ES2348600T3 - Partículas similares a coronavirus que comprenden genomas funcionalmente suprimidos. - Google Patents

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Bert Jan Haijema
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Abstract

Una partícula similar a un virus aislado o recombinante capaz de replicación, estando dicha partícula derivada de un coronavirus, en donde los genes para las proteínas estructurales no están presentes en el orden 5'-S-E-M-N-3'.

Description

Partículas similares a coronavirus que comprenden genomas funcionalmente suprimidos.
La invención se refiere al campo de los coronavirus y diagnosis, al uso terapéutico y a las vacunas derivadas de dichos virus.
Los coronaviriones tienen una estructura bastante simple. Consisten en una nucleocápsida rodeada por una membrana lipídica. La nucleocápsida helicoidal está compuesta por el genoma de RNA empaquetado en un tipo de proteína, la proteína de la nucleocápsida N. La envoltura viral contiene generalmente 3 proteínas de membrana: la proteína de la espícula (S) (correspondiente a la expresión inglesa spike protein, que se emplea en los dibujos), la proteína de membrana (M) y la proteína de envoltura (E). Algunos coronavirus tienen una cuarta proteína en su membrana, la proteína hemaglutinina-esterasa (HE). Como todos los virus los coronavirus codifican una amplia variedad de diferentes productos génicos y proteínas. Las más importantes entre ellos son evidentemente las proteínas responsables de las funciones relacionadas con la replicación viral y la estructura del virión. Pero además de estas funciones elementales los virus especifican generalmente una diversa colección de proteínas cuya función es con frecuencia todavía desconocida, pero que se sabe o supone que de algún modo son beneficiosas para los virus. Estas proteínas pueden ser esenciales -definidas de acuerdo con su función requerida para la replicación del virus en el cultivo celular- o prescindibles. Los coronavirus constituyen una familia de virus grandes de RNA de sentido positivo que provocan generalmente infecciones respiratorias e intestinales en muchas especies diferentes. Basándose en los criterios de proteínas antigénicas, genéticas y estructurales se han dividido en tres grupos distintos: grupo I, II y III. Realmente, en vista de las grandes diferencias entre los grupos su clasificación en tres géneros diferentes está siendo estudiada por el grupo de estudio responsable del International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) [Comité Internacional sobre la Taxonomía de Virus]. Los aspectos que todos estos virus tienen en común son un conjunto característico de genes esenciales que codifican la replicación y las funciones estructurales. Intercaladas entre estos genes y flanqueándolos existen secuencias que difieren profundamente entre los grupos y que son, más o menos, específicas de cada grupo. De los genes elementales el más predominante ocupa aproximadamente dos tercios del genoma. Situado en el extremo 5' y este gen denominado de polimerasa codifica dos precursores grandes cuyos muchos productos de escisión funcional se mantienen colectivamente responsables de la replicación y transcripción del RNA. Los otros genes elementales especifican las proteínas estructurales básicas N, M, E y S. La proteína de la nucleocápsida (N) empaqueta el RNA viral formando el núcleo del virión. Esta estructura de ribonucleoproteína (RNP) está rodeada por una envoltura lipídica en la que abunda la proteína de membrana (M) que constituye una matriz densa. Asociadas a la proteína M están la pequeña proteína de envoltura (E) y la proteína de la espícula (S), formando esta última los peplómeros virales que están implicados en la fusión virus-célula y célula-célula. Los genes de estas proteínas estructurales existen invariablemente en el genoma viral en el orden 5'-S-E-M-N-3'.
En las células infectadas las nucleocápsidas de los coronavirus están ensambladas en el citoplasma. Las nucleocápsidas interaccionan con las proteínas de la envoltura viral que después de su síntesis en el retículo endoplásmico se acumulan en el compartimento intermedio, un sistema de membranas localizado entre el retículo endoplásmico (abreviadamente ER por la expresión inglesa Endoplasmic Reticulum) y el complejo de Golgi. Este sistema de membranas actúa como el compartimento en ciernes: la interacción de las nucleocápsidas con las proteínas de la envoltura viral conduce al desapretamiento de los viriones que a continuación se liberan de la célula por exocitosis.
Los autores del presente invento han demostrado recientemente que el ensamblaje de las partículas coronavirales no requiere la participación de las nucleocápsidas. Las partículas desprovistas de una nucleocápsida se ensamblan en las células cuando los genes de la proteína de la envoltura viral se expresan conjuntamente. Los requisitos mínimos para la formación de partículas similares a virus (abreviadamente en lo sucesivo VLP por la expresión inglesa Virus-Like Particles) son las proteínas M y E: la proteína S es prescindible pero se incorpora si está presente a través de su interacción con la proteína M. Los análisis bioquímicos y por microscopía electrónica revelaron que las VLP tienen un tamaño homogéneo y dimensiones similares a los coronaviriones auténticos. Claramente, las proteínas M y E tienen la capacidad de asociarse en el plano de las membranas celulares e inducir la curvatura que conduce al apretamiento de "vesículas" específicas que posteriormente son secretadas de las células. Un artículo que describe estos resultados ha aparecido en EMBO Journal (vol. 15, pp. 2020-2028, 1996).
Incluso en otro artículo, se mostraron partículas similares a coronavirus que no estaban desprovistas de una nucleocápsida, aquí el ensamblaje no tuvo lugar independientemente de una nucleocápsida (Bos et al., Virology 218, 52-60, 1996). Además, no fue muy eficaz el empaquetamiento del RNA. Por otra parte, ninguna de estas dos publicaciones proporciona suficientes características en cuanto a la dirección a diana y a la administración que harían adecuadas a las VLP como vehículos terapéuticos, por ejemplo equipándolas con información específica sobre la dirección a una diana y/o con un mensaje genético o no genético.
Sin embargo, los coronavirus tienen varias ventajas teóricas distintas para su uso como vectores con relación a otros sistemas de expresión virales (véase también el documento WO98/49195): (i) los coronavirus son virus de RNA monocatenario que se replican en el citoplasma sin un DNA intermediario, haciendo improbable la integración del genoma del virus en el cromosoma de la célula hospedante; (ii) estos virus tienen el mayor genoma de RNA conocido que tiene en principio sitios para la inserción de genes extraños grandes; (iii) puesto que los coronavirus infectan en general las superficies de las mucosas, tanto respiratorias como entéricas, pueden usarse para inducir una fuerte respuesta inmune secretora; (iv) el tropismo de los coronavirus puede modificarse por la manipulación de la proteína de la espícula (S) permitiendo la manipulación del tropismo y la virulencia del vector; y, (v) están disponibles cepas de coronavirus no patógenas que infectan la mayoría de las especies de interés para desarrollar los sistemas de expresión.
Se han desarrollado dos tipos de vectores de expresión basados en los genomas de los coronavirus. Uno requiere dos componentes (dependiente del auxiliar) y el otro un único genoma que se modifica por recombinación dirigida a una diana o por manipulación genética de un cDNA que codifica un RNA infeccioso. Los sistemas de expresión dependientes del auxiliar, denominados también minigenomas se han desarrollado utilizando miembros de los tres grupos de coronavirus. Los coronavirus derivados de los minigenomas tienen una capacidad de clonación teórica próxima a 25 kb, puesto que los RNA minigenómicos de aproximadamente 3 kb son amplificados y empaquetados eficazmente por el virus auxiliar y el genoma del virus tiene aproximadamente 30 kb. Esta es en principio la mayor capacidad de clonación de un vector basado en los genomas de los virus de RNA.
La genética inversa ha sido posible por recombinación dirigida a una diana entre un virus auxiliar y los RNA derivados de coronavirus no replicativos o replicativos (9). La recombinación dirigida a una diana ha sido mediada por uno o dos cruzamientos. Se introdujeron cambios en el gen S que modificaron la patogenicidad del virus de la hepatitis de ratón (abreviadamente en lo sucesivo MHV por la expresión inglesa Mouse Hepatitis Virus). El gen que codifica la proteína verde fluorescente (abreviadamente en lo sucesivo GFP por la expresión inglesa Green Fluorescent Protein) se insertó en el MHV entre los genes S y E por recombinación dirigida a la diana, dando como resultado la creación de un vector con el mayor genoma viral de RNA conocido (1d). También se han producido mutaciones por mutagénesis dirigida en los genes E y M que muestran el papel crucial de estos genes en el ensamblaje.
La construcción de un clon de cDNA genómico de longitud completa podría mejorar considerablemente la manipulación genética de los coronavirus. Recientemente ha sido posible la construcción de un clon de cDNA del virus de la gastroenteritis transmisible (abreviadamente en lo sucesivo TGEV por la expresión inglesa Transmissible Gastro Enteritis Virus) infeccioso (1c). Para obtener un cDNA infeccioso se han combinado tres estrategias (i) la construcción del cDNA de longitud completa se comenzó a partir de un DI que era replicado estable y eficazmente por el virus auxiliar. Utilizando este DI, se completó el genoma de longitud completa y se comprobó en cada etapa el comportamiento del genoma ampliado. Este método permitió la identificación de un fragmento de cDNA que era tóxico para el hospedante bacteriano. Este hallazgo se utilizó como ventaja volviendo a introducir el fragmento tóxico en el cDNA viral en la última etapa de clonación; (ii) con el fin de expresar el genoma largo del coronavirus y añadir el grupo protector (cap) en 5', se utilizó un sistema de amplificación de dos etapas que acopla la transcripción en el núcleo a partir del promotor de citomegalovirus (CMV), con una segunda amplificación en el citoplasma, conducido por la replicasa viral; y, (iii) para aumentar la estabilidad del cDNA viral en las bacterias, se clonó el cDNA como un cromosoma artificial bacteriano (abreviadamente en lo sucesivo BAC por la expresión inglesa Bacterial Artificial Chromosome), que sólo produce una o dos copias plasmídicas por célula. El cDNA de longitud completa se dividió en dos plásmidos debido a que su fusión en uno reducía la estabilidad del cDNA. Un plásmido contenía toda la secuencia del virus excepto un fragmento ClaI a CIaI de aproximadamente 5 kb que se incluyó en un segundo BAC. Un clon de cDNA infeccioso completamente funcional, que conduce a un virus virulento capaz de infectar tanto los tractos entéricos como respiratorios, se manipuló genéticamente insertando el fragmento CIaI en el resto de la secuencia de cDNA del TGEV.
Como se ha dicho, se han desarrollado ambos sistemas de expresión dependiente del auxiliar, basados en dos componentes y en genomas sencillos construidos por recombinación dirigida o utilizando un cDNA infeccioso. Se han caracterizado las secuencias que regulan la transcripción. Se ha conseguido la expresión de altas cantidades de antígenos heterólogos (1 a 8 \mug/10^{6} células) y se han mantenido los niveles de expresión para alrededor de 10 pases. Estos niveles de expresión deben ser suficientes para provocar respuestas inmunes protectoras.
Los vectores de coronavirus de un solo genoma se han construido eficazmente expresando un gen extraño tal como GFP. Así, se ha abierto un nuevo camino para los coronavirus que tienen propiedades únicas, tal como un tamaño largo de genoma y tropismo estérico, que los hace de gran interés como vectores de expresión, aunque para el desarrollo de vacunas y terapia génica también deben satisfacerse otras condiciones, principalmente la virulencia para el hospedante de las construcciones de vector y la viabilidad de las construcciones de vector en el cultivo celular necesitan estar entre límites definidos. Por una parte, el vector puede no permanecer demasiado virulento, pero debe tener al menos algunas propiedades atenuadas que lo hagan útil para la replicación in vivo como vehículo de administración de genes o para vacunas para el hospedante o el sujeto que va a recibir la terapia. Por otro lado, el vector debe replicarse bien en el cultivo celular, al menos cuando se desea su uso comercial.
La descripción proporciona coronavirus replicativos y partículas similares a virus (VLP) replicativas a partir de las cuales grandes partes de su genoma son delecionadas (al menos funcionalmente) y/o transpuestas sin suprimir sus capacidades replicativas. Dicha deleción da como resultado preferiblemente al menos una deleción funcional en la que el gen correspondiente no se expresa o lo hace sólo parcialmente con lo que está ausente el producto génico resultante, disfuncional o al menos funcionalmente distinto de un producto génico de tipo natural correspondiente. Un resultado sorprendente observado con las VLP delecionadas y/o transpuestas proporcionadas en la presente memoria es el que dicha VLP delecionada o transpuestas, aunque capaz de replicación in vitro e in vivo, está en general muy atenuada, no provoca enfermedad (o lo hace en un grado mucho menor) en el hospedante diana, haciéndola muy adecuada para uso terapéutico, por ejemplo como un vehículo de administración de genes y otras cargas (con lo que la dirección a diana específica puede proporcionarse también cuando se desee), o para uso como una vacuna, estando atenuada mientras lleva determinantes inmunógenos importantes que ayudan a provocar una respuesta inmune. Dichos determinantes pueden proceder de un coronavirus (homólogo o heterólogo), pero también pueden proceder de otros agentes patógenos. En otras palabras, la descripción proporciona el uso de una VLP replicativa con un genoma delecionado y/o transpuesto como vector. En el vector puede introducirse una secuencia extraña de ácidos nucleicos. Esta secuencia génica extraña codifica una proteína (o parte de ella). Esta proteína, o parte de ella, es codificada por la secuencia insertada, que puede servir como inmunógeno o un "medio de dirección a diana" (ligando capaz de fijarse a un receptor).
En un ejemplo preferido, dichas VLP como se proporcionan en la presente invención se modifican además de uno de varios modos, genómicamente o en sus composiciones proteicas, exponiendo con ello en sus superficies diversas moléculas biológicas o diana y/o portando las partículas moléculas con actividad biológica que necesitan ser protegidas y/o conteniendo genomas en los que se han incorporado genes o secuencias extraños. Una de las necesidades principales en la medicina actual son los sistemas para la administración dirigida a una diana de agentes terapéuticos en el cuerpo. En consecuencia, el desarrollo de vehículos que puedan dirigir la carga a grupos específicos de células e introducir esta carga en estas células de tal modo que puedan ejercer su actividad biológica, es un reto importante en la investigación biológica. Se han realizado ya tremendos esfuerzos en el desarrollo y análisis de sistemas basados en liposomas, microesferas, anticuerpos, etc. para la administración de fármacos, genes, péptidos y proteínas. Aunque muchos de estos intentos son prometedores, los éxitos actuales son bastante limitados. El genoma de una VLP como la proporcionada en la presente invención ha sido delecionado y/o transpuesto de tal modo que sin suprimir la replicación sirva muy bien como vehículo administrador de dicha carga. Proporcionar dicha VLP con carga o usar la VLP como vector, se realiza por ejemplo insertando una secuencia génica extraña que codifica una molécula deseada, tal como un ligando o molécula de unión, si ésta es un inmunógeno o molécula de unión al receptor o cualquier otra proteína o péptido. En un ejemplo preferido dicha carga comprende un ácido nucleico al que se han incorporado genes o secuencias extraños de interés. Los genes extraños pueden ser expresados por una VLP tanto por la inserción adicional de dicho gen en su genoma, como por la utilización del espacio genético creado por la deleción de genes
no esenciales.
En una realización, la invención proporciona una VLP replicativa de acuerdo con las reivindicaciones que está también modificada en el ectodominio y/o el endodominio de una proteína viral. Por ejemplo, modificando el ectodominio de la proteína de la espícula, se provee a la VLP de moléculas biológicas modificadas como medios dirigidos a diana que sirven para hacer que la VLP interaccione con otras moléculas biológicas que reflejan, o pueden interaccionar con, los medios diana, tales como proteínas receptoras en células, sean receptores de hormonas, inmunoglobulinas específicas en células B, complejo de histocompatibilidad principal (en lo sucesivo MHC por la expresión inglesa Major Histocompatibility Complex) y moléculas asociadas al MHC presentes en células T y otras células, proteínas de transferencia u otras moléculas receptoras conocidas por los expertos en el campo de los receptores de las superficies celulares. Los medios dirigidos a diana pueden ser proporcionados también para interaccionar con sitios de unión conocidos de enzimas o proteínas seleccionadas u otras moléculas que sirven como sustrato para la enzima seleccionada.
En un ejemplo más, se proporcionan VLP replicativas que exponen un determinante inmunógeno, tal como una toxina bacteriana o una proteína viral o bacteriana heteróloga que comprende un determinante antigénico correspondiente específico para un agente patógeno. Este es un ejemplo en el que las VLP sirven como inmunógeno o vacuna, aquí por ejemplo dirigida contra la toxina bacteriana. Los linfocitos B que llevan las inmunoglobulinas correspondientes en sus superficies son en este caso las células diana para las VLP, una vez reconocidas por el linfocito B, esta(s) célula(s) se multiplicará(n) y producirá(n) el anticuerpo apropiado.
La preparación de las VLP o los coronavirus con proteínas de la espícula modificadas puede lograrse genéticamente por modificación del genoma viral de tal modo que exprese la proteína S modificada en las células infectadas. En la presente invención se proporciona también la preparación de los coronavirus que contienen proteínas de la espícula alteradas de un modo diferente expresando los genes S modificados en células que además están infectadas por coronavirus. La incorporación conjunta de la proteína de la espícula mutante proporciona el virus con nuevos medios de dirección a una diana.
Los virus del grupo I, con el virus de la peritonitis infecciosa felina (abreviadamente en lo sucesivo FIPV por la expresión inglesa Feline Infectious Peritonitis Virus) probablemente como el miembro más complejo, tienen sus genes típicos situados entre los genes S y E y en dirección 3' del gen N, es decir entre el gen N y la región no traducida (abreviadamente UTR por la expresión inglesa Untranslated Region) 3'. Los virus del grupo II, entre los que se encuentran los virus de la hepatitis del ratón (MHV), tienen sus genes particulares entre el gen de polimerasa y el gen S y entre los genes para las proteínas S y E. Una de las proteínas codificadas características de este grupo es la proteína hemaglutinina-esterasa (HE), que está incorporada en viriones y de la que se ha demostrado actividades de hemaglutinación y esterasa. Las actividades de la HE no son esenciales y su significado sigue sin ser aclarado. Por último, los virus del grupo III, con el virus prototipo de la bronquitis infecciosa por coronavirus (abreviadamente IBV por la expresión inglesa Infectious Bronchitis Virus) como representativo, tiene secuencias entre los genes S y E pero también entre los genes M y N. Aunque para algunos de los genes específicos del grupo no pudieron detectarse productos de expresión en las células infectadas para otros (por ejemplo el gen HE en MHV) que existen de forma natural se han observado mutantes virales que llevan deleciones en estos genes, existe la posibilidad de que para algunos de estos genes sean importantes o esenciales, no los productos proteínicos sino otros productos génicos, tales como las secuencias de nucleótidos (DNA o RNA) per se.
En otra realización, para los grupos I, II o III, la invención proporciona una partícula similar a virus capaz de replicación, derivándose dicha partícula de un coronavirus en el que los genes para las proteínas estructurales no están presentes en el orden 5'-S-E-M-N-3'. Dicha VLP replicativa con el orden génico transpuesto tiene dos aspectos importantes. Uno es la seguridad, que resulta del hecho de que la recombinación homóloga del genoma de la VLP con la de un virus virulento accidental es poco probable que genere una progenie nueva viable. El otro es la atenuación debida al mezclamiento de los genes. Dicha VLP replicativa con el orden génico transpuesto proporciona VLP muy atenuadas para el uso como vacuna o sistema administrador de genes, y también es provista en la presente invención llevando las deleciones de genes no esenciales. En la presente invención se muestra que los cambios en el llamado orden invariable de los genes que especifican las funciones de la polimerasa [marcos de lectura abiertos (abreviadamente ORF por la expresión inglesa Open Reading Frames)] 1a/1b) y las proteínas estructurales S, E, M y N en el genoma coronaviral son tolerados sorprendentemente bien, por ejemplo se obtienen fácilmente las VLP con el orden de los genes S, M, E, N o E, S, M, N. También en la presente invención, pueden insertarse genes extraños en diferentes posiciones en el genoma viral, bien como un gen adicional o sustituyendo a genes no esenciales delecionados; estos genes se expresan y se mantienen establemente durante el pase del virus. La transposición de los genes había sido demostrada para virus de RNA de cadena negativa no segmentados (Wertz, 1998).
En otro ejemplo, la descripción proporciona una VLP recombinante en la que ha sido modificado o al menos parcialmente delecionados el ácido nucleico que codifica la proteína S. La proteína S de estos virus es responsable de la unión al receptor celular y de la subsiguiente fusión de la membrana viral y celular durante la entrada. Estas dos funciones tienen lugar en regiones separadas de la molécula: la unión al receptor en el extremo amino y la fusión en el extremo carboxi. Por consiguiente, sustituyendo el dominio de unión al receptor (o partes de él) por moléculas biológicas con diferentes especificidades de dirección a diana, los coronavirus pueden dirigirse a interaccionar con una amplia variedad de moléculas dianas que se expresan por ejemplo en la superficie de las células. Haciéndolo así, sin afectar la función de fusión de la proteína S, la VLP de acuerdo con la invención puede fusionarse o penetrar en células normalmente no infectables por el virus original.
La descripción proporciona partículas similares a virus (VLP) derivadas de coronavirus en los que han sido modificadas una o más copias de las proteínas de la membrana viral de modo que contengan restos proteínicos extraños de origen viral (bien coronaviral o no coronaviral) o no viral, estando dichos restos bien sustituyendo parte(s) de las proteínas de la membrana de la VLP o incorporados en estas proteínas de membrana constituyendo una parte integral de ellas. Por esto se proporcionan VLP con nuevas propiedades biológicas, tales como nuevos medios dirigidos a diana, o información inmunológica, o proteínas con actividad biológica específica contenida en la partícula similar a virus, cuyas propiedades biológicas están asociadas a las de la VLP próximas a la, o en lugar de, la proteína de la espícula natural del coronavirus original.
En un ejemplo, se proporcionan VLP recombinantes con genoma delecionado y/o transpuesto en el que el ectodominio (o una parte de él) (es decir, la parte expuesta en el exterior de la partícula viral) de la proteína de la espícula ha sido sustituido por el dominio correspondiente (o una de sus partes) de la proteína de la espícula de otro coronavirus. Por ello la VLP ha adquirido otra especificidad del sustrato celular con la que la VPL es capaz de penetrar en las células que de otra manera no serían accesibles ni sensibles al coronavirus original. En otro ejemplo, se proporcionan VLP que están compuestas por las proteínas M y E del coronavirus de la hepatitis de ratón (MHV) y que contienen moléculas de la espícula quiméricas que consisten en la transmembrana + dominio del extremo carboxi de S del MHV, pero con el ectodominio de la proteína de la espícula del coronavirus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV). Estas VLP pueden penetrar ahora en las células felinas y suministrar partículas similares al MHV. Las partículas con estas proteínas de la espícula quiméricas se producen haciendo construcciones del gen S del coronavirus MHV en el que la región que codifica el dominio del extremo amino es reemplazada por el dominio correspondiente del FIPV. Estas construcciones se insertan en plásmidos detrás de un promotor de polimerasa del bacteriófago T7. A continuación las construcciones se transfectan conjuntamente con los plásmidos que llevan los genes M y E del MHV, ambos también detrás del promotor de T7, en células OST-7 que han sido infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la polimerasa de T7. Las VLP resultantes contienen la proteína S quimérica de MHV/FIPV. En otro ejemplo, se proporciona la VLP por los métodos usados anteriormente con ectodominios de la proteína de la espícula del coronavirus de la bronquitis infecciosa (IBV) o el ectodominio (o una de sus partes) de una proteína de envoltura de cualquier virus envuelto que no pertenezca a los coronavirus. Por ejemplo, la invención proporciona VLP basadas en el MHV que llevan en sus superficies el ectodominio de la glicoproteína gD del virus de la pseudo-rabia (abreviadamente PRV por la expresión inglesa Pseudorabies Virus) en lugar del ectodominio de la proteína de la espícula del MHV o el dominio (o una de sus partes) luminal (es decir, del extremo amino) de cualquier proteína de membrana de tipo I no viral. De este modo, se proporcionan las VLP con una especificidad celular para células de pollo o células de cerdo o células reactivas con la proteína de membrana de tipo I.
Todavía en otro ejemplo, se producen VLP replicativas con modificaciones que están contenidas en las partículas. Esto se consigue por incorporación de construcciones modificadas de cualquiera de la proteínas coronavirales S, M, E y HE. En las partículas del coronavirus estas proteínas tienen su dominio del extremo carboxi encerrado en el interior de la envoltura viral. Por tanto, las secuencias de las proteínas extrañas incorporadas al dominio del extremo carboxi, añadidas a él o sustituyéndolo, también están encerradas. De este modo, pueden proporcionarse VLP que contengan restos proteínicos, o sus fragmentos, a partir de otros virus o proteínas no virales, tales como hormonas, tal como la eritropoyetina. Esto permite la producción de VLP que contienen una proteína biológicamente activa o uno de sus fragmentos, que es/son protegidos por la envoltura viral y pueden ser liberados y/o recuperados más tarde, cuando la membrana viral se degrada o fusiona a otra membrana. Esto permite la producción in vitro en células o la producción in vivo en glándulas secretoras, tales como las glándulas de la leche, de una sustancia biológicamente activa que si no sería perjudicial o tóxica para las células productoras o que por otras razones necesita ser producida de forma protegida.
Como otro ejemplo, se proporcionan VLP basadas en MHV que llevan en sus superficies o en su interior una molécula enzimáticamente activa como furina o una citoquina o un receptor de hormonas u otro polipéptido viral o no viral con actividad biológica. En estos ejemplos, se proporcionan VLP con medios de dirección a diana (adicionales) que sirven para dirigir la VLP hacia células que de otro modo no serían accesibles al coronavirus original. La descripción proporciona VLP replicativas obtenidas por técnicas recombinantes que están además modificadas en el ectodominio y/o el ectodominio de cualquiera de la proteínas virales. Modificando el ectodominio de la proteína de la espícula, se proporcionan VLP con moléculas biológicas modificadas como medios de dirección a diana que sirven para dirigir la VLP para que interaccione con otras moléculas biológicas que reflejan o pueden interaccionar con los medios de dirección a diana, tales como las proteínas receptoras en las células, es decir receptores de hormonas, inmunoglobulinas específicas en células B, MHC y moléculas asociadas a MHC presentes sobre las células T y otras células, proteínas de transferencia u otras moléculas receptoras conocidas por los expertos en la técnica en el campo de los receptores de las superficies celulares. También pueden proporcionarse medios de dirección a diana que interaccionen con sitios de unión conocidos de enzimas seleccionadas sobre proteínas u otras moléculas que sirven como sustrato para la enzima seleccionada.
La preparación de las VLP o coronavirus con proteínas de la espícula modificadas puede realizarse genéticamente por modificación del genoma viral de tal forma que exprese la proteína S modificada en las células infectadas. En la presente invención se proporciona también la preparación de coronavirus que contienen proteínas de la espícula alteradas de un modo diferente por expresión de genes S modificados en células que además están infectadas con coronavirus. La incorporación conjunta de la proteína de la espícula mutante proporciona un virus con nuevos medios de dirección a diana. Como ejemplo, los autores de la presente invención demuestran la producción de partículas de MHV que contienen la proteína S quimérica de MHV/FIPV. La construcción del gen S quimérico se expresa en células L que se infectan posteriormente con la cepa A59 del MHV natural (MHV-A59) o uno de sus mutantes. El virus de la progenie liberado por las células contiene la proteína S modificada. Para demostrar la dirección a diana alterada el virus se utilizó para infectar células felinas que en la naturaleza no son susceptibles al MHV. Como se demuestra por inmunofluorescencia las células son ahora infectadas y producen el MHV normal. Como otro ejemplo, los autores de la presente invención demuestran la producción de MHV que contiene proteínas S quiméricas en las que parte del ectodominio de S ha sido sustituido por la parte correspondiente (es decir, el dominio luminal o del extremo amino) de la molécula CD4 humana, como ejemplo de una proteína no viral. Estos coronavirus modificados han adquirido la propiedad de infectar las células infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (abreviadamente HIV por Human Immunodeficiency Virus) y las células que expresan la glicoproteína de envoltura HIV por medio del reconocimiento específico del complejo de CD4 y la gp 120 del HIV. Como resultado, las células infectadas por HIV experimentan una infección lítica, que reduce eficazmente el número de células infectadas por HIV en el cuerpo y reduciendo con ello la gravedad de la enfermedad o incluso terminando la infección.
Como otro ejemplo, los autores de la presente invención demuestran la producción de una VLP de acuerdo con la invención que contiene moléculas de la espícula en las que el extremo amino ha sido sustituido por un fragmento de anticuerpo monocatenario que reconoce una proteína superficial de una célula específica que se expresa en células que normalmente pueden no ser infectadas por el coronavirus que se encuentra en la base de dicha VLP. El virus modificado es capaz de infectar estas células que de otro modo serían refractarias. Este ejemplo ilustra el principio de que de este modo, es decir insertando información de dirección a diana muy específica en la proteína de la espícula viral, los coronavirus pueden ser dirigidos a células o tejidos seleccionados. El fragmento de anticuerpo monocatenario puede seleccionarse por ejemplo en sistemas de expresión en fago o en otros sistemas de selección clonales de fragmentos de anticuerpos monocatenarios conocidos en la técnica.
Otro aspecto de la presente descripción se refiere al uso de dichas VLP replicativas o coronavirus como vehículos administradores de genes. Esto puede conseguirse de diferentes modos. Un modo es incorporando genes o secuencias extraños en el genoma viral de tal modo que al penetrar el virus en las células estos genes se expresen o que las secuencias insertadas se vuelvan biológicamente activas de cualquier otra manera (como es el caso de las ribozimas o los RNA antisentido generados por el virus en el interior de las células). El otro modo utiliza las VLP para empaquetar el RNA extraño en partículas utilizando la(s) señal(es) de empaquetamiento coronaviral(es). La incorporación de secuencias extrañas en el genoma coronaviral puede realizarse por manipulación genética utilizando un clon de (c-)DNA infeccioso, una copia del DNA de tamaño completo del genoma viral. También puede conseguirse por recombinación del RNA en cuyo caso el RNA que representa parte del genoma viral y que contiene las secuencias extrañas se introduce en células infectadas lo que permite que las secuencias extrañas sean incorporadas por medio de una recombinación homóloga. Debido a que los coronavirus matarán generalmente a las células que infectan, es importante en la mayoría de los casos atenuarlos de modo que no maten a las células con las que interaccionan. En la presente invención la atenuación se realiza alterando genómicamente el virus por deleción o transposición.
Como ejemplo, la atenuación se realiza por la preparación de un mutante de MHV del cual ha sido delecionado por recombinación un gen esencial. Se proporciona una línea celular de ratón en la que el gen E del MHV ha sido integrado cromosómicamente permitiendo que sea producida la proteína E por la expresión del gen. El MHV que carece de un gen E se ha producido en células de ratón normales por recombinación utilizando un RNA sintético que contiene una copia perfecta del extremo 3' genómico del MHV excepto por la carencia de un gen E intacto. El virus defectuoso por la carencia del gen E es capaz de desarrollarse sólo en las células que complementan el defecto. El virus producido es atenuado de tal forma que pueda infectar otras células de ratón, pero no productivamente: la carencia de una proteína E evita el ensamblaje de la progenie. Como ejemplo del principio de incorporación de secuencias genéticas extrañas en las VLP atenuadas o no atenuadas o los coronavirus y de su expresión la invención proporciona lo siguiente. Se proporciona una VLP derivada de un MHV en la que ha sido recombinado un gen indicador, tal como LacZ o una proteína verde fluorescente y una en la que se ha incorporado el gen S quimérico de MHV/FIPV. La expresión de los genes se muestra por una tinción fluorescente azul o verde de las células infectadas con VLP y por la capacidad adquirida para infectar células felinas, respectivamente. El otro modo de obtener vehículos de administración a base de coronavirus utiliza las VLP que comprenden secuencias de RNA extrañas. La incorporación de secuencias de RNA extrañas en estas partículas requiere su empaquetamiento en nucleocápsidas. El empaquetamiento del RNA viral por las moléculas de la proteína de la nucleocápsida (N) tiene lugar por el reconocimiento de secuencias específicas, siendo empaquetada la señal o señales por la proteína N. En el empaquetamiento del MHV la señal incluye una región con una longitud de 69 nucleótidos en el gen 1B. Los RNA extraños (no coronavirales) que contienen la(s) señal(es) de empaquetamiento del coronavirus o genomas coronavirales defectuosos en los que se mantienen esta(s) señal(es) pero en los que se han incorporado secuencias extrañas, se ensamblan en las VLP cuando se introducen en células que expresan los genes N, M y E (\pmS). La VLP puede introducir en una célula diana un RNA definido que puede tener una de varias funciones. Un ejemplo es un RNA que actúa como mRNA y que especifica una proteína particular, tal como una toxina o un inductor de apoptosis o un fragmento de anticuerpo. Otro ejemplo es un RNA antisentido o un RNA con actividad de ribozima. Para la mayoría de los fines, es esencial adquirir múltiples copias del RNA en cada célula para obtener el efecto deseado. Esto puede no ser factible con las VLP que sólo lleven una o pocas seudo-NC. La invención proporciona así los RNA con señales de amplificación de tal modo que se multipliquen en la célula diana. Para lograr este objetivo, se utilizan las secuencias de replicación del virus de Semliki Forest (abreviadamente SFV por la expresión inglesa Semliki Forest virus) como base de la construcción de RNA. El mRNA derivado del SFV que comprende además las secuencias de encapsidación del coronavirus y que especifica una proteína indicadora se ensambla en las VLP. La amplificación conducida por el SFV permite la síntesis de la proteína indicadora en las células; en animales, la aparición de anticuerpos contra la proteína indicadora demuestra la administración productiva del contenido de las VLP. La descripción proporciona también una VLP que es un vehículo administrador de antígenos o epítopos destinado a la inducción de respuestas inmunes específicas, celulares y/o humorales, sistémicas y/o locales, incluyendo la inducción y producción de anticuerpos específicos contra proteínas, para conseguir la protección contra la infección por agentes patógenos de origen viral y no viral. Como ejemplo la descripción proporciona la inducción de anticuerpos contra la proteína indicadora procedente del mRNA derivado del SFV que comprende además las secuencias de encapsidación del coronavirus y que especifica una proteína indicadora, como se ha descrito antes. Como otro ejemplo se demuestra la inducción de anticuerpos en ratones contra la proteína de la espícula del FIPV y contra la gD del PRV por inmunización con las VLP, también descritas anteriormente. Así, las respuestas inmunes pueden ser provocadas tanto contra las proteínas que son codificadas por el genoma alterado de la VLP como contra las proteínas que han sido incorporadas como medios de dirección a diana en la VLP, sustituyendo con ello parcial o totalmente la proteína de la espícula original. Los ejemplos ilustran la aplicabilidad del método a la inducción de respuestas inmunes contra proteínas tan diversas como por ejemplo de origen viral, bacteriano, parásito, celular y hormonal.
La descripción proporciona también las VLP que han mantenido totalmente la proteína de la espícula original pero que han sido alteradas genómicamente para atenuar la VLP y/o codificar las secuencias de nucleótidos que necesitan ser administradas a las células a las que iba dirigido el coronavirus original. Por ejemplo, de este modo, las células epiteliales intestinales o las células epiteliales respiratorias, que son infectadas normalmente por TGEV o PRCV, respectivamente, pueden interaccionar ahora con las VLP derivadas de TGEV o coronavirus respiratorio porcino (abreviadamente PRCV por la expresión inglesa Porcine Respiratory Coronavirus), o si es necesario con otros coronavirus específicos de otras células, para expresar proteínas normalmente no expresadas por dichos virus. De este modo, las células epiteliales respiratorias de pacientes con fibrosis quística pueden ser inducidas por ejemplo para expresar moléculas tensioactivas de los pulmones que son codificadas por el genoma alterado de la VLP. En la descripción detallada se proporcionan varios ejemplos.
Fig. 1:
A. La parte superior muestra el principio de la tecnología de recombinación del RNA. Se infectan células felinas con fMHV (el derivado del MHV que lleva una proteína S quimérica con un ectodominio procedente de la proteína S del FIPV que permite desarrollarse al virus en la células felinas) y se transfectan con el RNA donador sintético que lleva, entre otros, el gen S intacto del MHV. La recombinación apropiada del RNA conduce a virus que han recuperado la capacidad para desarrollarse en células de múridos por la adquisición de las proteínas de la espícula cognadas. La parte inferior muestra, a la izquierda, la representación esquemática de las partes correspondientes de las construcciones plasmídicas a partir de las cuales se generaron los RNA donadores. A la derecha se representa la organización genómica de los virus recombinantes generados con estos RNA donadores.
B. Se muestran las secuencias de nucleótidos de los nuevos empalmes creados en las construcciones plasmídicas (y los virus resultantes), cuyas posiciones y números se indican en la parte A (lado izquierdo).
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Fig. 2:
Análisis por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (abreviadamente en lo sucesivo RT-PCR por la expresión inglesa Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) de los virus recombinantes con deleciones genéticas. Se aisló el RNA genómico de virus clonados, se preparó el cDNA por transcriptasa inversa (RT) con cebadores apropiados (1092 y 1127) y se realizó la PCR con los cebadores 1261 + 990 o con los cebadores 1173 + 1260 para analizar la región de los genes 4a/b/5a o de los genes 2A + HE, respectivamente. El esquema de los análisis se muestra a la derecha, los resultados de los análisis con gel de agarosa de los productos de la PCR se muestran a la izquierda. Los virus analizados se indican encima del gel. En la pista de la derecha se registraron los DNA marcadores.
Fig. 3:
Los RNA virales sintetizados en células infectadas por los diferentes mutantes por deleción del MHV se analizaron por extracción del RNA citoplásmico total, se marcaron metabólicamente con [^{33}P]ortofosfato en presencia de actinomicina D, seguido de electroforesis en gel de agarosa al 1%. En la parte superior se muestra el complemento genético de los virus con deleción, mientras que las especies subgenómicas del RNA se recogen a la derecha también de acuerdo con su composición genética.
Fig. 4:
Curvas de crecimiento en una etapa del virus recombinantes con deleciones. Después de infección a una alta m.o.i. de las células LR7 con virus con deleción y MHV natural (abreviadamente en lo sucesivo WT por la expresión inglesa Wild Type), se tomaron muestras de cada medio de cultivo en diferentes momentos y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
Fig. 5:
Como en la Fig. 1 se representa la construcción de los virus con el orden génico transpuesto. A la izquierda la partes correspondientes de las construcciones plasmídicas: la organización del genoma de sus secuencias del cDNA del MHV y las designaciones de los plásmidos. A la derecha los virus respectivos con su estructura genómica y sus nombres.
Fig. 6:
Curvas del crecimiento en una etapa de los virus recombinantes con genoma transpuesto. Después de infección a una alta m.o.i. de las células LR7 con los virus MHV-Ä2aHE (DELTA2aHE), MHV-1bMS, MHV-MS-mN o MHV-WT, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en diferentes momentos y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
Fig. 7:
A. Como en la Fig. 1 se representa la construcción de virus con inserciones de genes extraños. A la izquierda se representan las diversas construcciones plasmídicas (vector), con sus nombres. A la derecha, se muestra la composición genética de los virus obtenidos con estos plásmidos por recombinación del RNA en células felinas junto con sus nombres. Debajo: las secuencias (y números) de los cebadores utilizados para la introducción de una secuencia promotora intergénica (SPI) delante del gen de la luciferasa de renilla (abreviadamente RL por la expresión Renilla Luciferase) y de la luciferasa de luciérnaga (abreviadamente FL por la expresión inglesa Firefly Luciferase).
B. Análisis por RT-PCR de los virus recombinantes que llevan el gen de RL. Se preparó cDNA por RT utilizando el cebador 1412 en el RNA viral; para cada virus se analizaron en paralelo dos virus derivados independientemente (designados por las extensiones A1A y B1A; A2 y B1; A7A y B2D). Posteriormente, se realizó la PCR sobre el cDNA resultante así como sobre los plásmidos utilizados para generar los virus (véase la Fig. 7A) con los pares de cebadores indicados en la parte inferior de la figura. Para cada conjunto también se incluyó una muestra como control negativo (H_{2}O). Se muestra el análisis de los fragmentos de la PCR junto con los marcadores de DNA (pistas flanqueantes) y a la derecha se indican los tamaños de los productos.
Fig. 8:
Curvas de crecimiento en una etapa de los virus recombinantes que llevan genes extraños. Después de infección a una alta m.o.i. de las células LR7 con virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en diferentes momentos y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
A. Curvas de crecimiento de diferentes virus que tienen el gen de la luciferasa de renilla en comparación con MHV-WT.
B. Se muestra el crecimiento de dos clones obtenidos independientemente del virus MHV-EFLM que lleva el gen de la luciferasa de luciérnaga en comparación con el MHV-WT.
Fig. 9:
Expresión de la luciferasa por virus recombinantes. Se infectaron células LR7 con virus que expresaban la luciferasa de renilla (A) o de luciérnaga (B) y con MHV-WT y se monitorizó en el tiempo la actividad de luciferasa en las células. En B se compararon los dos clones obtenidos independientemente del virus MHV-EFLM (véase la Fig. 8B) con MHV-WT.
Fig. 10:
Estabilidad de los virus que llevan genes extraños. Se realizaron 8 pases de los virus recombinantes MHV-ERLM y MHV-EFLM (en cada caso dos clones obtenidos independientemente) sobre células LR7 a baja m.o.i. Después de cada pase, se determinó la infectividad viral (50% de dosis infectiva en cultivo de tejidos (DICT_{50}) en el medio de cultivo recolectado. El virus recolectado así obtenido se inoculó en paralelo a células LR7 a una m.o.i. de 5 y se cuantificó la expresión de luciferasa en las células 8 horas después de la infección. Los resultados se representan en función del número de pases.
Fig. 11:
Inhibición de la infección con MHV por el péptido HR2. A células LR7 se les inoculó el virus MHV-EFLM en presencia de diferentes concentraciones del péptido HR2 o, como control, un péptido correspondiente a los aminoácidos 1003-1048 de la proteína S viral. Después de una hora de inoculación se lavaron las células y se incubaron en ausencia de péptido. Para evaluar el éxito de la infección se analizaron las células 4 horas después de la infección para valorar la expresión de luciferasa. En la figura se representa la actividad de luciferasa frente a las diferentes concentraciones de péptidos utilizados.
Fig. 12:
Inhibición de la fusión célula-célula por el péptido HR2. Después de inoculación de cultivos paralelos de las células LR7 con MHV-A59, las células se revistieron con medio de agar-agar que contenía diferentes concentraciones de péptido HR2 y al día siguiente se realizó un recuento en las placas.
Fig. 13:
A. La estructura genética del vector plasmídico primario pBRDI1 en comparación con el del virus parental del que procede. La parte superior presenta la organización genómica de la cepa 79-1146 del FIPV. Las partes encuadradas por las líneas de puntos (es decir, la mayoría de las 702 bases muy próximas al extremo 5' y las bases 9, 2, 62 derivadas del extremo 3) se ensamblaron en la construcción de cDNA de pBRDI1; en este plásmido el cDNA viral está precedido por una secuencia promotora del fago T7 y la inserción está flanqueada por los sitios de restricción XhoI (5') y NotI (3').
B. El plásmido pBRDI2 es un derivado de pBRDI1 en el que el gen S de FIPV ha sido sustituido por un gen S quimérico (denominado mS) que codifica el ectodominio S de MHV-A59 aunque reteniendo las secuencias para la transmembrana y el endominio de la proteína S del FIPV. El plásmido pBRDI2 se obtuvo sustituyendo en pBRDI1 el segmento SacI-AfiII por el fragmento correspondiente de pTMFS1. Este último plásmido es un derivado del plásmido pTMFS (12) que contiene la secuencia de los genes quiméricos y en el que se clonó un fragmento SacI-StuI para extender la secuencia S del MHV en su extremo 5' con las secuencias correspondientes a pol1B del extremo 3' del FIPV.
Fig. 14:
Detalles de las secuencias de las construcciones de pBRDI.
A. La secuencia de nucleótidos de pBRDI1 y pBRDI2 alrededor del extremo 5' de la secuencia genómica del FIPV: el sitio XhoI y la secuencia del fago T7 van seguidos por un triplete G y posteriormente por la secuencia del FIPV.
B. La secuencia en el empalme pol1A/pol1B.
C. Secuencia de nucleótidos en el extremo muy próximo a 3' de la construcción del cDNA. La región en 3' no traducida (3'UTR) es seguida por un tramo de nucleótidos de adenina y una secuencia NotI.
D. Secuencia de nucleótidos en la transición S de FIPVpol1B-MHV en pTMFS1 y pBRDI2.
Fig. 15:
Representación esquemática de la generación de mFIPV por recombinación del RNA genómico del FIPV y el RNA sintético derivado de pBRDI2 en células felinas. Se indica la organización genética en cada RNA así como la selección para el virus recombinante (es decir, el mS quimérico que contiene) por crecimiento en células de múridos.
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Fig. 16:
Análisis de las proteínas estructurales del mFIPV. Se infectaron células LR7 de múridos con mFIPV y, para comparación, con MHV-A59; se infectaron células de fetos enteros de gato (abreviadamente en lo sucesivo FCWF por la expresión inglesa Felis Catus Whole Fetus) con la cepa 79-1146 del FIPV. Las células infectadas se marcaron con ^{35}S-aminoácidos a las 5-7 horas posteriores a la infección, se prepararon lisados celulares y se realizaron inmunoprecipitaciones con diferentes anticuerpos: anticuerpos policlonales contra el FIPV (pistas 1, 6 y 10) y contra el MHV (pistas 3, 4, 8 y 12) y anticuerpos monoclonales contra la proteína S felina (S_{f}; pistas 2, 7 y 11) y la proteína S de múridos (S_{m}; pistas 5, 9 y 13). Las proteínas se analizaron por electroforesis sobre SDS-gel de poliacrilamida al 12%. Las posiciones en el gel de las proteínas del MHV y del FIPV se indican en el lado izquierdo y en el lado derecho, respectivamente. La proteína S del mFIPV es precipitada por los sueros específicos para S del MHV, no por los que precipitan la proteína S del FIPV, y su migración en el gel es similar a la de la proteína S del MHV.
Fig. 17:
Curvas de crecimiento en una etapa del mFIPV en comparación con el MHV. Después de infección a una alta m.o.i. de las células de LR7 con los dos virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en diferentes momentos y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
Fig. 18:
Generación de mutantes por deleción del FIPV. En la parte superior se muestra el principio del método: la recombinación del RNA del mFIPV con RNA donador sintético derivado de pBRDI que lleva el gen S intacto del FIPV. Debajo de esto se representa la organización genética de los plásmidos pBRDI1 construidos (izquierda) y los virus generados (derecha). Las flechas indican la posición (y el número) de los cebadores utilizados, los triángulos en blanco indican las deleciones. A la derecha, los números de pares de bases (pb) indican los tamaños de los fragmentos de la PCR que se predice que se han de obtener con los pares de cebadores indicados.
Fig. 19:
Análisis genético de los virus recombinantes por deleción del FIPV. Se aisló el RNA genómico de los virus con deleción, así como del FIPV recombinante tipo natural. Se realizaron las RT-PCR utilizando los cebadores 1 y 9 para el análisis de los genes 3ABC (panel A) y los cebadores 10 y 11 para los genes 7AB (panel B). Al lado de los genes se indican las posiciones de los fragmentos de DNA en los geles de agarosa junto con su tamaño predicho (véase la Fig. 18, derecha). A la derecha se indican los RNA virales analizados en las diferentes pistas.
Fig. 20:
Regiones repetidas en heptadas (abreviadamente HR por la expresión inglesa Heptad Regions) y sus secuencias de aminoácidos en las proteínas de la espícula de los coronavirus.
A. Representación esquemática de la estructura de la espícula del coronavirus MHV-A59. La glicoproteína de la espícula (S) contiene una secuencia señal en el extremo N (SS) y un dominio transmembranal (TM) próximo a su extremo C. El gen S es escindido proteolíticamente (flecha) en las subunidades S1 y S2, que están unidas no covalentemente. S2 contiene dos regiones repetidas en heptadas, HR1 y HR2, como se indica.
B. Alineación de secuencias de los dominios HR1 y HR2 de MHV-A59, HCV-OC43 (cepa OC43 del coronavirus humano), HCV-229E (cepa 229E del coronavirus humano), FIPV e IBV (cepa Beaudette de la bronquitis infecciosa). La alineación muestra una inserción notable de exactamente 2 regiones repetidas en heptadas (14 aa) tanto en HR1 como HR2 de HCV-229E y FIPV, que está presente en las proteínas S de todos los virus del grupo 1. Encima de la secuencia se indican los residuos a y d de la unidad repetida en heptada hidrófoba predicha. El desplazamiento del marco de las regiones repetidas en heptada predichas en HR1 es provocado por un entrecortamiento. Los asteriscos indican residuos conservados. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos HR1, HR1a, HR1b, HR1c y HR2 utilizadas en este estudio se representan en cursiva debajo de las alineaciones. Los residuos del N-terminal derivados del sitio de escisión proteolítico de la proteína de fusión con GST (Glutation-S-transferasa) están entre paréntesis.
Fig. 21 = Tabla 1:
Se muestran las secuencias de los empalmes que se generaron en los plásmidos representados en la Fig. 5 y en los virus obtenidos con estos plásmidos. Los números corresponden a la numeración de los empalmes indicados por las puntas de las flechas en los plásmidos (Fig. 5, izquierda).
Fig. 22 = Tabla 2:
Cebadores utilizados para empalme por extensión solapante por PCR (abreviadamente en lo sucesivo SOE-PCR, por la expresión inglesa Splicing by Overlap Extension by the Polymerase Chain Reaction) y para RT-PCR en la construcción y análisis de los FIPV recombinantes. Para su posición en el genoma de FIPV: véase la Fig. 18, en la que están indicados con flechas sus números y sentido. La numeración de los cebadores se refiere a la de la secuencia de pBRDl1.
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Fig. 23 = Anexo 1:
Secuencia de nucleótidos del plásmido pBRDl1. La secuencia comienza con el sitio XhoI (CTCGAG) seguido de la secuencia promotora de la polimerasa del fago T7 y la secuencia triple de G, después de la cual sigue la secuencia del cDNA del FIPV en 5'.
Fig. 24 = Anexo 2:
Secuencia de nucleótidos del plásmido pBRDI2. La secuencia comienza con el sitio XhoI (CTCGAG) seguido de la secuencia promotora de la polimerasa del fago T7 y la secuencia triple de G, después de la cual sigue la secuencia del cDNA del FIPV en 5'.
Fig. 25:
Supervivencia de ratones C57B1/6 infectados con recombinantes del MHV. A ratones de cuatro semanas se les inocularon intracranealmente diversas diluciones de virus recombinantes de tipo natural y con deleciones (n=5 por virus) y se monitorizó la supervivencia. Se muestran los datos de los ratones infectados con 2,5x10^{5} UFP. Mientras que los animales infectados con MHV-WT habían sucumbido todos 7 días después de la infección, todos los ratones inoculados con los virus mutantes por deleción sobrevivieron hasta 21días después de la infección.
Fig. 26A:
Células 17CI1 infectadas se marcaron metabólicamente con [^{33}P]ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se ha descrito (4, 10). Muestras del RNA citoplásmico total, purificadas utilizando reactivo Ultraspec (Biotecx), se desnaturalizaron con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% que contenía formaldehído y se visualizaron por fluorografía. Las diferentes especies de RNA se indican con los números correspondientes a la Tabla 4 (=Fig 42).
Fig. 26B:
Los ratones inoculados intraperitonealmente con 1x10^{6} DICT_{50} de cada recombinante de MHV se sacrifican 4 días después de la infección y se determinó la replicación viral en el hígado por análisis cuantitativos de placas.
Fig. 27:
Análisis por RT-PCR de los virus recombinantes MHV-EFLM y MHV-minFL. Se preparó cDNA utilizando el cebador 1475 por RT sobre el RNA viral; para cada virus se analizaron en paralelo dos virus derivados independientemente (designados por las extensiones A1A y B1A, A6F y B4A). Posteriormente, se realizó la PCR del cDNA resultante así como de los plásmidos utilizados para generar los virus (véase la Fig. 7A) con el par de cebadores 935 y 1474. Se muestra el análisis en gel de agarosa de los fragmentos de la PCR junto con un marcador de DNA.
Fig. 28:
Análisis por RT-PCR de los virus recombinantes MHV-EFLM y MHVminFL. Se preparó cDNA utilizando el cebador 1412 por RT del RNA viral; para cada virus se analizaron en paralelo dos virus derivados independientemente (denominados por las extensiones A2E y B4D). Posteriormente, se realizó la PCR sobre el cDNA resultante así como sobre los plásmidos utilizados para generar los virus (véase la Fig. 7A) con los pares de cebadores indicados en la parte inferior de la figura. Se muestra el análisis en gel de agarosa de los fragmentos de la PCR junto con un marcador de DNA.
Fig. 29-31:
Síntesis de RNA por los MHV recombinantes. En la parte superior se representan los genomas de los virus recombinantes, debajo se muestran sus perfiles de expresión del RNA observados. Las células 17CI1 infectadas se marcaron metabólicamente con [^{33}P]ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se ha descrito (4, 10). Muestras del RNA citoplásmico total, purificadas utilizando reactivo Ultraspec (Biotecx), se desnaturalizaron con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis en agarosa al 1% que contenía formaldehído y se visualizaron por fluorografía. Obsérvese que las especies de RNA subgenómicas en esta figura están designadas por su composición, en lugar de como RNA2 a RNA7, puesto que las designaciones numéricas serían ambiguas para los mutantes.
Fig. 29: MHV-WT, MHV-ERLM y MHV-EFLM.
Fig. 30: MHV-EFLM y MHV-minFL.
Fig. 31: MHV-MRLN, MHV-ERLM, MHV-2aRLS, MHV-MSmNRL y MHV-MSmN
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Fig. 32:
Replicación in vitro de los virus recombinantes que llevan genes extraños. Después de infección a una alta m.o.i. de las células LR7 con virus (arriba: MHV-MRLN, MHV-ERLM, MHV-2aRLS; centro: MHV-EFLM, MHV-minFL; abajo, MHV-ERLM, MHV-MSm-NRL) se tomaron muestras de cada medio de cultivo 9 horas después de la infección y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
Fig. 33:
Expresión de la luciferasa por virus recombinantes. Se determinó la expresión intracelular de luciferasa de luciérnaga y renilla de diversos virus recombinantes siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega) 9 horas después de la infección. Arriba: MHV-EFLM y MHV-minFL; abajo: MHVERLM y MHV-MSmNRL.
Fig. 34:
Expresión in vivo de la luciferasa de luciérnaga. En el experimento se utilizaron ratones BALB/c hembras, negativos al MHV, de ocho semanas. Se inocularon los ratones intranasalmente con MHV-EFLM. Se utilizaron cuatro animales por dosis (10^{6} DICT_{50}). Se sacrificaron los ratones y se extrajeron los hígados y cerebros 4 días después de la infección. Los órganos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en reactivo para lisis de cultivos celulares provisto del sistema de valoración de luciferasa (Promega). Se midió la actividad de la FL siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500).
Fig. 35:
Tasas de supervivencia después de la inoculación de gatos con varios mutantes por deleciones: FIPW 79-1146; r-wt-FIPV; FIPV\Delta3abc ; FIPV\Delta7a; y FIPV\Delta3abc+7ab (100 UFP).
Fig. 36:
Los títulos del anticuerpo que neutraliza el FIPV aumentan en diferentes momentos después de la infección de gatos con variantes por deleción del FIPV.
Fig. 37:
Tasas de supervivencia después de la prueba de virulencia de gatos con FIPV 79-1146 (100 UFP). Gatos (N=4) no vacunados previamente (\ding{110}); gatos (N=5) vacunados previamente con FIPV\Delta3abc (+); gatos (N=5) vacunados previamente con FIPV\Delta7ab (\ding{115}); y gatos (N=5) vacunados previamente con FIPV\Delta3abc+7ab (\ding{116}).
Fig. 38:
Curvas de crecimiento en una etapa de los virus FIPV recombinantes que llevan genes extraños. Después de infección a alta-m.o.i. de las células de FCWF con virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en diferentes momentos y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras. Recombinante nº 1 (\ding{116}) y recombinante nº 9 (\ding{108}).
Fig. 39:
Expresión de la luciferasa por virus recombinantes. Células de FCWF se infectaron con virus que expresan la luciferasa de renilla (nº 1 \ding{116}; y nº 9 \ding{108}) y con wt-rFIPV (\ding{110}) y se monitorizó en el tiempo la actividad de luciferasa generada en las células.
Fig. 40:
Curvas de crecimiento en una etapa de los virus FIPV recombinantes con deleción de genes no esenciales. Después de infección a una alta m.o.i. de las células de FCWF con virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en diferentes momentos y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
Fig. 41 = Tabla 3:
Cuantificaciones de la síntesis de RNA por MHV recombinantes que llevan deleciones de genes no esenciales.
Fig. 42 = Tabla 4:
Cuantificaciones de la síntesis de RNA por MHV recombinantes con genomas transpuestos.
Fig. 43 = Tabla 5:
Tabla de puntuación de los signos clínicos después de la vacunación y la prueba de virulencia.
Fig. 44 = Tabla 6:
Puntuación clínica total después de una vacunación inicial con diferentes mutantes del FIPV79-1146.
Fig. 45 = Tabla 7:
Puntuación clínica total después de la prueba de virulencia con FIPV79-1146.
Fig. 46A:
Replicación del virus recombinante que lleva 2 genes extraños. Después de infección a una alta m.o.i. de las células LR7 con virus (MHV-RLFL, MHV-2aRLS, y MHV-EFLM) se tomaron muestras de cada medio de cultivo 9 horas después de la infección y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.
Fig. 46B:
Expresión de luciferasa por virus recombinantes. Se determinó la expresión intracelular de luciferasa de luciérnaga y de renilla de varios virus recombinantes siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega) 9 horas después de la infección (MHV-RLFL, MHV-2aRLS y MHV-EFLM).
Datos experimentales relacionados con la patente:
I. Virus de la hepatitis del ratón (MHV), cepa A59 (MHV-A59)
1. Generación de virus atenuados vivos.
a.
Construcción de MHV recombinantes que carecen de genes.
b.
Confirmación de los genotipos recombinantes.
c.
Síntesis de RNA por mutantes por deleción del MHV.
d.
Fenotipo del crecimiento de los cultivos de tejidos.
e.
Virulencia de los virus recombinantes en ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Generación de virus recombinantes con el orden génico transpuesto.
a.
Construcción de virus recombinantes con el orden génico transpuesto.
b.
Síntesis de RNA por mutantes del MHV con el orden de genes transpuesto.
c.
Fenotipo del crecimiento de los cultivos de tejidos.
d.
Replicación de los virus recombinantes en ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Generación de virus recombinantes que expresan genes extraños.
a.
Construcción de virus recombinantes que llevan genes indicadores.
b.
Síntesis de RNA por virus recombinantes.
c.
Replicación de virus que expresan luciferasa de renilla o de luciérnaga.
d.
Expresión de luciferasa de renilla y de luciérnaga en un cultivo celular.
e.
Mantenimiento de genes extraños durante pases virales.
f.
Expresión de luciferasa de luciérnaga en ratones.
f.
Generación del MHV que expresa dos genes extraños a partir de un genoma.
h.
Generación del MHV que expresa un gen espícula-GFP quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
4. Inhibición de la infección y de la fusión celular por un péptido derivado de la proteína de la espícula.
\vskip1.000000\baselineskip
II. Virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV), cepa 79-1146
1. Generación de un coronavirus felino que crece en células de múridos (abreviadamente en los sucesivo mFIPV por la expresión inglesa murine Feline Infectious Peritonitis Virus)
a.
Construcción de un vector sintético de transcripción de RNA
b.
Generación de mFIPV por recombinación de RNA
c.
Análisis de proteínas del mFIPV
d.
Características del crecimiento del mFIPV
\vskip1.000000\baselineskip
2. Generación de una vacuna viva y atenuada de FIPV por deleción de genes
a.
Construcción de vectores de transcripción sintéticos de RNA
b.
Generaciones de FIPV recombinantes que carecen de genes
c.
Análisis genético de FIPV recombinantes que carecen de genes
d.
Características de crecimiento de FIPV recombinantes que carecen de genes
e.
Virulencia de virus recombinantes en gatos
f.
Respuesta inmune inducida por virus recombinantes
g.
Los virus FIPV con deleciones sirven como vacunas vivas atenuadas.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Inserción y expresión de genes extraños
a.
Construcción de virus recombinantes que llevan genes indicadores
b.
Crecimiento en una etapa de los virus
c.
Expresión de luciferasa de renilla
\vskip1.000000\baselineskip
4. Generación de vacunas multivalentes basadas en el FIPV
a.
Construcción de una vacuna multivalente del virus de la leucemia felina (abreviadamente en lo sucesivo FeLV por la expresión Feline Leukemia Virus) basada en un vector del FIPV
b.
Construcción de una vacuna multivalente del virus de la inmunodeficiencia felina (abreviadamente en lo sucesivo FIV por la expresión inglesa Feline Immunodeficiency Virus) basada en un vector del FIPV
c.
Construcción de una vacuna multivalente del calicivirus felino (abreviadamente en lo sucesivo FCV por la expresión inglesa Feline Calicivirus) basada en un vector del FIPV
d.
Construcción de una vacuna multivalente del virus de la panleucopenia felina (abreviadamente en lo sucesivo FPV por la expresión inglesa Feline Panleucopenia Virus) basada en un vector del FIPV
e.
Construcción de una vacuna multivalente del herpesvirus felino (abreviadamente en lo sucesivo FHV por la expresión inglesa Feline Herpes Virus) basada en un vector del FIPV
f.
Construcción de una vacuna multivalente del serotipo I y II del FIPV basada en un vector del serotipo II del FIPV
\vskip1.000000\baselineskip
5. Generación de virus recombinantes con el orden génico transpuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Generación de vacunas basada en el FIPV contra agentes patógenos caninos.
a.
Generación de una vacuna basada en el FIPV contra el moquillo canino.
b.
Generación de una vacuna basada en el FIPV contra la parvovirosis canina.
c.
Generación de una vacuna basada en el FIPV contra la hepatitis canina infecciosa.
d.
Generación de una vacuna basada en el FIPV contra la enfermedad hemorrágica de los cachorros.
\vskip1.000000\baselineskip
III. Virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV)
1. Generación de una vacuna viva atenuada contra el TGEV.
2. Generación de vacunas multivalentes basadas en el TGEV.
a.
Construcción de una vacuna multivalente contra el parvovirus porcino (abreviadamente en los sucesivo PPV por la expresión inglesa Porcine Parvovirus) basada en un vector del TGEV
b.
Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la gripe porcina basada en un vector del TGEV
c.
Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la fiebre porcina africana basada en un vector del TGEV
d.
Construcción de una vacuna multivalente contra el circovirus porcino tipo 2 basada en un vector del TGEV
e.
Construcción de una vacuna multivalente contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino basada en un vector del TGEV
\vskip1.000000\baselineskip
3. Generación de virus recombinantes con el orden génico transpuesto.
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IV. Virus de la bronquitis infecciosa aviar (abreviadamente en los sucesivo IBV por la expresión inglesa Infectious Bronchitis Virus)
1. Generación de una vacuna viva basada en IBV atenuado.
2. Generación de vacunas multivalentes basadas en IBV.
aI.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra más de un serotipo de IBV
aII.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la enfermedad de Newcastle
b.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la gripe aviar
c.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector de IBV que protege contra la enfermedad causada por el virus de la anemia del pollo (abreviadamente en lo sucesivo CAV por la expresión inglesa Chicken Anemia Virus).
d.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la reovirosis aviar.
e.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la bursitis infecciosa.
f.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la enfermedad de Marek.
g.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la laringotraqueitis infecciosa.
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3. Generación de virus recombinantes con el orden génico transpuesto
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V. Coronavirus humano (abreviadamente en los sucesivo HCoV por la expresión inglesa Human Coronavirus) cepa 229E (HCoV-229E)
1. Generación de una vacuna viva basada en HCoV-229E atenuado.
2. Generación de una vacuna viva atenuada contra la cepa OC43 del HCoV.
3. Generación de vacunas multivalentes basadas en el HCoV.
a.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del HCoV que protege contra el virus sincitial respiratorio (abreviadamente en lo sucesivo RSV por la expresión inglesa Respiratory Syncytial Virus),
b.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del HCoV que protege contra rotavirus.
c.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del HCoV que protege contra los virus similares al Norwalk.
d.
Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del HCoV que protege contra el virus de la gripe.
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4. Generación de virus recombinantes con el orden génico transpuesto.
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I. Virus de la hepatitis del ratón (MHV), cepa A59 (MHV-A59) I.1. Generación virus vivos y atenuados
Objetivo general: Establecer si es tolerada la deleción en el genoma coronaviral (es decir, MHV-A59) de genes o agrupaciones de genes que no pertenecen a los genes que especifican las funciones de polimerasa (ORF1a/1b) o las proteínas estructurales N, M, E y S, y proporciona virus viables incluso si estas secuencias de genes se eliminan totalmente; establecer si dichas deleciones tienen un efecto atenuante sobre el virus cuando se inocula en ratones.
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I.1.a. Construcción de MHV recombinantes que carecen de genes
Objetivo específico: Generar mutantes por deleción del MHV-A59 que carece de los genes 2a + HE (MHV-\Box\Delta2aHE), genes 4a + 4b + 5a (MHV-\Box\Delta45a) y genes 2a + HE + 4a + 4b + 5a (MHV-min).
Propuesta: Recombinación del RNA dirigido a diana (3, 9, 10) utilizando fMHV, el derivado del MHV-A59 que infecta células de FCWF y no células de múridos (LR7) (7) y RNA donadores sintéticos que llevan las deleciones deseadas (Fig. 1A, arriba).
Método: Se construyeron vectores de transcripción para la producción de los RNA donadores sintéticos a partir del plásmido pMH54 (7), que codifica un transcrito sintetizado hasta el extremo del DNA molde (en lo sucesivo dichos transcritos se expresan por la expresión inglesa run-off transcripts) que consiste en el extremo 5' del genoma MHV-A59 (467 nt) fusionado al codón 28 del gen HE y que llega hasta el extremo 3' del genoma (Fig. 1). Se utilizó el plásmido pMH54 para reconstruir el WT-MHV recombinante, un derivado del fMHV que infecta de nuevo las células de múridos. El vector de transcripción pXH\Box\Delta45a carece de los genes ORF 4a, 4b y 5a. Para la construcción de este plásmido se obtuvo un producto de PCR a partir del plásmido pB59 (2) utilizando el cebador 1089 (5'-ACCTGCAG
GACTAATCTAAACTTT ATTCTTTTTAGGGCCACGC-3'), que codifica un sito de restricción PstI/Sse83871, una secuencia intergénica (SGI) y que es complementario a la secuencia justo en dirección 5' del gen E o 5b, y el cebador 1092 (5'-CCTTAAGGAATTGAACTGC-3'), que es complementario al extremo 5' de la región que codifica la proteína M. El producto de PCR se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante, obteniendo pXH0803. El producto de PCR se escindió posteriormente con PstI y EcoRV y se clonó en pMH54 tratado con Sse83871 and EcoRV, dando como resultado pXH\Box\Delta45a. El vector de transcripción pXH\Box\Delta2aHE carece de los genes ORF 2a y HE y contiene aproximadamente 1200 pb del extremo 3' del gen de polimerasa fusionado al gen S. Para construir este plásmido se obtuvo un producto de PCR empalmando por PCR con extensión solapante. Se obtuvo un producto de PCR a partir del plásmido p96 (1) utilizando el cebador 1128 (5'-ACGGTCCGACTGCGCGCTTGAA
CACGTTG-3'), que codifica un sitio de restricción RsrII y es complementario a la región de 1200 pb en dirección 5' del codón de parada ORF1b, y el cebador 1130 (5'-CATGCAAGCTTTATTTGACATTTACTA GGCT-3'), que es complementario al extremo 3' de la región codificadora de la polimerasa y la región de la secuencia intergénica (SGI) en dirección 5' del gen S. El otro producto de PCR se obtuvo a partir de pMH54 utilizando el cebador 1129 (5'-GT
CAAATAAAGCTTGCATGAGGCATAATCTAAAC-3'), que es complementario al cebador 1130, y al cebador 1127 (5'-CCAGTAAGCAATAATGTGG-3'), que es complementario al extremo 5' del gen S. Los productos de PCR se purificaron y mezclaron y a continuación se amplificaron con los cebadores 1128 y 1127. El producto de PCR obtenido en la segunda serie de PCR se clonó en pGEM-T Easy, obteniendo pXH1802. El producto de PCR se escindió con RsrII y AvrII y se clonó en pMH54 tratado con las mismas enzimas, dando como resultado pXH\Box\Delta2aHE. El vector de transcripción pXHmin tiene el extremo 3' del ORF-1b fusionado al gen S y la deleción de ORF4a, 4b y 5a. Este vector se construyó clonando el fragmento escindido con PstI y EcoRV del pXH0803 en pXH-\Box2aHE tratado con Sse83871 y EcoRV. La composición de todos los segmentos generados por PCR fue confirmada por secuenciación de DNA.
Para generar los virus mutantes por deleción, se transcribieron los RNA donadores a partir de los plásmidos derivados de pMH54 (linealizados con PacI) y se transfectaron por electroporación en células de FCWF que habían sido infectadas con fMHV. Estas células infectadas y transfectadas se extendieron a continuación sobre una monocapa de células LR7 (7) de ratón. Después de 24 horas de incubación a 37ºC, se recogieron los virus de la progenie retirando el líquido sobrenadante del cultivo celular y se seleccionaron los recombinantes candidatos por dos rondas de purificaciones en placa sobre células LR7.
Resultado: Con cada uno de los RNA donadores sintéticos utilizados, se obtuvieron placas transparentes.
Conclusión: Se han obtenido virus recombinantes que habían recuperado la capacidad de crecer en células de múridos.
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I.1.b. Confirmación de los genotipos recombinantes
Objetivo: Confirmar por RT-PCR la organización genética de los virus recombinantes obtenidos.
Método y Resultados: Sobre células LR7 se produjeron virus recombinantes clonados, uno de cada experimento de recombinación, se aisló el RNA viral y se realizó una RT-PCR utilizando métodos estándares sobre el RNA genómico como se muestra en la Fig. 2. Para confirmar la deleción de los genes ORF 4 y 5a, se realizó la etapa de RT con el cebador 1092 (5'-CCTTAAGGAATTGAACTGC-3'), que es complementario al extremo 5' del gen M, mientras que la PCR se realizó con el cebador 1261 (5'-GCTGCTTACTCCTATCATAC-3') y el cebador 990 (5'-CCTGATT
TATCTCTCGATTTC-3'), que era complementario con el extremo 3' de los genes E y S, respectivamente. En el caso del MHV-WT recombinante, se observó un producto de RT-PCR correspondiente en tamaño al de 1328 pb esperado (Fig. 2, arriba). Como se esperaba, se observó un producto de PCR de la misma longitud para MHV-\Box\Delta2aHE. En contraste, se detectaron tanto para MHV-\Box\Delta45a como para MHV-min productos de RT-PCR mucho menores. El tamaño menor de los productos de RT-PCR correspondía a la deleción de 736 pb. De modo similar se analizó la deleción de los ORF 2a y HE. La etapa RT se realizó con el cebador 1127 (5'-CCAGTAAGCAATAATGTGG-3'), que es complementario del extremo 5' del gen S. La PCR se realizó con el cebador 1173 (5'-GACTTAGTCCTCTCCTTGA-3') y el cebador 1260 (5'-CTTCAACGGTCTCAGTGC-3'), que es complementario con el extremo 3' del gen 1b y con el extremo 5' del gen S, respectivamente. Tanto para MHV-WT como para MHV-DA45a se detectaron los productos de PCR, que eran mucho mayores que los productos de PCR detectados para MHV-\Delta2aHE y MHV-min (Fig. 2, abajo). La diferencia de tamaño correspondía a la deleción de 2164 pb. Finalmente, los empalmes recién generados, presentes en los genomas de los virus mutantes por deleción (Fig. 1A [triángulos] y 1B [secuencia]), se analizaron por secuenciación de los productos de RT-PCR. Para este fin se clonaron los productos de PCR en el vector pGEM-T Easy (Promega). Las secuencias obtenidas estaban en perfecto acuerdo con las predicciones.
Conclusión: Los mutantes virales construidos tenían la deleción genética deseada.
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I.1.c. Síntesis de RNA por mutantes por deleción del MHV
Objetivo: Confirmar los perfiles de los RNA sintetizados en células infectadas por los virus mutantes.
Método: Células 17Cl1 se marcaron metabólicamente con [^{33}P]ortofosfato en presencia de actinomicina D como se ha descrito esencialmente (4, 10). Muestras del RNA citoplásmico total, purificado utilizando reactivo Ultraspec (Biotecx), se desnaturalizaron con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis en agarosa al 1% que contenía formaldehído y se visualizaron por fluorografía (Fig. 3; obsérvese que las especies subgenómicas de RNA en esta figura se designan por su composición, en lugar de como RNA2 a RNA7, puesto que las designaciones numéricas serían ambiguas para los mutantes por deleción).
Resultado: Para el MHV-WT recombinante, el perfil de RNA y las cantidades molares relativas de las seis especies subgenómicas (sg) de RNA y el RNA genómico (g) eran muy similares a los indicados anteriormente para MHV (10)(4)(5)(8), con una excepción notable. El sgRNA de 4-5a/E-M-N, que se denomina generalmente RNA4, era mucho más abundante que el observado anteriormente para esta especie en MHV (10)(4)(5)(8) de tipo natural. Esto era debido presumiblemente a los tres cambios de nucleótidos en las posiciones 13, 15 y 18 en dirección 5' de la señal reguladora de la transcripción de consenso, (5'AAUCUAAAC3') que precede al gen 4 (Fig. 1) que se introdujeron en el vector de transcripción pMH54 para crear el sitio Sse83871 en la dirección 3' del gen S (7). Para los mutantes por deleción, todos los sgRNA variantes tenían movilidades que correspondían a sus tamaños predichos (Fig. 3 y Tabla 3) y no se observaron especies extra prominentes. Las cantidades molares relativas de las especies sgRNA mutantes eran bastante similares a las de sus equivalentes de tipo natural que se originan a partir de las señales reguladoras de la transcripción correspondientes.
\newpage
Conclusión: Los resultados confirman los genotipos de los virus recombinantes y demuestran sus fenotipos esperados a nivel de RNA.
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I.1.d. Fenotipo del crecimiento del cultivo de tejidos
Objetivo: Comparar los fenotipos de crecimiento in vitro.
Método y Resultados: Monocapas de células LR7 confluentes crecidas en placas de 35 mm se infectaron con cada virus recombinante (8 UFP/célula) y se determinó la infectividad viral en medios de cultivos en diferentes momentos después de la infección (p.i.) por titulación en células LR7. Se calcularon y representaron gráficamente los valores de la DICT_{50} (dosis infecciosa del 50% en cultivos de tejidos) (Fig. 4). Los virus recombinantes no diferían apreciablemente en cuanto a la inducción de amplios efectos sincitiales o citopáticos o a su tamaño de placa. Sin embargo, MHV-\Box\Delta45a y MHV-min diferían de MHV-WT y MHV-\Box\Delta2aHE en su cinética de crecimiento en una etapa (Fig. 4). Los dos virus presentaban aproximadamente títulos 10 veces menores en todos los momentos.
Conclusión: Todos los virus con deleción se multiplican bien in vitro aunque la deleción de los genes 4 y 5a tenía un efecto ligeramente negativo.
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I.1.e. Virulencia de los virus recombinantes en ratones
Objetivo: Establecer si las deleciones genéticas afectan a la virulencia viral.
Método y Resultados: Los virus recombinantes se caracterizaron en su hospedante natural, el ratón. Como primera etapa, los autores de la presente invención determinaron la virulencia de los virus recombinantes. Se realizó una valoración de la DL_{50} (dosis letal del 50%) inoculando intracranealmente MHV-negativos en ratones C57BI/6 con cuatro diluciones en 10 series (5 x 10^{5} - 5 x 10^{2}) de virus recombinantes. Los virus se diluyeron utilizando PBS que contenía seroalbúmina bovina al 0,75%. Se utilizó un volumen de 25 \mul para inyección en el hemisferio cerebral izquierdo. Se analizaron cinco animales por dilución por virus. Se calcularon los valores de la DL_{50} por el método de Reed-Muench basado en la muerte a los 21 días después de la infección. Evidentemente, los virus mutantes por deleción estaban atenuados en comparación con el MHV-WT recombinante. Mientras que el virus MHV-WT tenía una DL_{50} de 1,8 x 10^{4} no se podía obtener ninguna DL_{50} de los mutantes por deleciones. Aunque los animales inoculados con las dosis mayores mostraban algunos signos de enfermedad, ninguno de los animales infectados con cualquiera de los virus mutantes por deleción murió hasta la aportación de 50.000 UFP/ratón. Esto implica que la DL_{50} para estos virus supera un valor de 50.000 y puede muy bien superar los 100.000.
La Figura 25 ilustra la cinética de mortalidad de ratones infectados con la mayor dosis de inoculación, 2,5 x 10^{5} unidades formadoras de placas (UFP), de los virus WT y por deleción. Mientras que todos los animales inoculados con el virus de tipo natural murieron siete días después de la infección, los virus con deleción estaban muy atenuados, no causando la muerte y provocando síntomas clínicos menos graves. A pesar de no observar ninguna mortalidad, todos los ratones infectados con los virus \Box45a y \Box2aHE mostraron signos clínicos de postura encorvada, aspecto desaliñado y marcha de pato durante la primera semana después de la infección; estos síntomas eran menos graves y se observaron en menos ratones infectados con MHV-min.
Conclusión: Los virus con deleciones de las secuencias que especifican los genes 2a + HE o los genes 4a + 4b + 5a o de la combinación de todos estos genes presentan un fenotipo significativamente atenuado en ratones. En otras palabras, los genes no esenciales de coronavirus no son cruciales para el crecimiento in vitro pero determinan la virulencia viral. La atenuación adquirida por su deleción proporciona así excelentes vacunas virales y vectores terapéuticos.
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1.2. Generación de virus recombinantes con el orden génico transpuesto
Objetivo general: Establecer si el orden invariable de los genes que especifican las funciones de polimerasa (ORF1a/1b) y las proteínas estructurales S, E, M y N en el genoma coronaviral es esencial para la viabilidad de estos virus o si tolera la transposición de este orden.
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I.2.a. Construcción de virus recombinantes con el orden génico transpuesto
Objetivo específico: Generar mutantes de MHV-A59 en los que se cambian las posiciones relativas de los genes de las proteínas estructurales en el genoma de MHV-A59 moviendo el gen M y/o E.
Propuesta: Recombinación del RNA dirigida a diana utilizando RNA de fMHV y de donadores sintéticos que llevan las transposiciones deseadas (Fig. 5, arriba).
\newpage
Método: Los vectores de transcripción para la producción de RNA donador para una recombinación dirigida se construyeron a partir de los plásmidos pMH54 y pXH\Box2aHE (antes descrito). Con el fin de generar el vector de transcripción pXHSM45N (Fig. 5, parte inferior izquierda), se generó un producto de PCR empalmando una extensión solapante (SOE)-PCR que contenía el extremo 3' del gen M y el extremo 5' del gen N y en el que se introdujo un sitio de restricción EcoRV entre el gen M y la secuencia intergénica (SGI) justo en dirección 5' del gen N. Para generar este fragmento de PCR, se utilizaron el cebador exterior 1C (5'-GTGTATAGATATGAA AGGTACCGTG-3'), correspondiente a la región del gen M que contiene el sitio único KpnI y el cebador exterior 1097 (5'-CGAACCA
GATCGGCTAGCAG-3'), correspondiente a la región del gen N que contiene el sitio único NheI. Como cebadores interiores se usaron el cebador 1095 (5'-AGATTAGATATCTTAGGTTCTCAACAATGCGG-3') y el cebador 1096 (5'-GAACCTAAGATATCTAATCTAAACTTTAAGGATG-3'). Corresponden a la secuencia entre el gen M y el gen N e introducen el sitio de restricción EcoRV. El producto de PCR resultante se clonó en pGEM-T Easy (Promega) obteniéndose el vector pXH0302. Como etapa siguiente en la construcción de pXHSM45N, se trató pMH54 con las enzimas de restricción Sse83871 y EcoRV y el fragmento resultante se clonó en el sitio EcoRV de pXH0302 después de ser hecho romo por tratamiento con DNA polimerasa de T4, obteniéndose el vector pXH0902. Después de escisión del fragmento Sse83871-EcoRV de pMH54, se hizo romo también el vector remanente por tratamiento con DNA polimerasa de T4 y se volvió a ligar dando como resultado el plásmido pXH1401. Finalmente, el plásmido pXH0902 se trató con las enzimas de restricción NheI y BssHII y el fragmento resultante se clonó en pXH1401 tratado con las mismas enzimas, obteniéndose pXHSM45N.
Para la construcción de pXHMSmN, primeramente se eliminaron de pMH54 los marcos de lectura abiertos (OFM) 4, 5 y M por restricción de este vector con las enzimas Sse8387I y BssHII, seguido por tratamiento con DNA-polimerasa de T4 y religación del vector remanente, lo que proporcionó pXH\Box45M5'. A continuación, el fragmento resultante del tratamiento de pXH0302 con las enzimas NheI y BssHII se clonó en pMH54 tratado con las mismas enzimas, dando como resultado pXHMeN. Subsiguientemente, el fragmento obtenido después de la restricción de pXHMeN con EcoRV se clonó en pXH1802 (descrito antes), que se digirió con HindIII y trató con fragmento de Klenow de DNA-polimerasa I, proporcionando pXH0305B. El fragmento obtenido por restricción de pMH54 con las enzimas MIuI y EcoRV se clonó en pB59 (2) tratado con las mismas enzimas, lo que dio como resultado el vector pXH2801. A continuación, el fragmento resultante del tratamiento de pXH2801 con las enzimas de restricción KpnI y PstI se trató con DNA-polimerasa de T4 y se clonó en pXH1802 tratado con la enzima de restricción HindIII y con el fragmento de Klenow de DNA-polimerasa I, proporcionando pXH0806. Subsiguientemente, el fragmento obtenido por digestión de pXH0305B con SpeI y AlfII se clonó en pXH0806 tratado con las mismas enzimas, dando como resultado pXH1506. Finalmente, se obtuvo pXHSmN clonando el fragmento resultante de restricción de pXH1506 con RsrII y AvrII en pXH\Box45M5' tratado con las mismas enzimas.
Para la construcción del vector de transcripción pXH1bMS, el vector pXHMeN se sometió a restricción con EcoRV. El fragmento resultante se eliminó y el vector se religó proporcionando pXH\BoxM. A continuación, el fragmento obtenido por digestión de pXH0305B con RsrII y AvII se clonó en pXH\BoxM tratado con las mismas enzimas, proporcionando pXH1bMS.
Todas las construcciones fueron confirmadas por análisis restricción y/o de secuencias. Se representan esquemáticamente en la Fig. 5 (parte izquierda). Todos los nuevos empalmes generados, incluyendo la introducción del sitio Sse83871 en la región 3' del gen S en pMH54 (7), están indicados con cabezas de flechas, mientras que sus secuencias se muestran en la Tabla 1. Los virus recombinantes se generaron por recombinación RNA-RNA entre los transcritos run-off del vector de transcripción y el genoma del fMHV como se describe antes. Después de 2 rondas de purificación en placas sobre células LR7 los virus se analizaron por PCR con transcriptasa inversa sobre el RNA genómico y se encontró que contenían los genomas con la organización esperada.
Conclusión: El orden estricto de los genes de los coronavirus no es un requisito previo esencial para la viabilidad.
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I.2.b. Síntesis de RNA por mutantes del virus de la hepatitis del ratón (MHV) con el orden de los genes transpuestos
Objetivo general: Confirmar los modelos de los RNA sintetizados en células infectadas con los virus mutantes.
Método: Células 17Cl1 infectadas se marcaron metabólicamente con [^{33}P]ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se ha descrito (4, 10). Se desnaturalizaron con formaldehído y formamida muestras del RNA citoplásmico, purificado usando el reactivo Ultraspec (Biotecx), se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% que contenía formaldehído, y se visualizaron por fluorografía (Fig. 26A).
Resultado: Los coronavirus expresan su genoma mediante la generación de un conjunto co-anidado de RNA subgenómicos 3'-terminales. Se predice por tanto que los virus recombinantes con una organización genómica transpuesta sinteticen modelos de RNA virales que son claramente distintos del virus precursor. Para el virus de tipo natural reconstruido (MHV-WT) y para MHV-\Box2aHE, los modelos de RNA y las cantidades de las especies de RNA genómico (g) y subgenómico (sg) parecían ser similares a las observadas previamente (Fig. 3). Adviértase que MHV-\Box2aHE -así como sus derivados MHV-MSmN y MHV-1bMS- no sintetizan las especies de RNA subgenómico que codifican la proteína 2a. Para los mutantes del MHV con los genomas transpuestos, todos los RNA subgenómicos variantes tenían movilidades que correspondían a sus tamaños predichos (Fig. 26A y Tabla 4), y no se observaron especies adicionales obvias. El MHV-SM45N creció muy deficientemente, y por tanto estaba marcado muy débilmente. Todos los RNA subgenómicos podían ser detectados excepto uno a partir del cual debía ser traducida la proteína M. La escasa abundancia de este RNA subgenómico, cuya razón es desconocida, es probable que sea la causa de un crecimiento deteriorado del virus. Globalmente, los modelos de RNA virales sintetizados por las células infectadas con los virus recombinantes reflejan bien los cambios realizados en la organización del genoma de los coronavirus.
Conclusión: Los resultados confirman los genotipos de los virus recombinantes y demuestran sus fenotipos esperados al nivel de los RNA.
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I.2.c. Fenotipo del crecimiento en cultivo de tejidos
Objetivo: Comparar los fenotipos por crecimiento in vitro de los virus mutantes.
Método y Resultados: Monocapas de células LR7 confluentes crecidas en placas de 35 mm se infectaron con cada uno de los virus recombinantes (8 UFP/célula) y se determinó la infectividad viral en medios de cultivo en diferentes tiempos después de la infección por titulación de las células LR7. Se calcularon y representaron gráficamente los valores de la DICT_{50} (dosis infecciosa del 50% en cultivos de tejidos) (Fig. 6). De este modo se analizaron todos los virus excepto el mutante MHV-SM45N. El título infeccioso de este último virus fue demasiado bajo (aproximadamente 1000 veces menor que el del WT-MHV recombinante) para construir una curva de crecimiento de una etapa. Aunque el MHV-1bMs parecía inducir sincitios algo más lentamente que el virus natural (WT) recombinante, todos los virus se replicaban aproximadamente en la misma extensión en la curva de crecimiento de una etapa.
Conclusión: Excepto el virus mutante MHV-SM45N, la transposición de genes no tuvo efectos acusados en sus características de crecimiento.
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I.2.d. Replicación de virus recombinantes en ratones
Objetivo: Establecer si los virus con el orden de los genes transpuestos son capaces de replicarse en ratones.
Método y Resultados: En el experimento se usaron ratones BALB/c hembras de ocho semanas, negativos al MHV. Los virus se diluyeron en PBS y se usó un volumen total de 100 \mul (10^{6} DICT_{50}) para la inyección en la cavidad peritoneal. Se inocularon cuatro animales por virus. 4 días después de la infección se sacrificaron los ratones y se les extirpó el hígado. Los hígados se colocaron en 1,5 ml de DMEM se pesaron y se congelaron, a -80ºC hasta que se titularon respecto a la cantidad de virus. Los títulos de los virus se determinaron por ensayos en placas con monocapas de células LR7 después de la homogenización de los órganos. La replicación del MHV-WT, MHV-\Box2aHE y MHV-MSmN se estudió en su hospedante natural, el ratón. Aunque la dosis letal del 50% del MHV-WT en ratones se determinó previamente a 2,7x10^{4} UPF, el MHV-\Box2aHE no fue suficientemente virulento para una determinación de la dosis letal del 50% (apartado I.1.e.). Por tanto, los inventores decidieron entonces analizar la replicación in vivo de los virus recombinantes. Ratones inoculados intraperitonealmente con 1x10^{6} DICT_{50} se sacrificaron el día 4 después de la infección y se determinó la replicación viral en el hígado. Los resultados se muestran en la Fig. 26B. El MHV-\Box2aHE y el MHV-MSmN se replicaron en el hígado en una extensión similar aunque mucho menor que la del MHV-WT. La deleción de los marcos de lectura abiertos 2a y HE generaron un virus recombinante (MHV-\Box2aHE) que estaba atenuado en el hospedante natural, como se muestra en el apartado I.1.e., mientras que la transposición adicional del orden de los genes del coronavirus (MHV-MSmN) no dio como resultado un fenotipo más atenuado en este ensayo.
Conclusión: Los virus con un orden de genes transpuesto, que carecen de la organización típica del genoma de los coronavirus, y los virus que carecen de los marcos de lectura abiertos 2a y HE son capaces de replicarse en su hospedante natural, el ratón.
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I.3. Generación de virus recombinantes que expresan genes extraños
Objetivo: Establecer si pueden insertarse genes extraños en posiciones diferentes en el genoma viral, bien como un gen adicional o bien reemplazando genes no esenciales delecionados o en combinación con un orden de genes transpuestos; establecer si se expresan estos genes y si se mantienen establemente durante el pase in vitro del virus.
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I.3.a. Construcción de virus recombinantes que llevan genes indicadores
Objetivo: Generar virus MHV-A59 con inserciones de genes extraños.
Método: Se construyeron varios virus que contenían un gen indicador extraño en diferentes posiciones de su genoma (véase la Fig. 7A). Se usaron dos genes indicadores, que codifican luciferasa de renilla (abreviadamente RL por la expresión inglesa Renilla Luciferase) y luciferasa de luciérnaga (abreviadamente FL por la expresión inglesa Firefly Luciferase). Para ambos genes, se construyó un plásmido en el cual el gen estaba precedido por la secuencia intergénica (en lo sucesivo abreviadamente SIG) del MHV. A partir de esta construcción el casete de expresión (gen más SIG) podía ser transferido a diferentes vectores de transcripción.
Como una primera etapa la SIG del MHV se clonó delante del gen RL. Para esto, el cebador, 1286 (5'-GGATAC
TAATCTAAACTTTAG-3') y el cebador 1287 (5'-CTAGCTAAAGTTTAGATTAGATATCCTGCA-3') se asociaron uno al otro y se clonaron en pRL-null (Promega) tratado con NheI y Pst1, dando como resultado pXH1909. Para la construcción del vector de transcripción que contiene el gen RL entre los genes 2a y S (pXH22aRLS) se siguieron las siguientes etapas. El vector p96 (1) se sometió a restricción con HindIII y MluI y el fragmento resultante se clonó en pXH 1802 (descrito antes) tratado con HindIII y BssHII, proporcionando pKH2103. A continuación el casete de expresión RL se eliminó del pXH1909 por restricción con EcoRV y XbaI, se trató con fragmento de Klenow de DNA-polimerasa I y se clonó en XH2103 digerido con HindIII y tratado con fragmento de Klenow, dando como resultado pXH2509A. Finalmente se construyó pXH22aRLS clonando el fragmento resultante de la digestión de pXH2509A con RsrII y AvrII en pMH54 tratado con las mismas enzimas.
Para la construcción de pXH2ERLM se clonó, en pMH54 digerido con EcoRV, el mismo casete de expresión que el que se usó para preparar pXH2509A.
Este mismo casete de expresión también se clonó en pXHMeN (descrito antes) tratado con EcoRV, proporcionando pXH2ERLN. Subsiguientemente, se construyó pXH2MRLN clonando el fragmento resultante de la restricción de pXHMeN con EcoRV en pXH2ERLN tratado con la misma enzima. El pXHMSmNRL se construyó clonando el casete de expresión de renilla en pXHMSmN (descrito antes) tratado con EcoRV.
Para la construcción de pXHEFLM, se clonó primeramente el gen FL detrás de la misma SIG que la usada para el casete de expresión de RL. Para este fin se eliminó el gen de la luciferasa de pSP-Luc+ (Promega) por restricción con AvrII y XbaI y se clonó en pXH1909 tratado con NheI y XbaI, proporcionando pXH2711. Subsiguientemente, se cortó de pXH2711 el casete de expresión de FL por restricción con EcoRV y XbaI, se trató con fragmento de Klenow de DNA-polimerasa I, y se clonó en pMH54 sometido a restricción por EcoRV, dando como resultado pXHEFLM.
El plásmido pXHmirFL se construyó clonando el casete de expresión de FL en pXHmin (descrito antes) digerido con EcoRV. Este plásmido carece de los marcos de lectura abiertos 2a/HE/4a/4b/5a y contiene el gen FL entre los genes E y M.
Después de la confirmación de todas las construcciones, por análisis de restricción y secuencias se generaron virus por recombinación de RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del fMHV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Los resultados de los virus recombinantes que contienen el gen RL se muestran en las Fig. 7B y 27. Para confirmar la inserción de este gen se realizó una etapa con transcriptasa inversa en el RNA genómico con el cebador 1412 (5'-CTGCGGACCAGTTATCATC-3'), que es complementario al extremo 5' del gen RL. Subsiguientemente, se realizó una PCR con el cebador 1091 (5'-GTTACAAACCTGAATCTCATCTTAATTCTGGTCG-3') y el cebador 1413 (5'-CATCCGTTTCCTTTGTTCTGG-3') para MHV-ERLM y MHV-MRLN o con el cebador 1173 (5'-GACTTAGTCCTCTCCTTGATTG-3') y el cebador 1413 para MHV-2aRLS. El cebador 1091 y el cebador 1173 corresponden con el extremo 3' del gen 4b y el gen 1b, respectivamente, mientras que el cebador 1413 corresponde con el extremo 5' del gen RL. Como controles positivos, se tomaron juntos los vectores de construcción apropiados. En todos los casos, se obtuvieron fragmentos de PCR del mismo tamaño como controles positivos, mientras que el control de agua fue negativo. Los tamaños de fragmentos observados (y predichos) fueron de aproximadamente 1.000 pb para MHV-2aRLS, aproximadamente 670 pb para MHV-ERLM, y aproximadamente 1.300 pb para MHV-MRLN (7B). Para el MHV-MSmNRL se realizó una PCR con el cebador 1091 y el cebador 141.3 y con el cebador 1173 y el cebador 1413. Como controles positivos, se tomaron juntos los vectores de transcripción apropiados. En todos los casos, se obtuvieron fragmentos de PCR del mismo tamaño que los controles positivos. Los tamaños de fragmentos observados (y predichos) eran aproximadamente 670 pb para la reacción de PCR con los cebadores 1091 y 1413, y aproximadamente 1.200 pb para la reacción de PCR con los cebadores 1173 y 1413 (7B) (adviértase que en las Fig. 7B y 27 para cada tipo de virus 2 se analizaron e incluyeron los clones virales independientemente obtenidos). Los resultados confirmaron la inserción del gen RL en el genoma de MHV en la posición correcta.
Los resultados de los virus recombinantes que contienen el gen FL se muestran en la Fig. 28. Para confirmar la inserción de este gen se realizó una etapa con transcriptasa inversa RT en RNA genómico con el cebador 1475 (5'-GCCTAATGCAGTTGCTCTCC-3'), que es complementario del extremo 5' del gen FL. Subsiguientemente, se realizó una PCR con el cebador 935 (5'-GTTTTAGCACAGGGTGTGGCTCATG-3'), que corresponde con el extremo 3' del gen S, y el cebador 1474 (5'-CCATCTTCCAGCGGATAG-3'), que corresponde con el extremo 5' del gen FL. Como controles positivos, se tomaron juntos los vectores de transcripción apropiados. En todos los casos, los fragmentos de PCR se obtuvieron del mismo tamaño que los controles positivos, mientras que el control de agua fue negativo. Los tamaños de fragmentos observados (y previstos) fueron aproximadamente 1.200 pb para MHV-EFLM, y aproximadamente 500 pb para MHV-ininFL (adviértase que en la Fig. 28 para cada tipo de virus 2 se analizaron e incluyeron los clones virales independientemente obtenidos).
Conclusión: La inserción de módulos genéticos en el genoma coronaviral es tolerada en todas las posiciones ensayadas; todos los virus intentados fueron viables.
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I.3.b. Síntesis de RNA por virus recombinantes
Objetivo: Confirmar los modelos de los RNA sintetizados en células infectadas por los virus mutantes.
Método: Células 17C11 infectadas fueron marcadas metabólicamente con [^{33}P]ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se ha descrito (4,10). Muestras de RNA citoplásmico total, purificadas usando el reactivo Ultraspec (Biotecx), se desnaturalizaron con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% que contenía formaldehído y se visualizaron por fluorografía (Fig. 29-31; adviértase que las especies de RNA subgenómicas en esta figura están designadas por su composición, en lugar de cómo RNA2 hasta RNA7, puesto que las designaciones numéricas serían ambiguas para los mutantes).
Resultado: Para todos los mutantes del MHV con los genes de la luciferasa, todas las variantes de los RNA subgenómicos tenían movilidades que correspondían a sus tamaños predichos (Fig. 29-31). Para los virus que contenían el gen de la renilla-luciferasa no se observaron especies obvias adicionales. Para los virus que contenían el gen de la luciferasa de luciérnaga se observaron dos especies de RNA adicionales, que correspondían en tamaño con la transcripción de RNA subgenómicos procedentes de las secuencias del gen de la luciferasa de luciérnaga que son similares a las SIG del MHV. Globalmente, los modelos de los RNA virales sintetizados por las células infectadas con los virus recombinantes reflejan bien la inserción de los casetes de expresión de luciferasa en el genoma del coronavirus.
Conclusión: Los resultados confirman los genotipos de los virus recombinantes y demuestran sus fenotipos esperados al nivel del RNA.
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I.3.c. Replicación de virus que expresan luciferasa de renilla o de luciérnaga
Objetivo: Comparar las características de crecimiento de los virus con los virus naturales y de unos con otros.
Método y Resultados: Después de dos rondas de purificación en placa se prepararon lotes (stocks) de virus, se titularon y se usaron para una alta multiplicidad de infección (abreviadamente en los sucesivo m.o.i por la expresión inglesa multiplicity of infection) (m.o.i. de 8) de células LR7 tras lo cual se monitorizaron las infectividades virales en los medios de cultivo. Los resultados se representan por las curvas de crecimiento mostradas en las Fig. 8A y 8B y por los resultados mostrados en la Fig. 32. Se analizaron dos clones virales de MHV-EFLM, independientemente obtenidos del experimento de recombinación descrito en I.3.a. En la Fig. 32, se muestran los valores de la DICT_{50} obtenidos a las 8-9 horas después de la infección. Obviamente, las características de crecimiento de los virus recombinantes mostrados en las Fig. 8A y 8B son esencialmente indistinguibles; todos los virus crecieron hasta títulos que fueron comparables a los del virus recombinante de tipo natural. El MHV-MSmNRL alcanzó títulos algo más bajos (Fig. 32).
Conclusión: Los casetes de expresión insertados apenas afectan a las características de crecimiento in vitro de los virus recombinantes.
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I.3.d. Expresión de luciferasa de renilla y de luciérnaga en cultivo de células
Objetivo: Establecer si los casetes de expresión insertados eran funcionales.
Método y Resultados: Cultivos confluentes en monocapas de células LR7 se infectaron a una m.o.i. de 8 y se monitorizó la producción de la actividad de luciferasa, en las células en el tiempo. La expresión de RL en las células se midió usando el sistema de ensayo doble informador de luciferasa (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Similarmente, la expresión de FL se midió usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de RL y FL se midió en unidades de luz relativas (ULR) usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500 o Turner Designs Model TD-20120).
Los resultados se muestran gráficamente en las Fig. 9A, 9B y 33. Todos los virus recombinantes excepto los virus recombinantes de tipo natural expresaron altos niveles de luciferasa, lo que indica que los casetes del gen de la luciferasa de renilla de la luciferasa de luciérnaga fueron funcionales en cada posición genómica ensayada. Para la mayoría de los virus los altos niveles de expresión se alcanzaron a las 9 horas después de la infección. El nivel de expresión de la luciferasa de luciérnaga se determinó en este tiempo a 1,6 \mug/10^{6} células. Los niveles expresados en MHV-minFL de actividad de luciferasa fueron comparables con los producidos por otros virus recombinantes que contienen el gen FL, mientras que la expresión del gen de la luciferasa de renilla gen en células infectadas con MHV-MSmNRL eran aproximadamente 10 veces menor en las células infectadas con MHV-ERLM. Esta diferencia corresponde con la diferencia encontrada en la replicación entre MHV-MSmNRL y MHV-ERLM.
Conclusión: Los genes extraños pueden ser expresados por los coronavirus tanto por la inserción adicional de dichos genes, usando el espacio genético creado por una deleción no esencial, como en combinación con la organización de un genoma transpuesto.
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I.3.e. Mantenimiento de genes extraños durante los pases virales
Objetivo: Evaluar la estabilidad de los genes de luciferasa insertados durante el pase viral.
Método y Resultados: Los virus recombinantes MHV-ERLM y MHV-EFLM se sometieron a pases 8 veces sobre células LR7 a una baja m.o.i. (<0,05). Después de cada pase se determinó la infectividad viral (DICT_{50}) en el medio de cultivo 9 horas después de la infección. Subsiguientemente, se determinó la actividad de luciferasa de renilla y luciferasa de luciérnaga en un experimento de expresión en paralelo (m.o.i. = 5) las 8 horas después de la infección (Fig. 10). Se analizaron tanto el MHV-ERLM como el MHV-EFLM de dos clones A y B obtenidos independientemente. Aunque la expresión de luciferasa de renilla era consistentemente estable durante al menos 8 pases, la de la luciferasa de luciérnaga solamente era estable durante 5 pases. Después del pase 5 de MHV-EFLM, el nivel de expresión disminuyó claramente para ambos clones independientes. Después de 8 pases se aislaron 10 clones virales por análisis en placa tanto de MHV-ERLM como de MHV-EFLM y se analizaron en cuanto a la expresión de luciferasa. Mientras que para MHV-ERLM todos los 10 clones fueron positivos, 9 de los clones de MHV-EFLM ya no mostraron claramente la expresión de luciferasa detectable.
Conclusión: Un gen extraño puede ser mantenido establemente en el genoma coronaviral durante al menos 8 pases in vitro.
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I.3.f. Expresión de luciferasa de luciérnaga en ratones
Objetivo: Establecer si el gen de la luciferasa de luciérnaga insertado se expresa en el hospedante natural, el ratón.
Método y Resultados: En el experimento se usaron ratones BALB/c hembras negativos al MHV. Los ratones se inocularon intranasalmente con 10^{6}DICT_{50} de MHV-EFLM. Se usaron cuatro ratones por virus. En el día 4 después de la infección los ratones se sacrificaron y se extirparon los hígados y cerebros. Los órganos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en el reactivo de lisis para cultivo de células proporcionado con el sistema de ensayo de luciferasa (Luciferase Assay System de Promega). Se midió la actividad del gen FL de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500). Claramente, como se muestra en Fig. 34, la actividad de luciferasa se pudo detectar tanto en el hígado como en el cerebro. Como alternativa para evaluar si el gen extraño también se expresaba in vivo, es decir en animales, se inoculó intraperitonealmente un ratón con 10^{6} DICT_{50} de MHV-EFLM. Cuatro días más tarde el ratón fue sedado y se le administró luciferina subcutáneamente. La expresión de luciferasa se evaluó 5 minutos más tarde registrando en tiempo real la emisión de luz desde el cuerpo del ratón sedado usando una pantalla sensible acoplada a una cámara con dispositivo acoplado a la carga. Se observó que la luz emanaba de la zona del hígado.
Conclusión: Un gen extraño se puede expresar por los coronavirus en su hospedante natural.
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I.3.g. Generación de MHV que expresa dos genes extraños desde un genoma
Objetivo: Establecer si dos genes extraños se pueden expresar en un solo genoma.
Método y Resultados: El virus pXH2aRLSEFLM se generó clonando el casete de expresión de FL en pXH2aRLS digerido con EcoRV. Después de la confirmación de la construcción por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generaron por recombinación RNA-RNA entre los transcritos run-off del vector de transcripción y el genoma del fMHV como se ha descrito antes. El virus resultante, MHV-RLFL, fue confirmado genéticamente por análisis por RT-PCR. Se pudieron detectar tanto actividad de luciferasa de renilla como de luciferasa de luciérnaga en placas individuales. Después de la generación de un lote de alto título, se infectaron cultivos de monocapas confluentes de células LR7 a una m.o.i. de 8 y se monitorizó en el tiempo la producción de actividad de luciferasa en las células. La expresión del gen RL en las células se midió usando el sistema de ensayo de renilla (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Similarmente, la expresión del gen FL se midió usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante 8 horas después de la infección. La actividad de los genes RL y FL se midió en unidades de luz relativa (ULR) usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500). Los resultados muestran que el MHV-RLFL se replicaba en la misma extensión que el MHV-2aRLS y el MHV-EFLM (Fig. 46A). El MHV-RLFL expresó tanto luciferasa de renilla como luciferasa de luciérnaga, el MHV-2aRLS expresó solamente luciferasa de renilla, mientras que el MHV-EFLM expresó solamente luciferasa de luciérnaga (Fig 46B).
Conclusión: En un solo genoma de coronavirus se pueden expresar dos genes extraños.
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I.3.h. Generación de MHV que expresa un gen espícula-GFP quimérico
Objetivo: Establecer si puede ser generado un MHV recombinante que exprese e incorpore proteínas espícula-GFP quiméricas.
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Método y Resultados: El gen de la proteína fluorescente verde se clonó en marco con el gen S en pMH54. Después de la confirmación de la construcción por análisis de restricción y secuencia, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off del vector de transcripción y el genoma del fMHV como se ha descrito antes. El virus resultante, MHV-SGFP, se confirmó genéticamente por análisis por RT-PCR. Las placas se analizaron microscópicamente y mostraron que expresaban GFP como se pone de manifiesto por la fluorescencia verde. El análisis por inmunoprecipitación indicó que se generaron proteínas híbridas que podían ser precipitadas con anticuerpos específicos para MHV-S y GFP.
Conclusión: Se puede generar un MHV que exprese un gen S-GFP quimérico en lugar de un gen S de tipo natural. Este virus mutante es viable y podía ser propagado en cultivos celulares lo que indica que estas proteínas híbridas están incorporadas en la partícula viral.
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I.4. Inhibición de infección y de fusión celular por un péptido derivado de la proteína de la espícula
Objetivo general: Inhibir la infección coronaviral y la extensión de una infección incipiente con fusión de membranas usando péptidos.
Objetivo específico: Producir un péptido que constituye una secuencia derivada de la región de repetición membrana-heptada próxima (HR2) de la proteína S del virus MHV-A59 y demostrar que su efecto inhibidor sobre la entrada de MHV-A59 en las células LR7 y en la fusión célula-célula en un cultivo infectado de esta células.
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Métodos a. Construcciones de plásmidos
Se obtuvo un fragmento de PCR procedente de un plásmido molde pTUMS (13) que contiene el gen de la espícula de MHV-A59, correspondiente a los residuos de aminoácidos 1216-1254 (HR2) de la proteína S (Fig. 20). El cebador delantero usado fue: 5'-GCGGATCCATCGAAGGTCGTGATTTATCTCTCGATTTC-3'. Este cebador introdujo un sitio BamHI en la región 5' y una secuencia que codifica un sitio de escisión del factor Xa en la región 3' inmediatamente del sitio BamHI en el fragmento amplificado. El cebador inverso (5'-CGAATTCATTCCTTGAGGTTGATGTA G-3') contenía un sitio EcoRI en la región 3', así como un codón de parada precediendo al sitio EcoRI. El fragmento de PCR se clonó en el sitio BamHI-EcoRI del vector de expresión bacteriano pGEX-2T.
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b. Expresión y purificación de proteínas bacterianas
Células BL21 recientemente transformadas (NOVAGEN) se hicieron crecer en un medio 2YT hasta la fase logarítmica (DO_{600} de 1,0) y subsiguientemente se indujo su expresión añadiendo IPTG (Isopropil-Beta-D-Tiogalactósido de GibcoBRL) hasta una concentración final de 0,4 mM. Dos horas después del comienzo de la inducción la células se sedimentaron, se volvieron a poner en una suspensión, en 1/25 del volumen de cultivo, de Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA10 mM, PMSF 1 mM y se trataron con ultrasonidos en hielo (5 veces durante 2 minutos con un intervalo de 1 minuto). Los lisados celulares se centrifugaron a 20.000 x g durante 60 minutos a 4ºC. Luego se añadieron 2 ml de glutation-sefarosa 4B (50% v/v en PBS) por cada 50 ml de líquido sobrenadante y la suspensión se incubó durante una noche a 4ºC bajo rotación. Las perlas se lavaron tres veces con 50 ml de PBS y se volvieron a suspender en un volumen final de 1 ml de PBS. Los péptidos se escindieron del resto de GST sobre las perlas usando 20 U de trombina por incubación durante 4 horas a temperatura ambiente (TA). Los péptidos del líquido sobrenadante se purificaron por HPLC en una columna de fenilo con un gradiente lineal de acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones que contenían los péptidos se secaron a vacío durante una noche y se disolvieron en agua. La concentración de péptidos se determinó midiendo la absorbancia a A_{280} nm o por análisis de la proteína BCA (Kit de ensayo de Micro BCA^{Tm} Assay Kit, PIERCE).
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c. Ensayos de entrada del virus en células e inhibición de la fusión célula-célula
La potencia del péptido HR2 en inhibir la infección viral se determinó usando el virus recombinante MHV-EFLM que expresa la luciferasa de luciérnaga. Monocapas confluentes de células LR7 en placas de 96 pocillos se inocularon a 37ºC en DMEM a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 5 durante 1 hora en presencia de concentraciones variables de péptido que varían desde 0,4 a 50 \muM. Después de 1 hora las células se lavaron con DMEM y el medio se reemplazó por DMEM exento de péptidos. 5 horas después de la infección las células se lisaron durante 15 minutos a TA en 50 \mul de tampón de lisis, de acuerdo con el protocolo del fabricante (sistema de ensayo de luciferasa, de Promega). Tras la mezcla de 10 \muI de lisado celular con 40 \mul de sustrato, se midió la actividad de luciferasa inmediatamente usando un beta-luminómetro Wallac. Se calculó la concentración inhibidora eficaz del 50% (valor CE_{50}) ajustando los datos de inhibición a una ecuación de unión en el equilibrio: % de actividad de luciferasa = 100/(1+(C/CE_{50}).
Se determinó la capacidad del péptido HR2 de inhibir la fusión célula-célula mediada por la proteína de la espícula usando un ensayo en placa. Se incubaron monocapas de células LR7 en placas de 6 pocillos con 50 UFP de MHV-A59 en DMEM a 37ºC. Después de una hora las células se lavaron con DMEM y se añadió un revestimiento de agar que contenía el péptido HR2 a concentraciones de 50, 10, 2, 0,4 y 0,08 \muM. Las placas se recontaron 48 horas después de la infección, tras tinción y fijación con formaldehído al 0,9%/violeta cristal al 0,75%.
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Resultados
Se analizó la potencia del péptido HR2 en inhibir la entrada del virus usando un virus que expresa un gen indicador de luciferasa puesto que esto permite una detección de la infección extremadamente sensible. Las inoculaciones de células con el virus se llevaron a cabo en presencia de diferentes concentraciones del péptido HR2. Después de 1 hora de inoculación, las células se lavaron e incubaron en medio de cultivo en ausencia del péptido. A las 4 horas después de la infección, antes que tenga lugar la formación de sincitios, las células se lisaron y analizaron en cuanto a la actividad de luciferasa (Fig. 11). En esta figura la actividad normalizada de luciferasa, que representa el éxito de la infección, se representó gráficamente frente a la concentración de péptido presente durante la inoculación. El péptido HR2 bloqueó muy eficazmente la entrada viral, siendo la infección inhibida virtualmente de un modo completo a la concentración de 50 \muM. La concentración eficaz (CE_{50}) a la cual se inhibió el 50% de la infección viral fue 0,15 \muM.
La capacidad del péptido HR2 de inhibir la fusión célula-célula mediada por la proteína de la espícula se examinó usando un ensayo en placa. Después de la inoculación de células (cultivos en paralelo) en ausencia de péptido, se aplicó un revestimiento que contenían diferentes concentraciones del péptido HR2. La formación de placas pareció estar completamente abolida en presencia de concentraciones del péptido HR2 de hasta 0,4 \muM (Fig. 12). A 0,08 \muM del péptido HR2 solamente pudieron observarse placas diminutas.
La especificidad de la inhibición se demostró en estos ensayos analizando en paralelo el efecto de otros péptidos (Fig. 20) preparados idénticamente y usados en las mismas concentraciones, incluyendo por ejemplo el péptido correspondiente a los aminoácidos 1003-1048 de la proteína S del virus MHV-A59 (mostrada como "péptido de control" en la Fig. 11). Solamente fue eficaz el péptido HR2.
Conclusión: El péptido HR2 es un potente inhibidor tanto de la entrada del virus en las células como de la fusión célula-célula de mediada por la proteína de la espícula del virus MHV-A59.
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II. Virus de la peritonitis infecciosa de los felinos (FIPV), cepa 79-1146 II.1. Generación de mFIPV, un coronavirus de los felinos que crece en células de múridos
Objetivo general: Poner a punto un sistema de recombinación de RNA dirigido a diana para el coronavirus de los felinos (FIPV) 79-1146 similar similar al descrito antes para la manipulación genética del coronavirus de los múridos MHV-A59.
Objetivo específico: Generar un mFIPV, un derivado de FIPV en el cual el ectodominio de la proteína de la espícula ha sido reemplazado genéticamente por el de la proteína S del virus MHV-A59, cambiando el tropismo del virus quimérico a células de múridos en lugar de a células de felinos.
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II.I.a. Construcción un vector de transcripción de RNA sintético
Objetivo: Preparar una construcción de plásmido a partir de la cual puede ser transcrito RNA donador sintético para la recombinación de RNA dirigido a diana que consiste en secuencias derivadas del extremo 5' del genoma de FIPV fusionado a secuencias derivadas de la parte 3' del genoma viral, es decir, todas las secuencias situadas en la región 3' (e incluyendo) el extremo 3'-terminal del marco de lectura abierto 1B. También: Preparar un derivado de este plásmido en el cual la secuencia que codifica el ectodominio de la proteína de la espícula ha sido reemplazado por el dominio correspondiente proteína de la espícula de MHV-A59.
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Método y Resultados
Usando técnicas de clonación de DNA estándares se construyó el vector PBRDI1 que contiene una copia de cDNA de las 702 bases más próximas al extremo 5' ligada a las 9.262 bases más próximas al extremo 3' del genoma del FIPV 79-1146 (Fig. 13A). La ligación se hizo de tal modo que el fragmento génico del marco de lectura abierto 1A (pol 1A) se fusionó en marco en su extremo 3' al extremo 5' del fragmento de gen del marco de lectura abierto 1B (pol 1B) (Fig. 14B). Además, en este punto se introdujo un sitio de restricción SacI único (Fig. 14B). La secuencia de coronavirus se colocó bajo el control de una secuencia del promotor de polimerasa del bacteriófago T7 seguido por una triple G (Fig. 14A) para realizar eficazmente la transcripción del RNA in vitro usando la polimerasa de T7. En el extremo 3', la secuencia se terminó mediante una cola de poliA de 15 A seguida por un sitio de restricción NotI único (Fig.14 C) para facilitar la transcripción hasta el extremo del DNA molde (run-off transcription). La secuencia del promotor de T7 está precedida por un sitio de restricción XhoI único (Fig. 14A) de tal modo que el cDNA de coronavirus felino pudo ser clonado como un fragmento de restricción XhoI-NotI de 10.015 pb en el vector principal pBRXN (11) dando como resultado pBRDI1 (Fig. 13A).
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El plásmido pBRDI1 se usó subsiguientemente para preparar pBRD12 en el cual el gen S del FIPV estaba reemplazado por un gen de la espícula quimérico (mS) compuesto de una parte que codifica el ectodominio de la proteína de la espícula del MHV y una parte que codifica el dominio transmembranal y el endodominio de proteína de la espícula del FIPV. Para introducir este gen híbrido en pBRDI1, primeramente se fusionó el extremo 3' del gen pol1B felino al extremo 5' del gen de la espícula de múridos (véase la Fig. 14D para la secuencia en los empalmes). Este producto de fusión se clonó en pTMFS (12) como un fragmento SacI-StuI, dando como resultado pTMFS1 (Fig. 13B). El gen híbrido se aisló luego de pTMFS1 como un fragmento SacI-AlfII y se usó para reemplazar el gen de la espícula de FIPV de pBRDI1 dando como resultado pBRDI2 (Fig. 13B). Las secuencias de pBRDI1 y pBRDI2 se muestran en el anexo 1 y 2, respectivamente.
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II.I.b. Generación de mFIPV por recombinación de RNA
Objetivo: Generar mFIPV, un derivado FIPV dirigido a células de múridos. Método y Resultados: Se sintetizaron transcritos run-off de RNA protegidos con grupos protectores (caps) a partir de pBRDI2 linealizado con NotI usando un kit de RNA-polimerasa de T7 (Ambion) de acuerdo con las instrucciones de fabricante. Los transcritos se introdujeron en células de FCWF (frasco de cultivo de 80 cm^{2}) que habían sido infectadas antes con el FIPV 79-1146 (m.o.i. de 1), por electroporación (aparato de electroporación Gene pulser, Biorad, 2 impulsos consecutivos; 0,3 kV/960 microF). Las células sometidas a electroporación se cultivaron conjuntamente en un matraz de 25 cm^{2} con células LR7 de múridos (confluencia del 50%) para permitir la recombinación del RNA sintético y genómico (Fig. 15). Después de 24 horas de incubación a 37ºC se pudieron observar sincitios masivos de tanto células LR7 de múridos como de células de FCWF. Los virus recombinantes de mFIPV candidatos se seleccionaron tomando el líquido sobrenadante del cultivo y haciendo pasar el virus por tres diluciones de punto final consecutivas sobre células LR7. El virus resultante fue incapaz de infectar y causar efecto citopático en células de FCWF.
Conclusión: Se obtuvo un virus con el tropismo deseado en células de múridos.
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II.1.c. Análisis de la proteína mFIPV
Objetivo: Confirmar la identidad del mFIPV en el nivel de síntesis de la proteína viral.
Método y Resultados: Células LR7 de múrido fueron infectadas con el mFIPV y las proteínas se marcaron con aminoácidos marcados conS durante 2 horas comenzando a las 5 horas después de la infección. Como controles, los inventores infectamos células LR7 y de FCWF con MHV y FIPV, respectivamente, y las marcamos similarmente a partir de 5-7 horas después de la infección. Después del marcado, se prepararon lisados celulares y se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones en presencia de detergente como se ha descrito en (12). Se usaron los siguientes anticuerpos (para referencias, véase (12)): G73 (\alphaFIPV), un fluido ascítico obtenido de un gato infectado con el FIPV (proporcionado por H. Vennerna); K134 (\alphaMHV), un suero de conejo producido contra el MHV-A59 purificado; WA3.10 (\alphaS_{m},), un anticuerpo monoclonal (Mab) contra un epítopo presente en el ectodominio S del MHV-A59; 23F4.5 (\alphaS_{f}), un Mab contra un epítopo del ectodominio S del FIPV. Las proteínas inmunoprecipitadas se recogieron en un tampón de muestra de electroforesis y se calentaron durante 2 minutos a 95ºC excepto una muestra de proteína (pista 4 de la Fig. 16) que se mantuvo a temperatura ambiente para impedir la agregación de la proteína M del MHV. Las proteínas se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 12,5%. Los patrones electroforéticos se muestran en la Fig. 16. Como se esperaba, los anticuerpos anti-FIPV precipitaban las proteínas S, M y N del FIPV del lisado de células infectadas con FIPV (pista 10), pero a ninguna de las proteínas del MHV del lisado de células infectadas con MHV (pista 1). El MAb 23F4.5 precipitó la proteína S de felino de FIPV (pista 11) pero no la proteína S de múridos del MHV (pista 2), como era de esperar. También, el suero anti-MHV precipitó las proteínas S, N y M del MHV (pistas 3 y 4) pero no las proteínas del FIPV (pista 12), y el Mab WA3.10 precipitó la proteína S del MHV (pista 5) pero no la proteína S del FIPV (pista 13). Cuando se observan las proteínas precipitadas en los lisados en las células infectadas con el mFIPV, es evidente que el suero G73 anti-FIPV precipitó las proteínas M y N, pero no la proteína S (pista 6). La proteína S tampoco fue precipitada por el MAb 23F4.5 Mab (pista 7). La proteína S del mFIPV sin embargo, fue precipitada por el suero anti-MHV (pista 8) así como por el Mab WA3.10 (pista 9).
Conclusión: Las células infectadas por mFIPV expresan las proteínas virales predichas, particularmente la proteína S híbrida con el ectodominio derivado del MHV.
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II.1.d. Características del crecimiento del mFIPV
Objetivo: Comparar los títulos obtenidos para el mFIPV con los de FIPV y MHV-A59.
Método y Resultados: Los experimentos de infección y titulación revelaron que el virus recombinante mFIPV ya no era capaz de infectar células de FCWF pero crecía en eficazmente en células L7 de múridos mostrando características de crecimiento similares a las del MHV-A59. Esto se demuestra, por ejemplo, mediante una comparación de sus curvas de crecimiento en una etapa mostrada en la Fig. 17. En este experimento las células fueron infectadas con mFIPV y MHV-A59 (cada una de ellas a una m.o.i. de 5) después de que se tomarán las muestras del fluido de cultivo en diversos momentos de tiempo y se titularan las células LR7 por dilución al punto final. También, el mFIPV indujo excesivos sincitios y efectos citopáticos por infección de estas células: Los lotes del mFIPV recombinante crecidos en células L7 alcanzaron títulos del mismo orden de magnitud que el FIPV en células de FCWF (5.10^{7} UFP/ml). Sin embargo, dicho título fue un orden de magnitud más bajo que el que se observó para el MHV-A59 en células L7.
Conclusión: El reemplazamiento del ectodominio de la proteína de la espícula da como resultado un mFIPV recombinante que se replica bien en sus "nuevas" células hospedantes y aparentemente no pierde mucho de su capacidad biológica.
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II.2. Generación de una vacuna de FIPV atenuado por deleciones de genes
Objetivo general: Delecionar secuencias de genes del genoma del FIPV que no son esenciales para la replicación viral in vitro para obtener virus con deleciones que están atenuados en animales felinos y por tanto son candidatos para (vectores) vacunas virales.
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II.2.a. Construcción de vectores por transcripción de RNA sintéticos
Objetivo: Construir los plásmidos para la síntesis de transcritos de RNA donadores que carecen de los genes 3ABC y/o 7AB para la recombinación dirigida a diana con RNA del mFIPV (Fig. 18, parte superior).
Método y Resultados: Las deleciones de los genes 3ABC y 7AB se introdujeron en el plásmido pBRDI1 usando empalme por extensión solapante por reacción en cadena de la polimerasa (SOE-PCR). Para los cebadores usados, véase la Tabla 2 y el lado izquierdo de la Fig. 18.
Para suprimir la agrupación 3ABC, se usaron las combinaciones de cebadores 1 y 4 y de 2 y 3 para generar los fragmentos de 375 pb (A) y 1012 pb (B), respectivamente (lado izquierdo de la Fig. 18). Los fragmentos A y B se fusionaron usando el solapamiento entre ambos fragmentos a través de los cebadores 3 y 4, y se amplificaron usando los cebadores 1 y 2 dando como resultado un pb fragmento (C) de 1366 pb. El fragmento C se digirió con AflII y SnaBI y se clonó en pBRI1 digerido con AfIII y SnaBI, dando como resultado pBRDI1\Delta3ABC (Fig. 18).
Para delecionar los genes 7AB, se usaron combinaciones de los cebadores 5 y 8 y de los cebadores 6 y 7 para generar los fragmentos de 1215 pb (D) y de 324 pb (E), respectivamente (Fig. 18). Los fragmentos D y E se fusionaron usando el solapamiento entre ambos fragmentos a través de los cebadores 7 y 8, y se amplificó usando los cebadores 5 y 6 dando como resultado un fragmento (F) de 1524 pb. El fragmento F se digirió con MluI y NotI y se clonó en pBRDI1 digerido con MluI y NotI, dando como resultado pBRD1\Delta7AB (Fig. 18). Se confirmó que las secuencias de los fragmentos C y F eran las correctas por secuenciación del DNA.
Para construir el pBRDI1\Delta3ABC+\Delta7AB, se introdujo el fragmento MLuII NotI de 1524 pb de pBRDI1\Delta7AB en pBRDI1\Delta3ABC digerido con MluII NotI (Fig. 18).
Conclusión: Se obtuvieron construcciones de RNA donador derivadas de pBRDI1 que carecen de las agrupaciones de genes 3ABC y/o 7AB.
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II.2.b. Generaciones de FIPV recombinantes que carecen de ciertos genes
Objetivo: Generar los FIPV recombinantes que carecen de las secuencias de los genes 3ABC, de los 7AB, y de ambas agrupaciones de estos genes.
Método y Resultado: Se sintetizaron transcritos donadores de run-off de RNA protegidos con grupos protectores (caps) a partir de pBRDI1, pBRDI1\Delta3ABC, pBRDI1\Delta7AB y pBRDI1\Delta3ABC+\Delta7AB linealizados con NotI, respectivamente, usando un kit de RNA-polimerasa de T7 (Ambion) como se especifica por el fabricante. Los transcritos donadores se introdujeron en células L7 de múridos (matraz de 80 cm^{2}), que habían sido infectadas antes con mFIPV (m.o.i. de 0,4), por electroporación (aparato de electroporación Gene pulser, Biorad, 2 impulsos consecutivos; 0,85 kV/50 microF). Las células sometidas a electroporación se cultivaron conjuntamente en un matraz de cultivo de 25 cm^{2} con células de FCWF (confluencia del 50%). Después de una incubación de 24 horas a 37ºC se pudieron detectar sincitios masivos tanto en las células L7 de múridos como en las células de FCWF. Los virus con deleciones candidatos liberados en el líquido sobrenadante del cultivo celular mixto se purificaron por dos rondas de purificación en placa en células de FCWF.
Conclusión: Los virus que habían adquirido la capacidad de crecer en células de FCWF habían sido obtenidos por el experimento de recombinación con mFIPV.
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II.2.c. Análisis genético de FIPV recombinantes que carecen de ciertos genes
Objetivo: Confirmar el complemento genético de virus con supuestas deleciones.
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Método y Resultados: Para evaluar si las deleciones pretendidas están realmente presentes en los diversos mutantes por deleción del FIPV, se realizó una RT-PCR sobre los RNA virales genómicos centrándose en las regiones 3ABC y 7AB. Los cebadores usados y los tamaños de DNA esperados se indican en la Tabla 2 y en el lado derecho de la Fig. 18. Los resultados del análisis por RT-PCR se muestran en la Fig. 19. La Fig. 19A revela que el virus de tipo natural recombinante (r-wt-FIPV) y el FIPV\Delta7AB llevan cada uno la región 3ABC, mientras que esta región falta en los virus FIPV\Delta3ABC y FIPV\Delta3ABC+\Delta7AB, según se deduce por los tamaños de los fragmentos amplificados. La Fig. 19B demuestra el r-wt-FIPV y el FIPV\Delta3ABC todavía llevan la región 7AB, mientras que los virus FIPV\Delta7AB y FiPV\Delta3ABC+\Delta7AB carecen de esta región. Los fragmentos de 397 pb y 646 pb, indicativos de una deleción de 3ABC y 7AB, respectivamente, fueron clonados y secuenciados lo cual confirmó las secuencias de DNA esperadas.
Conclusión: Los virus con deleciones tenían precisamente las deleciones genómicas pretendidas.
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II.2.d. Características de crecimiento de FIPV que carecen de ciertos genes
Objetivo: Comprobar el tropismo celular de los virus con deleciones y evaluar su crecimiento in vitro.
Resultados: La totalidad de 4 virus recombinantes se inocularon en células L7 de ratón pero fracasaron en producir efectos citopáticos. Sin embargo, crecieron eficazmente en células de FCWF, como era de esperar. Los virus r-wtFIPV, FIPV\Delta3ABC y FIPV\Delta7AB alcanzaron títulos en estas células que eran similares a los obtenidos con la cepa FIPV 79-1146 precursora. Los títulos eran todos del orden de 5.10^{7} UFP/ml (Fig. 40). Sin embargo, el mutante doble FIPV\Delta3ABC+ \Delta7AB creció menos eficientemente; los títulos obtenidos con este virus eran generalmente 1 a 2 unidades logarítmicas inferiores (Fig. 40).
Conclusión: Las secuencias que comprenden las agrupaciones de genes 3ABC y 7AB no son esenciales para la viabilidad del FIPV. Aparentemente, ni sus secuencias de nucleótidos ni las proteínas codificadas por los genes son esenciales para la replicación del virus.
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II.2.e. Virulencia de virus recombinantes en gatos
Objetivo: Establecer si las deleciones genéticas afectan a la virulencia.
Método y Resultados: Los virus recombinantes con deleciones se caracterizaron en su hospedante natural, el gato. Para este fin, 24 gatos exentos de patógenos específicos (abreviadamente SPF por la expresión inglesa Specific Pathogen Free) (de 5 meses) se colocaron en 5 grupos y se inocularon oronasalmente (100 UFP) con la cepa del FIPV 79-1146 (n=4), r-wtFIPV (n=5), FIPV\Delta3ABC (n=5), FIPV\Delta7AB (n=5) y FIPV\Delta3ABC+A7AB (n=5), respectivamente, y se controlaron durante (al menos) 3 meses. Los signos clínicos de enfermedades se puntuaron como se muestra en la Tabla 5. La inoculación de los gatos con las variantes por deleciones no indujo signos clínicos de enfermedad. En lugar de ello, todos los gatos permanecieron totalmente sanos a través del experimento (Tabla 6 y Fig. 35). En contraste, la infección con los controles FIPV 79-1146 y r-wtFIPV de tipo natural indujo un comienzo rápido de enfermedad clínica caracterizado por depresión, anorexia, ictericia, pérdida de peso y leucopenia (Tabla 6). Tres de cada cuatro y cinco de cada cinco gatos inoculados con FIPV 79-1146 y r-wtFIPV, respectivamente, tuvieron que ser sacrificados debido a síntomas avanzados de peritonitis infecciosa felina entre los días 14 y 42 después de la infección (Fig. 35).
Conclusiones: 1) El virus FIPV 79-1146 y su equivalente recombinante de tipo natural r-wtFIPV son igualmente virulentos; y 2) Los virus con deleciones de las secuencias que especifican los genes 3ABC o 7AB o la combinación de algunos o todos de estos genes exhiben un fenotipo significativamente atenuado en gatos.
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II.2.f. Respuesta inmune inducida por virus recombinantes
Objetivo: Determinar la actividad neutralizante del FIPV en sueros de gatos.
Método y Resultados: Se caracterizaron respuestas a anticuerpos específicos del FIPV de los gatos inoculados con virus con deleciones. Para este fin, se obtuvieron muestras de suero los días 0, 21 y 90 después de la infección, y se prepararon sueros inactivados por calor y se incubaron con FIPV 79-1146 (10.000 UFP) después de lo cual se determinó la actividad neutralizante del FIPV usando células de FCWF en un ensayo en microplaca de 96 pocillos. Los títulos se expresaron como las inversas de la dilución más baja que ya no inhibía los efectos citopáticos virales. Como se esperaba en el día 0 ninguno de los sueros de los gatos mostró una actividad neutralizante de FIPV significativa. En el día 21, todos los gatos habían sido seroconvertidos y mostraban altos títulos de anticuerpos neutralizantes. Los títulos observados en gatos inoculados con FIPV 79-1146, r-wtFIPV, FIPV\Delta3ABC y FIPV\Delta7AB eran comparables, mientras que los títulos observados en gato infectados con FIPV\Delta3ABC+\Delta7AB eran aproximadamente 50 veces menores (Fig. 36). Globalmente, los títulos permanecían altos durante al menos 90 días (fin del experimento).
Conclusión: A pesar de la ausencia de signos clínicos de la enfermedad, se observaron altos títulos de anticuerpos neutralizantes en gatos que había sido inoculados con variantes por deleción del FIPV. Esto sugiere fuertemente que los virus por deleción son viables y se replican en el gato conduciendo a una fuerte respuesta inmune en la forma de una respuesta de anticuerpos.
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II.2.g. Virus FIPV con deleciones sirven como vacunas vivas y atenuadas
Objetivo: Estudiar si la inoculación previa con variantes por deleción protege a los gatos contra una prueba de virulencia con FIPV 79-1146.
Método y Resultados: Los gatos previamente inoculados con las variantes por deleción se sometieron a la prueba de virulencia oronasalmente con FIPV 79-1146 (100 UFP) en los días 5 a 90. Como grupo de control, se sometieron a la prueba de virulencia idénticamente 4 gatos no tratados de edad similar. El grupo de control mostró un rápido comienzo de la enfermedad clínica caracterizada por depresión, anorexia, ictericia, pérdida de peso y leucopenia (día 7). Se observó un comienzo rápido similar de síntomas con 3 de cada 5 gatos previamente inoculados con FI PV\Delta3ABC+\DeltaAB, mientras que todos los gatos previamente infectados con FIPVA3\DeltaBC o FIPV\Delta7AB permanecían generalmente sanos y sin síntomas típicos de FIP a través del experimento (Tabla 7), aunque 2 de cada 5 gatos previamente inoculados con FIPV\Delta3ABC mostraron pérdida de peso temporal.
Debido a los síntomas avanzados de FIP, un gato del grupo de control hubo de ser sacrificado el día 32, mientras que los otros gatos del grupo de control se recuperaron de sus síntomas iniciales de FIP. Una puntuación de letalidad de 25% es menor que la observada en los experimentos previos. Se supone que esto es debido a la edad avanzada de los gatos que se sabe conduce a una susceptibilidad reducida para el FIPV. Los tres gatos vacunados con FIPV\Delta3ABC+\Delta7AB con síntomas iniciales permanecían enfermos y fueron sacrificados entre los días 11 y 56 (Fig. 37). Aparentemente, la deleción combinada de las dos agrupaciones de genes 3ABC y 7A que se encontró que reduce la forma física de FIPV\Delta3ABC+\Delta7AB -según se juzga por su disminución del crecimiento in vitro- afecta también a la tasa de replicación del virus en los gatos, como se pone de manifiesto por los niveles inferiores de anticuerpos neutralizantes inducidos. Por tanto, el virus está sobre-atenuado y solamente es capaz de proteger parcialmente contra una prueba de virulencia con FIPV. La protección completa requeriría una dosis superior o repetida.
Conclusión: La vacunación previa con FIPV\Delta3ABC o FIPV\Delta7AB protege a los gatos contra la enfermedad causada por una prueba de virulencia con el FIPV.
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II.3. Inserción y expresión de genes extraños
Objetivo: Establecer si pueden insertarse genes extraños en diferentes posiciones del genoma viral, bien sea como un gen adicional o bien sea reemplazando genes no esenciales, y establecer si se expresan estos genes y si se mantienen establemente durante pases in vitro del virus.
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II.3.a. Construcción de virus recombinantes que llevan genes informadores
Objetivo: Generar virus FIPV 79-1146 con inserciones de genes extraños.
Método: Se construyó un virus que contenía un gen informador extraño en su genoma en la posición de los genes 3abc. El gen informador, luciferasa de renilla (RL), se colocó bajo el control transcripcional de la SIG precediendo al gen 3a. Para delecionar la agrupación 3abc e introducir el gen RL en el plásmido pBRDI1 se usaron las combinaciones de los cebadores 1244 (5'-GCCATTCTCATTGATAAC-3') y 1514 (5'-CTGAGTCTAGAGTAGCTAGCTAATGAC
TAATAAGTTTAG-3') y de los 1245 (5'-GCTTCTGTTGAGTAATCACC-3') y 1513 (5'-GCTAGCTACTCTAGACT
CAGGCG GTTCTAAAC-3') para generar los fragmentos de 336 pb (A) y 1068 pb (B) por PCR, respectivamente. En los cebadora 1513 y 1514, las secuencias subrayadas y en negrita representan un sitio de restricción NheI y XbaI, respectivamente. Los fragmentos A y B se fusionaron usando el solapamiento entre ambos fragmentos a través de los cebadores 1514 y 1513 y se amplificaron usando los cebadores1244 y 1245, usando SOE-PCR, dando como resultado un fragmento (C) de 1384 pb. El fragmento C se clonó en el vector pGEM-T Easy (Promega), dando como resultado pGEMC. El gen RL derivado de pRL-null (Promega) se introdujo como un fragmento NheI/XbaI en pGEM-C l digerido con Nhw y XbaI, dando como resultado pGEM-C+luc. El fragmento C+luc se introdujo como un fragmento AfIII y SnaBI en pBRDI1 digerido con AfIII y SnaBI dando como resultado pBRDI1\Delta3ABC+luc.
Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre los transcritos run-off del vector de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Conclusión: El gen informador extraño de luciferasa de renilla se puede colocar en el genoma del coronavirus de tipo I FIPV. Los virus recombinantes pretendidos son viables.
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II.3.b. Crecimiento de virus en una etapa
Objetivo: Comparar las características del crecimiento de los virus con de tipo natural.
Método y Resultados: Después de dos rondas de purificación en placa de lotes de virus se prepararon 2 recombinantes obtenidos independientemente en II.3.a, se titularon y se usaron para una alta m.o.i (m.o.i. de 8) células de FCWF después de lo cual se monitorizaron las infectividades virales en los medios de cultivo. Los resultados se representan en las curvas de crecimiento mostradas en la Fig. 38. Ambos recombinantes obtenidos independientemente crecieron a 1 a 2 títulos logarítmicos más bajos en comparación el del virus recombinante de tipo natural.
Conclusión: Los virus recombinantes con un casete de expresión insertado crecen normalmente in vitro pero resultaron afectados sus rendimientos.
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II.3.c. Expresión de luciferasa de renilla
Objetivo: Establecer si el casete de expresión insertado era funcional.
Método y Resultados: Se infectaron cultivos de monocapas de células de FCWF a una m.o.i. de 8 y se monitorizó en el tiempo la producción de la actividad de luciferasa en las células. La expresión de RL en las células se midió usando el sistema de ensayo informador de luciferasa doble (Dual-Luciferase Reporter Assay System de Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La RL se midió en unidades de luz relativas (ULR) usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500 o Turner Designs Model TD-20120).
Los resultados se muestran gráficamente en la Fig. 39. En contraste con el virus recombinante de tipo natural, los dos virus que contenían el gen recombinante de luciferasa expresaban altos niveles de actividad de luciferasa, lo que indicaba que el gen de la luciferasa de renilla gen era funcional. La expresión comenzó tan pronto como 2 horas después de la infección. El nivel de expresión más alto se consiguió a las 9 horas después de la infección.
Conclusión: Genes extraños pueden ser expresados por coronavirus usando el espacio genético creado por la deleción de genes no esenciales.
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II.4 Generación de vacunas multivalentes basadas en FIPV
Objetivo: Desarrollo de vacunas multivalentes basadas en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Propuesta: Se seleccionaron genes (o fragmentos de genes) de otros agentes patógenos de animales felinos y caninos que codifican antígenos que se sabe inducen inmunidad protectora contra estos patógenos. Casetes de expresión de estos genes se introdujeron en el genoma de FIPV en combinación con deleciones atenuantes de genes no esenciales. Los casetes de expresión contienen secuencias reguladoras de la transcripción (abreviadamente TRS por la expresión inglesa Transcription Regulatory Sequence) del FIPV delante del (de partes del) gen que se ha de expresar.
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II.4.a. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la leucemia felina (FeLV) basada en un vector del FIPV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el FeLV basada en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes gag y env de FeLV relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDI\Delta3ABC y pBRDI\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes gag y env de FeLV se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes gag y env del FeLV relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un virus de la leucemia felina y la infección por FIPV.
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II.4.b. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) basada en un vector del FIPV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna para el FIV basada un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes gag y env de FIV relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma de mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes gag y env del FIV se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
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Conclusión: (Partes de) los genes gag y env del FIV relacionados con la protección se pueden ser introducido en, y expresados por, una cepa de FIPV viva atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un virus de la inmunodeficiencia felina y una infección por FIPV.
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II.4.c. Construcción de una vacuna multivalente contra el calicivirus felino (FCV) basada en un vector del FIPV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el FCV basada en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes del) gen de la cápsida del FCV relacionado con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión del gen de la cápsida del FCV se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes del) gen de la cápsida del FCV relacionado con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron una cepa de FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un calicivirus felino y una infección por el FIPV.
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II.4.d. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la panleucopenia de los felinos (FPV) basada en un vector del FIPV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna de FPV basada en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes del) el gen R3 relacionado con la protección, que codifica las proteínas de la cápsida VP1 y VP2 se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en p8RDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de (partes del) el gen R3 se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes del) el gen R3 relacionado con la protección puede ser introducido en, y expresado por, una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra el virus de la panleucopenia de los felinos y una infección por el FIPV.
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II.4.e. Construcción una vacuna multivalente para el herpes virus de los felinos (FHV) basada en un vector del FIPV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el FHV basada en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes del virus del herpes de los felinos gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, ICP0, ICPl e ICP4 relacionados con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma de mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes del FHV insertados se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, ICP0, ICPl e ICP4 del virus del herpes de los felinos relacionados con la protección se pueden introducir y expresar en una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra el virus del herpes de los felinos y el FIPV.
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II.4.f. Construcción de una vacuna multivalente de los serotipos I y II del FIPV basada en un vector del serotipo II del FIPV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna que protege tanto contra el serotipo 1 como el II de los coronavirus de los felinos, basada en un serotipo II del FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: Se suprimió el gen (o partes de mismo) de la proteína de la espícula de un serotipo I de coronavirus de los felinos relacionado con la protección que codifica la secuencia señal y se colocó en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujo en pBRDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Por ejemplo: en un caso se usó una construcción de un gen de la proteína de la espícula a partir de la cual se había delecionado la secuencia señal; en otro caso se usó un gen truncado de la proteína de la espícula a partir del cual se había delecionado la región que codifica el dominio transmembranal + el endodominio. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de la construcción del gen de la proteína de la espícula del serotipo I insertada se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes del) el gen de la proteína de la espícula del serotipo I de coronavirus de los felinos relacionado con la protección puede ser introducido y expresado en una cepa del FIPV del serotipo II viva y atenuada y por tanto puede funcionar como una vacuna multivalente contra ambos serotipos I y II de coronavirus de los felinos.
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II.5. Generación de virus recombinantes con orden de genes transpuesto
Objetivo: Desarrollo de una vacuna de FIPV en la cual la deleción de genes no esenciales está combinada con un orden de genes transpuesto por movimiento del gen N a una posición en la región 5' del gen S en el genoma del FIPV.
Método y Resultados: Se sintetizaron transcritos de donadores run-off protegidos en los extremos (capped) de los vectores pBRDI1\Delta3ABC, pBRDl1\Delta7AB y pBRDI1\Delta3ABC+\Delta7AB linealizados con NotI en los cuales el gen N, junto con su secuencia intergénica (SIG), estaba insertado en una posición en la región 5' del gen S. Los transcritos donadores se introdujeron en células L7 de múridos (matraz de 80 cm^{2}), que habían sido infectadas antes con el mFIPV (m.o.i. de 0,4), por electroporación (aparato de electroporación Gen pulser, Biorad, 2 impulsos consecutivos; 0,85 kV/50 microF). Las células sometidas a electroporación se cultivaron conjuntamente en un matraz de cultivo de 25 cm^{2} con células de FCWF (confluencia del 50%). Después de 24 horas de incubación a 37ºC se pudieron detectar sincitios masivos en los cultivos celulares. Los virus mutantes por deleción con genomas transpuestos liberados en el líquido sobrenadante del cultivo celular mixto se purificaron por dos rondas de purificación en placa de células de FCWF.
Conclusión: Pueden ser generados FIPV mutantes por deleción con el orden de genes transpuesto. Estos virus pueden funcionar como vacunas del FIVP vivo y atenuado. En virtud de su orden de genes transpuesto estos virus representan vacunas más seguras debido a su capacidad reducida de generar una progenie viable por recombinación con los virus que circulan en el medio.
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II.6 Generación de vacunas basadas en FIPV contra agentes patógenos de los animales caninos
Objetivo general: Desarrollo de vacunas basadas en una cepa del serotipo II de FIPV viva y atenuada como vector contra agentes patógenos de los animales caninos.
Propuesta: Puesto que los coronavirus de los felinos de tipo II expresan proteínas de la espícula similares a la de los coronavirus de los caninos (2a), dichos vectores de coronavirus de los felinos se pueden usar como vacunas en animales caninos. Por tanto, la vacuna de FIPV vivo y atenuado que los inventores desarrollaron también se puede usar para la vacunación de animales caninos contra los coronavirus de los caninos (CCV). Además, las vacunas multivalentes se pueden generar introduciendo casetes de expresión de genes relacionados con la protección de otros agentes patógenos de los caninos en el genoma del FIPV en combinación con deleciones atenuantes de genes no esenciales y con transposiciones del genoma. Los casetes de expresión contienen la secuencia reguladora terminal (TRS) del FIPV delante de (partes del) gen que se ha de expresar.
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II.6.a. Generación de vacunas basadas en el FIPV contra el moquillo de los caninos
Objetivo: Desarrollo de vacunas contra el moquillo de los caninos basadas en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes H y F relacionados con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de (partes de) los genes H y F se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes H y F relacionados con la protección del virus del moquillo de los caninos puede ser introducida en, y expresada por, una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna contra el virus del moquillo de los caninos y una infección por el CCV.
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II.6.b. Generación de vacunas basadas en el FIPV contra enfermedades producidas por parvovirus de los animales caninos
Objetivo: Desarrollo de vacunas contra parvovirus caninos basadas un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes del) el gen R3 relacionado con la protección, que codifica las proteínas de la cápsida VP1 y VP2 se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDI1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de (partes del) gen R3 se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes del) el gen R3 relacionado con la protección de parvovirus de los caninos puede ser introducida en, y expresada por, una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna contra enfermedades producidas por parvovirus de los caninos y una infección por CCV.
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II.6.c. Generación de vacunas basadas en FIPV contra la hepatitis infecciosa canina
Objetivo: Desarrollo de vacunas contra el adenovirus 1 de los caninos basada un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes de las proteínas estructurales relacionados con la protección del adenovirus 1 de los caninos se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRD1\Delta3ABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de (partes de) los genes de las proteínas estructurales relacionados con la protección del adenovirus 1 de los caninos se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes de las proteínas estructurales relacionados con la protección de adenovirus I de los caninos pueden ser introducidos en, y expresados por una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna contra la hepatitis infecciosa de los animales caninos y una infección por el CCV.
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II.6.d. Generación de vacunas basadas en FIPV contra enfermedades hemorrágicas de los cachorros
Objetivo: Desarrollo de vacunas contra los herpesvirus 1 de los caninos basada en un FIPV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, ICP0, ICPl e ICP4 del herpesvirus de los caninos relacionados con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en pBRDl1\DeltaABC y pBRDI1\Delta7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes por recombinación RNA-RNA entre transcritos run-off de vectores de transcripción y el genoma del mFIPV como se ha descrito antes. Los virus resultantes fueron genéticamente confirmados by RT-PCR análisis. La expresión de los genes insertados se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, gM, ICP0, ICPl e ICP4 del herpesvirus de los caninos pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del FIPV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra el herpesvirus 1 de los caninos y el CCV.
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III. Virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV) III.1.1. Generación de una vacuna viva y atenuada contra el TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna viva y atenuada contra el TGEV.
Propuesta: Para este objetivo se generaron virus mutantes por deleción del TGEV recombinantes que carecen de los genes no esenciales 3ab y/o 7.
Método: Se generaron virus recombinantes como se ha descrito por Almazan et al. (2000). A partir de pBAC-TGEV^{FL}, un clon de cDNA de TGEV infeccioso colocado detrás de un promotor de CMV en pBeloBAC11, se delecionaron los genes 3AB y 7 mediante técnicas de clonación estándares, dejando intactos los marcos de lecturas abiertos y las secuencias reguladoras de la transcripción. Células epiteliales de testículos de cerdos (abreviadamente ST por la expresión inglesa Swine Testis) se transfectaron con este derivado pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7 (pBAC-TGEV^{FL}). Los virus TGEV recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por RT-PCR en cuanto a la ausencia de los genes 3ab y/o 7. Infestando células de ST se generaron grandes cantidades de los TGEV con deleciones.
Conclusión: Se generó TGEV recombinante que carecía de los genes 3AB y 7. Estos virus pueden funcionar como una vacuna viva y atenuada contra el TGEV.
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III.2 Generación de vacunas multivalentes basadas en el TGEV
Objetivo: Desarrollo de vacunas multivalentes basadas en un TGEV vivo y atenuado como vector.
Propuesta: Casetes de expresión de genes relacionados con la protección de agentes patógenos porcino se introdujeron en el genoma del TGEV en combinación con deleciones atenuantes de genes no esenciales y transposiciones genómicas. Los casetes de expresión contienen las secuencias reguladoras de la transcripción del TGEV delante de (partes del) gen que se ha de expresar.
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III.2.a. Construcción de una vacuna multivalente contra el parvovirus porcino (PPV) vacuna basada en un vector del TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna basada un TGEV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes del) el gen R3 relacionado con la protección, que codifica las proteínas de la cápsida VP1 y VP2 se colocó en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujo en un derivado de pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes transfectando células de ST con este derivado por deleción pBAC-TGEV^{FL} que contiene (partes de) el gen R3 relacionado con la protección. Los virus resultantes se confirmaron genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión del gen R3 insertado se confirmó análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección puede ser introducido en, y expresado por, una cepa del TGEV atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un parvovirus porcino y una infección por el TGEV.
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III.2.b. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la gripe de los cerdos basada un vector del TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la gripe de los cerdos basada en un TGEV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) relacionados con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en un derivado de pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes transfectando células de ST con este derivado por deleción pBAC-TGEV^{FL} que contiene (partes de) los genes de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) relacionados con la protección. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes insertados de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Parte de) los genes de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del TGEV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un virus de la gripe de los cerdos y una infección por el TGEV.
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III.2.c. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la fiebre porcina africana basada un vector del TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la fiebre porcina africana basada en un TGEV vivo y atenuado como vector.
Método: (Partes de) los genes que codifican las proteínas estructurales relacionados con la protección se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en un derivado de pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes transfectando células de ST con este derivado por deleción pBAC-TGEV^{FL} que contiene (partes de) los genes que codifican las proteínas estructurales relacionados con la protección. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes que codifican las proteínas estructurales se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes que codifican las proteínas estructurales pueden ser introducidos por, y expresados en, una cepa del TGEV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un virus de la fiebre porcina africana y una infección por un TGEV.
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III.2.d. Construcción de una vacuna multivalente contra el tipo 2 del circovirus porcino basada en un vector del TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el tipo 2 del circovirus porcino basada en una cepa del TGEV viva y atenuada como vector.
Método: (Partes de) los genes C1, C2, V1 y V2 relacionados con la protección del tipo 2 del circovirus porcino se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en un derivado de pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes transfectando células de ST con este derivado por deleción pBAC-TGEV^{FL} que contiene (partes de) los genes C1, C2, V1 y V2 relacionados con la protección del tipo 2 del circovirus porcino. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes C1, C2, V1 y V2 relacionados con la protección del tipo 2 del circovirus porcino se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes C1, C2, V1 y V2 relacionados con la protección del tipo 2 del circovirus porcino pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa de TGEV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra el tipo 2 del circovirus porcino y una infección por
el TGEV.
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III.2.e. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino basada en un vector del TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna multivalente contra el virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino basada en un TGEV como vector.
Método: (Partes de) los ORF2 a ORF7 relacionados con la protección del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en un derivado de pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes transfectando células de ST con este derivado por deleción pBAC-TGEV^{FL} que contiene (partes de) los ORF2 a ORF7 relacionados con la protección del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de ORF2 a ORF7 del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los ORF2 a ORF7 relacionados con la protección del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del TGEV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra un virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino y una infección por TGEV.
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III.2.f. Construcción de una vacuna multivalente contra el virus de la glosopeda basada en un vector del TGEV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la glosopeda basada en una del TGEV viva y atenuada como vector.
Método: (Partes de) las secuencias relacionadas con la protección que codifican las proteínas VP1 a VP4 del virus de la glosopeda se colocaron en un casete de expresión y subsiguientemente se introdujeron en un derivado de pBAC-TGEV^{FL} que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes transfectando células de ST con este derivado por deleción pBAC-TGEV^{FL} que contiene (partes de) las secuencias relacionadas con la protección que codifican las proteínas VP1 a VP4 del virus de la glosopeda. Los virus resultantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de las secuencias relacionadas con la protección que codifican las proteínas VP1 a VP4 del virus de la glosopeda se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) las secuencias relacionadas con la protección que codifican las proteínas VP1 a VP4 del virus de la glosopeda pueden ser introducidas en, y expresadas por, una cepa del TGEV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente contra el virus de la glosopeda y una infección por el TGEV.
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III.3. Generación de virus recombinantes con orden de genes transpuesto
Objetivo: Desarrollo de una vacuna del TGEV en la cual la deleción de genes no esenciales está combinada con un orden de genes transpuesto moviendo el gen N a una posición en la región 5' del gen S en el genoma del TGEV.
Método y Resultados: Se generaron virus recombinantes como se describe por Almazan et al. (2000). A partir de pBAC-TGEV^{FL}, un clon de cDNA de TGEV cDNA infeccioso se colocó detrás de un promotor de CMV plBeloBAC11, se delecionaron los genes 3ab y 7 mediante técnicas de clonación estándares, dejando intactos los marcos de lectura abiertos circundantes y las secuencias reguladoras de la transcripción. Además se clonó el gen N en una posición en el genoma en la región 5' del gen S. Células epiteliales de testículos de cerdo (ST) se transfectaron con este derivado de pBAC-TGEV^{t} - que carece de los genes 3ab y 7 y tiene un genoma transpuesto. Los virus TGEV recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por RT-PCR en cuanto a la ausencia de los genes 3ab y/o 7. Infectando células de ST se generaron grandes cantidades de virus recombinantes TGEV por deleción.
Conclusión: Se generó un TGEV recombinante que carecía de los genes 3ab y 7, y que tenía un orden de genes transpuesto. Estos virus funcionan como una vacuna viva y atenuada contra un TGEV, así como contra otros agentes patógenos porcinos cuando llevan apropiadamente incorporados los genes que codifican los antígenos relevantes.
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IV. Virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV) IV.1. Generación de una vacuna viva y atenuada contra el IBV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna viva y atenuada contra el IBV.
Propuesta: Se generaron virus mutantes del IBV por deleción que carecen de los genes no esenciales 3a/b y/o 5a/b. Para adquirir virus vacunales que protejan contra los múltiples serotipos del IBV se incorporaron construcciones de genes de la proteína de la espícula derivados de dichos diferentes virus.
Método: Se generaron virus recombinantes como se ha descrito por Casais et al. (2001). Se ensamblaron clones de cDNA de IBV infeccioso en el genoma del virus vaccinia usando ligación secuencial in vitro de fragmentos de cDNA derivados de los plásmidos pFRAG1, pFRAG2 y pFRAG3, seguido por su clonación directa en el genoma del virus vaccinia vNotI/tk como se ha descrito (1a). Los genes 3a/b y 5a/b se eliminaron de pFRAG3, por mutagénesis con PCR dejando intactos los marcos de lectura abiertos circundantes y las secuencias reguladoras de la transcripción, dando como resultado pFRAG3\Delta. El gen S en pFRAG3\Delta pudo ser reemplazado por los genes S derivados de diferente serotipos del IBV usando RT-PCR. Se generaron virus vaccinia recombinantes por recombinación entre los siguientes virus de la viruela de las aves (fowlpox) HP 1.441 y el IBV vNotI/tk en una mezcla de ligación in vitro. Los virus recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por PCR y análisis por transferencia Southern. Finalmente, el IBV infeccioso que carece de los genes 3a/b y/o 5a/b se generó como sigue: Células de riñón de pollo (abreviadamente en los sucesivo CK por la expresión inglesa Chick Kidney) fueron infectadas con el virus de la viruela de las aves recombinante que expresa RNA-polimerasa de T7. Subsiguientemente las células se transfectaron con DNA aislado de virus vaccinia recombinante que contiene el cDNA del IBV que carece de los genes 3a/b y 5a/b. 3 días después de la infección se recogió el medio de cultivo y se usó para infectar células CK para generar grandes cantidades de IBV recombinante. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Conclusión: Se generó IBV recombinante que carecía de los genes 3a/b y/o 5a/b. Estos virus pueden funcionar como una vacuna viva y atenuada contra el IBV. Reemplazando el gen S, pudieron obtenerse IBV recombinantes que funcionan como vacunas vivas y atenuadas contra diferentes serotipos del IBV.
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IV.2. Generación de vacunas multivalentes basadas en IBV
Objetivo: Desarrollo de vacunas multivalentes basadas en una cepa de IBV viva y atenuada como vector.
Propuesta: Se introdujeron casetes de expresión de genes relacionados con la protección de agentes patógenos de pollo en el genoma del IBV en combinación con deleción atenuante de genes no esenciales. Los casetes de expresión contienen la secuencia reguladora de la transcripción (CTTAACAA) del IBV delante de (partes del) gen que se ha de expresar.
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IV.2.aI. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra más de un serotipo del IBV serotipo
Objetivo: Desarrollo de una vacuna del IBV vacuna basada en una cepa del IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales y protege contra más de un serotipo.
Método: (Partes del) el gen relacionado con la protección del gen S del IBV de un serotipo del IBV diferente se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en FRAG3\Delta. La construcción más grande contenía una copia extra completa del gen S excepto la secuencia que codifica el péptido señal; otra construcción tenía un gen S truncado terminalmente en el extremo carboxi que carecía del codón para el dominio transmembranal y el endodominio. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión apropiada de las construcciones del gen S heterólogo se verificó por análisis por inmunoprecipitación con antisueros específicos del tipo, usando lisados de células infectadas con virus recombinante radiomarcados.
Conclusión: (Partes de) el gen S del IBV relacionado con la protección de un serotipo del IBV diferente puede ser introducido en, y expresado por, una cepa del IBV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como vacunas multivalentes para proteger contra la infección por más de un serotipo del IBV.
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IV.2.aII. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la enfermedad de Newcastle
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la enfermedad de Newcastle (tipo 1 del paramixovirus aviar; APMV-1) basada en una cepa del IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes HN y F del APMV-1 relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en FRAG3\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes HN y F del APMV-1 relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa viva y atenuada del IBV. Los virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por el APMV-1 y el IBV.
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IV.2.b. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la gripe aviar
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la gripe aviar basada en una cepa de IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes HN y F del virus de la gripe aviar relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pFRAG3\Delta. Después de confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes HN y F del virus de la gripe aviar relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del IBV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por el virus de la gripe aviar y el IBV.
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IV.2.c. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la enfermedad causada por el virus de la anemia de los pollos (CAV)
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el CAV basada en una cepa del IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes V1, V2, y V3 del CAV relacionados con la protección se colocaron en un casete de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pFRAG3\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes V1, V2, y V3 del CAV relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del IBV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por el CAV y el IBV.
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IV.2.d. Construcción de una vacuna multivalente basada un vector de IBV que protege contra la reovirosis aviar
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra un reovirus aviar basada en una cepa del IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes \Phi1, \Phi2, y \Phi3 relacionados con la protección de un reovirus aviar se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujo en pFRAG3\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes \Phi1, \Phi2, y \Phi3 relacionados con la protección de un reovirus aviar pueden ser introducidos en, y expresado por, una cepa del IBV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por un reovirus aviar y por el IBV.
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IV.2.e. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la bursitis infecciosa
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) basada en una cepa del IBV que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) el gen VP2 del IBDV relacionado con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pFRAG3\Delta. Después de confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión del gen extraño fue confirmada por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes del) gen VP2 relacionado con la protección del IBDV pueden ser introducido en, y expresado por, una cepa del IBDV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por IBDV aviar y el IBV.
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IV.2.f. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector de IBV que protege contra la enfermedad de Marek
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el herpesvirus gallináceo 2 (virus de la enfermedad de Marek) basada en una cepa del IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) el gen gB del herpesvirus gallináceo 2 relacionado con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pFRAG3A. Después de confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) el gen gB del herpesvirus gallináceo 2 relacionado con la protección puede ser introducido en una cepa del IBV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por herpesvirus gallináceo 2 y el IBV.
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IV.2.g. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del IBV que protege contra la laringotraqueitis infecciosa
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el herpesvirus gallináceo 1 (virus de la laringotraquitis infecciosa) basada en una cepa del IBV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes gB, gC, gD, gE, gH, gI, gK, gL y gM del herpesvirus gallináceo 1 relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pFRAG3\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes del herpesvirus gallináceo 1 relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del IBV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por herpesvirus gallináceo 1 y el IBV.
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IV.3. Generación de virus recombinantes con el orden de genes transpuesto
Objetivo: Desarrollo de una vacuna del IBV en la cual la deleción de los genes no esenciales está combinada con un orden de genes transpuesto moviendo el gen N a una posición en la región 5' del gen S en el genoma del IBV.
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Método: Se generaron virus recombinantes como se ha descrito por Casais et al. (2001). Clones de cDNA del IBV infecciosos se ensamblaron en el genoma del virus vaccinia usando ligación secuencial in vitro de fragmentos de cDNA derivados de los plásmidos pFRAG1, pFRAG2 y pFRAG3, seguido por clonación directa en el genoma del virus vaccinia vNotI/tk como se ha descrito (1a). Los genes 3a/b y 5a/b se eliminaron del plásmido pFRAG3, por mutagénesis por PCR dejando intactos los marcos de lectura abiertos y las secuencias reguladoras de la transcripción. Además, el gen N junto con su secuencia reguladora de la transcripción (TRS) se movió a una posición en la región 5' del gen S dando como resultado pFRAG3A transpuesto. Se generaron virus vaccinia recombinantes por recombinación entre el virus de la viruela de las aves HP1.441 y la mezcla de ligación in vitro vNotIltk-IBV. Los virus recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por PCR y análisis de transferencia Southern. Finalmente, se generó IBV infeccioso que carecía de los genes 3a/b y 5a/b y con un orden de genes transpuesto, como sigue: Células de riñón de pollo (CK) fueron infectadas con el virus de la viruela de las aves recombinante que expresa RNA-polimerasa de T7. Subsiguientemente las células se transfectaron con DNA aislado del virus vaccinia recombinante que contiene el clon del cDNA del IBV que carecía de los genes 3a/b y 5a/b en combinación con el orden de genes transpuesto. 3 días después de la infección se recogió el medio de cultivo y se usó para infectar células CK para generar grandes cantidades del IBV recombinante. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Conclusión: Se generó un IBV recombinante que carecía de los genes 3a/b y 5a/b en combinación con el orden de genes transpuesto. Estos virus funcionan como vacuna una viva y atenuada contra el IBV. Cuando estos virus se combinan con construcciones del gen S gen procedentes de otros serotipos del IBV y/o construcciones de genes de otros agentes patógenos aviares adicionales se pueden generar vacunas multivalentes.
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V. Coronavirus humano (HCoV), cepa 229E (HCoV-229E) V.1. Generación de una vacuna viva basada en la cepa HCoV-229E atenuada
Objetivo: Desarrollo de una vacuna viva y atenuada contra la cepa HCoV-229E.
Propuesta: Se generaron virus mutantes por deleción del HCoV recombinante que carece de los genes no esenciales 4a/b.
Método: Se generaron virus recombinantes esencialmente como se ha descrito por Thiel et al. (2001). En el genoma del virus vaccinia se ensamblaron clones de cDNA de HCoV infeccioso. El virus vaccinia vHCoV-vec-1 contiene un fragmento de cDNA de 22,5 kpb que codifica el extremo 5' del genoma del HCoV. Este fragmento se eliminó del genoma del virus vaccinia por digestión con Bsp120I, se digirió con MluI y se ligó a un fragmento de cDNA de pME\Delta que se obtuvo por digestión con MluI/EagI. El pME\Delta contiene un fragmento de cDNA que codifica el extremo 3' del genoma del HCoV, pero carece de los genes 4a/b, sin perturbar a los otros genes o a las secuencias reguladoras de la transcripción. El pME\Delta se derivó de pME usando métodos convencionales de mutagénesis por PCR. Los productos de ligación se ligaron al DNA del virus vaccinia vNotI/tk. Se generaron virus vaccinia recombinantes como se ha descrito antes. Los virus vaccinia recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por análisis por PCR y transferencia Southern. Finalmente, se generó, HCoV infeccioso que carece de los genes 4a/b, como sigue: Células de riñón de pollo (CK) fueron infectadas con el virus de la viruela de las aves recombinante que expresa RNA-polimerasa de T7. Subsiguientemente las células se transfectaron con DNA aislado del virus vaccinia recombinante que contiene el clon del cDNA del IBV que carece de los genes 4A/B. 3 días después de la infección se recogió el medio de cultivo y se usó para infectar células de fibroblastos humanos grandes (MCR-5) para generar grandes cantidades del IBV recombinante. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Conclusión: Se generó HCoV recombinante que carecía de los genes 4a/b. Estos virus pueden funcionar como una vacuna atenuada contra la cepa HCoV-229E.
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V.2. Generación de una vacuna viva y atenuada contra la cepa OC43 del HCoV
Objetivo: Desarrollo de una vacuna viva y atenuada contra la cepa HCoV-OC43.
Propuesta: Se generaron virus mutantes por deleción de HCoV recombinante que carecen de los genes 4A/B, y contienen un gen de la proteína S híbrida, que codifica el ectodominio del HCoV-OC43.
Método: Se generaron virus recombinantes esencialmente como se ha descrito por Thiel et al. (2001). En el genoma del virus vaccinia se ensamblaron clones de cDNA de HCoV infeccioso. El virus vaccinia vHCoV-vec-1 contiene un fragmento de cDNA de 22,5 kpb que codifica el extremo 5' del genoma del HCoV. Este fragmento se eliminó del genoma del virus vaccinia por digestión con Bsp120I, se digirió con MluI y se ligó a un fragmento de cDNA de pME\Delta-SOC43 que se obtuvo por digestión con MluI/EagI. El pME\Delta-SOC43 contiene un fragmento de cDNA que codifica el extremo 3' del genoma del HCoV, carece de los genes 4a/b, y contiene un gen de la proteína S híbrida sin perturbar a los otros genes o a las secuencias reguladoras de la transcripción. El gen de la proteína S híbrida contiene la región del gen S de HCoV-OC43 que codifica el ectodominio de la proteína S, mientras que el resto del gen se deriva del gen HCoV-229E. pMEA-SOC43 se derivó de pME\Delta usando métodos convencionales de RT-PCR. Los productos de ligación se ligaron al DNA del virus vaccinia vNotI/tk. Se generaron virus vaccinia recombinantes como se ha descrito antes. Los virus vaccinia recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por análisis por PCR y transferencia Southern. Finalmente, se generó, HCoV infeccioso que carece de los genes 4a/b, como sigue: Células de riñón de pollo (CK) fueron infectadas con el virus de la viruela de las aves recombinante que expresa RNA-polimerasa de T7. Subsiguientemente las células se transfectaron con DNA aislado del virus vaccinia recombinante que contiene el clon del cDNA del IBV que carece de los genes 4a/b. 3 días después de la infección se recogió el medio de cultivo y se usó para infectar células de fibroblastos humanos grandes (MCR-5) para generar grandes cantidades del HCoV recombinante. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Conclusión: Se generó HCoV recombinante que carecía de los genes 4a/b. Estos virus contienen el ectodominio de la proteína S de HCoV-OC43 y pueden funcionar por tanto como una vacuna viva y atenuada contra la cepa HCoV-OC43.
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V.3. Generación de vacunas multivalentes basadas en el HCoV
Objetivo: Desarrollo de vacunas multivalentes basadas en HCoV vivo y atenuado como vector.
Propuesta: Casetes de expresión de los genes relacionados con la protección de agentes patógenos humanos se introdujeron en el genoma del HCoV en combinación con deleción atenuante de genes no esenciales. Los casetes de expresión contienen la secuencia reguladora de la transcripción (TCTCAACT) del HCoV delante de (partes del) gen que se ha de expresar.
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V.3.a. Construcción de una vacuna multivalente basada un vector de HCoV que protege contra el virus sincitial respiratorio (RSV)
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el RSV basada en una cepa de HCoV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes HN y F del RSV relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pME\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes HN y F del RSV relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa de HCoV viva y atenuada. Esto virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por el RSV y el HCoV.
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V.3.b. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del HCoV que protege contra rotavirus
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra rotavirus basada en una cepa del HCoV viva y atenuad que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes de rotavirus VP4, VP6 y VP7 relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pME\Delta. Después de confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes de rotavirus VP4, VP6 y VP7relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del HCoV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por rotavirus y HCoV.
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V.3.c. Construcción de una vacuna multivalente basada un vector del HCoV que protege contra virus similares al de Norwalk
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra virus similares al del Norwalk basada en una cepa del HCoV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) el gen de la cápsida del virus similar al de Norwalk relacionado con la protección se colocó en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujo en pME\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones por análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión del gen extraño se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) el gen de la cápsida del virus similar al de Norwalk relacionado con la protección puede ser introducido en, y expresado por, una cepa de HCoV viva y atenuada. Este virus recombinante puede funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por virus similares al de Norwalk y HCoV.
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V.3.d. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector del HCoV que protege contra el virus de la gripe
Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el virus de la gripe basada en una cepa del HCoV viva y atenuada que carece de genes no esenciales.
Método: (Partes de) los genes H y N del virus de la gripe relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión, y subsiguientemente se introdujeron en pME\Delta. Después de la confirmación de todas las construcciones análisis de restricción y secuencias, se generaron virus recombinantes como se ha descrito antes. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR. La expresión de los genes extraños se confirmó por análisis por inmunoprecipitación.
Conclusión: (Partes de) los genes H y N del virus de la gripe relacionados con la protección pueden ser introducidos en, y expresados por, una cepa del HCoV viva y atenuada. Estos virus recombinantes pueden funcionar por tanto como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones por el virus de la gripe y el HCoV.
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V.4. Generación de virus recombinantes con orden de genes transpuesto
Objetivo: Desarrollo de una vacuna del HCoV en la cual la deleción de genes no esenciales está combinada con un orden de genes transpuesto moviendo el gen N a una posición en la región 5' del gen S en el genoma del HCoV.
Método: Se generaron virus recombinantes esencialmente como se ha descrito por Thiel et al. (2001). En el genoma del virus vaccinia se ensamblaron clones de cDNA del HCoV infeccioso. El virus vaccinia vHCoV-vec-1 contiene un fragmento de cDNA de 22,5 kpb que codifica el extremo 5' del genoma del HCoV. Este fragmento se eliminó del genoma del virus vaccinia por digestión con Bsp120I, se digirió con MluI y se ligó a un fragmento de cDNA de pME\Delta transpuesto que se obtuvo por digestión con MluI/EagI. El pME\Delta transpuesto contiene un fragmento de cDNA que codifica el extremo 3' del genoma del HCoV, pero carece de los genes 4A/B, sin perturbar a los otros genes o a las secuencias reguladoras de la transcripción (TRS) y en el cual el gen N, junto con su secuencia reguladora de la transcripción estaba posicionada en la región 5' del gen S. El pME\Delta transpuesto se derivó de pME usando métodos convencionales de mutagénesis por PCR. Los productos de ligación se ligaron al DNA del virus vaccinia vNotI/tk. Se generaron virus vaccinia recombinantes como se ha descrito antes. Los virus vaccinia recombinantes se purificaron en placa y se caracterizaron por análisis por PCR y transferencia Southern. Finalmente, se generó, HCoV infeccioso que carece de los genes 4A/B, como sigue: Células de riñón de pollo (CK) fueron infectadas con el virus de la viruela de las aves recombinante que expresa RNA-polimerasa de T7. Subsiguientemente las células se transfectaron con DNA aislado del virus vaccinia recombinante que contiene el clon del cDNA del HCoV que carece de los genes 4A/B. 3 días después de la infección se recogió el medio de cultivo y se usó para infectar células de fibroblastos humanos grandes (MCR-5) para generar grandes cantidades del HCOV recombinante. Los virus recombinantes fueron confirmados genéticamente por análisis por RT-PCR.
Conclusión: Se generaron virus recombinantes del HCoV combinación que carecían de los genes 4A/B con un orden de genes transpuesto. Estos virus pueden como una vacuna viva y atenuada contra la cepa HCoV-229E. Se pueden generar vacunas multivalentes cuando estos virus se combinan con construcciones del gen S de la cepa HcoV-OC43 y/o construcciones de genes de otros agentes patógenos humanos.
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Referencias
1. Bredenbeek, P. J., C. J. Pachuk, A. F. Noten, J. Chante, W. Luytjes, S. R. Weiss, and W. J. Spaan. 1990. The primary structure and expression de the second open reading frame de the polymerase gene of the coronavirus MHV-A59; a highly conserved polymerase is expressed by an efficient ribosomal frameshifting mechanism. Nucleic Acids Res. 18: 1825-32.
1a. Casais, R., V. Thiel, S.G. Siddell, D. Cavanagh, and P. Britton. 2001. Reverse genetics system for the avian coronavirus infectious bronchitis virus. J. Virol. 75:12359-12369.
1c. Almazan, F., J.M. Gonzalez, Z. Penzes, A. Izeta, E. Calvo, J. Plana-Duran, and L. Enjuanes. 2000. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5516-5521.
1d. Fischer, F., C.F. Stegen, C.A. Koetzner, and P. S. Masters. 1997. Analysis of a recombinant Mouse Hepatitis Virus Expressing a foreign gene reveals a novels aspect de coronavirus transcription. J. Virol. 71:5148-5160.
2. Fischer, F., D. Peng, S. T. Hingley, S. R. Weiss, and P. S. Masters. 1997. The internal open reading frame within the nucleocapsid gene of mouse hepatitis virus encodes a structural protein that is not essential for viral replication. J. Virol. 71:996-1003.
2a. Herrewegh, A.A., 1. Smeenk, M.C. Horzinek, P.J.M. Rottier, and R.J. de Groot. 1998. Feline coronavirus type II strains 79-1683 y 79-1146 originate from a double recombination between feline corona-virus type l and canine coronavirus. J. Virol. 72: 4508-4514.
3. Hsue, B., T. Hartshorne, y P. Masters. 2000. Characterización of an essential RNA secondary structure in the 3' untranslated region of the murine coronavirus genome. J. Virol. 74:6911-6921.
4. Hsue, B., and P. S. Masters. 1999. Insertion of a new transcriptional unit into the genome de mouse hepatitis virus. J. Virol. 73:6128-6135.
5. Jacobs, L., W. Spaan, M. Horzinek, and B. van der Zeijst. 1981. Synthesis of subgenomic mRNA's de mouse hepatitis virus is initiated independently: evidence from UV transcription mapping. J. Virol. 39: 401-406.
6. Jendrach, M., V. Thiel, and S. Siddell. 1999. Characterization of an internal ribosome entry site within mRNA 5 of murine hepatitis virus. Arch. Virol. 144: 921-933.
7. Kuo, L., G. Godeke, M. Raamsman, P. Masters, and P. Rottier. 2000. Retargeting de coronavirus by substitution of the spike glycoprotein ectodomain: crossing the host cell species barrier. J. Virol. 74: 1393-1406.
8. Leibowitz, J., K. Wilhelmsen, and C. Bond. 1981. The virus-specific intracellular RNA species of two murine coronaviruses: MHV-a59and MHV-JHM. Virology. 114:39-51.
9. Masters, P. S. 1999. Reverse genetics of the largest RNA viruses. 53:245-264. Adv. Virus Res. 53: 245-264.
10. Masters, P. S., C. A. Koetzner, C. A. Kerr, and Y. Heo. 1994. Optimization of targeted RNA recombination and mapping of a novel nucleocapsid gene mutation in the coronavirus mouse hepatitis virus. J. Virol. 68:328-37.
10a. Thiel, V., J. Heroid, B. Schelle, and S. Siddell. 2001. Infectious RNA transcribed in vivo from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J. Gen. Virol. 82, 1273-1281
11. de Vries, A.A.F, A.L. Glaser, M.J.B. Raamsman, C.A.M. de Haan, S. Sarnataro, G.-J. Godeke, and P.J. M. Rottier. 2000. Genetic manipulation of equine arteritis virus usíng full-length cDNA clones: separation of overlapping genes and expression of a foreign epitope. Virology 270:84-97.
12. Godeke, G.-J., C.A.M. de Haan, J.W.A. Rossen, H. Vennema, and P.J.M. Rottier. 2000. Assembly of spikes into coronavirus particles is mediated by the carboxy-terminal domain de the de spike (S) protein. J. Virol. 74:1566-1571.
13. Vennema, H., G.-J. Godeke, J.W.A. Rossen, W.F. Voorhout, M.C. Horzinek, D.-J.E. Opstelten, and P.J.M. Rottier. 1996. Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like particles by coexpression de viral envelope proteins. EMBO J. 15:2020-2028.

Claims (12)

1. Una partícula similar a un virus aislado o recombinante capaz de replicación, estando dicha partícula derivada de un coronavirus, en donde los genes para las proteínas estructurales no están presentes en el orden 5'-S-E-M-N-3'.
2. Una partícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde está delecionado al menos un fragmento funcional de un ácido nucleico que codifica un producto de gen viral distinto de una polimerasa o una proteína estructural N, M, E o S.
3. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, provista de al menos una proteína biológicamente activa o uno de sus fragmentos asociada con la superficie de dicha partícula similar a virus distinta del ectodominio natural de una cualquiera de las proteínas del coronavirus original.
4. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, provista de al menos una proteína biológicamente activa o uno de sus fragmentos asociado con el interior de dicha partícula similar a virus distinta del endodominio natural de una cualquiera de las proteínas del coronavirus original.
5. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, provista de al menos medios de diana funcionales asociados con la superficie de dicha partícula similar a virus distintos de la proteína de la espícula natural del coronavirus original.
6. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha partícula está provista de un genoma de coronavirus en donde ha sido insertado un gen extraño o partes del mismo.
7. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que está atenuada.
8. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un vehículo de administración de genes.
9. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un vehículo de administración de genes o epítopos.
10. Una composición que comprende una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso terapéutico.
11. Una composición que comprende una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso como vacuna o inmunógeno.
12. Una composición que comprende una particular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en diagnóstico.
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7556957B2 (en) 2001-05-17 2009-07-07 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Coronavirus-like particles comprising functionally deleted genomes
JP4242607B2 (ja) * 2002-07-04 2009-03-25 学校法人北里研究所 ネコ伝染性腹膜炎ワクチン
ATE445412T1 (de) * 2003-03-03 2009-10-15 Intervet Int Bv Ein virus der infektiösen bronchitis mit veränderten spike-gen
AU2004277370A1 (en) * 2003-04-28 2005-04-14 Sequoia Pharmaceuticals, Inc. Antiviral agents for the treatment, control and prevention of infections by coronaviruses
AU2004243886A1 (en) * 2003-05-27 2004-12-09 Anticancer, Inc. Imageable animal model of SARS infection
WO2004110483A1 (en) * 2003-05-31 2004-12-23 Yiyou Chen Method and composition of a novel vaccine design for the prevention and treatment of sars
KR101206206B1 (ko) * 2003-07-22 2012-11-29 크루셀 홀란드 비.브이. 사스-코로나바이러스에 대한 결합분자 및 그것의 용도
CN1324049C (zh) * 2003-08-04 2007-07-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗sars冠状病毒基因工程抗体
JP2007502612A (ja) † 2003-08-18 2007-02-15 アムステルダム インスティチュ−ト オブ ヴァイラル ゲノミックス ベー．フェー． コロナウイルス、核酸、蛋白質、ならびにワクチンの生成方法、薬剤および診断
WO2005056781A1 (fr) * 2003-12-02 2005-06-23 Institut Pasteur Utilisation des proteines et des peptides codes par le genome d'une nouvelle souche de coronavirus associe au sras.
US20080027006A1 (en) * 2004-02-12 2008-01-31 The Regents Of The University Of Colorado Compositions And Methods For Modification And Prevention Of Sars Coronavirus Infectivity
US20060199176A1 (en) * 2004-07-15 2006-09-07 Yeau-Ching Wang Coronavirus S peptides
EP1650308A1 (en) * 2004-09-03 2006-04-26 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
AU2005279303B2 (en) * 2004-09-03 2011-10-27 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
KR100915980B1 (ko) 2004-11-26 2009-09-10 디엔에이 셔틀 바이오팜 컴퍼니, 엘티디. 코로나바이러스-유사 입자를 인코딩하는 발현 벡터
AU2004325189B2 (en) * 2004-11-26 2009-08-13 Dna Shuttle Biopharm Co., Ltd. An expression vector encoding coronavirus-like particles
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
JP2012525133A (ja) * 2009-05-01 2012-10-22 レッドバイオテック・アーゲー 多重遺伝子ベクターによってコードされる組換えウイルス様粒子
EA201201620A1 (ru) * 2010-06-02 2013-07-30 Авир Грин Хилз Байотекнолоджи Рисерч Дивелопмент Трейд Аг Способ получения рнк-вируса
CN101948516B (zh) * 2010-08-30 2013-05-01 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种以痘苗病毒载体为基础的反向遗传学系统建立及应用
CN103316337B (zh) * 2010-08-30 2014-08-13 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 痘苗病毒载体基因修饰系统的建立及重组冠状病毒的应用
BR112013022011A2 (pt) 2011-03-02 2016-11-16 Intervet Int Bv proteína da espícula do vírus da bronquite infecciosa ou um fragmento imunogênico da mesma, estrutura de proteína, molécula de dna, plasmídeo, vírus carreador recombinante vivo aviário, vacina, e, célula de mamífero
JP6224015B2 (ja) * 2012-03-13 2017-11-01 ユニベルシタイト ユトレヒト ホールディング ベーフェー 二重特異性アダプター
US20170266274A1 (en) 2014-08-08 2017-09-21 Universiteit Utrecht Holding B.V. Mutant porcine epizootic diarrhea virus for use in a vaccine
GB201601498D0 (en) * 2016-01-27 2016-03-09 Pirbright Inst The Coronavirus
CN112300251B (zh) * 2020-02-24 2022-04-05 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗
WO2021232067A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Glg Pharma, Llc Stats3 inhibition for treatment and prevention of human coronavirus infection
CN111732637B (zh) * 2020-05-25 2022-03-01 上海交通大学 抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染宿主细胞的多肽及其应用
MX2023002413A (es) * 2020-08-27 2023-05-23 Cz Biohub Sf Llc Proteinas de fusion inmunogenicas de coronavirus y metodos relacionados.
CN112250738B (zh) * 2020-09-02 2023-05-12 兰州大学 严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定方法
US11479582B2 (en) 2020-10-16 2022-10-25 King Faisal University Anti-SARS-CoV-2 fusion peptides
US20230408515A1 (en) * 2020-11-10 2023-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Engineered protein for rapid, efficient capture of pathogen-specific antibodies
CN113151359A (zh) * 2020-12-25 2021-07-23 广州医科大学 一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装体系及其应用
CN112852762B (zh) * 2021-04-02 2021-09-10 青岛海华生物医药技术有限公司 新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法
CN113713122A (zh) * 2021-08-24 2021-11-30 华中科技大学 一种与新冠病毒竞争性结合细胞表面受体的超分子
CN116042538B (zh) * 2022-11-24 2024-05-07 华中农业大学 一株猫冠状病毒及其应用
CN116808193B (zh) * 2023-08-29 2023-11-14 成都导飞科技有限公司 一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998049195A1 (en) * 1997-04-29 1998-11-05 Universiteit Utrecht Corona virus-like particles as tools for vaccination and therapy
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.

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