ES2278810T3 - Nucleoproteina recombinante mutante del virus de la enfermedad de newcastle (ndv) como marcador de vacuna. - Google Patents
Nucleoproteina recombinante mutante del virus de la enfermedad de newcastle (ndv) como marcador de vacuna. Download PDFInfo
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Abstract
Un mutante del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) que carece de un epítopo inmunodominante en una proteína de NDV como resultado de una mutación en un gen que codifica la proteína, caracterizado porque el mutante de NDV carece de un epítopo localizado en una región de la nucleoproteína (NP), teniendo la región la secuencia de aminoácidos (447-455) mostrada en el SEQ ID No. 1.
Description
Nucleoproteína recombinante mutante del virus de
la enfermedad de Newcastle (NDV) como marcador de vacuna.
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es
responsable de una de las enfermedades más devastadoras de la
volatería y tiene un impacto económico sustancial en la industria de
la volatería. La vacunación de pollos, concretamente de aquellos
producidos para consumo comercial, se lleva a cabo en todo el mundo.
Aunque se encuentran disponibles en la actualidad vacunas para ND
vivas o atenuadas, el virus continúa siendo una amenaza para las
parvadas comerciales.
El genoma del virus con ARN de NDV de hebra
negativa, que tiene una longitud de aproximadamente 15 kb, contiene
seis genes que codifican seis proteínas estructurales principales:
nucleoproteína (NP), fosfoproteína (P), proteína de la matriz (M),
proteína de fusión (F), hemaglutinin-neuraminidasa
(HN) y ARN-polimerasa ARN dependiente (L). El ARN
junto con las proteínas NP, P y L forma el complejo
ribonucleoproteína (RNP) que sirve como molde para la síntesis del
ARN. Una característica común de todos los virus de hebra negativa
(NSV) es la presencia de su información genética exclusivamente en
forma de una RNP. La RNP, pero no el ARN desnudo, sirve como molde
para la transcripción y la replicación.
La NP junto con las proteínas polimerasa, P y L,
juegan un papel eminente en la encapsulación y protección del ARN
de la degradación enzimática. Por otra parte, la NP regula la
transcripción y replicación del genoma viral interaccionando con P
sola, con P y L (ARN polimerasa) o consigo misma (interacción
NP-NP). Para el paramixovirus Sendai, se demostró
que una región N-terminal conservada de NP estaba
implicada en la interacción NP-ARN y
NP-NP (Buchholz et al., J. Virol. 67,
5803-5812, 1993), a la vez que se demostró que se
requería el dominio carboxi terminal para la función de molde
(Curran et al., J. Virol. 67, 4358-64). La
mayoría de las partes de la NP son de este modo absolutamente
esenciales para la replicación del virus debido al compromiso del
plegado múltiple de NP en el ensamblaje y la actividad biológica de
la RNP.
En muchos países, ya existe una legislación para
controlar los brotes de NDV. En algunos países, se ponen en
práctica políticas de erradicación con eliminación obligatoria de
aves infectadas. Para un mantenimiento de las industrias de la
volatería internacionales con éxito, es deseable la introducción de
medidas de control de ND sistemáticas. No obstante, todos los virus
completos utilizados en la actualidad basados en vacunas de ND
vivas e inactivadas tienen una desventaja principal, ya que los
animales vacunados no se pueden distinguir de los animales
infectados con ensayos serológicos normalizados como inhibición de
hemaglutinina (HI) o neutralización de virus (VN). Por lo tanto,
existe la necesidad de material inmunogénico de NDV que comprenda
una proteína de NDV que carezca al menos de un epítopo
inmunodominante. Un epítopo es una pequeña región estructural de un
antígeno que interacciona con un anticuerpo. Un epítopo puede
constar de tan pocos como 3 aminoácidos de un polipéptido, pero
normalmente comprende 5-10 o en algunos casos más
aminoácidos.
Recientemente, las vacunas denominadas
"vacunas marcadoras" están ganando popularidad en la medicina
veterinaria cuando la erradicación de enfermedades específicas es
de interés nacional o internacional. Una vacuna marcadora se define
como una vacuna, junto con un ensayo de diagnóstico, que permite la
diferenciación serológica de los animales vacunados de los animales
infectados.
Los enfoques para desarrollar vacunas marcadoras
incluyen la deleción de uno o más genes no esenciales, pero
inmunogénicos. Este enfoque es aplicable principalmente para ADN
virus que contienen diversos genes dispensables (p. ej.
herpesvirus). Para los virus con ARN, la mayoría de los genes son
esenciales o los no esenciales son no inmunogénicos. El NDV, un
virus con ARN de hebra negativa, contiene seis genes estructurales
principales, que son todos esenciales para la propagación del
virus. Cabría esperar que la deleción de uno o más genes causara la
pérdida de actividades biológicas. En efecto, mientras tales
programas de control para otras enfermedades infecciosas virales en
animales están en desarrollo, hasta la presente invención todavía no
se ha descrito una vacuna basada en una cepa de vacuna de NDV que
se ajuste a los programas de control de ND.
Un enfoque alternativo para el desarrollo de una
vacuna marcadora es el uso de "vacunas subunitarias". Este
enfoque ha sido implementado para NDV identificando dos
glicoproteínas, la proteína de fusión (F) y la
hemaglutinina-neuraminidasa (HN), implicadas en la
inducción de la inmunidad protectora. Se han construido con éxito
vectores recombinantes, tales como herpesvirus de pavo (HVT) y
virus de viruela aviar (FVP) que expresan F y/o HN de NDV y se han
estudiado extensamente su seguridad y eficacia.
Las nucleoproteínas (NP) de los virus con ARN
con hebra negativa (NSV) son muy inmunogénicas en la naturaleza y
han sido utilizadas como antígeno en ELISA de diagnóstico. Estos
incluyen virus de la rabia, sarampión, Rinderpest (peste bovina),
estomatitis vesicular y NDV. Estos ensayos se utilizaron
principalmente para controlar los programas de vacunación. Junto
con una vacuna de la subunidad HN de NDV, también se describió un
inmunoanálisis basado en NP como ensayo de diagnóstico en la
diferenciación entre animales vacunados e infectados (Makkay et
al., Vet. Microbiol. 66, 209-222, 1999).
No obstante, los inmunoanálisis con NP junto con una vacuna
marcadora basada en NSV completo, en particular una vacuna de NDV,
no existen, principalmente debido al hecho de que se espera que la
modificación genética del gen NP muy vital tenga consecuencias
perjudiciales sobre la replicación y la infectividad del virus.
Una desventaja de las vacunas de subunidades de
NDV es, no obstante, que la eficacia de los virus recombinantes que
expresan la proteína F o HN de NDV se reduce significativamente en
presencia de anticuerpos maternales (MDA) en pollos comerciales. En
contraste, las vacunas de ND convencionales basadas en preparaciones
de virus completos confieren total protección incluso en presencia
de MDA.
Otra desventaja general de varios de los
vectores recombinantes es el comienzo retardado de la inmunidad
protectora. Las vacunas de ND vivas convencionales generalmente
proporcionan protección total 6-7 días después de la
vacunación mientras se demostró que el comienzo de la inmunidad
inducida por una vacuna basada en un HVT recombinante que expresa
la proteína F de NDV se producía entre 14 y 21 días después de la
vacunación. (Morgan et al., Avian Dis. 37,
1032-1040, 1993).
A la vista de estas desventajas de las vacunas
de subunidades de ND existe la necesidad de una vacuna marcadora de
ND basada en virus completo que conserve su proteína F- y HN en su
forma natural y que pueda ser discriminada serológicamente del tipo
salvaje así como de virus de vacunas tradicionales.
En la solicitud internacional WO 99/66045 se
describe una vacuna marcadora de NDV basada en un mutante de NDV
que carece de epítopo inmunodominante en una proteína NDV. No
obstante, este virus de vacuna contiene una proteína HN híbrida
compuesta solamente por la cuarta parte de la proteína HN de NDV
mientras la parte restante de la proteína HN está derivada de un
paramixovirus aviar no relacionado de tipo 2 o 4. La separación de
la mayoría de la región HN de NDV reduciría de manera concebible el
papel desempeñado por HN en la inducción de anticuerpos protectores
de NDV.
Las vacunas de NDV vivo asequibles en la
actualidad solamente pueden ser administradas a pollos eclosionados
a través del agua de bebida, aerosoles, gotas oculares o rutas
parenterales. Estos métodos de aplicación tienen algunas
desventajas. Muy importantemente, estos métodos son costosos debido
al trabajo necesario para su aplicación. Recientemente, se ha
demostrado que el uso de vacunas en forma de vacunas de embriones es
eficaz y económica (Sharma and Burmester, Avian Diseases 26,
134-149, 1982 y Sharma, Avian Diseases 29,
1155-1169, 1985). Por otra parte, se encontró que
la vacunación de embriones era ventajosa debido a la temprana edad
de resistencia a la enfermedad específica y a la administración de
una dosis uniforme de vacuna a cada huevo utilizando máquinas
semi-automáticas con múltiples cabezales de
inyección.
Se debe observar que muchas vacunas utilizadas
convencionalmente para la vacunación post-eclosión
de las aves no podrían ser utilizadas para la vacunación in
ovo. Los embriones en fase tardía son muy susceptibles de
infección con la mayoría de los virus de vacuna examinados,
incluyendo aquellos virus de vacuna que se pueden utilizar de forma
segura en pollos eclosionados de un día de edad. Por consiguiente,
las vacunas convencionales no pueden ser utilizadas para la
administración in ovo.
Actualmente, no existe una vacuna de ND
asequible comercialmente adecuada que se pueda aplicar in
ovo, principalmente debido al elevado nivel de mortalidad de
los embriones asociado incluso con dos de las cepas de vacuna de
NDV asequibles comercialmente más suaves: NDW (patente de los
Estados Unidos núm. 5.149.530) y C2 (patente de los Estados Unidos
núm. 5.750.111). La patente de los Estados Unidos núm. 5.427.791
(Regents of the University of Minnesota) describe el uso de agentes
mutagénicos químicos para producir mutantes de NDV de la cepa
Hitchner B1 que no son patogénicos para los embriones en fase
tardía. El tratamiento químico de la cepa B1 con
etil-metano-sulfonato (EMS)
producía el virus NDV-B1-EMS
mutante, que se podía administrar de manera segura a huevos de pollo
a los 18 días de embrionación. No obstante, desventajosamente, cada
fase de paso a un huevo de esta cepa se debe llevar a cabo en
presencia del agente mutagénico EMS debido a la propiedad del
mutante de revertir a la cepa B1 parental que no es segura para los
embriones.
Un objeto de esta invención es proporcionar un
mutante de NDV que se pueda utilizar como componente activo en una
vacuna marcadora de ND basada en un virus completo para permitir la
distinción serológica entre animales infectados con NDV de tipo
salvaje o vacunados con cepas de vacuna de NDV convencionales de
aquellos animales inmunizados con una vacuna basada en este mutante
de NDV.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un mutante de NDV que se pueda utilizar como
componente activo en una vacuna que se puede administrar no
solamente a aves jóvenes después de la eclosión, sino que también
se pueda administrar de manera segura in ovo.
La invención descrita aquí satisface estos
objetos proporcionando un mutante de NDV construido mediante
ingeniería genética que es distinto de las cepas de NDV (vacuna)
conocidas debido a la separación de un epítopo inmunodominante
novedoso de la NP, que es serológicamente muy relevante en la
infección por NDV, pero cuya deleción no afecta adversamente a las
propiedades protectoras del mutante de NDV novedoso.
La presente invención proporciona un mutante de
NDV que carece de un epítopo inmunodominante en una proteína de NDV
como resultado de una mutación en un gen que codifica la proteína,
caracterizado porque el mutante de NDV carece de un epítopo
localizado en una región de la nucleoproteína (NP), teniendo la
región la secuencia de aminoácidos (447-455)
mostrada en el SEQ ID No. 1.
\newpage
Se ha descubierto que la secuencia de
aminoácidos (447-455) Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala
Val Ala de la NP, codificada por los nucleótidos
1460-1486 del genoma de NDV, comprende un epítopo
inmunodominante de la NP de NDV. Es decir que los antisueros
obtenidos a partir de virtualmente todos los pollos infectados con
NDV interaccionan con un epítopo localizado en esta región. Los
antisueros interaccionan con los aminoácidos mencionados antes,
pero no interaccionan sustancialmente con los aminoácidos que
flanquean esta región.
Además, se demuestra en la Figura 2 que el
antisuero de pollo inducido por cepas de NDV convencionales, tanto
vivas como inactivadas, reaccionan con el péptido
18-mero de NP que abarca los aminoácidos
(443-460) Gly Glu Thr Gln Phe Leu Asp Leu Met Arg
Ala Val Ala Asn Ser Met Arg Glu (SEQ ID No. 2) que comprende la
región (447-455). Una comparación de las secuencias
de aminoácidos que abarcan esta región revela una identidad de
aminoácidos del 100% entre la cepa Texas GB velogénica, la cepa
Beaudette C mesogénica y la cepa Clone-30
lentogénica. Por lo tanto, se satisface uno de los criterios
importantes para desarrollar una vacuna marcadora, es decir la
identificación de un epítopo expresado por una proteína de las cepas
de NDV convencionales que es reconocido por el sistema inmunitario
del pollo.
La numeración entre paréntesis utilizada en la
presente memoria para identificar las posiciones de nucleótidos en
el genoma de NDV y los restos aminoácido en las proteínas de NDV es
la descrita por Römer-Oberdorfer et al., J.
Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999, núm. de
acceso EMBL Y18898).
Inesperadamente, se ha descubierto
adicionalmente que a pesar del hecho de que la NP es una proteína
esencial para la replicación del NDV, los aminoácidos
(447-455) no son necesarios para la replicación del
virus. Un mutante de NDV recombinante infeccioso que no expresa el
epítopo NP localizado dentro de esta región se recuperó de las
células después de la transfección de estas células con los
plásmidos apropiados utilizando la tecnología de la "genética
inversa", y se pudo propagar eficazmente en huevos de pollo.
Se generó un mutante de NP de NDV según la
presente invención introduciendo una mutación en el gen NP de manera
que se perdiera la capacidad del epítopo inmunodominante para
inducir anticuerpos en pollos que sean reactivos con un epítopo
localizado en el péptido 18-mero que tiene la
secuencia de aminoácidos (443-460). Los Ejemplos 2
y 3 demuestran (i) que el mutante de NP de NDV según la invención es
capaz de inducir anticuerpos HI y suero anti-NDV de
pollo policlonal que reaccionan con el antígeno del virus completo,
pero que (ii) estos antisueros no muestran reactividad con un
epítopo localizado en el péptido 18-mero.
La observación de que los sueros
anti-NDV de pollo originados contra el mutante NP de
NDV según la presente invención se pueden distinguir de los sueros
de pollos originados contra las cepas de NDV de origen natural y
las cepas de vacuna de NDV convencionales examinando la interacción
de los antisueros con un epítopo localizado en la región
(447-455) hace de este mutante de NP de NDV un
candidato adecuado para una vacuna marcadora. En particular, la
presente invención también incluye un mutante de NP de NDV que
carece de un epítopo inmunodominante localizado en la región
(447-455) que induce el antisuero en pollos que se
puede distinguir del antisuero inducido por las cepas de NDV
convencionales examinando la interacción del antisuero mutante con
un péptido que comprende la región (447-455) en
presencia de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente con
un epítopo inmunodominante localizado en esta región. En el último
caso, el examen es normalmente un análisis de competición o bloqueo
inmunológico.
Por lo tanto, un mutante de NP de NDV concreto
según la presente invención se caracteriza porque el mutante induce
antisuero en pollos que carecen de anticuerpos que reaccionan con un
epítopo inmunodominante localizado en la región de aminoácidos
(447-455) de la NP.
En una realización más preferida se proporciona
un mutante de NP de NDV que induce antisuero en pollos que carecen
de anticuerpos que reaccionan con el péptido 18-mero
que tiene la secuencia de aminoácidos de NP
(443-460) mostrada en el SEQ ID No. 2.
Con el término "induce antisuero en pollos que
carecen de anticuerpos que reaccionan con" se quiere significar
que una muestra de suero obtenida de un pollo infectado/vacunado se
puntúa negativo en un ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada
de NP directo o de bloqueo (ELISA).
Típicamente, el valor de corte de la absorbancia
(DO) para el ELISA de NP para diferenciar las muestras positivas de
las negativas se ajusta a tres desviaciones típicas por encima de
las razones P/N medias de las muestras de control negativas de
pollos SPF (donde P = la DO de las muestras de los pocillos
recubiertos con un péptido relevante acoplado a una molécula
portadora y; N = la DO de las muestras de pocillo recubiertos con la
molécula portadora). Una molécula portadora puede ser una proteína
portadora, tal como BSA, ovoalbúmina, KLH, una cadena de
carbohidrato o una cadena de aminoácidos sintética.
El gen NP está localizado en el genoma de NDV en
las posiciones de nucleótidos 56 a 1801 (cepa Clone 30® de NDV). La
NP de NDV tiene 489 aminoácidos de longitud y está muy conservada en
las cepas lentogénicas, mesogénicas y velogénicas. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del gen NP de esta cepa de
NDV se muestran en el SEC ID no. 3 y 4. Una comparación de las
secuencias de aminoácidos deducidas de la NP de
Clone-30 con las correspondientes secuencias de las
cepas Texas GB- velogénica y Beaudette C mesogénica de NDV revelan
una identidad del 100% y el 99,3%. En el caso de que la región
polipeptídica se defina aquí mediante la referencia a una secuencia
de aminoácidos específica derivada de la cepa Clone 30 de NDV
específica, se considera que esta región abarca la correspondiente
región con una secuencia de aminoácidos que diverge de otra cepa de
NDV.
Se entiende que una mutación es un cambio de la
información genética en un gen NP de "tipo salvaje" o no
modificado de una cepa de NDV de origen que es capaz de expresar
una NP natural de manera que la NP expresada por el mutante de NDV
carece de un epítopo inmunodominante localizado en la región
(447-455) de la NP.
Un requerimiento adicional de la mutación
introducida en el gen NP es que la NP alterada permita la
recuperación de NDV infeccioso del cultivo de células después de la
transfección de estas células con los plásmidos apropiados
utilizando la tecnología de la "genética inversa" para NDV. Los
Ejemplos 1 y 2 describen experimentos que son adecuados para
determinar la capacidad de la NP alterada para inducir anticuerpos
para NDV y la permisividad de la mutación para generar virus
infeccioso recuperable del cultivo celular transfectado con los
plásmidos apropiados.
La mutación es, por ejemplo, una sustitución,
deleción, inserción de ácido nucleico, o combinación de las
mismas.
En una realización preferida de la presente
invención el mutante de NP de NDV comprende una deleción o
sustitución de uno o más aminoácidos en una región de la NP que
tiene la secuencia de aminoácidos (447-455) mostrada
en el SEQ ID. No. 1.
Se ha encontrado en la presente memoria que no
todas las deleciones en la región del gen NP que comprende las
secuencias codificadoras de un epítopo inmunodominante son
permisibles. Una deleción de los nucleótidos correspondientes a los
aminoácidos de NP 443-460 (mutante
NDV-\Delta18) conduce a la recuperación de un
mutante de NDV infeccioso del cultivo celular después de la
transfección con los plásmidos apropiados, mientras la deleción de
los nucleótidos correspondientes a los aminoácidos de NP
444-455 (mutante NDV-\Delta12) o
442-489 (mutante NDV-\Delta48)
no.
El análisis de la estructura secundaria de la
proteína (análisis
Gamier-Osguthorpe-Robson) mostraba
que las posiciones de los aminoácidos 444-459 de la
NP forman una hélice alfa. Se encontró que la eliminación de la
hélice completa y de los nucleótidos limítrofes (\Delta
443-460) no evitaba la generación de NDV
recombinante infeccioso, viable, mientras la eliminación de la
estructura en hélice parcial o porciones adicionales de la proteína
NP no conducía a la recuperación de NDV infeccioso del cultivo
celular.
Por lo tanto, un mutante de NDV preferido según
la presente invención comprende una deleción de los aminoácidos
443\pm1-460\pm1.
En un aspecto preferido concreto de esta
realización de la invención se proporciona un mutante de NP de NDV
que comprende una deleción de los aminoácidos
443-460.
Un mutante de NDV particularmente ventajoso
según la presente invención es un mutante de NDV como se ha descrito
antes que comprende mutaciones atenuantes adicionales. Semejantes
mutantes de NDV pueden estar derivados de cualquier cepa de vacuna
de la ND. Los ejemplos de semejantes cepas de vacunas de NDV
adecuadas presentes en las vacunas de la ND asequibles
comercialmente son: Clone-30®, La Sota, Hitchner B1,
NDW, C2 y AV4, siendo Clone-30® la cepa de vacuna
preferida.
En un aspecto adicional de esta realización la
presente invención proporciona un virus vector recombinante en el
mutante de NDV descrito antes. Semejante virus vector recombinante
se puede utilizar no solamente para la preparación de una vacuna
contra NDV, sino también contra otras enfermedades infecciosas de la
volatería. Alternativamente, semejante virus vector recombinante
también puede proporcionar una seguridad extra en una prueba de
diagnóstico y hace de los virus recombinantes candidatos a
marcadores duales atractivos.
Un vector de NDV se puede obtener mediante
sustitución en marco (completa o parcial) de la región que codifica
el epítopo inmunodominante de NP definido antes por una secuencia de
ácido nucleico heteróloga que codifica un epítopo inmunodominante
de un polipéptido distinto de la NP, v.g., un polipéptido de otro
patógeno aviar. El epítopo inmunodominante representa una región de
un polipéptido que interacciona virtualmente con todos los
antisueros inducidos por (una composición que comprende) el
polipéptido.
En un vector de NDV preferido según la presente
invención los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos
de NP 444-459 o 444-455 son
sustituidos por una secuencia de nucleótidos heteróloga, en
particular por una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica
16 o 12 aminoácidos, respectivamente.
En el ejemplo 5 se demuestra que se puede
utilizar un epítopo de una célula B de un virus no relacionado con
NDV para remplazar el epítopo inmunodominante de NP de NDV. Los
vectores de NDV recombinantes eran capaces de inducir anticuerpos
específicos contra el epítopo foráneo sin inducir anticuerpos
dirigidos contra el epítopo inmunodominante de la NP. Además, se
demuestra que el epítopo foráneo expresado es capaz de inducir
protección frente a la sensibilización por el correspondiente virus
de tipo salvaje.
También se puede obtener un vector de NDV
insertando una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica
un polipéptido de otro patógeno aviar en una región no traducida del
mutante de NDV. Las regiones no traducidas adecuadas para este fin
se localizan entre el promotor genómico y el inicio del gen NP, y
las conexiones génicas NP/P, P/M, M/F, F/HN y HN/L así como entre
el extremo del gen L y el promotor antigenómico. La secuencia de
ácido nucleico heteróloga puede codificar un antígeno de un patógeno
aviar tal como el virus de la enfermedad bursal, el virus de la
bronquitis infecciosa, el virus de la enfermedad de Marek, el virus
de la encefalomielitis aviar, el reovirus aviar, el virus de la
influenza aviar, el virus de la anemia de los pollos, Salmonella
sp., E.coli, y Eimeria sp.
Se puede preparar un mutante de NP de NDV según
la presente invención por medio del método bien establecido de la
"genética inversa" que permite la modificación de genes de
virus con ARN de hebra negativa, no segmentado (revisado por
Conzelmann, Annu. Rev. Genet. 32, 123-162,
1998, y Roberts and Rose, Virology 247, 1-6,
1998).
Adicionalmente, semejante método también ha sido
descrito para NDV por Peeters et al. (J. Virology 73,
5001-5009, 1999) y Römer-Oberdörfer
et al. (J. Gen. Virol. 80,
2987-2995,1999) y se describe en el Ejemplo 1.
Las mutaciones deseadas se pueden introducir en
el genoma de NDV por medio de métodos generalmente conocidos en la
técnica para este fin. En particular, las mutaciones son
introducidas por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Semejante
método se describe en la presente memoria, pero se utiliza
generalmente en la técnica (Peeters et al., 1999,
supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F. M.
Ausubel et al., Wiley N.Y., edición 1995, páginas
8.5.1.-8.5.9. y Kunkel et al., Methods in Enzymology Vol.
154, 376-382, 1987).
Además del descubrimiento inesperado de que un
mutante de NP de NDV según la presente invención es capaz de
inducir una respuesta de anticuerpos en pollos que se puede
distinguir de la inducida por las cepas de NDV de origen natural,
también se ha descubierto que el mutante de NP de NDV descrito antes
es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora.
Por lo tanto, en otra realización de esta
invención, se proporciona una vacuna contra la enfermedad de
Newcastle en la volatería que comprende un mutante de NP de NDV
como se ha definido antes en una forma viva o inactivada, y un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Se puede preparar una vacuna según la invención
mediante métodos convencionales tales como los utilizados
comúnmente para las vacunas de NDV vivas e inactivadas asequibles
comercialmente.
Brevemente, se inocula un sustrato susceptible
con el mutante de NP de NDV y se propaga hasta que el virus replica
a un título deseado después de lo cual se cosecha el material que
contiene NDV. Con posterioridad, el material cosechado se formula en
una preparación farmacéutica con propiedades inmunizantes.
Cada sustrato que es capaz de soportar la
replicación de los virus ND se puede utilizar en la presente
invención, incluyendo cultivos de células primarias (aviares), tales
como células fibroblásticas de embrión de pollo (CEF) o células de
riñón de pollo (CK), o líneas celulares de mamífero tales como la
línea celular VERO o la línea celular de riñón de cría de hámster
(BHK).
Un sustrato particularmente adecuado sobre el
que se puede propagar el mutante de NP de NDV son los huevos
embrionados SPF. Los huevos embrionados se pueden inocular, por
ejemplo, con 0,2 ml de NDV conteniendo fluido alantoico que
comprende al menos 10^{2,0} DIE_{50} por huevo. Preferiblemente,
se inoculan huevos embrionados de 9 a 11 días de edad con
aproximadamente 10^{5,0} DIE_{50} y con posterioridad se
incuban a 37°C durante 2-4 días. Después de
2-4 días el producto de virus de ND se puede
cosechar preferiblemente recogiendo el fluido alantoico. El fluido
se puede centrifugar después durante 10 minutos a 2500 g seguido de
filtración del sobrenadante a través de un filtro (100 \mum).
La vacuna según la invención comprende el
mutante NP de NDV junto un portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable usado habitualmente para tales composiciones.
La vacuna que contiene el virus vivo se puede
preparar y comercializar en forma de una suspensión o en forma
liofilizada. Entre los portadores se incluyen estabilizantes,
conservantes y tampones. Entre los diluyentes se incluyen agua,
tampones acuosos y polioles.
Si se desea, la vacuna viva según la invención
puede contener un coadyuvante. Los ejemplos de los compuestos y las
composiciones adecuados con actividad coadyuvante son los mismos
mencionados más abajo para la vacuna de NDV inactivada.
Aunque es posible la administración mediante
inyectables, v.g. intramuscular, subcutánea de la vacuna viva según
la presente invención, la vacuna se administra preferiblemente
mediante técnicas de aplicación masivas poco costosas utilizadas
comúnmente para la vacunación de NDV. Para la vacunación de NDV
estas técnicas incluyen el agua de bebida y la vacunación por
pulverización.
Una propiedad inesperada adicional de un mutante
de NP de NDV según la invención es que su virulencia para los
embriones de pollos está significativamente atenuada de manera que
se puede administrar in ovo. Por lo tanto, la presente
invención también proporciona una vacuna basada en un mutante de NP
de NDV como se ha descrito antes que puede ser utilizado para la
vacunación in ovo.
La vacuna que comprende el mutante de NP de NDV
se puede inyectar en huevos embrionados según los métodos de
vacunación in ovo convencionales. Normalmente, la vacuna se
inyecta en los huevos embrionados durante las fases tardías de la
embrionación, generalmente durante el último cuarto del período de
incubación (días 15-21), preferiblemente el día 18
o 19 del período de incubación. El mecanismo de inyección de los
huevos incubados no es particularmente crítico siempre que no
lesione indebidamente tejidos y órganos del embrión. Por ejemplo,
todo el agujero es traspasado con una aguja
(2,54-3,81 cm, calibre aproximadamente 22) unida a
la jeringa en el extremo ancho de la cáscara y la vacuna se inyecta
por debajo de la membrana de la cubierta interna y la membrana
corioalantoica. Con posterioridad, los huevos embrionados vacunados
se transfieren a una incubadora hasta la eclosión (patente de los
Estados Unidos núm. 4.458.630, 5.427.791, WO 98/56413 y WO
95/35121). Preferiblemente, todo el proceso de vacunación de los
embriones se lleva a cabo utilizando sistemas de vacunación
automatizados, tales como Inovoject® asequible comercialmente.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona una vacuna que comprende el mutante de NP de NDV en una
forma inactivada. Las principales ventajas de una vacuna inactivada
son su seguridad y los elevados niveles de anticuerpos protectores
de larga duración que pueden inducir.
El propósito de la inactivación de los virus
cosechados después de la etapa de propagación es eliminar la
reproducción de los virus. En general, esto se puede obtener
mediante métodos químicos o físicos bien conocidos.
Una vacuna que contiene el mutante de NP de NDV
según la invención, puede comprender, por ejemplo, uno o más de los
portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables adaptados a
este fin.
Preferiblemente, una vacuna inactivada según la
invención comprende uno o más compuestos con actividad coadyuvante.
Los compuestos o composiciones adecuados para este fin incluyen
hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsión de aceite en agua
o de agua en aceite basada, por ejemplo, en un aceite mineral, tal
como Bayol F® o Marcol 52® o un aceite vegetal tal como acetato de
vitamina E y saponinas.
La vacuna según la invención comprende una dosis
eficaz del mutante de NP de NDV como componente activo, es decir
una cantidad de material de NDV inmunizante que inducirá inmunidad
en las aves vacunadas frente a la sensibilización por un virus
virulento. La inmunidad se define en la presente memoria como la
inducción de un nivel de protección superior significativo en una
población de aves frente a la mortalidad y síntomas clínicos
después de la vacunación en comparación con un grupo no vacunado. En
particular, la vacuna según la invención evita a una gran
proporción de animales vacunados la aparición de síntomas clínicos
de la enfermedad y de mortalidad.
Típicamente, la vacuna viva puede ser
administrada a una dosis de 10^{2,0}-10^{8,0}
dosis infecciosa de embriones (DIE_{50}), preferiblemente a una
dosis que oscila entre 10^{4,0}-10^{7,0}
DIE_{50}. Las vacunas inactivadas pueden contener el equivalente
antigénico de 10^{4,0}-10^{9,0} DIE_{50}.
Las vacunas inactivadas se administran
normalmente parenteralmente, v.g. intramuscularmente o
subcutáneamente.
Aunque la vacuna de NDV según la presente
invención se puede utilizar eficazmente en pollos, también se puede
vacunar con la vacuna con éxito otra volatería tal como pavos,
palomas, codornices, faisanes, pintadas y perdices. Los pollos
incluyen pollos para asar, reproductoras y ponedoras.
La edad de los animales después de la
post-eclosión que reciben una vacuna viva o
inactivada según la invención es la misma que la de los animales
que reciben las vacunas de NDV vivas o inactivadas convencionales.
Por ejemplo, los pollos para asar se pueden vacunar con un día de
edad o a las 1-3 semanas de edad, concretamente los
pollos para asar con elevados niveles de MDA. Las ponedoras o las
reproductoras se pueden vacunar con 1-10 días de
edad y reforzarlas con una vacuna viva o atenuada a las
6-12 y 16-20 semanas de edad.
La invención también incluye vacunas combinadas
que comprenden, además del mutante de NP de NDV según la invención,
una cepa de vacuna capaz de inducir protección contra ND o contra
otro patógeno aviar.
Preferiblemente, la vacuna combinada comprende
adicionalmente una o más cepas de vacunas del virus de la Enfermedad
de Marek (MDV), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de
la enfermedad de Newcastle (NDV), virus del síndrome de la caída de
la postura (EDS), virus de la rinotraqueítis de los pavos (TRTV) o
reovirus.
La cepa de vacuna de ND adicional en la vacuna
combinada, preferiblemente, es un vector de vacuna recombinante
capaz de expresar la proteína F o HN de NDV. Tales vectores de
vacunas virales son bien conocidos y su seguridad y eficacia han
sido estudiados extensamente: Morgan et al., Avian Diseases
36, 858-870, 1992 y Avian Diseases
37, 1032-1040, 1993; Heckert et al.,
Avian Diseases 40, 770-777, 1996; Sakaguchi
et al., Vaccine 16, 472-479, 1998 y
Sonoda et al., J. Viral. 74,
3217-3226, 2000.
En una realización muy preferida, el vector de
vacuna recombinante en una vacuna combinada según la invención es
un vector de HVT recombinante capaz de expresar la proteína F o HN
de NDV.
\newpage
En caso de que la vacuna combinada se administre
por medio de la ruta in ovo la cepa de vacuna adicional debe
ser una cepa de vacuna segura para el embrión, es decir, una cepa de
vacuna viva que, si se inocula en huevos SPF el día de embrionación
18, produzca la eclosión de al menos el 70% de los huevos
embrionados.
La vacuna marcadora de NDV descrita antes, junto
con un método de diagnóstico, permiten la distinción entre animales
que están vacunados con ella y animales que están infectados con
cepas de NDV de origen natural o vacunados con vacunas de ND
convencionales.
La presente invención también proporciona una
inestimable herramienta para verificar las medidas de control de ND
que pueden conducir a la erradicación del NDV si se aplican en
programas de dominio a gran escala. Esta herramienta tiene que ver
con un método para determinar la infección por NDV en la volatería
que comprende la etapa de examinar una muestra del animal en cuanto
a la presencia o ausencia de anticuerpos reactivos con un epítopo
inmunodominante localizado en una región de la NP que tiene la
secuencia de aminoácidos (447-455).
La muestra del animal utilizada para este método
puede ser cualquier muestra en la que se puedan detectar los
anticuerpos de NDV, v.g. una muestra de sangre, suero o tejido,
siendo preferida una muestra de suero.
En cuanto al antígeno de semejante método se
hace uso de un fragmento de la NP que comprende la región
(447-455) como la única región que contiene
epítopo. Por lo tanto, un método preferido para determinar la
infección por NDV en un animal comprende las etapas de:
(i) incubar una muestra que se sospecha que
contiene anticuerpos anti-NDV, con un fragmento de
la NP que comprende la región de aminoácidos
(447-455) como la única región que contiene
epítopo,
(ii) permitir la formación del complejo
anticuerpo-antígeno, y
(iii) detectar la presencia del complejo
anticuerpo-antígeno.
En un método de diagnóstico preferido concreto
el fragmento de la NP es el polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos 360-470 o una parte de la misma que
comprende la región (447-455).
En un método de diagnóstico muy preferido el
antígeno utilizado es el péptido 18-mero que tiene
la secuencia de aminoácidos 443-460.
El diseño del inmunoensayo puede variar. Por
ejemplo, el inmunoensayo se puede basar en la competición o en la
reacción directa. Además, los protocolos pueden utilizar soportes
sólidos o pueden utilizar material celular. La detección del
complejo anticuerpo-antígeno puede implicar el uso
de anticuerpos marcados; las marcas pueden ser, por ejemplo,
enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas
o colorantes.
Los métodos adecuados para la detección de los
anticuerpos de NDV en la muestra incluyen el ensayo de
inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), la prueba
inmunofluorescente (IFT) y el análisis de transferencia Western,
prefiriéndose el ELISA.
En un ELISA ejemplificante, los pocillos de una
placa de microtitulación de poliestireno se recubren con un
fragmento apropiado de la NP que comprende un epítopo
inmunodominante. A continuación, los pocillos de las placas
recubiertas se llenan con suero de pollo y se realizan diluciones
seriadas. Tras la incubación, se determina la presencia o ausencia
de los anticuerpos en suero anti-NP de pollo
relevantes dirigidos contra un epítopo inmunodominante por medio de
un anticuerpo de detección marcado (v.g. conjugado con peroxidasa
de rábano picante) que se une a los anticuerpos
anti-NP capturados (si están presentes en el suero
de prueba). La cantidad de anticuerpos relevantes presentes en el
suero que se unen al fragmento de NP puede ser determinada
incubando las placas con sustrato de la enzima y leyendo el valor de
la absorbancia (DO) en un lector automático de microplaca.
En una realización alternativa del método de
diagnóstico se examina la presencia de suero de pollo con
anticuerpos específicos incubando el suero y un antígeno apropiado
en presencia de un anticuerpo monoclonal que reacciona
específicamente con un epítopo localizado en la región
(447-455).
El ELISA basado en la detección de anticuerpos
para los pollos infectados por NDV versus vacunados con NDV
(subunidad), basado en la NP total como antígeno ha sido descrito
por Makkay et al., (1999, supra) y Errington et
al. (J. Virol. Methods 55, 357-365, 1995) y el
principio descrito en la presente memoria se puede aplicar por
consiguiente cuando se utilice el anticuerpo relevante.
En una realización adicional de la presente
invención se proporciona un estuche para pruebas diagnósticas que
es adecuado para realizar el método de diagnóstico según la
invención como se ha descrito antes.
En particular, se proporciona un estuche para
pruebas diagnósticas que comprende además de los componentes
normalmente presentes, un fragmento de NP como se ha definido antes,
preferiblemente el péptido 18-mero
(443-460), acoplado preferiblemente a una molécula
portadora (si se desea aplicada como recubrimiento sobre una fase
sólida), como reactivo antigénico. Otros componentes normalmente
presentes en semejante estuche para pruebas incluyen, anticuerpos
conjugados con biotina o peroxidasa de rábano picante, sustratos de
enzima, tampón de lavado
etc.
etc.
Con el fin de generar NDV mutantes, se utilizó
el plásmido pflNDV, que expresaba el ARN del antigenoma completo de
la cepa de vacuna de ND lentogénica, Clone-30
(Römer-Oberdörfer et al., J. Gen. Virol. 80,
2987-2995, 1999), para introducir mutaciones. Las
deleciones internas en la región en la que está localizado el
epítopo inmunodominante fueron introducidas utilizando el estuche
de mutagénesis dirigida al sitio de cambio rápido'' según las
instrucciones del proveedor (Stratagene). Primero, se preparó un
fragmento de ADN que abarcaba los nucleótidos
77-2289 el genoma de NDV digiriendo pflNDV con
MluI, rellenando con Klenow y tratando con ApaI. El
fragmento de ADN de \sim2.2 kb fue ligado en el vector pSKT7T
digerido con ApaI y EcoRI. La mutagénesis por PCR se
realizó después sobre el molde descrito antes utilizando los
siguientes grupos de cebadores (SEQ ID No:
5-10):
Para suprimir los nucleótidos
1451-1486, correspondientes a los aminoácidos de NP
444-455
| P1A | (5'-CCAGAAGCCGGGGATGGG/AATAGCATGAGGGAG-3') y | |
| P1B | (5'-CTCCCTCATGCTATT/CCCATCCCCGGCTTCTGG-3') |
Para suprimir los nucleótidos
1448-1501, correspondientes a los aminoácidos de NP
443-460
| P2A | (5'-CCAGAAGCCGGGGAT/GCGCCAAACTCTGCACAGG-3') y | |
| P2B | (5'-CCTGTGCAGAGTTTGGCGC/ATCCCCGGCTTCTGG-3') |
Para suprimir los nucleótidos
1445-1588, correspondientes a los aminoácidos de NP
442-489
| P3A | (5'-GGCAACCAGAAGCCGGG/TGATGGACAAAACCCAGC-3') | |
| P3B | (5'-GCTGGGTTTTGTCCATCA/CCCGGCTTCTGGTTGCC-3') |
Los clones mutagenizados fueron digeridos por
AatII/ApaI y clonados en los mismos sitios de pflNDV. Se
confirmó la presencia de las mutaciones introducidas secuenciando
los respectivos clones. Los clones completos resultantes, con
deleciones en el gen NP correspondientes a las posiciones de
aminoácidos 444-455, 443-460, o
442-489 fueron denominados
NDV-\Delta12, NDV-\Delta18, y
NDV-\Delta48, respectivamente (Fig. 1).
Se hicieron crecer aproximadamente 1,5x10^{6}
células BSR-T7/5 que expresaban establemente la ARN
polimerasa del fago T7 durante la noche hasta una confluencia del
90% en placas para el cultivo de tejidos de 3,2 cm de diámetro. Las
células fueron transfectadas con mezclas de plásmidos que contenían
5 \mug de pCite-NP, 2,5 \mug de
pCite-P, 2,5 \mug de pCite-L y 10
\mug de uno de los clones completos utilizando un estuche de
transfección en mamíferos (protocolo de transfección CaPO_{4};
Stratagene). Tres a cinco días después de la transfección, los
sobrenadantes fueron cosechados e inoculados en la cavidad alantoica
de huevos de pollo SPF embrionados de 11 días de edad. Después de
3-4 días de incubación, se determinó la presencia de
virus en el fluido alantoico mediante una prueba rápida de
hemaglutinación en placa (HA) utilizando eritrocitos de pollo.
Con el fin de suprimir el epítopo
inmunodominante del gen NP, o bloquear la expresión de la porción
C-terminal de NP, se llevaron a cabo las
modificaciones descritas en materiales y métodos. Cada clon de ADNc
completo modificado, junto con tres plásmidos de soporte que
expresaban las proteínas NP, P, y L de NDV, fue transfectado en
células BSR-T7/5. Al cabo de 3-5
días de incubación, los sobrenadantes fueron cosechados e inoculados
en huevos de pollo SPF embrionados de 9-11 días de
edad. Después de 3-4 días de incubación, se
recogieron muestras de fluido alantoico y se sometieron a una
prueba de HA. Se detectó HA en huevos inoculados con el sobrenadante
de células transfectadas con el pflNDV no modificado.
Sorprendentemente, se detectó NDV-\Delta18
utilizando la prueba de HA después de un paso extra por el huevo.
Después se hizo pasar seriadamente NDV-\Delta18
durante un total de ocho pases en huevos SPF embrionados. Se aisló
ARN de las células infectadas con cada pase y se sometió a a
RT-PCR. En todos los pases se mantuvo la deleción
introducida, demostrando la estabilidad del virus recombinante. No
se detectó virus infeccioso en el fluido alantoico de huevos
embrionados inoculados con sobrenadantes obtenidos de transfecciones
con NDV-\Delta12 y NDV-\Delta48,
incluso después de tres pases por huevos sucesivos.
Quince pollos SPF de 3 semanas de edad fueron
inmunizados con NDV-\Delta18 por la ruta
oculo-nasal con una dosis DIE_{50} de 6,5
log_{10} por 0,2 ml y reforzados 5 semanas después de la primera
inmunización con la misma dosis. Las muestras de suero fueron
recogidas inmediatamente antes de la vacunación y 2, 5, y 7 semanas
después de la primera inmunización. Después las muestras de ensayo
fueron sometidas a una prueba de inhibición de la hemaglutinación
(HI) y ELISA para determinar el nivel de seroconversión.
Se sintetizó un péptido 18-mero
(SEQ ID No. 1) que comprendía la secuencia de aminoácidos
(443-460) de la nucleoproteína y se acopló a
seralbúmina bovina (BSA). Brevemente, el péptido sintético (2 mg)
fue acoplado a BSA (razón molar 4:1, respectivamente) utilizando
glutaraldehído 20 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
como entrecruzador. Paralelamente, se preparó un antígeno de control
negativo entrecruzando una mezcla de BSA sin la adición de péptido.
Después de incubar durante la noche a la temperatura ambiente, se
detuvo la reacción de entrecruzamiento añadiendo tampón
estabilizante que contenía glicina a la mezcla de reacción. Se
hicieron alícuotas de las mezclas de BSA/péptido y se almacenaron a
-20ºC.
Se recubrieron placas de microtitulación durante
la noche a 2-8ºC con 05 \mug de péptido sintético
acoplado a BSA o BSA solo en tampón en de recubrimiento (tampón
carbonato, pH 9,6). El antígeno no unido se separó lavando los
pocillos cuatro veces con solución PBST
(PBS-Tween-20). Antes de someter a
prueba las muestras de suero se diluyeron 50 veces en solución
IB-EIA (tampón
Na_{2}HPO4-2H_{2}O 0,2 M, pH 7,0, 0,05%
Tween-20, NaCl 0,5 M, 0,1% BSA) y se añadieron a
los pocillos recubiertos. Después de una incubación de 1,5 horas a
37ºC en una atmósfera humidificada, los pocillos fueron lavados con
solución PBST e incubados con 100 \mul de inmunoglobulinas
anti-pollo de conejo conjugadas con peroxidasa de
rábano picante diluidas en solución IB-EIA. Después
de 45 minutos de incubación a 37ºC, los pocillos se lavaron con PBST
y se detectaron los complejos de
antígeno-anticuerpo mediante la adición de TMB como
sustrato. Después de 15 minutos de incubación a la temperatura
ambiente la reacción se detuvo añadiendo 50 \mul de ácido
sulfúrico 2 M a cada pocillo. Se midieron las densidades ópticas a
450 nm. El valor de corte (COV) se ajustó tres desviaciones típicas
por encima de las razones de P/N medias de la muestra de control
negativo de pollos SPF (donde P = DO de las muestras de pocillos
recubiertos con péptido y; N = DO de las muestras pocillos
recubiertos con BSA).
Con el fin de medir la respuesta de anticuerpos
específicos de NDV completos en los paneles de suero sometidos a
prueba, las placas de microtitulación se recubrieron con antígenos
Clone 30 de NDV purificados en gradiente de sacarosa. Brevemente,
los pocillos fueron recubiertos durante la noche con antígenos
virales tratados con 0,5% Triton X-100 (1,0
\mug/ml) en tampón fosfato 40 mM (PBS, pH 7,2). Después de la
separación de los antígenos no unidos mediante lavado con PBST, los
pocillos fueron recubiertos con posterioridad con un 10% v/v de
suero de caballo donante en PBS. Se utilizaron los pocillos que
contenían solamente antígenos recubiertos con posterioridad como
controles negativos. Las muestras de suero sometidas a prueba fueron
diluidas (1:150) en solución IB-EIA y añadidas a
pocillos de control tanto positivo como negativo. Las etapas de
incubación restantes del procedimiento de ELISA eran idénticas al
ELISA basado en el péptido descrito antes con la excepción del
tampón de dilución del producto conjugado IB-EIA
que estaba suplementado con 5% de suero de caballo donador. El valor
de corte (COV) se ajustó tres desviaciones típicas por encima de
las razones P/N medias de la muestra de control negativo de los
pollos SPF.
Los sueros de los animales vacunados con
NDV-\Delta18 recombinante fueron recogidos 2, 5 y
7 semanas y sometidos a una prueba de HI y a ELISA. Como se muestra
en la Fig. 2, los títulos medios eran 4,7, 4,9 y 7,7 a las 2, 5 y 7
semanas de la primera inmunización, respectivamente. También había
una elevada reacción correspondiente en el ELISA basado en el virus
completo, que mostraba la inducción de una respuesta inmunitaria
considerable frente al virus recombinante. En contraste, ninguno de
los sueros reaccionaba en el ELISA recubierto con el péptido,
mostrando que los pollos inmunizados con
NDV-\Delta18 carecen completamente de anticuerpos
dirigidos contra el epítopo inmunodominante de la proteína NP, ni
siquiera después de la inmunización de refuerzo (sueros a las 7
semanas). El análisis de los sueros obtenidos de animales vacunados
con vacunas de virus inactivado o vivo convencionales mostraba
reactividad frente al ELISA del virus completo. Por otra parte,
todos los sueros sometidos a ensayo eran positivos en el ELISA
basado en el péptido (Fig. 2), demostrando la presencia de
anticuerpos dirigidos contra el epítopo inmunodominante de NP en
sueros recogidos de animales inmunizados con vacunas de ND
convencionales. Por lo tanto, este ELISA basado en el péptido puede
discriminar la respuesta de los anticuerpos al
NDV-\Delta18 recombinante de la de las cepas de ND
convencionales.
Para determinar el título de virus y la
mortalidad de los embriones, se prepararon diluciones seriadas a la
décima del virus NDV-\Delta18 recombinante, y se
inocularon huevos de pollo SPF embrionados de 9 a 11 días de edad
en la cavidad alantoica. Los huevos fueron observados diariamente en
cuanto a la mortalidad de los embriones durante el menos 7 días, y
se determinó la dosis letal de embriones del 50% (DLE_{50})
utilizando el método de Reed y Muench (Am. J. Hyg. 27,
493-497, 1938). También se llevó a cabo una prueba
de HA rápida en otro grupo de huevos después de 4 días de
incubación, y se calculó el título, expresado como la dosis
infecciosa de embriones del 50% (DIE_{50}), utilizando el mismo
método.
Se inocularon huevos de pollo SPF embrionados de
18 días de edad con el virus NDV-\Delta18
recombinante solo o combinado con un vector HVT que expresaba la
proteína F de NDV (Morgan et al., Avian Dis. 37,
1032-1040, 1993). Utilizando una aguja 23G, se
inyectaron 0,1 ml de dilución de virus o fluido alantoico negativo,
a través de un agujero perforado en el extremo romo del huevo, justo
debajo de la membrana del saco aéreo. Los huevos fueron incubados
hasta la eclosión. Se registró la capacidad de eclosión en tanto por
ciento, y los pollos se observaron diariamente en cuanto a la salud
general. A las 3 semanas de edad, se tomaron muestras de sangre y
los sueros se sometieron a ensayo en cuanto a los anticuerpos de NDV
en la prueba de inhibición de hemaglutinación de NDV (HI) y en
ELISA. A las 3 semanas de edad, todos los animales fueron
sensibilizados con la cepa Herts de NDV virulenta
intramuscularmente. Los pollos se observaron diariamente durante un
período de 10 días en cuanto a la aparición de signos clínicos de
enfermedad o mortalidad.
Para determinar la mortalidad en embriones
causada por NDV-\Delta18, se inocularon diluciones
seriadas a la décima del tercer pase de
NDV-\Delta18 en huevos de pollo SPF embrionados de
11 días de edad (0,2 ml/huevo) y se incubaron durante una semana.
Sorprendentemente, no se detectó mortalidad de embriones específica
durante los 7 días del período de incubación, mostrando que
NDV-\Delta18 estaba considerablemente atenuado
para los embriones (Fig. 3). Los embriones de pollo inoculados con
el virus parental, NDV recombinante (rNDV), ya empezaban a morir a
los tres días de la inoculación, a dosis superiores a 4 log_{10}
DIE_{50}/ml. La diferencia entre la dosis infecciosa del 50% y la
dosis letal del 50% de rNDV era solamente 0,3 log_{10}. En
contraste, esta diferencia era tan elevada como 8,0 log_{10} para
NDV-\Delta18, demostrando que éste estaba
significativamente atenuado (Fig. 3).
NDV-\Delta18 estaba muy
atenuado para embriones de pollo cuando se aplicaba a embriones de 9
a 11 días de edad, por lo tanto se llevó a cabo un experimento de
vacunación in ovo (embriones) para determinar la seguridad y
la eficacia de NDV-\Delta18 (Tabla 1). Los pollos
eclosionados de huevos embrionados vacunados in ovo fueron
sensibilizados con una cepa Herts velogénica de NDV. Los pollos
vacunados como embriones con NDV-\Delta18
desarrollaban elevados niveles de anticuerpos y la protección contra
la sensibilización letal era del 100%, ya se administre
NDV-\Delta18 solo o combinado con HVT recombinante
que expresa F de NDV (Tabla 1). Todos los pollos de control morían
a los 3 días de la sensibilización. Estos datos muestras que
NDV-\Delta18 puede conferir protección total
cuando se administra a embriones de pollo SPF de 18 días de
edad.
Para determinar si los animales vacunados in
ovo con NDV-\Delta18 se podrían distinguir
serológicamente de los animales infectados o de los animales
vacunados con vacunas convencionales, se recogieron muestras de
sangre a las tres semanas de edad y se sometieron a ELISA como se
describe en el Ejemplo 2. Como se esperaba, ninguno de los sueros
de los animales vacunados con NDV-\Delta18
reaccionaba con el ELISA basado en el péptido que abarca el epítopo
inmunodominante del gen NP, mientras todos los sueros eran reactivos
con el ELISA de virus completo y la prueba HI (Fig. 4). Esto
muestra que la administración in ovo de
NDV-\Delta18 no afectaba la posibilidad de
discriminar los animales vacunados con
NDV-\Delta18 de los animales infectados. La
ausencia de respuesta al epítopo inmunodominante del gen NP también
era confirmada cuando se administraba NDV-\Delta18
in ovo combinado con HVT-NDV/F, una vacuna
de vector que expresaba la proteína (F) de fusión de NDV (Fig. 4).
Esto demuestra que se puede combinar NDV-\Delta18
con otras vacunas de vectores que no expresan la región
inmunodominante de la nucleoproteína de NDV.
Como se muestra en la Tabla 1, la cantidad de
eclosión de los animales SPF se reducía, concretamente cuando se
utilizaban dosis superiores de NDV-\Delta18. Para
determinar si la presencia de anticuerpos maternos (MDA) modulaba
la seguridad de NDV-\Delta18, se vacunaron pollos
in ovo con NDV-\Delta18 solo o combinado
con HVT-NDV/F. La cantidad de eclosión de los huevos
de pollo comerciales embrionados no resultaba afectada por la
administración in ovo de NDV-\Delta18 solo
o combinado con HVT-NDV/F (Tabla 2), demostrando la
seguridad de NDV-\Delta18 en animales con MDA.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Además, se comparó la cantidad de eclosión
después de la administración de NDV-\Delta18 a los
18 o 19 días de la embrionación. Como se muestra en la Tabla 3, la
cantidad de eclosión de los embriones SPF vacunados a los 19 días de
la embrionación era del 100% en comparación con el 76% para los
embriones vacunados a los 18 días de embrionación.
Para determinar la seguridad y eficacia de
NDV-\Delta18 como vacuna
post-eclosión, se vacunaron pollos SPF de un día de
edad por la ruta de la gota ocular a una dosis de 6 log_{10}
DIE_{50}/pollo. Se observaron los pollos diariamente en cuanto a
los signos clínicos y a las 3 semanas de edad, se tomaron muestras
de sangre y todos los animales se sensibilizaron con la cepa Herts
de NDV virulenta administrada intramuscularmente. Se analizaron los
sueros en la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI) y
ELISA. Los pollos se observaron diariamente durante un período de 2
semanas después de la sensibilización en cuanto a la aparición de
signos clínicos de enfermedad o mortalidad.
Los pollos vacunados después de la eclosión con
NDV-\Delta18 desarrollaban anticuerpos específicos
de NDV y la protección contra la sensibilización letal era mayor
del 90% a la dosis administrada (Tabla 4). Todos los pollos de
control morían a los 3 días de la sensibilización. Durante el
período de observación antes de la sensibilización no se detectaron
signos adversos relacionados con la vacunación. Para determinar si
los animales vacunados con NDV-\Delta18 podían
ser distinguidos serológicamente de los animales infectados o de
los animales vacunados con vacunas convencionales, las muestras de
sangre recogidas inmediatamente antes de la sensibilización fueron
sometidas a ELISA como se describe en el Ejemplo 2. Como se
esperaba, todos los sueros eran reactivos con el ELISA del virus
completo y en la prueba de HI, pero no con el ELISA basado en el
péptido que abarca el epítopo inmunodominante del gen NP. Tomados
juntos, estos datos demuestran que NDV-\Delta18
es adecuado no solamente para la administración in ovo, sino
que también es una vacuna marcadora post-eclosión
segura y eficaz.
Con el fin de determinar la posibilidad de
expresar un epítopo foráneo por un NDV recombinante, se seleccionó
un epítopo de la célula B bien caracterizado de la glicoproteína S2
del virus de la hepatitis murina (MHV) (Talbot et al.,
Virology, 132, 250-260, 1984; Luytjes et al.,
J. Virol. 63, 1408-1415, 1989) para remplazar el
epítopo inmunodominante de NP de NDV. La reposición en marco
sustituía cualquiera de los 16 aminoácidos (posiciones de
nucleótidos 1451 a 1499, correspondientes a los aminoácidos 444 a
459 de la NP) o 12 aminoácidos (posiciones de nucleótidos 1451 a
1486, correspondientes a los aminoácidos 444 a 455 de la NP) con dos
secuencias solapantes de 16 aminoácidos (epítopo-1
de MHV) o 10 aminoácidos (epítopo-2 de MHV),
respectivamente, que abarcaba el epítopo de la glicoproteína S2 de
MHV.
La secuencia del epítopo-1 de
MHV (núm. de acceso NCBI NC_001846; nucleótidos
26464-26511 del genoma completo; aminoácidos
845-860 de la proteína S2):
Secuencia del epítopo-2 de MHV
(núm. de acceso NCBI NC_001846; nucleótidos
26470-26499 del genoma completo; aminoácidos
847-856 de la proteína S2):
Se realizó la mutagénesis sobre el subclon
MluI/ApaI de 2,2 kb descrito en el Ejemplo 1 utilizando
pares de cebadores apropiados:
Los clones mutagenizados fueron digeridos por
AatII/ApaI y clonados en los mismos sitios de pflNDV. La
presencia de las mutaciones introducidas fue confirmada secuenciando
los respectivos clones. Los clones completos resultantes, en los
que los aminoácidos de NP 444-459 estaban
remplazados con la secuencia del epítopo-1 de MHV o
los aminoácidos 44-455 de NP estaban remplazados con
la secuencia del epítopo-2 de MHV, fueron
denominados NDV-MHV1 y NDV-MHV2,
respectivamente. La transfección y la recuperación de los virus se
llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Tres a cinco días
después de la transfección, los sobrenadantes fueron cosechados e
inoculados en la cavidad alantoica de huevos de pollo SPF
embrionados de 11 días de edad. Después de 3-4 días
de incubación, se determinó la presencia de virus en el fluido
alantoico mediante prueba de hemaglutinación (HA) rápida utilizando
eritrocitos de pollo.
Con el fin de determinar la expresión del
epítopo de MHV introducido, se infectaron células
BSR-T7 a una multiplicidad de infección (moi) de
0,01 con el Clone-30 recombinante parental,
NDV-\Delta18, NDV-MHV1 y
NDV-MHV2. Después de 24 horas de incubación, las
células infectadas fueron fijadas con etanol frió (96%) durante 1
hora a la temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con
PBS, las células fueron incubadas con anticuerpos monoclonales
dirigidos contra la proteína F, el epítopo inmunodominante de la
proteína NP o el epítopo de MHV. Las células fueron lavadas y
coloreadas con anticuerpo anti-ratón conjugado con
FITC y examinadas mediante microscopia fluorescente.
Se inmunizaron dos grupos de diez pollos SPF
cada uno de 3 semanas de edad o bien con NDV-MHV1 o
bien NDV-MHV2 mediante la ruta
óculo-nasal con una dosis de 6,0 log_{10}
DIE_{50} por 0,2 ml y se reforzaron 5 semanas después de la
primera inmunización con la misma dosis. Las muestras de suero se
recogieron inmediatamente antes de la vacunación y 2, 5, y 7
semanas después de la primera inmunización. Las muestras de suero se
sometieron a prueba mediante la prueba de inhibición de la
hemaglutinación (HI) y ELISA para determinar el nivel de
seroconversión.
Para determinar si los pollos inmunizados con
los virus NDV-MHV1 y NDV-MHV2 habían
desarrollado anticuerpos específicos contra el epítopo de MHV
expresado, se recubrieron las placas de ELISA con el antígeno A59 de
la cepa de MHV purificado en gradiente de sacarosa. Los pocillos
fueron recubiertos durante la noche con un 1% de antígeno viral
tratado con 1% Triton X-100 en tampón fosfato 40 mM
(PBS, pH 7,2). La eliminación de los antígenos no unidos, el
bloqueo y las etapas de incubación restantes fueron idénticas al
ELISA basado en NDV completo descrito en el ejemplo 2. Con el fin
de determinar la ausencia de respuesta contra el epítopo NP, se
llevó a cabo un ELISA utilizando el péptido 18-mero
sintético que abarcaba el epítopo inmunodominante de NP como se
describe en el ejemplo 2. De un modo similar, se midió la respuesta
de anticuerpos específicos de NDV completo en placas de ELISA
recubiertas con antígenos de Clone 30 de NDV purificados en
gradiente de sacarosa como se describe en el ejemplo 2.
Para determinar la capacidad protectora del
epítopo de MHV expresado por NDV, se utilizaron grupos de ratones
hembra Balb/c de 4 semanas de edad seronegativos para MHV para los
experimentos de inmunización y sensibilización. Se inmunizaron dos
grupos de 10 ratones cada uno con NDV-MHV1 o
NDV-MHV2 a una dosis de 6,0 log_{10}
DIE_{50}/ratón y se reforzaron con una dosis similar 4 semanas
más tarde. Tanto los inmunizados como los 10 animales de control de
edad similar fueron sensibilizados a las diez semanas de edad (dos
semanas después de la inmunización de refuerzo) con la cepa A59 de
MHV de tipo salvaje a una dosis de 10 DL_{50}/ratones por vía
intraperitoneal. Los animales fueron observados en cuanto a los
signos clínicos y a la mortalidad debida a MHV durante dos semanas
después de la sensibilización.
Los sobrenadantes de las células transfectadas
fueron cosechados y pasados dos veces por huevos de pollo SPF
embrionados de 9 a 11 días de edad. Las muestras de fluido alantoico
fueron cosechadas después y sometidas a una prueba de HA. Se
detectó HA en huevos inoculados con el sobrenadante de las células
transfectadas con recombinantes de NDV-MHV1 así
como de NDV-MHV2. Los virus recuperados fueron
pasados adicionalmente dos veces más por huevos embrionados. La
recuperación de estos virus recombinantes demuestra que el epítopo
inmunodominante de NP no solo es prescindible para la replicación
del virus, sino que también puede ser remplazado por una secuencia
o epítopo completamente foránea.
Para determinar si los virus recombinantes
expresan el epítopo recién introducido, se infectaron células BSR
como se ha descrito en materiales y método y se sometieron a
análisis de inmunofluorescencia. Utilizando un anticuerpo
monoclonal (Mab) dirigido contra la proteína de Fusión, la expresión
de la proteína F era indistinguible en todos los virus. En
contraste, un Mab dirigido contra el epítopo inmundominante de NP
reaccionaba solamente con el Clone-30 del virus
parental. Como se esperaba, un Mab dirigido contra el epítopo de MHV
reaccionaba solamente con las células infectadas con
NDV-MHV1 o NDV-MHV2, demostrando que
el epítopo está apropiadamente expresado en el marco de lectura
abierto del gen NP.
Los sueros recogidos inmediatamente antes de la
inmunización (T = 0) y 7 semanas (T = 7) después de la primera
inmunización fueron sometidos después a una prueba de HI y un ELISA
de NDV completo. Como se muestra en las figuras, los títulos de HI
en todos los pollos a las 7 semanas de la vacunación estaban por
encima de 6 unidades log_{2} HI y la reacción medida en el ELISA
basado en NDV completo también era considerablemente elevada
(Figuras 5-8). Interesantemente, del 80% al 90% de
los pollos inmunizados con NDV-MHV1 o
NDV-MHV2 reaccionaban positivamente en un ELISA
basado en el antígeno del virus MHV completo, demostrando que los
pollos producen anticuerpos específicos contra el epítopo de MHV
expresado por los NDV recombinantes (Figuras 9-11).
En contraste, ninguno de los sueros reaccionaba en el ELISA
recubierto con el péptido 18-mero, mostrando que los
pollos inmunizados con NDV-MHV1 o
NDV-MHV2 carecen completamente de anticuerpos
dirigidos contra el epítopo inmunodominante de la NP. Esta
propiedad proporciona una seguridad extra en la prueba de
diagnóstico, como marcador positivo y negativo y hace a los virus
recombinantes atractivos como candidatos marcadores duales.
Para demostrar adicionalmente la capacidad del
epítopo introducido para proteger frente a una sensibilización
letal, los autores de la presente invención inmunizaron ratones con
los virus recombinantes y los sensibilizaron 6 semanas después de
la primera inmunización. Aunque los ratones no son los anfitriones
naturales para NDV, se obtuvo un nivel significativo de protección
en ratones inmunizados frente a una sensibilización con MHV letal
(Tabla 5). Por lo tanto, estos virus recombinantes no solamente son
atractivos como vacunas marcadoras, sino también como vectores para
expresar epítopos foráneos para proteger frente a un patógeno no
relacionado.
Fig. 1. Constructos de NDV recombinante. Se
muestra una representación esquemática del orden de los genes de
NDV en el ARN genómico de hebra negativa. Las secuencias entorno al
epítopo dominante del gen NP (posición 1442-1501,
aminoácidos de NP 441-460) se presentan en sentido
efector. Las líneas discontinuas muestras las deleciones de 12 o 18
aminoácidos en NDV-\Delta12 y
NDV-\Delta18, respectivamente.
NDV-\Delta48 posee una NP truncada
C-terminal (48 restos) que se indica mediante un
signo de un codón de terminación (*) después del último
aminoácido.
Fig. 2. Se vacunaron quince pollos SPF por la
ruta oculo-nasal con NDV-\Delta18
a las tres semanas de edad y se reforzaron una vez a las 5 semanas
de edad. Las muestras de suero recogidas inmediatamente antes de la
vacunación (D18 OW), 2 semanas (D18 2W), 5 semanas (D18 5W) y 7
semanas (D18 7W) después de la primera vacunación fueron sometidas
a ELISA y a una prueba de HI como se describe en materiales y
métodos. La respuesta serológica contra una vacuna de ND comercial
viva, Clone-30, fue evaluada de una manera similar a
partir de 19 pollos SPF vacunados con una semana de edad y
desangrados 4 semanas más tarde. Para el grupo con NEWCAVAC, una
vacuna comercial inactivada, se vacunaron 21 pollos SPF a las 3
semanas de edad y se realizaron ensayos serológicos similares en
muestras de sueros recogidas a las 3 semanas de la inmunización.
(D18 = NDV-\Delta18).
Fig. 3. Patogenicidad de rNDV y
NDV-\Delta18 en embriones de pollo SPF. Se
inocularon huevos de pollo SPF de 11 días de edad con rNDV parental
o con el mutante NDV-\Delta18 y se incubaron
durante 7 días hasta que se producía la muerte de los embriones.
NDV-\Delta18 no causaba mortalidad en los
embriones durante 7 días a todas las dosis indicadas, mientras rNDV
era letal incluso con una dosis tan baja como 1 DIE50/ml
(aproximadamante una mortalidad del 10%). Los embriones inoculados
con rNDV empezaban a morir tan pronto como a los tres días de la
inoculación a las dosis superiores.
Fig. 4. Respuesta serológica de pollos SPF
vacunados in ovo con NDV-\Delta18 solo o
combinado con HVT-NDV/F, una vacuna de vector que
expresaba la proteína de fusión de NDV. Los animales fueron
vacunados a los 18 días de embrionación y se realizaron una prueba
de HI y un ELISA como se describe en la sección materiales y métodos
con los sueros recogidos a las 3 semanas de edad. (D18 =
NDV-\Delta18).
Fig. 5-8. Respuesta serológica
de pollos SPF vacunados con NDV-MHV1 o
NDV-MHV2. Las muestras de suero recogidas
inmediatamente antes de la vacunación (T = 0) y 7 semanas (T = 7)
después de la primera vacunación fueron sometidas a una prueba de HI
y a un ELISA basado en antígenos de NDV completo.
Fig. 9-11. Los pollos producen
anticuerpos específicos para el epítopo de MHV. Los mismos sueros
descritos en la figura 5 (para NDV-MHV1 y
NDV-MHV2) o la figura 2 (para
NDV-\Delta18) fueron sometidos a un ELISA basado
en antígenos de MHV completo.
<110> AKZO Nobel N.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un mutante de la nucleoproteína del
virus de la enfermedad de Newcastle como vacuna marcadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2000583
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
9-mero/epítopo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala Val Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido 18-mero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Glu Thr Gln Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala
Val Ala Asn Ser Met}
\sac{Arg Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1801
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (122)..(1588)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen de NP: nucleótidos
56-1801; secuencia codificadora de NP: nucleótidos
122-1588
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Newcastle disease virus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NP P1A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaagccg gggatgggaa tagcatgagg gag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NP P1B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccctcatg ctattcccat ccccggcttc tgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NP P2A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaagccg gggatgcgcc aaactctgca cagg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
NP primer P2B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgtgcaga gtttggcgca tccccggctt ctgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NP P3A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaaccaga agccgggtga tggacaaaac ccagc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NP P3B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgggtttt gtccatcacc cggcttctgg ttgcc
\hfill35
Claims (20)
1. Un mutante del virus de la enfermedad de
Newcastle (NDV) que carece de un epítopo inmunodominante en una
proteína de NDV como resultado de una mutación en un gen que
codifica la proteína, caracterizado porque el mutante de NDV
carece de un epítopo localizado en una región de la nucleoproteína
(NP), teniendo la región la secuencia de aminoácidos
(447-455) mostrada en el SEQ ID No. 1.
2. Un mutante de NDV según la reivindicación 1,
caracterizado porque en pollos el mutante de NDV induce
antisuero que carece de anticuerpos que reaccionan con un epítopo
inmunodominante localizado en la región de aminoácidos
(447-455) de la NP.
3. Un mutante de NDV según la reivindicación 2,
caracterizado porque el antisuero inducido en pollos carece
de anticuerpos que reaccionan con un péptido 18-mero
que tiene la secuencia de aminoácidos de NP
(443-460) mostrada en el SEQ ID No. 2.
4. Un mutante de NDV según las reivindicaciones
1-3, caracterizado porque el mutante
comprende una deleción o sustitución de uno o más aminoácidos en
una región del gen de NP que tiene la secuencia de aminoácidos
(447-455).
5. Un mutante de NDV según la reivindicación 4,
caracterizado porque los aminoácidos
443±1-460±1 son suprimidos.
6. Un mutante de NDV según la reivindicación 5,
caracterizado porque los aminoácidos 443-460
son suprimidos.
7. Un mutante de NDV según la reivindicación 4,
caracterizado porque los nucleótidos que codifican uno o más
aminoácidos en la región están sustituidos por una secuencia de
ácido nucleico heteróloga que codifica un epítopo inmunodominante
de un polipéptido.
8. Un mutante de NDV según las reivindicaciones
1-7, caracterizado porque el mutante de NDV
comprende mutaciones atenuantes adicionales.
9. Un mutante de NDV según las reivindicaciones
1-8, caracterizado porque el mutante de NDV
comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico heteróloga
que codifica un antígeno de un patógeno aviar.
10. Una vacuna contra la enfermedad de Newcastle
en la volatería, caracterizado porque comprende un mutante
de NDV como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
1-9 en una forma viva o inactivada, y un portador o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
11. Una vacuna según la reivindicación 10,
caracterizada porque la vacuna comprende adicionalmente una
cepa de vacuna capaz de inducir protección contra NDV o contra otro
patógeno aviar.
12. Una vacuna según la reivindicación 11,
caracterizada porque la cepa de vacuna adicional es un vector
de vacuna recombinante capaz de expresar la proteína F o HN de
NDV.
13. Una vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque el vector de vacuna recombinante es
HVT.
14. Una vacuna según las reivindicaciones
11-13, caracterizado porque la cepa de vacuna
adicional es una cepa de vacuna segura para el embrión.
15. El uso de un mutante de NP de NDV definido
en las reivindicaciones 1-9 para la fabricación de
una vacuna contra la enfermedad de Newcastle en la volatería para la
administración in ovo.
16. Un método para determinar la infección por
NDV en la volatería que comprende la etapa de examinar una muestra
del animal en cuanto a la presencia o ausencia de anticuerpos
reactivos con un epítopo inmunodominante localizado en la región de
aminoácidos (447-455) de la NP.
17. Un método según la reivindicación 16,
caracterizado porque comprende las etapas de:
- (i)
- incubar una muestra que se sospecha que contiene anticuerpos anti-NDV, con un fragmento de la NP que comprende la región de aminoácidos (447-455) como única región que contiene el epítopo,
- (ii)
- permitir la formación del complejo anticuerpo-antígeno, y
- (iii)
- detectar la presencia del complejo anticuerpo-antígeno.
18. Un método según la reivindicación 17,
caracterizado porque el fragmento de NP es un péptido
18-mero que tiene la secuencia de aminoácidos
(443-460).
19. Un estuche para pruebas de diagnóstico
adecuado para llevar a cabo un método según las reivindicaciones
16-18 que contiene un fragmento de NP que comprende
la región de aminoácidos (447-455), preferiblemente
la región de aminoácidos (443-460).
20. El uso de una vacuna definida en las
reivindicaciones 10-14 en un programa de control de
la enfermedad de Newcastle para distinguir los animales vacunados
de los animales infectados con el NDV de origen natural.
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