BRPI0407948B1 - “vacina para uso na proteção de aves domésticas contra a bronquite infecciosa, método para a preparação da mesma, e, uso da cepa beaudette de ibv” - Google Patents

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“VACINA PARA USO NA PROTEÇÃO DE AVES DOMÉSTICAS

CONTRA A BRONQUITE INFECCIOSA, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DA MESMA, E, USO DA CEPA BEAUDETTE DE IBV” A presente invenção diz respeito a uma vacina para uso na proteção de aves domésticas contra bronquite infecciosa (IB) que compreende um vírus da bronquite infecciosa atenuado (IBV) e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, um método para a preparação de uma tal vacina e ao uso de um IBV atenuado para a fabricação de uma vacina para a proteção de aves domésticas contra IB para a administração in ovo. O IBV é um membro do gênero Coronavirus, família Coronaviridae. Ele tem um genoma de RNA de sentido positivo, de filamento único de aproximadamente 28000 nucleotídeos associados com uma proteína de nucleocapsídeo, N, circundados por uma membrana/ envelope lipídicos.

Três outras proteínas virais estão associadas com o envelope: a glicoproteína com ponta (spike) grande, S; uma proteína de membrana integral menor, M; e a proteína E, a menor das proteínas associadas com envelope. A proteína S de coronavirus é uma glicoproteína tipo I que oligomeriza no retículo endoplasmático para formar trímeros que constituem as pontas do virion de coronavirus observáveis pela microscopia eletrônica. A proteína S é montada em membranas de virion, possivelmente através de interações não covalentes com a proteína M, mas não é requerida para a formação de partículas semelhantes a vírus de coronavirus. A seguir da incorporação em partículas de coronavirus, determinadas pelo domínio de terminal carbóxi, a glicoproteína S é responsável pela ligação ao receptor de célula alvo e fusão das membranas virais e celulares, desempenhando um papel principal na infecção de células suscetíveis. Além disso, a proteína com ponta de IBV está envolvida na indução de uma resposta imuno protetora quando inoculada em galinhas (para uma revisão ver Cavanagh, em: The Coronaviridae; ed: S. G. Siddell, Plenum Press, 73 a 113,1995).

Todas as glicoproteínas de coronavírus S, consistem de quatro domínios; uma sequência de sinal, que é clivada durante a síntese, o ectodomínio que está presente no lado de fora da partícula de virion, a região de transmembrana responsável pela ancoragem da proteína S na bicamada lipídica da partícula de virion e a cauda citoplasmática que pode interagir com outras proteínas IBV, tais como a proteína de membrana (E) e a proteína de membrana integral (Μ). A glicoproteína S de IBV (1162 aminoácidos) é clivada em duas subunidades, SI (535 aminoácidos 90 kDa) e S2 (627 aminoácidos 84 kDa). A subunidade S2 de terminal C associa-se não covalentemente com a subunidade SI de terminal N e contém os domínios de cauda citoplasmática de transmembrana e terminal C. A subunidade SI contém a atividade de ligação de receptor da proteína S.

Em estudos anteriores com outros coronavíms, o vírus da hepatite de murino (MHV) e o vírus da gastroenterite transmissível (TGEV), um gene com ponta de uma cepa viral doadora (virulenta) foi usado para substituir o gene com ponta de uma cepa viral receptora para investigar os determinantes de patogênese e tropismo celular. Estes estudos mostraram que tanto as propriedades in vitro (tropismo celular) quanto as propriedades in vivo (virulência) da cepa viral doadora foram adquiridas pela cepa viral receptora. Foi concluído que o gene com ponta é um determinante de tropismo celular e virulência (Phillips et ai, J. Virol. 73, 7752 a 7760, 1999;

Sanchez et al, J. Virol. 73, 7607 a 7618,1999; Das Sarma et al., J. Virol. 74. 9206 a 9213, 2000; Navas et al., J. Virol, 75, 2452 a 2457, 2001 e Kuo et al, J. Virol. 74 1393 a 1406, 2000; pedido de patente internacional WO 01/39797). Pedido de patente internacional WO 98/49195 divulga um coronavírus (por exemplo, MHV) em que uma parte do gene da proteína com ponta foi substituído pela parte correspondente do gene da proteína com ponta de um coronavírus não relacionado (por exemplo, FIPV), adquirindo deste modo uma outra especificidade de substrato celular permitindo que o vírus recombinante alveje outros tipos de célula. A bronquite infecciosa é uma doença respiratória aguda, altamente contagiosa das aves domésticas (galinha), causada pelo víms IB. Os sinais clínicos de IB incluem espirro/estalo, estertor traqueal, descarga nasal e chiadeira. Os sinais clínicos são mais óbvios em pintinhos do que nas aves adultas. As aves podem parecer deprimidas e consumir menos alimento. As aves para a produção de came têm ganho de peso reduzido, enquanto as aves para a postura de ovos põem menos ovos. A infecção respiratória pré dispõem as galinhas às infecções bacterianas secundárias, que podem ser fatais em pintinhos. O víms também pode causar dano permanente ao oviduto, especialmente em pintinhos, levando à produção e qualidade de ovos reduzidas e ao rim, algumas vezes levando às doenças renais, que podem ser fatais.

Tanto as vacinas de víms vivo quanto inativado são usadas na vacinação contra IB. Até agora, as vacinas mais eficazes são víms atenuados vivos empiricamente produzidos a seguir de passagens de repetição cega através de ovos embrionados até que um grau equilibrado desejado de atenuação e imunogenicidade tenha sido alcançado. Tais vacinas são geneticamente mal definidas e a base molecular da atenuação é desconhecida.

Desvantajosamente, na passagem serial a imunogenicidade do víms diminui o que freqüentemente resulta víms de vacina seguros mas menos eficazes.

Alcançar um grau ‘equilibrado’ de atenuação - suficiente de modo a não ser patogênico mas não excessiva até o ponto em que falharia em induzir respostas imunes fortes - é um método de tentativa e erro que toma o resultado deste método de atenuação convencional incerto.

Como indicado acima, uma das propriedades biológicas do IBV é que ele se toma vimlento e menos imunogênico com passagens sucessivas do vírus em embriões. A cepa Beaudette de IBV é um tal vírus de passagem de embrião alta, (super-) atenuado, que não é considerado ser imunogênico (Geilhausen et ah, Arch Gesamte Virusforsch 40 285 a 290, 1973).

Em um pedido de patente recentemente publicado (WO 02/092827) o desenvolvimento de coronavíms vivos, atenuados por meio de r técnicas de DNA recombinante é divulgado. E nele sugerido que a introdução de supressões em genes não essenciais nos genomas de coronavírus resulta na atenuação destes vírus. O IBV exibe enorme variação antigênica, inicialmente reconhecido como sorotipos diferentes. A classificação de cepa sorotípicas de cepas do IBV é fundamentada na capacidade de uma cepa para induzir anticorpos de neutralização viral eficazes contra uma outra cepa (Cook et al, Avian Pathol., 733 a 741,1984). A proteína mais variável de IBV é a proteína com ponta. Ela define o sorotipo e é a indutora principal de respostas imunes protetoras. Um vírus de vacina do IBV de um sorotipo induz as respostas imunes que frequentemente protegem deficientemente contra IBV de outros sorotipos, por causa das diferenças nas proteínas S. Conseqüentemente as vacinas IB foram desenvolvidas contra muitos sorotipos. Entretanto, sorotipos anteriormente desconhecidos estão continuamente surgindo, criando uma exigência quanto a vírus de vacina homólogos, novos.

As vacinas de IBV vivas são usualmente administradas às galinhas no choco. A administração pode ser individualmente pelo gotejamento ocular ou intranasalmente, mas estas vias são caras por causa do trabalho necessário para a sua administração, em particular em bandos grandes de frango. Os métodos de aplicação de massa, incluindo pulverização e água de beber, também são frequentemente usados, mas problemas na obtenção de uma aplicação de vacina uniforme e inativação do vírus de vacina foram observados. 0 uso de vacinas como vacinas de embrião (as chamadas vacinas in ovo) foram anteriormente sugeridas (Sharma et al, Avian diseases 29,1155 a 1169,1985). A vacinação in ovo, em princípio, pode ser vantajosa devido à idade precoce da resistência à doença específica e à administração de uma dose uniforme de vacina em cada ovo usando máquinas semi-automáticas com cabeças de injeção múltiplas.

Usualmente vacinas convencionais para a vacinação pós choco de aves não podem ser usadas para a vacinação in ovo, porque os embriões em estágio perto do fim são altamente suscetíveis à infecção com a maioria dos vírus de vacina examinados. Por exemplo, as cepas de vacina de IBV e do víms da doença de Newcastle (NDV) que são rotineiramente usados como vacinas em pintinhos recém chocados são letais para embriões seguindo a inoculação in ovo. Os exemplos de vacinas pós choco comercialmente disponíveis que não podem ser usadas para a vacinação in ovo devido aos seus efeitos adversos sobre a capacidade de chocar dos ovos embrionados são Poulvac® IB, Nobilis IB Ma5® e Nobilis IB 4/91®. O pedido de patente internacional WO 01/64244 divulga que a vacina Poulvac IB pode ser usada para a administração in ovo contanto que ela seja aplicada em uma dose muito baixa (IO"1,0 a IO2,0 EID50/ovo).

Wakenell et al. (J. Vet. Res., 47, 933 a 938, 1986) divulga que passar um vírus de vacina IB em cultura de tecido toma o víms apatogênico para os embriões. Entretanto, o víms da confrontação pode ser ainda isolado de pintinhos comerciais vacinados.

Em vista do exposto acima está evidente que existe uma necessidade quanto a vacinas de IBV que seja tanto seguras quanto produzam proteção adequada contra cepas de campo vimlentas, em particular de sorotipos emergentes e que podem ser fabricados sem usar o método empírico convencional para a preparação de vacina contra IBV.

Além disso, existe uma necessidade quanto a uma vacina de IBV segura e eficaz que possa ser administrada por intermédio da via in ovo sem que se tenha um impacto negativo sobre a capacidade de chocar dos ovos embrionados vacinados. A invenção aqui descrita atinge um ou mais destas necessidades pelo fornecimento de uma vacina de IBV que está fundamentada em uma cepa Beaudette do IBV atenuado que é capaz de expressar uma proteína com ponta derivada de uma cepa do IBV, por exemplo uma cepa de campo, que seja diferente da proteína com ponta da cepa Beaudette. Esta nova cepa de vacina de IBV atenuada é melhor equipada para combater infecções de IBV do que uma cepa IBV atenuada obtida pelos métodos convencionais, porque ela pode expressar uma proteína com ponta que é homóloga àquela de um vírus de campo (virulento).

Portanto, a presente invenção fornece uma vacina para uso na proteção de aves domésticas contra bronquite infecciosa que compreende um vírus da bronquite infecciosa atenuado (IBV) e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado em que o IBV atenuado é cepa Beaudette de IBV que compreende um gene com ponta de IBV heterólogo. / E demonstrado nos Exemplos que a cepa Beaudette de IBV que é conhecido ser atenuado, mas deficientemente protetor, é tomado altamente protetor pela inserção de um gene com ponta de um víms virulento (IBV M41), ao passo que o nível de atenuação da cepa atenuada de IBV não foi afetado (Exemplos 3 e 4). Em particular, a última propriedade do IBV recombinante foi inesperada visto que foi demonstrado para outros coronavíms que o gene S é um determinante de vimlência e que substituindo o gene S nos coronavíms brandos por um gene S de um coronavíms vimlento tomou os coronavíms recombinantes virulentos. A ausência de um aumento de vimlência do IBV recombinante depois da substituição do genes S é o mais surpreendente se é levado em conta que o IBV atenuado recombinante adquire o tropismo celular do IBV virulento in vitro (Exemplo 2). O cepa Beaudette de IBV foi originalmente isolado por Beaudette e Hudson (J, Am. Vet. Med. A. 90, 51 a 60, 1937) e passou várias centenas de vezes em embriões de galinha, é comumente aludido como uma cepa “adaptada a embrião de galinha” ou “adaptada a ovo”. A cepa Beaudette altamente adaptada a ovo é a-patogênica para a administração pós choco, causa pouco dano detectável ao epitélio ciliado da traquéia e replica predominantemente nas células subepiteliais, mas é conhecido ser extremamente patogênico para embriões de 9 a 12 dias de idade, além disso, o IBV Beaudette é conhecido ser uma cepa com uma imunogenicidade deficiente (Arch Gesamte virusforsch 40,285 a 290,1973). A cepa Beaudette de IBV é obtenível da ATCC (acesso no. VR-22). e é habitualmente usado em laboratórios por todo o mundo embora estes vírus possam ter diferenças de seqüência insignificantes devido às suas histórias de passagem individual. Por exemplo, as sequências de nucleotídeos do gene com pontas de isolados de IBV Beaudette diferentes demonstram uma identidade de 99 % ou mais, Uma região no genoma da cepa Beaudette de IBV que distingue esta cepa de IBV de outras cepas de IBV é uma região (nucleotídeos 26500 a 27499; numerando de acordo com Casais et al., 2001, supra, acesso No. AJ311317) localizada na extremidade do terminal 3’ do genoma que começa dentro do gene de nucleoproteína e termina dentro da região não traduzida 3’ (UTR).

Uma cepa Beaudette de IBV a ser usada na presente invenção é um IBV que demonstra uma identidade de seqüência de nucleotídeo de 99 % ou mais nesta região com a região correspondente na cepa Beaudette de IBV especificamente aqui usada (BeauR, acesso No. AJ311317). As seqüências de nucleotídeo da região correspondente em outras cepas IBV diferem significantemente (63 a 95 %) daquelas na cepa Beaudette de IBV. As identidades de seqüência de nucleotídeo aqui aludidas são determinadas pelo programa de alinhamento ClustaLX usando o modo de alinhamento múltiplo, Thomson et ai, NAR 24,4876-4882,1997 e analisada pelo Genedoc, versão 2,6.002, acessível de www.psc.edu/biomed/genedoc.

Em uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção uma vacina é fornecida que é ainda caracterizada em que o IBV atenuado é a cepa Beaudette Beau-CK ou BeauR (depositada no CNCM do Institute Pasteur, Paris, França em 27.02.2004 sob o acesso no. 1-3167).

BeauR é um IBV recombinante produzido a partir de um RNA infeccioso transcrito de um cDNA de tamanho natural de Beau-CK. A análise de seqüência genômica completa para Beau-CK (Boursnell et ai, J. Gen. Virol. 68, 57 a 77, 1987, acesso No. M95169) e BeauR foi determinada (Casais et ai, 2001, supra; acesso No. AJ311317).

Um IBV atenuado recombinante que compreende um gene com ponta heterólogo a ser usado em uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparado por meio do sistema genético reverso descrito em Casais et ai, (2001, supra). Este sistema permite a preparação de IBV recombinante (rIBV) montando-se o DNA de tamanho natural de IBV (mutado) in vitro, seguido pela clonagem direta em um genoma do vírus da vacínia e recuperar o IBV depois da síntese in situ de RNA de IBV infeccioso usando-se T7 RNA polimerase de bacteriófago expressada a partir de um vírus da fowlpox recombinante.

Por “um gene com ponta (S) heterólogo” é intencionado um gene S derivado de uma cepa do IBV (a cepa doadora) que é diferente da cepa Beaudette de IBV atenuada específica que recebe este gene S (a cepa receptora) e que codifica uma proteína S tendo uma seqüência de aminoácido que é diferente comparada com a proteína S codificada pelo gene S da cepa Beaudette de IBV. A cepa doadora e receptora pode ser dos mesmos sorotipos de IBV ou diferentes). Um tal IBV recombinante é fundamentado no genoma de uma cepa do IBV única (receptora), a única diferença, em essência, sendo o gene S que é derivado de uma cepa IBV diferente (doadora).

Além disso, no contexto da presente invenção não é requerido que o gene com ponta completo deva ser transferido da cepa de IBV doadora para a receptora. Um gene com ponta é considerado ser heterólogo no caso em que o fragmento do gene com ponta que codifica o ectodomínio da proteína com ponta, ou uma parte funcional deste que seja capaz de induzir uma resposta imuno protetora, é derivado da cepa de IBV doadora.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção a vacina é fundamentada em uma cepa Beaudette de IBV que compreende um gene com ponta do qual o fragmento que codifica o ectodomínio ou uma parte funcional deste, em particular o polipeptídeo Sl, é derivado de um IBV doador diferente, ao passo que o fragmento que codifica a cauda citoplasmática é derivado da cepa Beaudette de IBV receptora. A vantagem de um tal gene com ponta “quimérico” é que quaisquer problemas potenciais entre a interação do domínio de cauda citoplasmática da proteína com ponta com as outras proteínas de IBV são evitados visto que ambos são nativos para o IBV receptor.

No geral, a seqüência de sinal, o ectodomínio, a região de transmembrana e o domínio da cauda citoplasmática da proteína com pontas de IBV abrange os fragmentos de aminoácido de 1 a 18, 19 a 1091, 1092 a 1119 e 1120 a 1162, respectivamente (os números referem-se à Beaudette- CK, Casais et al., J. Virol. 75,12359 a 12369, 2001; as proteínas S de outras cepas de IBV podem diferir no número de aminoácidos devido a pequenas supressões e inserções). Além disso, também a seqüência de aminoácido no sítio de divagem S1/S2 de IBV; é bem conhecida. Para Beaudette os polipeptídeos Sl e S2 transpõem o aminoácido 1 (19) a 535 e 536 a 1162, respectivamente.

Preferivelmente, um gene com ponta a ser usado na presente invenção é derivado de um IBV (virulento) do campo.

Os genes com ponta podem ser isolados de qualquer cepa do IBV disponível independente do seu sorotipo pelas técnicas padrão habitualmente usadas na técnica para este propósito. As seqüências de nucleotídeo do gene com pontas derivado de cepas do IBV do mesmo sorotipo são relativamente conservadas. A diferença de seqüência de nucleotídeo máxima entre o gene com pontas dentro do mesmo sorotipo é de 10 % na parte Sl.

Portanto, com um gene com ponta de um IBV de um certo sorotipo é intencionado um gene com ponta derivado de uma cepa tendo as características imunológicas daquele sorotipo e tendo uma seqüência de nucleotídeo que exibe um máximo de 10 % de diferença de seqüência de nucleotídeo (na parte Sl) com aquela de uma cepa de referência do sorotipo.

Os exemplos de cepas de referência típicas e os números de acesso da base de dados de seqüência de nucleotídeo de suas seqüências de gene com ponta são M41 (Massachusetts sorotipo; X04722), NL/D274/78 (sorotipo D274; X15832), USA/Arkansas 99 (sorotipo Ark 99; L10384), Belgium/B1648 (sorotipo B1648; X87238), USA(DE)/072/92 (sorotipo DE072; U77298), US(GA)/0470/98 (sorotipo Geórgia 98; AF274437), UK/4/91 (sorotipo 793B1; AF093794), USA/Connecticut (sorotipo Connecticut; L18990) e NL/D1466(sorotipo D1466; M21971). A clonagem de vários genes com pontas de IBV está descrita em Adzhar et al., Avian Path. 26, 625 a 640,1997; Shaw et al, Avian Pathol. 25 607 a 611, 1996; Binns et al., J. Gen. Virol. 67, 2825 a 2831, 1986 e Binnset etal, J. Gen Virol. 66,719 a 726,1985).

Uma forma de realização preferida da presente invenção diz respeito a uma vacina como descrita acima que é fundamentada em um IBV atenuado que compreende um gene com ponta que codifica uma proteína com ponta de um sorotipo Massachusetts do IBV, em particular da cepa M41 do IBV.

Em uma outra forma de realização preferida a vacina é fundamentada em um IBV atenuado que compreende um gene com ponta que codifica uma proteína com ponta de um sorotipo 793B do IBV, em particular da cepa 4/91.

Em princípio, a cepa Beaudette de IBV que compreende o gene com ponta heterólogo pode ter este gene inserido no seu genoma além do gene com ponta naturalmente presente no genoma. Entretanto, em uma forma de realização preferida da presente invenção a vacina compreende uma cepa Beaudette de IBV em que o gene com ponta heterólogo substitui o gene com ponta original na sua posição natural entre o gene da replicase e o gene 3 (Figura 5).

Até hoje nenhuma vacina do IBV que seja tanto segura quanto eficaz para a administração in ovo é comercialmente disponível. A presente invenção, em particular, demonstra que uma vacina de acordo com a presente invenção com base na cepa BeaudetteR de IBV (BeauR) pode ser administrada com segurança por intermédio da via in ovo assim como ao pintinhos chocados e que ao mesmo tempo induz uma resposta imuno protetora. No Exemplo 4 é mostrado que esta cepa BeauR do IBV não é letal para embriões de 18 dias de idade (SPF) e que a capacidade de choco dos ovos inoculados é muito alta. Esta propriedade toma a cepa BeauR de IBV adequada para receber um gene com ponta heterólogo e para administrar uma vacina de acordo com a invenção com base nesta cepa de IBV recombinante a uma galinha por intermédio da via in ovo.

Uma vacina de acordo com a presente invenção pode compreender o IBV atenuado em uma forma viva ou inativada, a forma viva sendo preferida, isto é por que ela não requer adjuvante. A presente invenção também fornece uma solução para o problema de interferência que ffeqüentemente ocorre quando da administração de combinações de víms de vacina viva diferente. A administração combinada de dois ou mais vírus de vacina que são os mesmos em essência, mas expressam a proteína com pontas de (soro) tipos diferentes de IBV, é possível agora sem a interferência de replicação de um vírus vacina pelo outro vírus de vacina.

Portanto, a presente invenção também fornece uma vacina como definida acima que compreende duas ou mais cepas Beaudette de IBV que compreendem genes com ponta heterólogos de cepas de IBV diferentes, preferivelmente de cepas IBV de sorotipos diferentes.

Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada pelos métodos convencionais tais como aqueles habitualmente usados para as vacinas de IBV vivas e inativadas comercialmente disponíveis.

Em resumo, um substrato suscetível é inoculado com o IBV atenuado e propagado até que o vírus replicasse a um título desejado depois do que o material contendo IBV é colhido. Subsequentemente, o material colhido é formulado em uma preparação farmacêutica com propriedades imunizantes.

Cada substrato que é capaz de sustentar a replicação do IBV pode ser usado na presente invenção, incluindo culturas de célula primária (aviária), tais como linhagens de células de fibroblasto de embrião de galinha (CEF), células renais de galinha (CK), culturas de órgãos da traquéia ou células de mamífero tais como a linhagem de célula VERO.

Os substratos particularmente adequados em que o IBV atenuado pode ser propagado são ovos embrionados SPF. Os ovos embrionados de 9 a 12 dias de idade podem ser inoculados com, por exemplo 9 Λ 0,1 ml de fluido alantóico contendo IBV que compreende pelo menos 10 ’ EID50 por ovo. Preferivelmente, de ovos embrionados de 9 a 12 dias de idade são inoculados com cerca de 105 EID50 e subseqüentemente incubados a 37°C por 12 a 72 horas. O IBV pode ser colhido preferivelmente coletando-se 0 fluido alantóico.

A vacina de acordo com a invenção compreende o IBV atenuado junto com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis habitualmente usados para tais composições. . A vacina contendo o vírus vivo pode ser preparada e comercializada na forma de uma suspensão ou em uma forma liofilizada. Os veículos incluem estabilizadores, conservantes e tampões. Os diluentes incluem água, tampão aquoso e polióis.

Se desejado, a vacina viva de acordo com a invenção pode conter um adjuvante. Os exemplos de compostos e composições adequadas com atividade de adjuvante são os mesmos como aqueles mencionados abaixo para a vacina IBV inativada.

Embora a administração por injeção, por exemplo, intramuscular, subcutânea da vacina viva de acordo com a presente invenção seja possível, a vacina é preferivelmente administrada pelas técnicas de aplicação em massa baratas habitualmente usadas para a vacinação com IBV, Para a vacinação com IBV estas técnicas incluem a vacinação na água de beber, em aerossol e pulverização. Altemativamente, a administração da vacina viva também pode ser individualmente pelo gotejamento ocular, intratraqueal ou intranasal.

Como esboçado acima, a presente invenção também fornece uma vacina de IBV que pode ser administrada com segurança por intermédio da via in ovo e ao mesmo tempo ser capaz de induzir uma resposta imuno protetora. A administração in ovo da vacina envolve a administração da vacina a um embrião aviário enquanto contido no ovo (para uma revisão na vacinação in ovo ver: Ricks et ai, Advances in Vet. Med. 495 a 515,1999). A vacina pode ser administrada a qualquer compartimento adequado do ovo (por exemplo, fluido alantóico, saco vitelínico, âmnio, célula de ar ou ao embrião) como descrito na técnica (Sharma; Am. J. Vet. Res. 45 1619 a 1623, 1984).

Preferivelmente a vacina é administrada abaixo da membrana da casca (célula de ar) e membrana corioalantóica. Usualmente a vacina é injetada em ovos embrionados durante estágios tardios da embrionação, no geral durante o quarto final do período de incubação, preferivelmente 3 a 4 dias antes do choco. Em galinhas a vacina é preferivelmente administrada entre os dias 15 a 19 do período de incubação de 21 dias, em particular nos dia 17 ou 18, o mais preferivelmente no dia 18 do período de incubação.

Subsequentemente, os ovos embrionados vacinados são transferidos a uma incubadora para chocar (Patente US No. 4.458.630, WO 98/56413 e WO 95/35121). Preferivelmente, o processo de vacinação de embrião inteiro é realizado usando sistemas de vacinação automatizados de alta velocidade, tais como o INOVOJECT® comercialmente disponível. Tais dispositivos também são divulgados nas Patentes U.S. No. 4.681.063 e 4.903.635,4.040.388,4.469.047 e 4.593.646.

Em um outro aspecto da presente invenção uma vacina é fornecida compreendendo o IBV atenuado em uma forma inativada. As vantagens de uma vacina inativada são a sua segurança e os altos níveis de anticorpos protetores de duração longa que podem ser induzidos. O objetivo da inativação dos vírus colhidos depois da etapa de propagação é eliminar a reprodução dos vírus. No geral, isto pode ser obtido por meios químicos e físicos bem conhecidos.

Uma vacina inativada de acordo com a invenção, por exemplo, pode compreender um ou mais dos veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis mencionados acima adaptados para este propósito.

Preferivelmente, uma vacina inativada de acordo com a invenção compreende um ou mais compostos com atividade adjuvante. Os compostos ou composições adequadas para este propósito incluem hidróxido, fosfato ou óxido de alumínio, emulsões de óleo em água ou água em óleo com base, por exemplo em um óleo mineral, tal como Bayol F® ou Marcol 52® ou um óleo vegetal tal como acetato de vitamina E e saponinas.

As vacinas inativadas são usualmente administradas por injeção, por exemplo, intramuscularmente ou subcutaneamente. A vacina de acordo com a invenção compreende uma dosagem eficaz do IBV atenuado como o componente ativo, isto é uma quantidade de IBV imunizante que induzirá a imunidade nas aves vacinadas contra a confrontação por um vírus virulento. A imunidade é aqui definida como a indução de um nível significantemente mais alto de proteção em uma população de aves contra a mortalidade e sintomas clínicos depois da vacinação comparada com um grupo não vacinado.

Tipicamente, a vacina viva para a administração pós choco compreende o IBV atenuado em uma concentração de IO2,0 a IO8,0 dose infecciosa de embrião (EID50) por unidade de dose, preferivelmente em uma concentração de IO3,0 a IO7’0 EID5o por unidade de dose. O volume de dose por ave depende da via de vacinação e da idade da ave. Tipicamente, as vacinas em gotas oculares são administradas em um volume de 20 a 100 μΐ por dose em qualquer idade. As vacinas de pulverização podem conter a dose em um volume de 100 a 1000 μΐ para aves de dias de idade e uma dose de uma vacina em água de beber usualmente é diluída em um volume de cerca de 1 ml para cada dia de idade. As vacinas inativas podem conter o equivalente antigênico de IO4,0 a IO9,0 EID50 por dose unitária. A vacina viva para a administração in ovo tipicamente compreende uma quantidade do IBV atenuado de IO2,0 a 108,0 EID5o, preferivelmente IO3,0 a IO7,0 EID50 em um volume de 50 a 100 μΐ, preferivelmente 50 μΐ.

Contudo, a vacina de IBV de acordo com a presente invenção pode ser usada eficazmente em galinhas, também outras aves domésticas tais como perus, pombos, codomiz, faisões, galinha d’angola e perdizes podem ser vacinadas com sucesso com a vacina. As galinhas incluem frangos, criação de reprodução e criação de postura. A idade das aves que recebem uma vacina viva ou inativada de acordo com a invenção pós choco é a mesma como aquela das aves que recebem as vacinas de IBV vivas ou inativadas comercialmente disponíveis convencionais. Por exemplo, os frangos podem ser vacinados com um dia de idade ou com 1 a 3 semanas de idade, particularmente para frangos com altos níveis de MDA. A criação de postura ou a criação de reprodução podem ser vacinados inicialmente com 1 a 10 dias de idade e reforçadas com uma vacina viva ou inativada com 7 a 12 ou 16 a 18 semanas de idade. A invenção também inclui as vacinas de combinação que compreendem, além do IBV atenuado, uma cepa de vacina capaz de induzir proteção contra uma outra cepa de sorotipo do IBV ou contra um outro patógeno aviário.

Preferivelmente, a vacina de combinação adicionalmente compreende uma ou mais cepas de vacina do vírus da doença de Marek (MDV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da doença bursal infecciosa (IBDV), vírus da síndrome da queda do ovo (EDS), vírus da rinotraqueíte de pem (TRTV) ou reovírus.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Preparação de IBV Beaudette recombinante com genes com ponta heterólogos Técnicas de DNA recombinante.

As técnicas de DNA recombinante aqui usadas foram de acordo com procedimentos padrão (Ausubel et al, em: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons Inc, NY, 1987; Sambrook et al., em: Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) ou foram usados de acordo com as instruções do fabricante. Todos os números de nucleotídeo e resíduo de aminoácido referem-se às posições em IBV Beau-R (Casais, 2001, supra, acesso No. AJ311317). Células, víms, plasmídeos e cepas bacterianas usados para a preparação do gene S quimérico, a montagem do cDNA de IBV de tamanho natural em víms da vacínia, geração de vírus da vacínia recombinante e geração de IBV recombinante infeccioso foram como descrito em Casais et al, (2001, supra).

Construção de gene S quimérico, montagem/modificação de um cDNA de IBV de tamanho natural no vírus da vacínia e geração de vírus da vacínia recombinante. IBV Beaudette Recombinante- gene com ponta M41 A análise de seqüência do gene S M41-CK identificou diferenças de 72 nt quando comparado com a seqüência do gene S BeauR dos quais 50 representaram substituições não sinônimas e 22 sinônimas resultando em um total de 47 diferenças de aminoácido entre as duas glicoproteínas S. A última substituição não sinônima resulta em um códon de parada prematuro dentro do gene S M41, de modo que a glicoproteína S M41-CK é nove > aminoácidos mais curta que a proteína Beaudette. A parte da perda dos nove aminoácidos não houve nenhuma outra diferença de aminoácido entre os domínios citoplasmáticos dos dois vírus. No geral, os produtos da tradução primária dos dois genes S são 1153 e 1162 aminoácidos para M41-CK e BeauR, respectivamente, representando uma identidade de 95,2 % entre as duas proteínas S. A comparação da seqüência de replicase que sobrepõem a seqüência do gene S mostrou que existe apenas uma mutação sinônima sem nenhuma mutação entre a seqüência associada com a transcrição do gene S

(TAS) e o códon de início do gene S (Figura 1). Portanto, a região do gene S que contém a região de sobreposição do gene da replicase foi adquirida de M41-CK para a geração da seqüência de gene S rIBV. Entretanto, porque as extremidades de terminal C dos genes S de Beaudette e M41 variaram e estão potencialmente envolvidas na interação com outras proteínas de virion, foi retido os últimos 137 nt da seqüência de gene S de Beaudette para o rIBV.

Isto pode manter qualquer interação do domínio de terminal C da proteína S com as outras proteínas derivadas de Beaudette. O plasmídeo pACNR-Nheí-Notl-IBV (Figura 2) foi digerido com PacI e Sall c o fragmento contendo o vetor purificado e retido. O plasmídeo pACNR-Nheí-Notl-IBV também foi digerido com BspHI e Sall e o fragmento BspHI-SalI purificado e retido. O plasmídeo pM41Struct conteve uma seqüência de cDNA derivada de IBV, correspondente de dentro do gene de replicase para a cauda poli (A), derivado de gRNA M41-CK, em pBluescript SK (+). pM41Stract foi digerido com PacI e BspHI e o fragmento PacI-BspHI foi purificado e retido (Figura 3). Um gene quimérico S

Beaudette-CWM41-CK, que consiste da seqüência de sinal, ectodomínio e regiões de transmembrana derivado de M41-CK e o domínio da cauda citoplasmática de Beau-R, foi gerada. O fragmento PacI-BspHI derivado de M41-CK de pM41Struct foi usado para substituir a seqüência cDNA PacI- BspHI derivada de Beaudette-CK correspondente em pFRAG-3. Uma reação de ligação de três vias entre o fragmento contendo o vetor Pacl-Sall (de pFRAG-3), o fragmento de gene S PacI-BspHI derivado de M41-CK e o fragmento BspHI-SalI correspondente ao resto do genoma de Beaudette a jusante do gene S, foi realizada resultando em pACNR-NheI-NotI-IBV-M41- S (Figura 4 e resumido na Figura 5A). A análise de seqüência de pFRAG3- M41S confirmou a presença de uma seqüência de gene S quimérica contígua, junto com a presença das duas mutações marcadoras, U19666 e G27087, originalmente presente em pFRAG3.

Os fragmentos de cDNA derivados de IBV de pFRAG-3- M41S, contendo a seqüência S de gene quimérico e pFRAG-1 e pFRAG-2 foram usados para gerar um cDNA de IBV de tamanho natural usando a ligação in vitro. O cDNA tamanho natural foi gerado usando um procedimento de ligação in vitro de duas etapas como descrito por Casais et al. (2001, supra). Na primeira etapa, o SacI-NheIcDNA(FRAG-2) de pFRAG- 2 e o Nhel-BspHI cDNA (FRAG-3-M41S) de p FRAG-3-M41S foram ligados para dar um fragmento SacI-Bspl20I de 21,5 kb que foi purificado em gel. Na segunda etapa, o fragmento SacI-Bspl20I de 21,5 kb foi ligado ao BspHI-SacI cDNA (FRAG-1) de pFRAG-1 para produzir um cDNA de 27,9 kb de IBV de tamanho natural (Figura 5B). Este cDNA de tamanho natural, contendo o gene S quimérico, estava sob o controle de um promotor da T7 RNA polimerase e terminado por uma sequência de terminação H8R-T7 distai a poli (A). O promotor T7 e a seqüência de terminação H8R-T7 foram requeridos para a geração in situ de RNA de IBV infeccioso pela T7 RNA polimerase. Os produtos da segunda ligação in vitro, contendo o cDNA de IBV de tamanho natural com extremidades Bspl20I desfosforiladas, foram diretamente ligados aos braços derivados de vNotl/tkNotl na presença de NotI. Os produtos de ligação foram usados sem outra purificação para recuperar os vírus da vacínia recombinantes usando o vírus auxiliar do vírus fowlpox, FP9, em células CV-1. Foi obtido 22 vírus da vacínia recombinante e a análise de restrição do DNA isolado de células infectadas indicou que oito deles continham um inserto do tamanho esperado dos quais vNoíI/IBVFl- M41S, foi selecionado para análise adicional.

Gene com ponta Beaudette-4/91 de IBV Recombinante A análise de seqüência do gene S 4/91 identificou diferenças de 562 nt quando comparada com a seqüência de gene S BeauR dos quais 245 representaram substituições não sinônimas e 317 sinônimas resultando em um total de 201 diferenças de aminoácido entre as duas glicoproteínas S das quais duas resultaram de uma inserção de seis nucleotídeos dentro da seqüência de gene S 4/91. Existem duas diferenças de aminoácido entre os domínios citoplasmáticos dos dois vírus. No geral, os produtos de tradução primária dos dois genes S são de 1162 e 1164 aminoácidos para Beau-R e 4-91, respectivamente, com uma identidade de 83 % entre as duas proteínas S. A região do gene S contendo a região de sobreposição do gene da replicase foi adquirida de 4/91 para a geração da seqüência de gene S de rIBV. Além disso, porque as extremidades do terminal C dos genes S Beaudette e 4/91 são similares, foi retido os últimos 137 nt do gene S Beaudette, idênticos à seqüência 4/91 para a montagem do gene S quimérico. A proteína S resultante das seqüências de gene S quiméricas consiste do ectodomínio de 4/91, do domínio de transmembrana de 4/91 e um domínio de cauda citoplasmática de Beaudette-CK e é análoga à proteína S M41 quimérica descrita acima.

A seqüência de gene S 4/91 foi obtida a partir do RNA derivado do vírus isolado da cepa de IBV 4/91 virulenta usando duas PCRs.

Os dois produtos de PCR, de 2042 pb e 2300 pb, foram gerados usando dois conjuntos de oligonucleotídeos (Figura 6). O produto de 2042 pb foi gerado usando o oligonucleotídeo BG42 (correspondente aos nucleotídeos 19941 a 19958 no genoma Beau-R) e um oligonucleotídeo de 4/91 específico, 4/91 d (o complemento reverso para os nucleotídeos equivalentes de 21957 a 21976 no genoma de Beau-R). O produto de 2300 pb foi gerado usando um oligonucleotídeo de 4/91 específico, 4/9 lc (correspondente aos nucleotídeos equivalentes de 21600 a 21619 no genoma de Beau-R) e o oligonucleotídeo BG141 (o complemento reverso de nucleotídeos 23879 a 23898 no genoma de Beau-R). Ambos os fragmentos foram inseridos no pGEM-T e os plasmídeos resultantes foram usados como a fonte da seqüência de gene S 4/91 (Figura 6). A seqüência de gene S 4/91 quimérica foi construída modificando-se pGPT-M41S (Figura 7A) usando os dois produtos de PCR derivados de 4/91. O produto derivado de 4/91 de 2042 pb no pGEM-T foi excisado como um fragmento de 1580 pb, representando a metade de 5’ do gene S 4/91, usando PacI e AlwNl que foi purificado e retido (Figura 6). O produto derivado de 4/91 de 2300 pb em pGEM-T foi excisado como um fragmento de 1804 pb, representando a metade de 35 do gene S 4/91, usando ÁlwNl e BspEl que foi purificado e retido (Figura 6). O plasmídeo pGPT- M41S foi digerido com PacI e BamHI e o fragmento de 5018 pb que representa a seqüência de plasmídeo foi purificado e retido (Figura 7 A). Além disso, pGPT-M41S foi digerido com BspHI e BamHI e um fragmento de 1080 pb derivado de Beau-R foi purificado e retido (Figura 3A). Uma reação de ligação de quatro vias entre o fragmento contendo o plasmídeo PacI- BamHI de 5018 bp, o fragmento derivado de Beau-R BspHI-BamHI de 1080 bp, o fragmento derivado de 4/91 PacI-AlwNI de 1580 bp e o fragmento derivado de 4/91 A/wNI-RypHI de 1804 bp foi realizada resultando no pGPT- 4/9IS (Figura 7B). Isto resultou na construção de uma seqüência de gene S quimérica 4/91-Beau-CK, consistindo da seqüência de sinal, ectodomínio e regiões de transmembrana derivados de 4/91 e o domínio da cauda citoplasmática de Beau-R (Figura 7B). A análise de seqüência de pGPT-4/91S confirmou a presença de uma seqüência de gene S quimérica contígua.

De modo a modificar o cDNA de tamanho natural derivado de Beaudette CK no vírus da vacínia recombinante vNotl/IBVpi foi usado o método de seleção dominante transitória (TDS) (Falkner e Moss, Journal of Virology 64, 3108 a 3111, 1990) para substituir a seqüência do gene S de Beaudette com a seqüência de gene S quimérico 4/91-Beau-CK. O sistema TDS consistiu de um processo de duas etapas (Figuras 8 e 9). Na primeira etapa o método TDS foi usado para remover a seqüência do gene S de Beaudette do cDNA de tamanho natural no vírus da vacínia recombinante vNoí/IBVfl· O plasmídeo pGPT-IBV-AS, contendo a seqüência Beau-CK correspondente à replicase e gene 3 com parte do gene M, mas carecendo da seqüência de gene S foi transfectada em células infectadas com vNotI/IBVFL.

Seguindo a recombinação homóloga entre a seqüência derivada de IBV em pGPT-IBV-AS e a seqüência IBV dentro de vNoíFIBVfl um vírus da vacínia recombinante, vNoíI/IBV-ASfl, contendo o cDNA de IBV que carece da seqüência do gene S (recombinante “sem ponta”) foi isolado e identificado (Figura 8). Na Segunda etapa o método TDS foi usado para inserir a seqüência de gene S quimérico 4/91-Beau-CK no vírus da vacínia recombinante “sem ponta” vNotI/IBV-ASFL. O plasmídeo pGPT-4/91S foi transfectado em células infectadas com vNotI/IBV-ASFL e seguindo a recombinação da seqüência derivada de IBV em pGPT-4/91S e a seqüência de IBV dentro de vNotI/IBV-ASfL um vírus da vacínia recombinante, vNotI/IBVFL-4/91S contendo o cDNA de IBV de tamanho natural com a seqüência de gene S quimérica 4/91-Beau-CK inserida foi isolado e identificado (Figura 9).

Recuperação de IBVs infecciosos que expressam as proteínas com ponta quiméricas Beaudette-M41 e Beaudette-4/91. O rIBV infeccioso foi recuperado de vNotI/IBVFL-M41S ou vNotI/IBVFL-4/91S usando células CK, previamente infectadas com rFPV/T7 (Britton et al, J. Gen. Virol. 77, 963 a 967, 1996), para fornecer a T7 RNA polimerase, e co-transfectadas com DNA de vNotI/IBVFL-M41S restrito por Asei ou vNotI/IBVFL-4/91S e pCi-Nuc (Hiscox et ai., J. Virol. 75, 506 a 512, 2001). O DNA de vNotI/IBVFLM41S ou vNotí/IBVFL-4/91S foi preparado a partir do vírus da vacínia semi-purificado e pCi-Nuc, um plasmídeo que expressa a proteína N de IBV sob o controle tanto do promotor T7 quanto do promotor CMV foi requerido para a recuperação bem sucedida derIBV.

As células CK transfectadas (P0) foram incubados até que elas apresentassem um efeito citopático (CPE), o meio foi filtrado para remover qualquer rFPV/T7 e qualquer IBV potencial passado em células CK frescas (Pi). Um rIBV, BeauR-M41(S), foi isolado das células Pi e o genótipo do rIBV determinado pela análise de seqüência. Que confirmou a presença das duas mutações de marcador e que o ectodomínio do gene da proteína S quimérica foi derivado da seqüência de gene S M41-CK. BeauR-M41 (S), derivado de células P5 CK, foi usado para outra caracterização.

Exemplo 2. Caracterização Biológica de BeaudetteR-IBV M41 com ponta in vitro Curvas de desenvolvimento viral.

As monocamadas confluentes de células CK, VERO, CEF e BIIK-21 emplacas de 60 mm foram infectadas com 1,5 x 106 PFU de IBV. A seguir da absorção, por 1 h a 37° C, as células foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o vírus residual e incubado a 37° C em 5 ml dos meios apropriados. As amostras de meios foram, em tempos selecionados em um período de 96 horas, analisado em triplicata quanto víms de progênie pelo ensaio de placa.

Replicação de BeauR-M41 (S) em linhagens de célula diferentes.

As cepas de IBV Beau-CK e M41-CK têm tropismo celular diferentes. É conhecido que ambos os vírus replicam em títulos similares em células CK mas apenas o Beau-CK produz vírus infeccioso em células VERO.

Portanto usando-se os vírus isogênicos, BeauR e BeauR-M41 (S), que diferem apenas no ectodomínio da proteína S, foi procurado determinar se a glicoproteína de IBVS foi responsável pelas diferenças observadas na capacidade de distinguir cepas IBV para infectar e replicar em linhas de célula diferentes.

BeauR, M41-CK e BeauR-M41 (S), demonstraram perfis de desenvolvimento similares nas células CK (Figura 10 A). Além disso, todos os três víms causaram CPE dentro de 24 h. A análise dos perfis de desenvolvimento dos três víms em VERO, CEF e BHK-21 (Figura 10 B a D) mostrou que apenas Beau-R replicou em algum grau significante nas células diferentes, usualmente com título máximo em 24 h após a infecção. Estes resultados mostraram que BeauR-M41 (S) teve o mesmo tropismo como M41-CK em todos os quatro tipos de célula, indicando que a substituição do ectodomínio da glicoproteína S Beaudette com a seqüência correspondente da glicoproteína S M41-CK resultou em um rIBV com um tropismo celular alterado quando comparado com BeauR.

Os resultados das análises de produtos de RT-PCR de RN A isolado de células infectadas com estes vírus e a análise da imunofluorescência indireta de células infectadas com IBV corroboraram com os resultados do experimento de desenvolvimento.

Exemplo 3. Caracterização Biológica de BeaudetteR Recombinante - IBV M41 com ponta in vivo (administração pós choco) A - Segurança de IBVs recombinantes (rIBVs) BeauR e BeauR-M41(S) Materiais e Métodos Vírus e Células A cepa Massachusetts M41-CK de IBV, virulento para galinhas no choco, foi usada depois de 11 passagens em células renais (CK) de pintinho primárias e três passagens em embriões de 10 dias de idade de galinhas Rhode Island Red (RIR) especificadas isentas de patógeno (SPF). Os rIBVs BeauR e BeauR-M41 (S) foram propagados em células CK. Os vírus foram titulados em culturas orgânicas da traquéia de embrião de pintinho. Os títulos foram expressados em logio de dose 50 ciliostática.

Galinhas Galinhas RIR de oito dias de idade foram inoculadas pela gota ocular e no nariz com 0,1 ml de solução salina tamponada com fosfato contendo 3,0 logio dose 50 ciliostática de vírus, ou apenas com PBS (grupo inoculado com simulado). As aves foram alojadas em grupos.

Estudo de Animal Para determinar se cada um dos dois rIBVs foram patogênicos em galinhas no choco, três sinais clínicos foram registrados: estalo, descarga nasal e estertores. Estalo foi registrado para os grupos de aves durante um período de dois minutos e é apresentado como estalos/ave/minuto. A descarga nasal (clara ou túrbida) e os estertores (moderado e grave) foram registrados para as aves individualmente, a incidência sendo apresentada abaixo como uma porcentagem do grupo. A atividade ciliar foi determinada matando-se as aves, removendo-se a traquéia, cortando-se a traquéia transversalmente em anéis de aproximadamente 1 mm de profundidade e observando-os pela microscopia de baixa potência. 10 anéis foram examinados para cada traquéia. A atividade ciliar foi registrada como sendo de aproximadamente 100 %, 75 %, 50 %, 25 % ou 0 %. Os grupos compreenderam não menos do que 20 aves nos dias quando os dados abaixo foram registrados.

Resultados Estalo foi máximo no dia 6 p.i.. Não houve nenhuma diferença significante na taxa de estalo de aves infectadas com BeauR- e BeauR- M41(S) e as aves infectadas com simulado. A cepa M41-CK induziu uma ordem de magnitude mais estalo (Tabela 1).

Tabela 1 A descarga nasal foi máxima no dia 5 p.i. As aves infectadas com M41-CK exibiram descarga nasal em uma maioria das aves ao passo que os dois vírus recombinantes o fizeram apenas em umas poucas aves. Não houve nenhuma diferença estatisticamente significante entre os números de aves exibiram descarga nasal nos grupos infectados com simulado e infectados com rIBY (tabela 2).

Tabela 2 Os estertores foram máximos no dia 4 p.i. no gmpo infectado com M41-CK. BeauR-M41 (S) e BeauR não causou qualquer estertor moderado ou grave (tabela 3) Tabela 3 Nenhuma dos rIBVs diminuíram a atividade ciliar, ao passo que o M41-CK virulento causou a ciliostase completa (tabela 4).

Tabela 4 Os resultados representados nas Tabelas acima demonstram que tanto a cepa BeauR de IBV precursora e a permuta mutante BeauR-M41 (S) não foi patogênica para galinhas recém chocadas. B - Eficácia da indução de imunidade protetora pela BeauR e BeauR-M41 (S ) Materiais e Métodos Estudo Animal As aves neste Experimento que foram vacinadas com BeauR, BeauR-M41 (S), M41CK ou nenhum vírus aos oito dias de idade, foram confrontadas 21 dias mais tarde com 3 logio doses 50 ciliostáticas de IBV M41-CK virulento. Um quinto grupo de aves foram infectadas com simulado.

Este foi retido como um grupo não confrontado. Quatro dias depois da confrontação dos pintinhos, as traquéias foram removidas, o epitélio foi raspado e recolocado em suspensão em 1 ml de meio. Isto foi titulado em culturas de órgão traquéia e o título expressado como log10 dose 50 ciliostática (CD50).

Resultados A confrontação, com M41-CK virulento, de aves que foram vacinadas com BeauR-M41 (S) resultou em estalo em um nível baixo, similar àquele das aves que foram tanto vacinadas quanto confrotadas com M41-CK.

Ao contrário as aves vacinadas com BeauR exibiram uma taxa alta de estalo, embora menor do que as aves não vacinada que foram confrontadas (tabela 5).

Tabela 5 A confrontação com M.41-CK causou a descarga nasal em 56 % das aves vacinadas com simulado e nenhuma descarga nasal em aves que foram vacinadas com BeauR-M41 (S) ou M41-CK (tabela 6).

Tabela 6 A confrontação com M41-CK causou estertores moderados ou graves em 23 % das aves vacinadas com simulado no dia 6 p.i. e em nenhuma das aves que foram vacinadas com os rIBVs (tabela 7) Tabela 7 As aves que foram vacinados com M41-CK foram totalmente protegidos contra a confrontação com M41-CK; a atividade ciliar foi de 100 %, ao contrário das aves não vacinadas, onde não houve nenhuma atividade ciliar. A maioria (7/9) das aves que foram vacinadas com BeauR-M41 (S) tiveram alta atividade ciliar (> 50 %) depois da confrontação isto é, elas resistiram à confrontação. As duas aves remanescentes tiveram quase 50 % de atividade (Tabela 8).

Tabela 8 1 As outras 8 aves neste grupo tiveram < 25 % atividade ciliar. 2 As outras 2 aves neste grupo tiveram 48 % e 45 % de atividade ciliar.

Nenhum vírus confrontado pôde ser detectado nos vários grupos de aves vacinadas (Tabela 9).

Tabela 9 a O título médio de vírus confrontado recuperado foi de 2,9 logio 50/ml. b Nenhum vírus confrontado recuperado.

Estes experimentos de confrontação demonstram que BeauR- M41 (S) é capaz de induzir a proteção contra a confrontação em um grau similar a M41-CK, ao passo que o IBV BeauR precursor apenas induz uma proteção deficiente.

Exemnlo 4. Caracterização Biológica de IBV com ponta Beaudctte-M41 recombinante in vivo (administração in ovo) Teste 1. Estudo de segurança e eficácia para a vacinação in ovo com IBV

Capacidade de chocar Grupos de ovos isentos de patógeno específico (SPF) foram incubados até 18 dias de embrionação. As vacinações in ovo dadas estão resumidas na Tabela 10. Uma dose de Ma5, uma vacina de IBV sorotipo Massachusetts (Intervetlntemational BV), foi dada ao grupo 1, o grupo 2 não foi vacinado, o grupo 3 recebeu o IBV de mudança mutante Beau-R-M41 (S) e o grupo 4 o Beau-R recombinante. Os vírus foram diluídos em meio de Eagles modificado (MEM). Um furo pequeno foi perfurado no ovo acima do espaço de ar e uma agulha de calibre 20 de polegada longa usada para liberar 0,1 ml do vírus no fluido amniótico, Os ovos foram colocados em incubadores separados e a capacidade de chocar foi avaliada no dia 21 de incubação Tabela 10 Avaliação de sinais clínicos pós choco No dia 6 após o choco as aves foram avaliadas quanto ao exsudato nasal (NE), um sinal clínico associado com a infecção pelo IBV. NE não foi detectado nas aves vacinadas in ovo com Beau-R ou BeauR-M41 (S).

Entretanto, NE foi detectado em uma proporção dos vacinados com Ma5 in ovo que chocaram (Tabela 11).

Tabela 11 Para avaliar ainda mais o efeito das vacinações IBV in ovo um pequeno número de aves foram submetidas à eutanásia no dia 7 de modo que uma avaliação da atividade ciliar traqueal pudesse ser feita. A atividade ciliar é usada como uma medida da atenuação do IBV inoculado. As traquéias de aves/embriões inoculados são cortadas em 10 seções, 3 do topo e fundo e quatro do meio. Uma avaliação microscópica da atividade ciliar é feita e a porcentagem média de cílios que pararam de bater para os 10 anéis é calculada. Quanto maior a pontuação maior o dano induzido pelo IBV.

Ma5 inoculado in ovo, embora avaliado apenas em 1 ave, deu pontuações de ciliostase muito altas em cada ave (tabela 12). Ambos dos Beaudette de IBV recombinantes deram pontuações baixas que são aceitáveis nos campos da segurança.

Tabela 12 Confrontação de IBV Virulento Para determinar a eficácia da vacinação in ovo com os clones infecciosos 4 semanas após o choco, uma seleção de aves foram confrontadas com 2,9 logio EID50 de IBV M41 sorotipo Massachusetts vimlento pela via ocular-nasal. Nos dias 5 e 7 após a confrontação os testes de ciliostase foram realizados em anéis da traquéia de aves submetidas à eutanásia. Com base em uma pontuação de ciliostase individual de 50 % ou menos sendo protegida, 100 % das aves vacinadas com Ma5 foram protegidas, 90 % das aves BeauR- M41 (S) foram protegidas e 30 % das aves vacinadas com Beau-R foram protegidas. As pontuações de ciliostase individual e média são mostradas na Tabela 13.

Tabela 13 Teste 2 estudo de segurança para a vacinação in ovo com IBV

Em um segundo tesíe a capacidade de chocar a seguir da vacinação in ovo foi re-avaliada. Como descrito para o teste 1 os ovos (40/grapo) foram vacinados em 18 dias de embrionação com cada um dos clones infecciosos ou com um placebo (MEM). O teste de ciliostase foi realizado nos dias 2, 5, 8 e 12 dias após o choco para confirmar a segurança da vacinação. É mostrado que a vacinação com BeauR-M41 (S) tem um efeito mínimo sobre a capacidade de chocar e causa dano mínimo à traquéia.

Tabela 14 Tabela 15 LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1. Diagrama esquemático do gene S de IBV. A extremidade 5’ do gene S sobrepõem a extremidade 3’ do gene da replicase.

Os quatro domínios da proteína S, a posição do ponto de divagem S1/S2 e as posições dos sítios de restrição PacI e BspHI, o gene S TAS, o gene 3 TAS e o início do gene 3 são mostrado. Os números referem-se às posições das diferenças de aminoácido entre as seqüências de proteína de IBV Beaudette- CK e M41-CK-S dentro das seqüências de gene S qmméricas, que resultam de substituições não sinônimas a seguir da mudança das duas seqüências de gene S.

Figura 2. A estrutura esquemática do plasmídeo pACNR- Nhel-Notl-IBV usado como uma fonte de FRAG-3 para a geração de cDNAs de tamanho natural derivados de Beaudette-CK de tamanho natural. O plasmídeo foi usado para a remoção da região do gene de Beaudette-CK que codifica a seqüência de sinal, o ectodomínio e o domínio de transmembrana.

Os sítios de restrição são indicados.

Figura 3. A estrutura esquemática do fragmento PacI- BspHIcDNA de 3383 pb que compreende a seqüência de sinal, o ectodomínio e o domínio de transmembrana do gene com ponta M41. Os sítios de restrição são indicados.

Figura 4. A estrutura esquemática do plasmídeo pACNR- NheI-NotI-IBV-M41-S que compreende o gene S quimérico e usado como a fonte de FRAG-3-M41 S para a geração de um cDNA de tamanho natural de IBV contendo as seqüências de gene S quimérico. Os sítios de restrição são indicados.

Figura 5. Diagrama esquemático para a construção do gene S

quimérico e produção de um cDNA de IBV de tamanho natural. (A) A substituição das seqüências de sinal, ectodomínio e regiões de transmembrana do gene S de Beaudette-CK com a seqüência correspondente de IBV M41-CK para a construção de FRAG-3-M41S. (B) Diagrama esquemático do cDNA de BeauR-M41 (S) de tamanho natural composto de FRAG-1, FRAG-2 e FRAG-3-M41S.

Figura 6. Diagrama esquemático para a isolação de produtos de PCR representando a seqüência de gene S 4/91. Figura 7. Diagrama esquemático mostrando a montagem do gene S quimérico 4/91 em pGPT- 4/9IS. (A) Dois fragmentos foram gerados a partir de pGPT-M41S para o uso no processo de montagem. Um fragmento representando o gene S M41 quimérico foi descartado. (B) Montagem do gene S 4/91 quimérico empGPT- 4/9IS, por uma reação de ligação de quatro vias, usando os dois fragmentos isolados de pGPT-M41S em conjunção com os dois produtos de digestão que representam a seqüência do gene S 4/91. Os fragmentos relevantes e os sítios de restrição são indicados.

Figura 8. Representação esquemática da primeira etapa de TDS para gerar o cDNA de IBV “sem ponta” dentro do vírus da vacínia recombinante vNoíI-IBV-ASfl· Figura 9. Representação esquemática da Segunda etapa de TDS para a inserção do gene S quimérico 4/91-Beau-R no cDNA de IBV de tamanho natural dentro do vírus da vacínia recombinante vNot-IBVFL-4/91S.

Figura 10. Perfis de desenvolvimento dos três IBVs em quatro tipos de célula. Os painéis mostram o padrão de desenvolvimento de Beau-R (linha sólida com triângulo), M41-CK (linha tracejada com diamante) e BeauR- M41 (S) (linha pontilhada com quadrado) em (A) células CK, (B) células VERO, (C) células CEF e (D) células BHK-21.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: 087161e005.txt - Data de Geração do Código: 02-05-2014 - Hora de Geração do Código: 15:36:14 - Código de Controle: - Campo 1: DFCFEAC03FE879FB

- Campo 2: B976D2258378AE4C

Claims (10)

1. Vacina para uso na proteção de aves domésticas contra a bronquite infecciosa compreendendo um vírus da bronquite infecciosa (IBV) atenuado e um veículo ou diluente famiaceuticamente aceitáveis, caracterizada pelo fato de que o IBV atenuado é da cepa Beaudette de IBV que compreende um gene que codifica para a proteína S de IBV heterólogo.

2. Vacina de acordo com a reivindicação I, caracterizada pelo fato dc que o gene que codifica para a proteína S de IBV heterólogo codifica uma proteína S (spike) de um IBV do sorotipo Massachusetts.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene que codifica para a proteína S de IBV heterólogo codifica uma proteína S de IBV cepa M41.

4. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo falo de que o gene que codifica para a proteína S de IBV heterólogo codifica uma proteína S de um IBV sorotipo 793B, em particular de IBV cepa 4/91.

5. Vacina de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o gene que codifica para a proteína S de IBV heterólogo substitui o gene que codifica para a proteína S de IBV original.

ó. Vacina de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o IBV está em uma forma viva*

7. Vacina de acordo com as reivindicações de I a 6, caracterizada pelo fato de que a vacina ainda compreende uma ou mais cepas de vacina de outros patógenos infecciosos para as aves domésticas*

8. Vacina de acordo com as reivindicações de 1 a 7* caracterizada pelo fato de que a vacina compreende um adjuvante.

9. Método para a preparação de uma vacina como definida nas reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o IBV atenuado é misturado com um veículo ou um diluente farmaceudcamente aceitáveis.

10. Uso da cepa Beaudette de IBV BeauR que compreende um gene um gene que codifica para a proteína S de IBV heterólogo, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para a proteção de aves domésticas contra a bronquite infecciosa para a administração in ovo.