon）によって５−１０倍濃 縮した。１ｍｌの濃縮上清をウサギに３週間間隔で３回注射し、次いで、血液採 取した。次いで、このウサギ抗血清を培養で用いて、ＨＶＴの増殖に対するイ ンターフェロンの効果を調べた。抗−ｃＩＦＮはプラーク・アッセイにおいてｃ ＩＦＮの添加によって誘導されたＨＶＴ（１：２００）およびＶＳＶ（１：８０ ）に対するブロックを逆行させることが示された。さらに、ＨＶＴウイルスＤＮ Ａのサブ−プラーキング・レベルで一時的にトランスフェクトしたＣＥＦの培地 中への抗−ｃＩＦＮの添加（１：１００）は、ＨＶＴプラークの形成（２００プ ラーク／ウェル）を増強させることが示された。抗−ｃＩＦＮの不存在下でＨＶ ＴＤＮＡでトランスフェクトしたＣＥＦはプラークを生じなかった。 ＨＶＴはＣＥＦから産生されたインターフェロンに高度に感受性であっで、ｃ ＩＦＮをブロックした場合、ＨＶＴ増殖が増強された。 出願人は、（１）ワクチン・ストックにおいてＨＶＴ力価を増加させるための 添加剤としてのｃＩＦＮに対する抗体の使用；（２）コスミド再構築を介する新 しい組換えＨＶＴウイルスの形成を容易とするための添加剤としてのｃＩＦＮに 対する抗体の使用を含める。実施例３７ Ｓ−ＳＰＶ−０６３ Ｓ−ＳＰＶ−０６３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＰ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を ＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一 のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター( ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＰ遺伝子は合成後期／初期プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −４１．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０６３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す、 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６３を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリクローナ ル血清はＳ−ＳＰＶ−０６３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１ 陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ− ０６３で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清またはヤギ抗−ＮＰ血清と反 応し、これは該ウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す 。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組 換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 ＳＩＶ ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６３で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリ クローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ６３感染細胞からの溶解物および上清は、ＳＩＶ ＮＰ蛋白質の予測されるサイ ズである５６ｋｄに対応するバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０６３はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＮＡを発現す るＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ ＨＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６５と組み 合わせたワクチンとして有用である。 Ｓ−ＳＰＶ−０６４ Ｓ−ＳＰＶ−０６４は１つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イ ー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子を６．９ｋｂ Ｓ ＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊゲノム断片内の唯一のＸｈｏＩ制限部位に挿入した。 該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあ る。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊゲノム断片はＡ５０Ｒ ＯＲＦの一部（ａａ２２７ない し５５２）を含有する。唯一のＸｈｏＩ部位はＡ５０Ｒ ＯＲＦ内にはない。Ｘ ｈｏＩ部位は豚痘ウイルス・ゲノムの３’末端から２５ｋｂにある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −４２．２８およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性 ベクター８０７−４２．２８は、プラスミド５５１−４７．２３からのＬＰ２Ｅ Ｐ２プロモーターｕｉｄＡ遺伝子カセットを含有するＮｏｔＩ断片（材料および 方法参照）の、６．９ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片中のＮｏｔＩ部位（ＤＮＡ リンカーによって唯一のＸｈｏＩ部位はＮｏｔＩに変換した）への挿入によって 生成した。「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについて のスクリーニングスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックを スクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６４と命名 した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセ イによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダ ーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウ ンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安 定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６４を精製し、これは外来性遺伝子、イー・コリｕｉｄＡを発 現し、これは６．９ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片内のＸｈｏＩ部位がウイルス 増殖に必須でない部位であって外来性遺伝子のための安定な挿入部位であること を示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来性遺伝子の発現に、 病気に対するワクチンとして、または発現された外来性遺伝子に対して抗体を生 起させるための発現ベクターとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６５ Ｓ−ＳＰＶ−０６５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を ＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一 のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター( ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター( ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −８４．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０６５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６５を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナ ル血清はＳ−ＳＰＶ−０６５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１ 陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ− ０６５で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清と反応した。ＳＩＶ外来性遺 伝子。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰ Ｖ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 ＳＩＶ ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６５で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリ クローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ６５感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ ＨＡ蛋白質の予測される サイズである６４ｋｄに対応ずるバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０６５はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＮＡを発現す るＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み 合わせたワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６６ Ｓ−ＳＰＶ−０６６は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を ＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した(唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一 のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた)。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター(Ｌ Ｐ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター(Ｌ Ｐ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７ −８４．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０６６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 ＳＩＶ ＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６６で感 染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロ ットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＡポリ クローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０ ６６感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ ＨＡ蛋白質の予測される サイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０６６はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＨＡを発現す るＳ−ＳＰＶ−０６５およびＳＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み 合わせたワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１ Ｓ−ＳＰＶ−０７１は少なくとも４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ １）についての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一の ＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は 合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＨＡ、およびＮＡ遺 伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７ −８６．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０７１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７１を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０７１プラークと特 異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しない ことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０７１で観察されたプラークはヤギ抗−Ｈ Ａ血清と反応し、これはウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたこ とを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞は ＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 ＳＩＶ ＨＡおよびＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ− ０７１で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該 ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗 −ＨＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ− ＳＰＶ−０７１感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ ＨＡおよびＮ Ａ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄおよび５２ｋｄに対応するバンドを 呈した。 Ｓ−ＳＰＶ−０７１はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ ＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用で ある。Ｓ−ＳＰＶ−０７４ Ｓ−ＳＰＶ−０７４は少なくとも４つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子および ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ １）についての遺伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一の ＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｕｉｄＡ遺伝子は 合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ ＨＡお よびＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある 。 Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７ −１４．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用し て達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスク リーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェ クション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＳＰＶ−０７４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した 青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルス を、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセ イした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、 これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７４を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ブタ抗−ＳＩＶ血清はＳ−ＳＰＶ−０７４プラークと特異的に反応す るがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示され た。全てのＳ−ＳＰＶ−０７４で観察されたプラークはヤギ抗−ＨＡ血清と反応 し、これはウイルスがＳＩＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。こ こに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換え ワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。 Ｓ−ＳＰＶ−０７４はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用で あって、ＳＩＶ ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳ ＩＶ ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用で ある。Ｓ−ＳＰＶ−０６９ Ｓ−ＳＰＶ−０６９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）蛋白質についての遺 伝子をＳＰＶ ７２８−９４．４ ＯＲＦ（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７７３塩 基対欠失；ヌクレオチド１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）に 挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＨＲＳ Ｖ Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０６９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１０ −２１９．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利 用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについての スクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランス フェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は Ｓ−ＳＰＶ−０６９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載 した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイ ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきア ッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であ り、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す 。 「組換えＳＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリー ニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６９を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッ セイした。ＨＲＳＶ Ｆに対するモノクローナル抗体６２１(Biodesign,Inc.)は Ｓ−ＳＰＶ−０６９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照 プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６９で 観察されたプラークはモノクローナル抗体６２１と反応し、これはウイルスがＰ ＲＶ外来性遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイを ＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために 適した基礎となろうことが示された。Ｓ−ＳＰＶ−０７８ Ｓ−ＳＰＶ−０７８は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）蛋白質についての遺 伝子をＳＰＶ ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位 は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期／初期プ ロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子は合成後期／ 初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは 「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８２２ −５２Ｇ．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用 して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのス クリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフ ェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ −ＳＰＶ−０７８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載し た青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイル スを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッ セイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり 、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０６９およびＳ−ＳＰＶ−０７８はブタにおいてヒト呼吸器系シ ンシチウムウイルス感染に対するワクチンとして個々にまたは組み合わせて有用 であって、ＨＲＳＶ ＦおよびＧ遺伝子の発現に有用である。 相同性ベクター８１０−２９．Ａ２ プラスミド８１０−２９．Ａ２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築 した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子 およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）遺伝子が組み 込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流 にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳ ＰＶ ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するため の相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードす るＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルス０１Ｌマーカー遺伝子プロモーターの制御下 にあり、ＨＲＳＶ Ｆ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御 下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を 合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３ ０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）の ほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片 １は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得るための、Ｄ ＮＡプライマー５’−ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴ ＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡ ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡ Ｇ−３’（配列番号：１８６）を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳ ＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ断片である。 断片２はイー・コリｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９） から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片３は 、ＨＲＳＶ株Ａ２（ＡＴＣＣ ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写酵 素およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ１ ７２８塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴ ＣＧＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＴ−３’；４／９５．２３ ）（配列番号）はＨＲＳＶ Ｆ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端 のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＧ ＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ Ｔ−３’；４／９５．２４）（配列番号）はＦ遺伝子の３’末端から合成し、逆 転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化 して、ＨＲＳＶ Ｆ遺伝子に対応する長さの断片１７２８塩基対を得た。断片４ は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端をもつ１１１３塩基対断片を得るための 、プライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡ ＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣ ＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴ −３’(配列番号：１８８)を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１１３塩基対サブ断片である。 相同性ベクター８２２−５２Ｇ．７． プラスミド８２２−５２Ｇ．７は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築 した。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子 およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）遺伝子が組み 込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流 にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ１４８４塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流には ＳＰＶ ＤＮＡのほぼ２１４９塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するた めの相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコード するＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御 下にあり、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２） の制御下にあることに注意されたい。それは、以下の源からの制限断片を連結す ることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築 した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対 ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ Ｈ ｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＡｃｃＩないしＢｇｌＩＩ制 限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３００６塩 基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＨＲＳＶ株Ａ２( ＡＴＣＣ ＶＲ−１３０２)からのＲＮＡを用い、逆転写およびポリメラーゼ鎖 反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ８９９塩基対ＥｃｏＲＩ制 限断片である。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧ ＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣ−３’；４／９５．２５）（配列番号）はＨＲＳＶ Ｆ遺 伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ停 止コドンを導入する。プライマー（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＧ ＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧ−３’；４／９５．２６）（配列番号）はＨＲＳＶ Ｇ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用い た。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子に対応する長さの 断片８９９塩基対を得た。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３ ）のほぼ２１４９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＡｃｃＩ制限部位亜断片である。 相同性ベクター８０７−４１．３ プラスミド８０７−４１．３は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築し た。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お よびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）核蛋白質（ＮＰ）遺伝子が組み込 まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製 するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子を コードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ （ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあ り、ＳＩＶ ＮＰ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制 御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片 を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２ ２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロ メガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘 導した。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基 対ＢｇｌＩＩないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株 （ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ ＮＰ遺伝子のほぼ１５０１塩 基対ＥｃｏＲＩないしＥｃｏＲＩ断片である。プライマー（５’−ＣＡＴＧＡＡ ＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣ−３’；６／９ ５．１３）（配列番号）はＳＩＶ ＮＰ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の ５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために 用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで臭化してＳＩＶ ＮＰ遺伝子に対応する長さ の断片１５０１塩基対を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほ ぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｕｖＩＩ制限断片である。断片４はＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｎ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉ ｎｄＩＩＩ制限亜断片である。 相同性ベクター８０７−８４．８ プラスミド８０７−８４．８は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた 。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およ びブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子が組み込 まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製 するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来性遺伝子を コードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃ Ｚ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター(ＬＰ１)の制御下にめり、ＳＩＶ ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあるこ とに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成 ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０ ）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほ ぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片 １は、 ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩないし ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からの ＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４ ２）によって合成したＳＩＶ ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩない しＢａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡ ＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）( 配列番号)はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢ ａｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＴＴ ＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＳ−３’；６／９５．６）(配列番 号：)はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ 鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＨＡ遺伝子 に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１ （１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断 片４はほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないし断片Ｍ（２３）である。 相同性ベクター８０７−８４．３５ プラスミド８０７−８４．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用い た。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お よびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子 が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。「組換えＳＰ Ｖを創製するための手法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子 をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあり、Ｓ ＩＶ ＮＡ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に あることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当 な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２およ び３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社 ）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した 。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対Ｂｇ ｌＩＩないしＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶ Ｓ Ｌ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） （１５、４２）によって合成したＳＩＶ ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対Ｅｃ ｏＲＩないしＢｇｌＩＩ断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡ ＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９ ５．１２）（配列番号；）はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子 の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣ ＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＨＨＴＨＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５ ．１３）（配列番号；）はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の ３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために 用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＮＡ遺伝子に対応する長さ の断片１４１４塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉ ｎｄＩＩＩ制限亜断片である。 相同性ベクター８０７−８６，３５ プラスミド８０７−８６．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用い た。それには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お よびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子および ノイラミラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰ Ｖ ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこ のプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイル スが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プ ロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各々 、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意さ れたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列 連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用し て構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２ 塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰ ＶＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩないしＡｃｃ Ｉ 制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを 用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によ って合成したＳＩＶ ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍ ＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＡＣＴ ＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）(配列番号 ：)はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍＨ Ｉ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴ ＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’；６／９５．６）（配列番 号；）はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢａｍ ＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産 物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩 基を得た。断片３は、ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆 転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成 したＳＩＶ ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌＩＩ断片 である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡ ＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号：）は ＳＩＶ ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位 を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧ ＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号：）はＳ ＩＶ ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を 導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏ ＲＩで消化してＳＩＶ ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た 。断片４はプラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩな いしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片５はＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（ ２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。 相同性ベクター８１７−１４．２ プラスミド８１７−１４．２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた 。それには、イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およ びブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミ ラ ダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡ がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミ ドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られ る。βグルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモ ーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各 々、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意 されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配 列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利 用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９ ７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、 ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩないし ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からの ＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４ ２）によって合成したＳＩＶ ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩない しＢａｍＨＩ断片である。プライマー（５’−ＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡ ＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴ−３’；６／９５．５）（ 配列番号：）はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端に ＢａｍＨＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡ ＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’；６／９５．６） （配列番号：）はＳＩＶ ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端 にＢａｍＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。 ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１ ７２１塩基を得た。断片３は、ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを 用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によ って合成したＳＩＶ ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌ ＩＩ断片である。プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡ ＡＴＡＡＴＡＡＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＴ−３’；６／９５．１２）（配列番号 ：）はＳＩＶ ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲ Ｉ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡ ＴＧＧ ＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧ−３’；６／９５．１３）（配列番号：）はＳ ＩＶ ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を 導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏ ＲＩで消化してＳＩＶ ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た 。断片４はプラスミドｐＲＡＪ２６０(Clonetech)のほぼ１８２３塩基対Ｎｃｏ Ｉ制限断片である。断片５はＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ ２１４９塩基対ＡｃｃＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。単一または複数のＰＲＲＳ遺伝子（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、 ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７を含有するＰＲＲＳ相同性ベクター ＰＲＲＳ相同性ベクターは外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。そ れには、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブ タ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲ Ｆ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７遺伝子が組み込まれており、それの 側に隣接してＳＰＶ ＤＮＡがある。外来性遺伝子の上流にはＳＰＶ ＤＮＡの ほぼ８５５塩基対断片がある。外来性遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ１ １１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従 ってこのプラスミドを用いる場合、外来性遺伝子をコードするＤＮＡを含有する ウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウ イルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、ＰＲＲＳ遺伝子は後期／初期 プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベ クターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に連結することによ って、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プ ラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄＩ ＩＩないしＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩ Ｉ末端を持つ８５５塩基対断片を生じさせるための、ＤＮＡプライマー５’−Ｇ ＡＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡ ＴＡ−３’（配列番号：１８５）および５’−ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴ ＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：１ ８６）を用いるポリマラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制 限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ−断片である。断片２は、イー・コリ ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００ ２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、ＮＶＳＬ（参照株 ）から得られたＰＲＲＳのＵ．Ｓ．単離体からのゲノムＲＮＡを用いて逆転写お よびポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成したＥｃｏＲＩないしＢａｍＨ Ｉ制限断片である。各相同性ベクターは１または複数のＰＲＲＳウイルスＯＲＦ ２ないし７を含有する。ＰＲＲＳ ＯＲＦ２を合成するために、プライマー（５ ’−ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＧＧＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴ ＴＴＧ−３’；１／９６．１５）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ２遺伝子の ５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマ ー(５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡ ＧＴＴＣＧ−３’；１／９６．１６)（配列番号）を逆転写およびＰＣＲのため に使用し、ＰＲＲＳ ＯＲＦ２遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥ ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ２遺伝子に対応する長さ の断片７７１塩基対を得た。ＯＲＦ３を合成するために、プライマー（ＴＴＣＧ ＡＡＴＴＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＴＴ−３ ’；１／９６．７）（配列番号）はＰＲＲＳ ＯＲＦ３遺伝子の５’末端から合 成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣ ＴＡＴＣＧＣＣＧＴＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧ−３’；１／９６ ．８）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ３ 遺伝子の３’末端から合成する。ＰＲＲＳ ＯＲＦ４を合成するために、プライ マー（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣ ＡＴＧＧ−３’；１／９６．１１）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ４遺伝子 の５’末端から合成し、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５ ’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡ ＡＧＡＣ−３’；１／９６．１２）（配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのため に用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ４遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃ ｏＲＩおよびＮａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ４遺伝子に対応する長さの 断片５３７塩基対を得る。ＰＲＲＳ ＯＲＦ５を合成するために、プライマー（ ５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣ ＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣ−３’；１ ／９６．１３）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ５遺伝子の５’末端から合成 し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣ ＴＡＡＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＧＣＴＧ−３’ ； １／９６．１４）(配列番号：)を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ５遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍ ＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ５遺伝子に対応する長さの断片６０３塩基対を 得る。ＰＲＲＳ ＯＲＦ６を合成するために、プライマー（５’−ＣＧＧＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＧＧＴＣＧＴＣＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’；１／９ ６．１７）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ６遺伝子を５’末端から合成し、 遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＣＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣ−３’ ；１／９６．１８）(配列番号：)を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ ＯＲＦ６遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａ ｍＨＩで消化してＰＲＲＳ ＯＲＦ６に対応する長さの５２５塩基対を得る。Ｐ ＲＲＳ ＯＲＦ７を合成するために、プライマー（５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧ ＣＣＡＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ−３’：１／９６． １９）（配列番号：）はＰＲＲＳ ＯＲＦ７の５’末端から合成し、遺伝子の５ ’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣ ＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧ−３’；１／９６．２０）（ 配列番号：）を逆転写およびＰＣＲのために合成し、ＰＲＲＳ ＯＲＦ７遺伝子 の３’末端から合成する。断片４は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ １１１３塩基対を生じさせるための、ＤＮＡプライマー５’−ＣＣＧＴＡＧＴＣ ＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴ−３’ （配列番号：１８７）および５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧ ＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴ−３’）（配列番号：１８８）を用いる ポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１ １３塩基対サブ断片である。仮性狂犬病遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス Ｓ−ＳＰＶ−０８６は少なくとも３つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＤおよびｇＩについての遺伝子をＳＰＶ ６１ ７−６８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限 部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御 下にあり、ＰＲＶ ｇＤおよびｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７７は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩについての遺伝子をＳＰＶ ６１７ ４８． １ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き 換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、 ＰＲＶ ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７９は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢについての遺伝子をＳＰＶ ６１７ ４８． １ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き 換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、 ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に ある。 Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＳ− ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するた めの相同組換え法」において相同性ベクターおよびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１ を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについ てのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトラ ンスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結 果はＳ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９と命 名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッ セイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシ ダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラ ウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純 粋で、安定であって外来性遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＰＲ Ｖ糖蛋白質の発現につき「黒色プラーク・アッセイ」および「ウェスタンブロッ ト」によってテストした。 Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はブタ においてＰＲＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＰＲＶ ｇＤ、ｇＩ またはｇＢの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ −ＳＰＶ−０１２、またはＳ−ＳＰＶ−０１３のごときＰＲＶ ｇＣを発現とす る組換え豚痘ウイルスと組み合わせたワクチンとして有用である。 １４３Ｂ 骨肉腫＊ Ａ４３１ 類表皮癌＊ Ａ５４９ 肺癌＊ Ｃａｐａｎ−１ 肝臓癌＊ ＣＦ５００ 包皮繊維芽細胞 Ｃｈａｎｇ肝臓 肝臓 Ｄｅｔｒｏｉｔ ダウン包皮繊維芽細胞 ＨＥＬ−１９８ 胚性肺 ＨｅＬａ 子宮頸部癌＊ Ｈｅｐ−２ 表皮咽頭癌＊ ＨＩＳＭ 腸平滑筋 ＨＮＫ 新生児腎臓 ＭＲＣ−５ 胚性肺 ＮＣＩ−Ｈ２９２ 肺粘液性類表皮癌＋ ＯＶＣＡＲ−３ 卵巣癌＊ ＲＤ 横紋筋肉腫＋ ＴＨＰ 単球（白血病）＊ ＷＩＬ２−ＮＳ Ｂリンパ球系、非分泌 ＷＩＳＨ 羊膜 ＰＢＬ 末梢血液リンパ球実施例３８ ＰＲＲＳ遺伝子ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、およびＯＲＦ６を 発現する組換え豚痘ウイルス Ｓ−ＳＰＶ−０８０少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルスで ある。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブ タ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２についての遺伝子 をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの７ ７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃ Ｚ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ２遺伝子 は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８１は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ３についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ３遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８２は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ４についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ４遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８３は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ５遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８４は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃｚ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ６遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８５は少なくとも２つの外来性遺伝子を発現する豚痘ウイルス である。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ７についての遺伝 子をＳＰＶ ７３８−９４．４ ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ Ｏ１Ｌ ＯＲＦの ７７３塩基対欠失；１６６９ないし２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａ ｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ ＯＲＦ７遺伝 子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ −０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導 した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベ クター材料および方法（ＰＲＲＳ相同性ベクター）およびウイルスＳ−ＳＰＶ− ００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶ についてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によっ てトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の 最終結果はＳ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ −ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５と命名した組換えウイルスであった 。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数 継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびイン サートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全 てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来性遺伝 子を発現することを示す。 Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ −０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はブタにおいてＰＲＲＳ感染に対するワクチ ンとして個々にまたは組み合わせて有用であって、ＰＲＲＳ ＯＲＦ２、ＯＲＦ ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７の発現で有用である。実施例３９ 以下の実験を行って、培養においてヒト細胞に感染する、およびｌａｃＺのご とき外来性ＤＮＡを発現する豚痘ウイルスの能力を測定した。 Ｓ−ＳＰＶ−００３をＭＯＩ＝０．１にて後記標記にリストしたヒト細胞系に ２ないし３時間吸着させた。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、増殖培地を添加し、細 胞を３７℃で４日間インキュベートした。細胞を収穫し、３回の凍結／解凍にホ って２００マイクロリットルのＰＢＳ中に溶解物を調製した。細胞夾雑物をペレ ット化し、１０マイクロリットルの上清をＯＮＰＧアッセイによって、３７℃に て、ガラクトシダーゼ活性につき１／２時間アッセイした。表はＳ−ＳＰＶ−０ ０３での種々のヒト細胞系の感染および細胞障害効果の相対的レベルおよびｌａ ｃＺの発現の結果を示す。 結果は、種々の細胞系はＳ−ＳＰＶ−００３を摂取し、ｌａｃＺを発現する能 力が変化することを示す。ＣＰＥは全ての場合において最小であって、ウイルス 複製の結果とはならなかった。１つの例外はＡ５４９細胞であり、これは、１つ の例で、数ラウンドの細胞周期およびプレートからの剥がれを示さず、もう１つ の例は継代の間の力価の１０倍増加であり、これは限定的ウイルス複製を示唆し た。いくつかの細胞系は、細胞障害効果を持たない有意なｌａｃＺ活性を示す。 異なる痘プロモーターは、多数のヒト細胞系で組換え豚痘ウイルスからのｌａ ｃＺを発現する。ＥＰ１、ＬＰ１、ＬＰ２、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、また はＳＰＶ ＰＯ１ＬプロモーターからのｌａｃＺを発現した６種の異なる豚痘ウ イルスを構築した。ウイルスを各々用いて、Ａ５４９、Ｃｈａｎｇ肝臓、または １４３Ｂ細胞を０．１ｍｏｉにて感染させ、細胞を２および３時間後にすすぎ、 次いで、３７℃で４日間インキュベートした。各細胞系はプロモーター活性の異 なる階層を維持し、これは以下の実験で再現性があった。例えば、ＥＰ１、ＬＰ ２ＥＰ２、およびＰＯ１Ｌプロモーターは１４３Ｂ細胞で最大の発現を与え、他 方、ＬＰ２はＣｈａｎｇ肝臓細胞で最も強力であり、ＥＰ１ＬＰ２はＡ５４９で 最も強力であった。Ｃｈａｎｇ肝臓およびＡ５４９細胞において、ＰＯ１Ｌプロ モーターからの発現は最も貧弱であり、他方、１４３Ｂにおいては、ＬＰ２から の発現が貧弱であった。従って、異なるヒト細胞系は異なる方法で痘プロモータ ーを利用する。これは、異なる細胞系で複製経路に沿ってどれ位遠くまで豚痘ウ イルスが進行できるかを反映し得る。 これらの初期および後期プロモーターは、組換え豚痘ウイルスによって感染さ れたヒト細胞型に応じてより低いまたはより高いｌａｃＺ活性を呈した。異なる 標的組織に対して異なるプロモーターを選択することによって、豚痘ウイルスか ら標的組織に送達される外来性遺伝子産物の量を調節することができる。 組換え豚痘ウイルスはヒト感染性病気に対するワクチンとして、および治療剤 をヒトに送達するのに有用である。組換え豚痘ウイルスはヒトにおいてウイルス または細菌感染に対するワクチンとして、および抗生物質、腫瘍抗原、細胞表面 リガンドおよび受容体、サイトカインのごとき免疫変調分子を送達するための癌 または遺伝病のための治療剤として有用である。実施例４０ ヒト細胞系におけるｌａｃＺのＳ−ＳＰＶ−００３発現 細胞障害効果およびｌａｃＺ発現の測定 細胞型 細胞障害効果＊ ｌａｃＺ発現＊＊ Ａ４３１ − − 類表皮癌＊ Ａ５４９ ＋＋ ＋＋＋ 肺癌＊ Ｃａｐａｎ−１ − − 肺癌＊ ＣＦ５００ ＋ ＋ 包皮繊維芽細胞 Ｃｈａｎｇ肝臓 ＋ ＋＋＋ Ｄｅｔｒｏｉｔ ＋／− − ガウン包皮繊維芽細胞 ＨＥＬ−１９９ ＋／− ＋＋＋ 胚性肺 ＨＥｐ−２ − ＋ 表皮咽頭癌＊ ＨＩＳＮ ＋ ＋ 腸平滑筋 ＨＮＫ − ＋＋ 新生児腎臓 ＭＲＣ−５ ＋／− ＋ 胚性肺 ＮＣＩ−Ｈ２９２ − ＋＋＋ 肺粘液性類表皮癌＊ ＯＶＣＡＲ−３ − ＋＋＋ 卵巣癌＊ ＲＤ − ＋ 横紋筋肉腫＋ ＴＨＰ − ＋ 単球（白血病）＊ ＷＩＬ２−ＮＳ − −−−− Ｂリンパ球系、非分泌 ＷＩＳＨ ＋／− 羊膜 ＨｅＬａ − ＋＋＋ ＰＢＬ − − 末梢血液リンパ球 ＊ヒト細胞をＳＰＶで感染させた場合、細胞障害効果が時々観察され る。ほとんどの細胞系において、この細胞障害効果は細胞の出現の 変化によって示され、細胞は薄くなり、エッジに沿ってより凸凹に なり；細胞は緊張しているように見える。この現象は以下のごとく に評価される。 −は感染および非感染細胞の間に差異のないことを示す。 ＋／−は、ほとんどの細胞が正常に見えるにも拘わらず、単層が非感 染のものと視覚的に異なることを示す。 ＋は、単層が明らかに侵されており、ほとんどの細胞が緊張して見え ることを示す。系列的継代後に力価が得られたある種の細胞（Ｈｅ Ｌａ、ＣＦ５００、１４３Ｂ）においては、１つの例外を除き、Ｓ ＰＶの複製の証拠がなかったことに注意すべきである。 Ａ５４９は、細胞が感染の間に丸くなってプレートから剥がれた場合に、１つ の例において細胞障害効果につき＋＋を与えたが、この観察は反復されなかつた 。また、Ａ５４９は継代の間に１０倍増加の力価の証拠をもう１つの例で示し、 これは限定的ウイルス複製を支持し得ることを示す。 ＊＊ ３５ｍｍ皿の１／２０からの細胞溶解物当たりのＡ₂₆₀単位で表 したβ−ガラクトシダーゼ活性 − 活性無し ＋ ０．２−０．９Ａ₂₆₀単位 ＋＋ ０．９−１．６Ａ₂₆₀単位 ＋＋＋ １．６Ａ₂₆₀単位より大 請求の範囲 １．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え 豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHi ndIII M断片の略２ｋＢのHindIII〜BglII亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウ イルス。 ２．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ｋＢのHindIII〜BglII亜断片内におけるBglI I部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ３．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが、豚 痘ウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に位 置するNdeI部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ４．請求項２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが、豚 痘ウイルスo1L遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム中に挿入され る組み換え豚痘ウイルス。 ５．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え 豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHi ndIII N断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞内で発現ず ることができる組み換え豚痘ウイルス。 ６．請求項５に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHind III N断片の略２．０ｋＢ Hind III〜BamHI亜 断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ７．請求項６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHind III N断片の略１．２ｋＢ BamHI〜Hind III亜 断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ８．請求項６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHind III N断片の略２．０ｋＢ Hind III〜BamHI 亜断片におけるオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイ ノレス。 ９．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリーディ ングフレームが、I7L遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 １０．請求項６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２．０ｋＢHindIII〜BamHI亜断片内における EcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １１．請求項６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２．０ｋＢHindIII〜BamHI亜断片内における SnaBI制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １２．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片の略2.0ｋＢHindIII〜BamHI亜断 片内におけるオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイノ レス。 １３．請求項７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリーデ ィングフレームが、I4L遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 １４．請求項７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略1.2ｋＢHindIII〜BamHI亜断片内におけるBgl II制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １５．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換 え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの HindIII K断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞内で発現 することができる組み換え豚痘ウイルス。 １６．請求項１５に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、豚痘ウィルスゲノムＤＮＡのHindIII K断片の略3.2ｋＢ亜断片内に挿入さ れる組み換え豚痘ウイルス。 １７．請求項１６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII K断片の略3.2ｋＢ亜断片内における オープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １８．請求項１７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームが、B18R遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 １９．請求項１７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームがB4R遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 ２０．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、ポリペプチドをコードする組み換え豚痘ウイルス。 ２１．請求項２０に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記ポリペプチド が、抗原性である組み換え豚痘ウイルス。 ２２．請求項１に記載の組み換え鶏痘ウイルスであって、さらに検出マーカー をコードする外来ＤＮＡ配列を含む組み換え鶏痘ウイルス。 ２３．請求項２２に記載の組み換え鶏痘ウイルスであって、前記検出マーカー が、大腸菌(E.Coli)ベーターガラクトシダーゼである組み換え鶏痘ウイルス。 ２４．請求項２２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記検出マーカー が、大腸菌(E.Coli)ベーターグルクロニダーゼである組み換え豚痘ウイルス。 ２５．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、サイトカインをコードする組み換え豚痘ウイルス。 ２６．請求項２５に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記サイトカイン が、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン( ｃＩＦＮ）である組み換え豚痘ウイルス。 ２７．請求項２５に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記サイトカイン が、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、 インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびインターロ イキン受容体からなる群から選択される組み換え豚痘ウイルス。 ２８．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、ヒト・ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペス ウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタインーバールウイルス、 水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス −７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウ イルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスからなる群から誘導される組 み換え豚痘ウイルス。 ２９．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパクまたはＢ型肝炎ウイルス表面タンパク である組み換え豚痘ウイルス。 ３０．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、ウマ・インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼまたは赤血球凝集 素である組み換え豚痘ウイルス。 ３１．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ ブチドが、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ 、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー９２ノイラミニダーゼ、ウ マ・インフルエンザウイルスＡ型／プラハ５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフ ルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザ ウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１ 型糖タンパクＢ及およびウマヘルペスウイルス１型糖タンパクＤからなる群から 選択される組み換え豚痘ウイルス。 ３２．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、豚コレラウイルス糖タンパクＥ１、豚コレラウイルス糖タンパクＥ２ 、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、豚インフルエンザウイルスノイラミ ニダーゼ、豚インフルエンザウイルスマトリックスおよび豚インフルエンザウイ ルス核タンパク質、仮性狂犬病ウイルス糖タンパクＢ、仮性狂犬病ウイルス糖タ ンパクＣ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質ＤおよびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ からなる群から誘導される組み換え豚痘ウイルス。 ３３．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タンパクＥ、ウシ呼吸器シンシチア ウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合タ ンパク(ＢＲＳＶ Ｆ)、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシドタンパク質( ＢＲＳＶ Ｎ)、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、およびウ シ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼからなる群 から選択される組み換え豚痘ウイルス。 ３４．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記前記抗原性ポ リペプチドが、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク４８また は糖タンパク５３である組み換え豚痘ウイルス。 ３５．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ、ネコ免疫不全ウイルスｅｎｖ、感染性咽頭 気管炎ウイルス糖タンパクＢ、感染性咽頭気管炎ウイルス糖タンパクＩ、感染性 咽頭気管炎ウイルス糖タンパクＤ、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タンパクＧ 、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タンパクＥ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク ５０、仮性狂犬病ウイルスII糖タンパクＢ、仮性狂犬病ウイルスIII糖タンパク Ｃ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパクＥ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパクＨ、マレ ック病ウイルス糖タンパクＡ、マレック病ウイルス糖タンパクＢ、マレック病ウ イルス糖タンパクＤ、ニューキャッスル病ウイルス赤血球凝集素またはノイラミ ニダーゼ、ニューキャッスル病ウイルス融合、感染性嚢症ウイルスＶＰ２、感染 性嚢症ウイルスＶＰ３、感染性嚢症ウイルスＶＰ４、感染性嚢症ウイルスポリプ ロテイン、感染性気管支炎ウイルススパイク、感染性気管支炎ウイルスマトリッ クス、およびニワトリ貧血ウイルスからなる群から誘導され、または誘導可能な 抗原性ポリペプチドをコードする組み換え豚痘ウイルス。 ３６．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、プロモーターの制御下にある組み換え豚痘ウイルス。 ３７．請求項３６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、内因性の上流ポックスウイルスプロモーターの制御下にある組み換え豚痘 ウイルス。 ３８．請求項３６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、異種の上流プロモーターの制御下にある組み換え豚痘ウイルス。 ３９．請求項３７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記プロモーター が、合成ポックスウイルスプロモーター、ポックス合成後期プロモーター１、ポ ックス合成後期プロモーター２初期プロモーター２、ポックス０１Ｌプロモータ ー、ポックスＩ４Ｌプロモーター、ポックスＩ３Ｌプロモーター、ポックスＩ２ Ｌプロモーター、ポックスＩ１Ｌプロモーター、およびポックスＥ１０Ｒプロモ ーターからなる群から選択される組み換え豚痘ウイルス。 ４０．組み換え豚痘ウイルス１であって、Ｓ−ＳＰＶ−０４２と命名された組 み換え豚痘ウイルス。 ４１．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４３と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４２．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４１と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４３．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４５と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４４．組み換え豚痘ウイルス１であって、Ｓ−ＳＰＶ−０４６と命名された組 み換え豚痘ウイルス。 ４５．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４７と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４６．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４８と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４７．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４９と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４８．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５０と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ４９．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５２と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ５０．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５３と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ５１．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５４と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ５２．組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５５と命名された組み 換え豚痘ウイルス。 ５３．請求項１２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６ ０と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５４．請求項１３に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６ １と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５５．請求項１６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６ ２と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５６．二本鎖ＤＮＡ分子を含む豚痘ウイルスのウイルスゲノム中に外来ＤＮＡ を挿入することにより、組み換え豚痘ウイルスを製造するための相同性ベクター であって、 （ａ）通常は豚痘ウイルスウイルスゲノム内に存在しない二本鎖の外来Ｄ ＮＡと； （ｂ）前記外来ＤＮＡの一端に存在する、前記豚痘ウイルスウイルスゲノ ムのコーディング領域のHindIII N断片の一方の側に位置する前記 ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡと ； （ｃ）前記外来ＤＮＡの他端に存在する、前記豚痘ウイルスウイルスゲノ ムのコーディング領域のHindIII N断片の他方の側に位置する前記 ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡ； とを具備した相同性ベクター。 ５７．請求項５６に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列が、 サイトカインをコードする相同性ベクター。 ５８．請求項５７に記載の相同性ベクターであって、前記サイトカインが、ニ ワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩ ＦＮ）である相同性ベクター。 ５９．請求項５６に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列が、 ポリペプチドをコードする相同性ベクター。 ６０．請求項５９に記載の相同性ベクターであって、前記ポリペプチドが、抗 原性である相同性ベクター。 ６１．請求項５６に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列が、 プロモーターの制御下にある相同性ベクター。 ６２．動物を豚痘ウイルスに対して免疫化するために有用なワクチンであって 、有効な免疫化量の請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスと、適切なキャリア とを含有するワクチン。 ６３．ヒトをヒト病原体に対して免疫化する方法であって、前記動物に対して 、有効免疫化量の請求項６２に記載のワクチンを投与することを具備した方法。 ６４．動物を動物の病原体に対して免疫化する方法であって、前記動物に対し て、有効免疫化量の請求項６２に記載のワクチンを投与することを具備した方法 。 ６５．ヒトの免疫応答を高める方法であって、有効量の請求項６２に記載のワ クチンの組み換え豚痘ウイルスおよび適切なキャリアをヒトに投与することを具 備した方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／４８８，２３７ (32)優先日 平成７年６月７日(1995．6．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え 豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHi ndIII M断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現す ることができる組み換え豚痘ウイルス。 ２．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における略２ＫｂのHindIII〜 BglII亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ３．請求項２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ＫｂのHindIII〜BglII亜断片内に位置するBg lII部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ４．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIIIM断片における大きい方のHindIII〜BglII 亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ５．請求項４に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に位置す るAccI部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ６．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、更に、豚痘ウイルスチ ミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に挿入された外来 ＤＮＡ配列を含んだ組み換え豚痘ウイルス。 ７．請求項６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡは、豚 痘ウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に位 置するNdeI部位中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含んだ組み換え豚痘ウイルス。 ８．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え 豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHi ndIII N断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現す ることができる組み換え豚痘ウイルス。 ９．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略２ＫｂのHindIII〜 BamHI亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １０．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIIIN断片における略1.2ｋＢのBamHI〜 HindIII亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １１．請求項９に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記ＤＮＡ配列が、 豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片の略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片 内のオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １２．請求項１１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記リーディング フレームはＩ７Ｌ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 １３．請求項９に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるE coRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １４．請求項９に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 が豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるSna BI制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １５．請求項１０に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略2.0ｋＢのHind III〜BamHI亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚 痘ウイルス。 １６．請求項１５に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームはＩ４Ｌ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 １７．請求項１５に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記略2.0ｋＢのHindIII〜ＢamHI亜断片内の BglII制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 １８．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換 え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの HindIII M断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現 することができる組み換え豚痘ウイルス。 １９．請求項１８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII Ｍ断片における略2.0ＫｂのBgl II〜HindIII亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ２０．請求項１９に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII Ｍ断片における略3.6ｋＢの大 きい方のHindIII〜BglII亜断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ２１．請求項２０に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記ＤＮＡ配列が 、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII Ｍ断片の略2.0ｋＢのBglIIBglII〜H indIII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウ イルス。 ２２．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームはＩ４Ｌ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 ２３．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームは０１Ｌ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 ２４．請求項１９に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略2.0ｋＢのBglII〜HindIII亜断片内におけ るBglII制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ２５．請求項２４に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII M断片における略3.6ｋＢの大き い方のHindIII〜BamHI亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される 組み換え豚痘ウイルス。 ２６．豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換 え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの HindIII Ｋ断片内に挿入されており、豚痘ウイルスに感染した宿主細胞中で発現 することができる組み換え豚痘ウイルス。 ２７．請求項２６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII Ｋ断片における略3.2Ｋｂの亜 断片内に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ２８．請求項２７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII K断片における略3.6ｋＢのオ ープンリーディングフレーム中に挿入される組み換え豚痘ウイルス。 ２９．請求項２１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームはＢ１８Ｒ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 ３０．請求項２８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記オープンリー ディングフレームはＢ４Ｒ遺伝子をコードする組み換え豚痘ウイルス。 ３１．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 はポリペプチドをコードする組み換え豚痘ウイルス。 ３２．請求項３１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記ポリペプチド が抗原性である組み換え豚痘ウイルス。 ３３．請求項１に記載の組み換え鶏痘ウイルスであって、更に、検出マーカー をコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる組み換え鶏痘ウイルス。 ３４．請求項３３に記載の組み換え鶏痘ウイルスであって、前記検出マーカー が大腸菌(E.coli)ベーターガラクトシダーゼである組み換え鶏痘ウイルス。 ３５．請求項３３に記載の組み換え鶏痘ウイルスであって、前記検出マーカー が大腸菌(E.coli)ベーターグルクロニダーゼである組み換え鶏痘ウイルス。 ３６．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列 がサイトカインをコードする組み換え豚痘ウイルス。 ３７．請求項３６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記サイトカイン がニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ ｃＩＦＮ）である組み換え豚痘ウイルス。 ３８．請求項３６に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記サイトカイン が、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、インタ ーフェロン、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキ ン受容体からなる群から選択される組み換え豚痘ウイルス。 ３９．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドは、ヒト・ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペス ウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水 痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス− ７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイ ルス、 Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスからなる群から誘導される組み換え豚 痘ウイルス。 ４０．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドは、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパクまたはＢ型肝炎ウイルス表面タンパク である組み換え豚痘ウイルス。 ４１．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドは、ウマ・インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼまたは赤血球凝集 素である組み換え豚痘ウイルス。 ４２．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ペプチ ドが、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウ マ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー９２ノイラミニダーゼ、ウマ・ インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフル エンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウ イルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスイウルス１型 糖タンパクＤからなる群から選択される組み換え豚痘ウイルス。 ４３．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、豚コレラウイルスｇＥ１、豚コレラウイルスｇＥ２、豚インフルエン ザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク、 仮性狂犬病ウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、並びにＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７か らなる群から誘導される組み換え豚痘ウイルス。 ４４．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドが、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス 付着タンパク（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合タンパク（ ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシドタンパク（ＢＲＳ Ｖ Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、およびウシ・ パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼからなる群から 選択される組み換え豚痘ウイルス。 ４５．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記抗原性ポリペ プチドは、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク４８または糖 タンパク５３である組み換え豚痘ウイルス。 ４６．請求項３２に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列は、ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ、ネコ免疫不全ウイルスｅｎｖ、感染性咽頭 気管炎ウイルス糖タンパクＢ、感染性咽頭気管炎ウイルスｇＩ、感染性咽頭気管 炎ウイルスｇＤ、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タンパクＧ、感染性ウシ鼻腔 気管炎ウイルス糖タンパクＥ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク５０、仮性狂犬病 ウイルスII糖タンパクＢ、仮性狂犬病ウイルスIII糖タンパクＣ、仮性狂犬病ウ イルス糖タンパクＥ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパクＨ、マレック病ウイルス糖 タンパクＡ、マレック病ウイルス糖タンパクＢ、マレック病ウイルス糖タンパク Ｄ、ニューキャッスル病ウイルス赤血球凝集素又はノイラミニダーゼ、ニューキ ャッスル病ウイルス融合、感染性嚢症ウイルスＶＰ２、感染性嚢症ウイルスＶＰ ３、感染性嚢症ウイルスＶＰ４、感染性嚢症ウイルスポリプロテイン、感染性気 管支炎ウイルススパイク、感染性気管支炎ウイルスマトリックス、およびニワト リ貧血ウイルスからなる群から誘導され、または誘導可能な抗原性ポリペプチド をコードする組み換え豚痘ウイルス。 ４７．請求項１の相同性ベクターであって、前記阿木ライＤＮＡ配列がプロモ ータの制御下にある相同性ベクター。 ４８．請求項４７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、外因性の上流ポックスウイルスプロモータの制御下にある組み換え豚痘ウ イルス。 ４９．請求項４７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配 列が、異種の上流プロモータの制御下にある組み換え豚痘ウイルス。 ５０．請求項４７に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、前記プロモータは 、合成ポックスウイルスプロモータ、ポックス合成後期プロモータ１、ポックス 合成後期プロモータ２初期プロモータ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックス Ｉ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌプロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポ ックスＩ１ＬプロモータおよびポックスＥ１０Ｒプロモータからなる群から選択 される組み換え豚痘ウイルス。 ５１．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４２ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５２．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４３ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５３．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４１ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５４．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４５ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５５．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４６ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５６．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４７ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５７．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４８ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５８．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０４９ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ５９．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５０ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６０．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５２ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６１．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５３ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６２．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５４ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６３．請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０５５ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６４．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６０ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６５．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６１ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６６．請求項８に記載の組み換え豚痘ウイルスであって、Ｓ−ＳＰＶ−０６２ と命名された組み換え豚痘ウイルス。 ６７．二本鎖ＤＮＡ分子を有する豚痘ウイルスのウイルスゲノム中に外来ＤＮ Ａを挿入することにより、組み換え豚痘ウイルスを製造するための相同性ベクタ ーであって、 （ａ）通常は豚痘ウイルスゲノム内に存在しない二本鎖の外来ＤＮＡと； （ｂ）前記外来ＤＮＡの一端に存在する、前記豚痘ウイルスゲノムのコー ディング領域のHindIII Ｎ断片の一方の側に位置する前記ウイルス ゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡと； （ｃ）前記外来ＤＮＡの他端に存在する、前記豚痘ウイルスゲノムのコー ディング領域のHindIII Ｎ断片の他方の側に位置する前記ウイルス ゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡ； とを具備した相同性ベクター。 ６８．請求項６７に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がサ イトカインをコードする相同性ベクター。 ６９．請求項６８に記載の相同性ベクターであって、前記サイトカインがニワ トリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦ Ｎ）である相同性ベクター。 ７０．請求項６７に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がポ リペプチドをコードする相同性ベクター。 ７１．請求項７０に記載の相同性ベクターであって、前記ポリペプチドは抗原 性である相同性ベクター。 ７２．請求項６７に記載の相同性ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がプ ロモータの制御下にある相同性ベクター。 ７３．動物を豚痘ウイルスに対して免疫化するために有用なワクチンであって 、有効な免疫化量の請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスと、適切なキャリア とを含有するワクチン。 ７４．動物をヒト病原体に対して免疫化する方法であって、前記動物に対して 、有効免疫化量の請求項７３に記載のワクチンを投与することを具備した方法。 ７５．動物の病原体に対して動物を免疫化する方法であって、前記動物に対し て、有効免疫化量の請求項７３に記載のワクチンを投与することを具備した方法 。 ７６．鳥類の免疫応答を高める方法であって、身体(person)に対して、有効投 与量の請求項１に記載の組み換え豚痘ウイルスおよび適切なキャリアを投与する ことを具備した方法。