HU226256B1 - A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine - Google Patents
A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU226256B1 HU226256B1 HU0302265A HUP0302265A HU226256B1 HU 226256 B1 HU226256 B1 HU 226256B1 HU 0302265 A HU0302265 A HU 0302265A HU P0302265 A HUP0302265 A HU P0302265A HU 226256 B1 HU226256 B1 HU 226256B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ndv
- mutant
- vaccine
- epitope
- amino acid
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 97
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 21
- 108010041963 Newcastle disease virus nucleoprotein Proteins 0.000 title 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 148
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 86
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 83
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 76
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 76
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 32
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 22
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 8
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 claims 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 claims 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 60
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 43
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 41
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 22
- 241000711466 Murine hepatitis virus Species 0.000 description 20
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 20
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 7
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 5
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 3
- 244000144992 flock Species 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000886677 Duck adenovirus 1 Species 0.000 description 2
- 208000009701 Embryo Loss Diseases 0.000 description 2
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 2
- PKKMDPNFGULLNQ-AVGNSLFASA-N Leu-Met-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O PKKMDPNFGULLNQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- ZMWOJVAXTOUHAP-ZKWXMUAHSA-N Cys-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ZMWOJVAXTOUHAP-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N Gly-Glu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- CTVJSFRHUOSCQQ-DCAQKATOSA-N Met-Arg-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CTVJSFRHUOSCQQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminophenyl)-4-[[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]methyl]benzamide Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC1=NC=CC(C=2C=NC=CC=2)=N1 HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SOACHCFYJMCMHC-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O SOACHCFYJMCMHC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N Val-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001424 embryocidal effect Effects 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000000994 inner shell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical class O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Newcastle-betegség vírusa (NDV) felelős a baromfi egyik legpusztítóbb betegségéért, és alapvetően befolyásolja az üzemi baromfitenyésztést. Csirkék, pontosabban kereskedelmi forgalomba kerülő csirkék vakcinációját világszerte elvégzik. Bár hatékony élő vagy inaktivált ND-vakcinák jelenleg rendelkezésre állnak, a vírus továbbra is fenyegeti a kereskedelmi forgalomba kerülő állományokat.
Az NDV negatív szálú RNS-vírus-genomja, melynek mérete körülbelül 15 kb, hat gént tartalmaz, amely hat jelentős strukturális fehérjét kódol: nukleoproteint (NP), foszfoproteint (P), mátrixfehérjét (M), fúziós fehérjét (F), hemagglutinin-neuraminidázt (HN) és RNS-függő RNS-polimerázt (L). Az RNS NP, P és L fehérjékkel együtt ribonukleoprotein-komplexet (RNP) alakít ki, amely templátként szolgál RNS-szintézishez. Valamennyi negatív szálú vírus (NSV) közös jellemzője, hogy genetikai információjuk kizárólag RNP formájában van jelen. Az RNP, tehát nem a csupasz RNS, templátként szolgál transzkripcióhoz és replikációhoz.
NP a P és L jelű, polimeráz-fehérjékkel együtt rendkívül fontos szerepet játszik a vírusburok kialakításában (csomagolásban) és az RNS enzimes lebontásával szembeni védelmében. Az NP szabályozza továbbá a vírusgenom transzkripcióját és replikációját úgy, hogy kölcsönhatásba lép csak P-vel, P-vel és L-lel (RNS-polimerázokkal) egyaránt, vagy önmagával (NP-NP-kölcsönhatás). Sendai paramixovírus esetén kimutatták, hogy egy NP-eredetű konzervatív N-terminális régió játszik szerepet az NP-RNS és NP-NP közötti kölcsönhatásban [Buchholz és munkatársai, J. Virol. 67, 5803-5812 (1993)], míg a karboxiterminális doménről kimutatták, hogy templátfunkcióhoz szükséges (Curran és munkatársai, J. Virol. 67, 4358-64). Ezért az NP nagyobb része abszolút esszenciális a vírusreplikációhoz, mert az NP többszörösen részt vesz az RNP szerveződésében és biológiai aktivitásában.
Számos országban létezik már törvényi szabályozás arra az esetre, ha NDV-járvány tör ki. Néhány országban az a gyakorlat, hogy a fertőzött madarakat kötelező jelleggel elpusztítják. A sikeres nemzetközi baromfikereskedelem folyamatosságának biztosítása céljából rendszeres ND-ellenőrző intézkedések bevezetése kívánatos. Azonban valamennyi jelenleg alkalmazott, teljes vírusra alapuló, élő és inaktivált ND-vakcinák rendelkeznek azzal a jelentős hátránnyal, hogy immunizált állatokat nem lehet megkülönböztetni fertőzött állatoktól standard szerológiai tesztek, például hemagglutináció-gátlási (Hl) vagy vírussemlegesítési (VN) tesztek alkalmazásával. Ezért olyan NDV-ből származó immunogén anyagra van szükség, amelyben egy NDV-fehérjéből legalább egy immundomináns epitóp hiányzik. Az epitóp-antigénen lévő, kis szerkezeti régió, amely kölcsönhatásba képes lépni egy ellenanyaggal. Az epitóp lehet olyan kicsi, hogy egy polipeptid három aminosavából áll, de általában 5-10, vagy bizonyos esetekben több aminosavból áll.
A közelmúltban nagy népszerűségre tettek szert az úgynevezett „markervakcinák az állatorvos-tudomány területén olyan esetekben, ha bizonyos betegségek leküzdése nemzeti vagy nemzetközi érdek. Egy markervakcinát olyan vakcinaként definiálunk, amely diagnosztikai teszttel együtt alkalmazva, képes immunizált állatokat és fertőzött állatokat szerológiailag megkülönböztetni.
Markervakcinák kifejlesztésére alkalmazott megközelítésekben egy vagy több, nem esszenciális, de immunogén gént deletálnak. Ez a megközelítés többnyire olyan DNS-vírusok esetén alkalmazható, amelyek néhány nélkülözhető gént tartalmaznak (például herpeszvírusok). RNS-vírusok esetén a legtöbb gén esszenciális, vagy a nem esszenciális gének nem immunogének. Az NDV egy negatív szálú RNS-vírus, hat jelentős strukturális gént tartalmaz, amelyek mindegyike esszenciális a vírusszaporodása szempontjából. Egy vagy több gén deléciójától azt várnánk, hogy biológiai aktivitások elvesztését okozza. Valóban, míg állatok más vírusos fertőző betegségeinek leküzdésére szolgáló programok kifejlesztés alatt állnak, addig a technika jelenlegi állása szerint NDV-vakcinatörzsre alapuló olyan vakcinát még nem írtak le, amely beleillene az ND megfékezését célzó programokba.
Markervakcina kifejlesztésének alternatív megközelítési módja „alegységvakcinák” alkalmazása. Ezt a megközelítést NDV-re úgy dolgozták ki, hogy két glikoproteint: fúziós fehéijét (F) és hemagglutinin-neuraminidázt (HN) azonosítottak, amelyek szerepet játszanak védettséget biztosító immunitás indukálásában. Sikeresen előállítottak olyan rekombináns vektorokat, például pulykában előforduló herpeszvírust (HVT) és baromfihimlő-vírust (FPV), amelyek NDV-F-et és/vagy HN-t expresszáltak, és biztonságosságukat és hatékonyságukat alaposan vizsgálták.
Negatív szálú RNS-vírusok (NSV) nukleoproteinjei (NP) természetes körülmények között nagymértékben immunogének, és diagnosztikai célú ELISA-ban antigénként alkalmazzák azokat. Ez lehet például veszettség, kanyaró, marhavész, vezikuláris sztomatítisz vírusa és NDV. Ezeket a teszteket többnyire a vakcinációs programok követésére használják. NDV-HN-alegységvakcinával összefüggésben leírtak NP-re alapuló immunológiai vizsgálati eljárást is diagnosztikai tesztként az immunizált és fertőzött állatok megkülönböztetésére [Makkay és munkatársai, Vet. Microbiol. 66, 209-222 (1999)]. Azonban NP-t tesztelő immunológiai vizsgálati eljárások teljes NSV-alapú markervakcinával, különösen NDV-vakcinával összefüggésben nem léteznek, főleg annak a ténynek köszönhetően, hogy a nagyon vitális NP-gén genetikai módosításának várhatóan káros következményei lesznek a vírusreplikációra és a fertőzőképességre.
Az NDV-alegységvakcinák hátránya azonban az, hogy az NDV-ben lévő F- vagy HN-fehérjét expresszáló rekombináns vírusok hatékonyságát az anyai eredetű ellenanyagok (MDA) jelenléte jelentősen lecsökkenti nagyüzemi tenyészetekben. Ezzel szemben teljes víruspreparátumra alapuló, általánosan alkalmazott ND-vakcinák teljes védelmet biztosítanak még MDA jelenlétében is.
HU 226 256 Β1
Néhány rekombináns vektor további általánosan előforduló hátránya az, hogy védőhatású immunitás késve kezdődik. Az általánosan alkalmazott, élő ND-vakcinák általában a vakcináció után 6-7 nappal nyújtanak teljes védelmet, míg kimutatták, hogy az NDV-ből származó F-fehérjét expresszáló, rekombináns HVT-re alapuló vakcinák által indukált immunitás a vakcinációt követő 14. és 21. nap között kezdődik [Morgan és munkatársai, Avian Dis. 37, 1032-1040 (1993)].
ND-alegységvakcinák említett hátrányaira tekintettel szükség van olyan, teljes vírusra alapuló ND-markervakcinára, amelyben az F- és HN-fehéije natív formája megmarad, és amelyet szerológiailag meg lehet különböztetni mind a vad típusú, mind az általánosan alkalmazott vakcinavírusoktól.
A WO 99/66045 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak genetikailag módosított NDV-mutánson alapuló NDV-markervakcinát, amelyben az NDV-fehérjéből hiányzik egy immundomináns epitóp. Ez a vakcinavírus azonban olyan hibrid HN-fehérjét tartalmaz, amely csak egynegyed részben tartalmaz NDV-ből származó HN-fehérjét, míg a HN-fehérje fennmaradó része egy eltérő szerkezetű, madárban előforduló 2. vagy 4. típusú paramixovírusból származik. Az NDVHN-régió nagy részének eltávolítása érthetően csökkenteni fogja a HN szerepét az NDV védettséget biztosító ellenanyag indukálásában.
Jelenleg rendelkezésre álló, élő NDV-vakcinákat csak kikelt csirkéknek lehet beadni ivóvízzel, aeroszollal, szemcseppel vagy parenterálisan. Az említett beadási módoknak vannak bizonyos hátrányai. Ezek közül a legjelentősebb, hogy ezek a módszerek igen költségesek a beadás munkaigényessége miatt. A közelmúltban vakcinák embrióvakcinaként való alkalmazása hatékonynak és gazdaságosnak bizonyult [Sharma és Burmester, Avian Diseases 26, 134-149 (1982), és Sharma, Avian Diseases 29, 1155-1169 (1985)]. Továbbá az embrióvakcinációt előnyösnek találták amiatt, mert konkrét betegséggel szemben fiatal korban kialakul rezisztencia, és egyforma vakcinadózis adható be minden tojásba több injekciós fejjel felszerelt, félautomata berendezések alkalmazásával.
Meg kell jegyezni, hogy sok vakcinát, melyeket hagyományosan a madarak kikelését követő vakcinációra alkalmaznak, nem lehet in ovo vakcinációra alkalmazni. A késői embrionális állapotban, kikelés előtt álló embriók nagymértékben érzékenyek a legtöbb vizsgált vakcinavírussal való fertőzésre, ideértve azokat a vakcinavírusokat, amelyeket az egynapos csirkék vakcinációjára biztonságosan lehet alkalmazni. Ennek következtében az általánosan alkalmazott vakcinákat nem lehet in ovo beadni.
Jelenleg nem áll rendelkezésre a kereskedelemben olyan ND-vakcina, amelyet in ovo lehet alkalmazni, leginkább a magas embriómortalitás miatt, amely még a két legenyhébb, kereskedelemben rendelkezésre álló NDV-vakcinatörzzsel is társult, melyek konkrétan: NDW (5,149,530 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és C2 (5,750,111 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
A 5,427,791 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Regents of University of Minnesota) szerint kémiai mutagén ágenseket alkalmaznak Hitchner-B1-törzs NDV-mutánsainak előállítására, amelyek nem patogének késői embrionális állapotban alkalmazva. A B1-törzs etil-metanin-szulfonáttal (EMS) való kémiai kezelése NDV-B1-EMS mutáns vírust eredményezett, amelyet biztonságosan be lehetett adni csirketojásokba, 18 napos embrióknak. Azonban hátránya az, hogy a törzs tojásban való passzálását EMS mutagén ágens jelenlétében kell végezni, mert a mutáns visszaalakulhat szülői B1-törzzsé, amely nem biztonságos az embriókra nézve.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki olyan NDV-mutáns előállítását, amelyet hatóanyagként lehet alkalmazni teljes vírusra alapuló ND-markervakcinában, lehetővé téve vad típusú NDVvel fertőzött vagy szokásosan alkalmazott NDV-vakcinatörzsekkel immunizált állatok szerológiai megkülönböztetését az ilyen NDV-mutánson alapuló vakcinával immunizált állatoktól.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célul tűztük ki olyan NDV-mutáns előállítását, amelyet hatóanyagként lehet alkalmazni olyan vakcinában, amelyet nemcsak tojásból kikelt fiatal madaraknak lehet beadni, hanem biztonságosan in ovo is be lehet adni.
A találmány szerinti megoldásban teljesítjük ezeket a célokat úgy, hogy létrehozunk olyan genetikailag tervezett NDV-mutánst, amely abban különbözik az ismert NDV (vakcina) törzsektől, hogy NP-ből eltávolítunk egy új immundomináns epitópot, amely szerológiailag nagyon releváns NDV-fertőzésben, de amelynek deléciója nem befolyásolja hátrányosan az új NDVmutáns védettséget biztosító tulajdonságait.
A találmány tárgyát képezi NDV-mutáns, amelyben egy NDV-fehérjében hiányzik egy immundomináns epitóp a fehérjét kódoló génben végbement mutáció eredményeként, amely NDV-mutánsban a nukleoprotein (NP) régiójában hiányzik egy epitóp, amely régió 1. azonosító számú aminosavszekvenciával (447-455. aminosavak) rendelkezik.
Azt találtuk, hogy az NP-ben lévő, Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala Val Ala aminosavszekvencia (447-455. aminosavak), melyeket az NDV-genom 1460-1468. nukleotidjai kódolnak, tartalmazza az NDV-NP immundomináns epitópját. Megjegyezzük, hogy gyakorlatilag minden NDV-vel fertőzött csirkéből származó antiszérum kölcsönhatásba képes lépni az említett régióban elhelyezkedő epitóppal. Az antiszérumok kölcsönhatásba lépnek a fentebb említett aminosavakkal, de lényegi módon nem képesek kölcsönhatásba lépni az említett régiót szegélyező aminosavakkal.
Továbbá a 2. ábrán bemutatjuk, hogy mind az élő, mind az inaktivált, szokásosan alkalmazott NDV-törzsek által csirkében indukált antiszérumok reakcióba lépnek azzal a 18 tagú peptiddel, amely a Gly Glu Thr Gin Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala Val Ala Asn Ser Met Arg Glu (2. azonosító számú szekvencia), (443-460) aminosavakból áll, melyek a (447—455)-régiót tartal3
HU 226 256 Β1 mázzák. A régiót felölelő aminosavszekvenciák összehasonlítása 100%-os aminosavazonosságot mutatott velogén Texas-GB-törzsben, mezogén BeaudetteC-törzsben és lentogén Clone-30-törzsben. Ezért markervakcinák kifejlesztésének fontos kritériuma általánosan alkalmazott NDV-törzsekből származó egyik fehérje által kifejezett olyan epitóp azonosítása, amit a csirke immunrendszere felismer.
A leírásban használt, NDV-genom nukleotidhelyzeteinek és NDV-fehérjékben lévő aminosavak azonosítására szolgáló, zárójelben szereplő számozás Römer-Oberdörfer és munkatársai által leírtak szerint történik [J. Gén. Virol. 80, 2987-2995 (1999), Y18898. EMBL nyilvántartási szám].
Továbbá váratlanul azt találtuk, hogy annak ellenére, hogy az NP az NDV-replikációjában esszenciális fehérje, (447-455) aminosavak nem szükségesek a vírusreplikáció számára. Olyan fertőző, rekombináns NDV-mutánst, amely nem expresszálja a régióban lévő epitópot, sikeresen visszaizoláltak sejtekből alkalmas plazmiddal való transzfekció után, „reverz genetikai” technológiát alkalmazva, és ezeket hatékonyan lehetett szaporítani csirketojásokban.
A találmány szerinti NDV-NP-mutánst az NP-génbe bevitt mutációval állítottuk elő, így az immundomináns epitóp elvesztette azt a képességét, hogy csirkékben a (443-460) aminosavszekvenciával rendelkező, 18 tagú peptidben lévő epitóppal reakcióba lépő ellenanyagokat indukáljon. A 2. és 3. példában bemutatjuk, hogy (i) a találmány szerinti NDV-NP-mutáns képes Hl-ellenanyagokat és poliklonális csirkében termelődő antiNDV-szérumot indukálni, amelyek reagálnak a teljes vírusantigénnel, de (ii) ezek az antiszérumok nem reaktívak a 18 tagú peptidben lévő epitóppal.
Az a megfigyelés, hogy a találmány szerinti NDVNP-mutáns ellen termeltetett anti-NDV-szérumokat meg lehet különböztetni a természetesen előforduló NDV-törzsek és általánosan alkalmazott NDV-vakcinatörzsekkel szemben termeltetett csirkeszérumoktól úgy, hogy vizsgáljuk az antiszérum és a (447-455)-régióban elhelyezkedő epitóp közötti kölcsönhatást, az NDV-NP-mutánst alkalmassá teszi szóba jöhető markervakcinaként történő alkalmazásra. A találmány tárgyát képezi különösen olyan NDV-NP-mutáns, amelyben hiányzik a (447-455)-régióban elhelyezkedő immundomináns epitóp, és amely csirkékben olyan antiszérumot indukál, amelyet meg lehet különböztetni az általánosan alkalmazott törzsek által indukált antiszérumtól úgy, hogy vizsgáljuk a mutáns antiszérum és a (447—455)-régiót tartalmazó peptid közötti kölcsönhatást olyan monoklonális ellenanyag jelenlétében, amely specifikusan képes kötni ebben a régióban elhelyezkedő immundomináns epitópot. Ez utóbbi esetben a vizsgálat általában immunológiai kompetitív vagy blokkolási vizsgálati eljárás.
Tehát a találmány szerinti, konkrét NDV-NP-mutánst az jellemzi, hogy a mutáns olyan antiszérumot indukál csirkékben, amely nem tartalmaz az NP (447-455) aminosavrégiójában elhelyezkedő, immundomináns epitóppal reagálni képes ellenanyagokat.
A találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi NDV-NP-mutáns, amely olyan antiszérumot indukál csirkékben, amely nem tartalmaz 2. azonosító számú NP-aminosavszekvenciával (443-460. aminosavak) rendelkező, 18 tagú peptiddel reagálni képes ellenanyagokat.
Az „olyan antiszérumot indukál csirkékben, amely nem tartalmaz olyan ellenanyagokat, amelyek reagálnak” kifejezés a leírásban azt jelenti, hogy a fertőzött/immunizált csirkéből kinyert szérumminta negatívnak bizonyul a direkt vagy blokkolási NP-enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárásban (ELISA).
Tipikusan az abszorbancia (OD) küszöbérték (cutoff) a pozitív és negatív minták megkülönböztetésére szolgáló NP-ELISA-ban SPF-csirkékhez tartozó negatív kontrollminták átlagos P/N-aránya felett háromszoros standard deviációra volt állítva (ahol P=egy hordozómolekulához kapcsolt, releváns peptiddel burkolt mérőhelyekhez tartozó minták OD-ja; N=a hordozómolekulával burkolt mérőhelyekhez tartozó minták OD-ja). Hordozómolekula lehet hordozófehérje, például BSA, ovalbumin, KLH, szénhidrátlánc vagy szintetikus aminosavlánc.
Az NP-gén az NDV-genomban az 56. és 1801. nukleotidhelyzetek között helyezkedik el (NDV-törzs „Clone 30®). Az NDV-ben lévő NP 489 aminosavhosszúságú, és nagymértékben konzervatív lentogén, mezogén és velogén törzsekben. Az említett NDV-törzsben lévő NP-gén nukleotidszekvenciáját és aminosavszekvenciáját bemutatjuk 3. és 4. azonosító számú szekvenciaként. A „Clone-30” NP-génjéből levezetett aminosavszekvencia és a velogén Texas GB és a mezogén Beaudette-C NDV-törzsek megfelelő szekvenciáinak összehasonlítása 100%-os, illetve 99,3%-os azonosságot mutat. Polipeptidrégió meghatározása esetén a leírásban a konkrét „Clone-30” NDV törzsből származó konkrét aminosavszekvenciára hivatkozunk, ezt a régiót úgy tekintjük, hogy felöleli a megfelelő régiót, amely más NDV-törzshöz képest eltérő aminosavszekvenciával rendelkezik.
Mutáción „vad típusú” vagy szülői NDV-törzsben lévő, módosítatlan NP-génben (natív NP-t képes expresszálni) található genetikai információ megváltoztatását értjük, így az NDV-mutáns által expresszált NP-ben hiányzik az NP (447-455)-régiójában elhelyezkedő immundomináns epitóp.
Az NP-génbe bevitt mutációval szembeni további követelmény, hogy a megváltoztatott NP lehetővé tegye fertőző NDV visszaizolálását sejttenyészetből azután, hogy ezek a sejtek transzferálva lettek a megfelelő plazmidokkal, NDV-re alkalmazott „reverz genetikai” technikával. Az 1. és 2. példában olyan kísérleteket ismertetünk, amelyek alkalmasak annak meghatározására, hogy a megváltoztatott NP képes-e NDV-ellenanyag indukálására, valamint megengedett mutáció meghatározására olyan fertőző vírus előállítása céljából, amely visszaizolálható alkalmas plazmidokkal transzfektált sejttenyészetből.
A mutáció lehet például nukleinsav szubsztitúciója, deléciója, inszerciója vagy ezek kombinációja.
HU 226 256 Β1
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az NDV-NP-mutáns egy vagy több aminosavdeléciót vagy szubsztitúciót tartalmaz az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával rendelkező NP-régióban (447—455. aminosavak).
Azt találtuk, hogy nem minden deléció megengedett az NP-gén immundomináns epitópot kódoló szekvenciát tartalmazó régiójában. A 443-460. NP-aminosavaknak megfelelő nukleotidok deléciója (NDVΔ18 mutáns) alkalmas plazmidokkal transzfektált sejttenyészetből visszaizolálható, fertőző NDV-mutánshoz vezetett, míg a 444-455. NP-aminosavaknak (NDVΔ12 mutáns) vagy a 442-489. aminosavaknak (NDVΔ48 mutáns) megfelelő nukleotidok deléciója nem.
A fehérje szekunder szerkezetének elemzése (Garnier-Osguthorpe-Robson analízis) azt mutatta, hogy az NP 444-459. aminosavai alfa-hélixet alakítanak ki. Azt találtuk, hogy a teljes hélix és a szegélyezőnukleotidok (Δ443-460) eltávolítása nem akadályozza életképes, fertőző rekombináns NDV kialakulását, míg a részleges hélixstruktúra vagy az NP-fehérje további részeinek eltávolítása után nem tudtunk fertőző NDV-t visszaizolálni sejttenyészetből.
Tehát, a találmány szerinti előnyös NDV-mutáns 443±1-460±1. aminosavak delécióját tartalmazza.
A találmány előnyös megvalósítási módjának különösen előnyös vonatkozása szerint, az NDV-NP-mutáns a 443-460. aminosavak delécióját tartalmazza.
A találmány szerinti, különösen előnyös NDV-mutáns olyan fentebb leírt NDV-mutáns, amely további gyengítő mutációkat tartalmaz. Ilyen NDV-mutánsokat bármelyik általánosan alkalmazott ND-vakcinatörzsből lehet származtatni. Ilyen alkalmas NDV-vakcinatörzsek kereskedelmi forgalomban lévő ND-vakcinákban vannak, például: Clone-30®, La Sota, Hitchner B1, NDW, C2 és AV4, melyek közül a Clone-30® az előnyös vakcinatörzs.
A találmány előnyös megvalósítási módjának egy további vonatkozása szerint, a találmány tárgyát képezi rekombináns vektorvírus, amely a fentebb leírt NDVmutánsra alapul. Ilyen rekombináns vektorvírust nemcsak az NDV elleni, hanem más fertőző baromfibetegségek elleni vakcina előállítására is lehet alkalmazni. Ezzel alternatív módon, ilyen rekombináns vektorvírus extra biztonságot nyújt diagnosztikai tesztben is, valamint a rekombináns vírusokat vonzó, szóba jöhető kettős markerré teszi.
NDV-vektorhoz juthatunk, ha a fentebb definiált, NP immundomináns epitópját kódoló régiót leolvasási fázist megtartva (teljes vagy részleges) szubsztituáljuk NP-től eltérő polipeptid, azaz más madárban előforduló patogénből származó polipeptid immundomináns epitópját kódoló, heterológ nukleinsavszekvenciával. Az immundomináns epitóp megfelel olyan polipeptidrégiónak, amely képes kölcsönhatásba lépni gyakorlatilag valamennyi antiszérummal, melyet a polipeptid (polipeptidet tartalmazó készítmény) indukál.
Egy előnyös találmány szerinti NDV-vektorban az NP 444-459. vagy 444-455. aminosavait kódoló nukleotidokat heterológ nukleotidszekvencia helyettesíti, különösen 16, illetve 12 aminosavat (sorrendben) kódoló heterológ nukleotidszekvencia.
Az 5. példában bemutatjuk, hogy NDV-vel nem rokon vírus B-sejtes epitópját NDV NP-immundomináns epitópjának helyettesítésére lehet alkalmazni. A rekombináns NDV-vektorok képesek voltak az idegen epitóp ellen specifikus ellenanyagokat indukálni anélkül, hogy az NP-n lévő immundomináns epitópra specifikus ellenanyagok indukálódtak volna. Továbbá bemutatjuk, hogy az expresszált idegen epitóp képes védettséget indukálni a megfelelő vad típusú vírus fertőzésével szemben.
NDV-vektort előállíthatunk úgy is, hogy madárban előforduló, más patogénből származó polipeptidet kódoló heterológ nukleinsavszekvenciát az NDV-mutáns nem transzlálódó régiójába inszertálunk. Erre a célra alkalmas, nem transzlálódó régiók a genomi promoter és az NP-gén startpontja között, és az NP/P, P/M, M/F, F/HN és HN/L gének kapcsolódási pontjainál, valamint az L-gén vége és az antigenom promotere között vannak. A heterológ nukleinsavszekvencia kódolhat madárban előforduló patogénből, például fertőző nyálkatömlő-betegség vírusából, fertőző bronchitis vírusából, Marek-betegség vírusából, madárban előforduló agyés gerincvelőgyulladás vírusából, madárban előforduló reovírusból, madárinfluenza-vírusból, csirkeanémia-vírusból, Salmonella spp., E. coli és Eimeria spp. fajokból származó antigént.
A találmány szerinti NDV-NP-mutánst elő lehet állítani jól ismert „reverz genetikai” módszerrel, amely lehetővé teszi nem szegmentált, negatív szálú RNS-vírusok genetikai módosítását [összefoglaló irodalom: Conzelmann, Annu. Rév. Génét. 32, 123-162 (1998), és Roberts és Rose, Virology 247, 1-6 (1998)].
Továbbá NDV-re alkalmazható, ilyen módszert szintén leírtak Peeters és munkatársai [J. Virology 73, 5001-5009 (1999)], valamint Römer-Oberdörfer és munkatársai [J. Gén. Virol. 80, 2987-2995 (1999)], és ilyen található az 1. példában.
A kívánt mutációkat az NDV-genomba be lehet vinni szakember által általánosan ismert, ilyen célra szolgáló eljárások alkalmazásával. A mutációkat különösen helyspecifikus mutagenezissel visszük be. Ilyen eljárást közlünk a leírásban is, de ilyen eljárásokat általánosan alkalmaznak a szakterületen [Peeters és munkatársai, lásd fentebb (1999); „Current Protocols in Molecular Biology, szerk. F. M. Ausubel és munkatársai, Wiley N. Y., (1995), 8.5.1-8.5.9 old.; valamint Kunkel és munkatársai, Methods in Enzymology 154, 376-382 (1987)].
A váratlan felismerésen túl, hogy találmány szerinti NDV-NP-mutáns képes csirkékben olyan ellenanyagválaszt indukálni, amelyet meg lehet különböztetni a természetesen előforduló NDV törzsek által kiváltott ellenanyagválasztól, továbbá azt találtuk, hogy a fentebb leírt NDV-NP-mutáns képes védő hatású immunválaszt kiváltani.
Tehát a találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi baromfiban előforduló, Newcastle-betegség elleni vakcina, amely
HU 226 256 Β1 fentebb definiált NDV-NP-mutánst élő vagy inaktivált formában, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítószert tartalmaz.
A találmány szerinti vakcinát általánosan alkalmazott eljárásokkal, például kereskedelmi forgalomban rendelkezésre álló, élő és inaktivált NDV-vakcinákra általánosan alkalmazott eljárásokkal előállítani.
Röviden összefoglalva, érzékeny szubsztrátot beoltjuk az NDV-NP-mutánssal, és addig tenyésztjük, míg a vírus egy kívánt titerig szaporodik, majd az NDV-t tartalmazó anyagot elkülönítjük. Ezt követően az elkülönített anyagot immunogén tulajdonságú gyógyászati készítménybe formulázzuk.
Minden olyan szubsztrátot, amely képes ND-vírusok replikációját elősegíteni, alkalmazható a találmány szerinti megoldásban, beleértve primer (madár) sejttenyészeteket, például csirkeembrióból származó fibroblasztsejteket (CEF) vagy a csirkeeredetű vesesejteket (CK) vagy emlőssejtvonalakat, például VERO-sejtvonalat, vagy bébihörcsög veséjéből származó (BHK) sejtvonalat.
Különösen alkalmas szubsztrát, amin NDV-NP-mutánst szaporítani lehet, SPF embriót tartalmazó tojások. Embriót tartalmazó tojásokat be lehet oltani például tojásonként 0,2 ml NDV-tartalmú allantois folyadékkal, amely legalább 102 ° EID50-et tartalmaz. Előnyösen, 9-11 napos embriót tartalmazó tojásokat körülbelül IO5·0 EID50-el oltunk, majd 37 °C-on, 2-4 napig inkubáljuk azokat. 2-4 nap elteltével az ND-vírusterméket el lehet különíteni, előnyösen az allantois folyadék elkülönítésével. Ezután a folyadékot 10 percig centrifugálhatjuk 2500 g-n, majd a folyadék felülúszóját átszűrjük egy (100 pm) szűrőn.
A találmány szerinti vakcina NDV-NP-mutánst tartalmaz szokásosan alkalmazott, gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy hígítószerrel.
Az élő vírust tartalmazó vakcinát szuszpenzióként vagy liofilizált formában lehet előállítani és forgalomba hozni. Hordozók lehetnek stabilizálószerek, tartósítószerek és pufferek. Hígítószer lehet víz, vizes puffer vagy poliolok.
A találmány szerinti élő vakcina kívánt esetben tartalmazhat adjuvánst. Adjuváns-aktivitással rendelkező alkalmas vegyületek és készítmények lehetnek például ugyanazok, amelyeket lentebb, az inaktivált NDV-vakcina esetén megemlítünk.
Bár a találmány szerinti élő vakcinát beadhatjuk injekcióval, például intramuszkulárisan vagy szubkután, a vakcinát előnyösen olcsó tömeges beadási technikák alkalmazásával adjuk be, melyet általánosan alkalmaznak NDV-vakcinációra. NDV-vakcinációra ilyen technika lehet ivóvízzel történő beadás vagy spray-vakcináció.
A találmány szerinti NDV-NP-mutáns egy további nem várt tulajdonsága, hogy a csirkeembriókra nézve szignifikánsan gyengébb a fertőzőképessége, így in ovo lehet beadni. Tehát szintén a találmány tárgyát képezi vakcina, amely fentebb leírt NDV-NP-mutánsra alapul, és amelyet in ovo vakcinációra lehet alkalmazni.
Az NDV-NP-mutánst tartalmazó vakcinával embriót tartalmazó tojásokat szokásos in ovo vakcinációs eljárások szerint lehet oltani. Szokásosan a vakcinát az embriót tartalmazó tojásba a kikelés előtti utolsó fázisban oltják be, általában a költési időszak utolsó negyedében (15-21. nap), előnyösen a költési időszak 18-19. napján. A keltetés alatt lévő tojások injektálásának mechanizmusa nem különösebben döntő, feltéve, ha az nem károsítja túlzottan az embrió szöveteit és szerveit. Például egy kis lyukat szúrunk fecskendőre helyezett injekciós tűvel (2,5-3,75 cm, 1-11/2 inch, körülbelül 22 gauge) a tojáshéj tompa végén, és a vakcinát a belső héj membránja és a chorioallantois membrán alá injektáljuk. Ezt követően a beoltott, embriót tartalmazó tojásokat átvisszük inkubátorba keltetés céljából (lásd 4,458,630, 5,427,791 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, WO 98/56413 és WO 95/35121 számú nemzetközi közzétételi iratokat). Az embriók beoltásának teljes folyamatát előnyösen automatizált vakcinációs rendszerekkel végezzük, például kereskedelemben rendelkezésre álló Inovoject® alkalmazásával.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában vakcina, amely inaktivált formában tartalmaz NDV-NP-mutánst. Az inaktivált vakcina fő előnye az, hogy biztonságos és a védőhatású ellenanyagokat fokozott mennyiségben és hosszabb ideig lehet indukálni.
A felszaporítási lépés után elkülönített vírusok inaktiválásának az a célja, hogy kizárjuk a vírusok reprodukcióját. Ezt általában szakember által jól ismert kémiai vagy fizikai eszközökkel lehet elérni.
A találmány szerinti inaktivált NDV-NP-mutánst tartalmazó vakcina tartalmazhat például egy vagy több, fentebb említett, olyan gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítószert, amely erre a célra megfelel.
A találmány szerinti inaktivált vakcina előnyösen egy vagy több, adjuváns-aktivitással rendelkező anyagot tartalmaz. Erre a célra megfelelő anyagok vagy készítmények lehetnek: alumínium-hidroxid, -foszfát, vagy -oxid, „olaj vízben” vagy „víz olajban” emulzió, amely például ásványi olajra, például Bayol F®-re vagy Marcol 52®-re vagy növényi olajra, például E-vitaminacetátra vagy szaponinokra alapul.
A találmány szerinti vakcinák hatóanyagként NDVNP-mutánst tartalmaznak hatásos dózisban, azaz akkora mennyiségű immunizáló NDV-anyagot, amely immunitást képes indukálni beoltott madarakban virulens vírussal való fertőzés ellen. Az immunitást a leírás szerint úgy definiáljuk, mint szignifikánsan nagymértékű védelem indukálódását egy madárpopulációban mortalitás és klinikai tünetek ellen vakcináció után, vakcinát nem kapott csoporthoz viszonyítva. A találmány szerinti vakcina elsősorban megvédi az immunizált állatok nagy részét attól, hogy a betegség klinikai tünetei kialakuljanak, és véd a pusztulástól.
A találmány szerinti élő vakcina tipikusan 102’°-108’° (EID50) embriófertőző dózisban, előnyösen 104’°-107’° EID50 dózistartományban adható be. Az inaktivált vakcina 1O4·0-109° EID50 antigénekvivalenst tartalmazhat.
HU 226 256 Β1
Inaktivált vakcinákat rendszerint parenterálisan, például intramuszkulárisan vagy szubkután adunk be.
Bár a találmány szerinti NDV-vakcinát hatékonyan csirkékben lehet alkalmazni, más baromfit, például pulykákat, galambokat, fürjeket, fácánokat, gyöngytyúkokat és foglyokat is sikeresen lehet oltani a vakcinával. A csirkék közé tartoznak broilerek, reprodukciós állomány és tojóállomány.
A találmány szerinti, élő vagy inaktivált vakcinával kikelést követően beoltható állatok kora ugyanolyan, mint az általánosan alkalmazott, többi ismert élő vagy inaktivált NDV-vakcinákat kapott állatok kora. Például broilereket egynapos korukban vagy 1-3 hetes korukban lehet oltani, különösen nagy mennyiségű MDA-val rendelkező broilereket. A tojóállományt vagy a reprodukciós állományt 1-10 napos korban lehet immunizálni, és 6-12 és 16-20 hetes korukban élő vagy inaktivált vakcinával ismétlő oltást lehet adni.
A találmány tárgyát képezi olyan kombinációs vakcina is, amely a találmány szerinti NDV-NP-mutánson kívül még egy olyan vakcinatörzset tartalmaz, amely képes ND vagy más madárban előforduló patogén ellen védelmet indukálni.
A kombinációs vakcina előnyösen egy vagy több, további vakcinatörzset tartalmaz az alábbiak közül: Marek-féle betegség vírusa (MDV), fertőző bronchitis vírusa (IBV), Newcastle-betegség vírusa (NDV), tojáscsepp szindróma vírusa (EDS), pulykában előforduló rhinotracheitis (orr- és légcsőgyulladás) vírusa (TRTV) vagy reovírus.
A további ND-vakcinatörzs a kombinációs vakcinában előnyösen rekombináns (vírus) vakcinavektor, amely képes NDV-ből származó F- vagy HN-fehérjét expresszálni. Ilyen virális vakcinavektorok szakember által jól ismertek, biztonságukat és hatékonyságukat alaposan vizsgálták: Morgan és munkatársai, Avian Diseases 36, 858-870 (1992) és Avian Diseases 37, 1032-1040 (1993); Heckert és munkatársai, Avian Diseases 40, 770-777 (1996); Sakaguchi és munkatársai, Vaccine 16, 472-479 (1998) és Sonoda és munkatársai, J. Virol. 74, 3217-3226 (2000).
A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint a rekombináns vektor a találmány szerinti kombinációs vakcinában rekombináns HVT-vektor, amely képes NDV-ből származó F- vagy HN-fehérjét expresszálni.
Ha a kombinációs vakcinát in ovo adjuk be, a további vakcinatörzsnek embrióra nézve biztonságos törzsnek kell lennie, azaz olyan élő vakcinatörzsnek, amelyet SPF-tojásokba oltva a keltetés 18. napján, az embriót tartalmazó tojások 70%-ának kikelését eredményezi.
A fentebb leírt NDV-markervakcina egy diagnosztikai módszerrel együtt lehetővé tesz megkülönböztetést olyan állatok között, melyeket ezzel immunizáltak, illetve amelyek természetesen előforduló NDV-törzsekkel fertőzöttek, vagy általánosan alkalmazott ND-vakcinákkal voltak immunizálva.
A találmány szerinti megoldás felbecsülhetetlen értékű eszközt biztosít az ND leküzdését célzó intézkedések ellenőrzésére is, amely az NDV felszámolásához vezethet, ha nagyszabású szűrési programokban alkalmazzuk. Az említett eszközön baromfiban előforduló NDV-fertőzés meghatározására szolgáló eljárást értünk, amelyben egy állatból vett mintát vizsgálunk NP (447-455) aminosavszekvenciájával rendelkező régiójában lévő, immundomináns epitóppal reagáló ellenanyagok jelenlétére vagy hiányára.
Az eljárásban alkalmazott állati eredetű minta lehet bármilyen minta, amelyben NDV-ellenanyagokat lehet detektálni, azaz vér, szérum vagy szövetminta, előnyösen szérumminta.
Ilyen eljárásban antigénként az (447—455)-rógiót tartalmazó NP-fragmenst alkalmazzuk, egyetlen epitóptartalmú régióként. Tehát NDV-fertőzés állatban való meghatározására szolgáló eljárás előnyösen az alábbi lépésekből áll:
(i) egy olyan mintát, amelyről feltételezzük, hogy anti-NDV-ellenanyagokat tartalmaz, inkubálunk (447-455) aminosavrégiót tartalmazó NP-fragmenssel, egyetlen epitóptartalmú régióként, (ii) lehetővé tesszük ellenanyag-antigén komplex kialakulását, és (iii) detektáljuk az ellenanyag-antigén komplexet.
Egy különösen előnyös diagnosztikai eljárásban az
NP-fragmens olyan polipeptid, amely a (447-455)-régiót tartalmazó, 360-470. aminosavakból álló szekvenciával vagy ennek egy részével rendelkezik.
A legelőnyösebb diagnosztikai eljárásban alkalmazott antigén 443-460. aminosavakból álló szekvenciával rendelkező, 18 tagú peptid.
Az immunológiai vizsgálati eljárást több változatban végezhetjük. Például az immunológiai vizsgálati eljárás alapulhat kompetícióra vagy direkt reakcióra. Továbbá az eljárásokban alkalmazhatunk szilárd hordozókat vagy alkalmazhatunk celluláris anyagot. Az ellenanyag-antigén komplex detektálására alkalmazhatunk jelölt ellenanyagokat; a jelölések lehetnek például enzimek, fluoreszcens, kemilumineszcens, radioaktív molekulák vagy festékek.
NDV-ellenanyagok mintában való detektálására alkalmas eljárás, például enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárás (ELISA), immunfluoreszcens teszt (IFT) vagy Western-blot-analízis, melyek közül az ELISA-t részesítjük előnyben.
Egy példaként bemutatott ELISA-ban polisztirol mikrotitertálca mérőhelyeit NP egy alkalmas fragmensével burkoljuk, amely immundomináns epitópot tartalmaz. Ezután a burkolt tálcák mérőhelyeit feltöltjük csirkeszérummal, és sorozathígítást készítünk. Inkubálás után meghatározzuk a releváns csirkében termelődött, olyan anti-NP szérumellenanyag jelenlétét vagy hiányát, amelyek immundomináns epitópra specifikusak, jelölt (azaz tormából származó peroxidázzal konjugált) detektáló ellenanyaggal, amely kötődik a kifogott anti-NP ellenanyagokhoz (ha jelen van a tesztelendő szérumban). A szérumban jelen lévő, NP-fragmenshez kötődött, releváns ellenanyagok mennyiségét úgy lehet meghatározni, hogy a tálcákat enzimszubsztráttal inkubáljuk, és leolvassuk az aszorbanciaértéket (OD) automata mikrotitertálca leolvasóban.
HU 226 256 Β1
A diagnosztikai eljárás egy alternatív előnyös megvalósítási módja szerint, specifikus ellenanyagok csirkeszérumban való jelenlétét úgy vizsgáljuk, hogy a szérumot és alkalmas antigént inkubálunk olyan monoklonális ellenanyag jelenlétében, amely specifikusan képes reagálni a (447-455)-régióban elhelyezkedő epitóppal.
Leírtak ellenanyag detektálására alapuló ELISA-kat NDV-vel fertőzött csirkékre, NDV (alegység-) vakcinával immunizált csirkékkel szemben, amely antigénként teljes NP-re alapszik [Makkay és munkatársai, lásd fentebb (1999), valamint Errington és munkatársai, J. Virol. Methods 55, 357-365 (1995)], és az idézett közleményekben leírt elvet ennek megfelelően lehet alkalmazni, ha releváns antigént használunk.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi diagnosztikai teszt-reagenskészlet, amely alkalmas a találmány szerinti diagnosztikai eljárás végrehajtására, a fentebb leírtak szerint.
A találmány tárgyát képezi különösen olyan diagnosztikai teszt-reagenskészlet, amely szokásosan jelen lévő alkotórészeken kívül alkalmas NP-fragmenst tartalmaz a fentebb definiáltak szerint, előnyösen 18 tagú (443-460)-peptidet, előnyösen hordozó molekulához kapcsolva (kívánt esetben szilárd fázisra burkolva), antigénreagensként. Ilyen teszt-reagenskészlet komponense lehet rendszerint például biotin vagy tormából származó peroxidázzal konjugált ellenanyagok, enzimszubsztrát, mosópuffer stb.
1. példa
Rekombináns NDV előállítása, amelyben a nukleoproteinen (NP) hiányzik az immundomináns epitóp
Anyagok és módszerek
Mutáció bevitele a teljes hosszúságú NDVcDNS-be.
Mutáns NDV-k előállítása céljából a Clone-30 jelű, lentogén ND-vakcinatörzsből származó, teljes hosszúságú antigenom-RNS-t expresszáló pfINDV-plazmidot [Römer-Oberdörfer és munkatársai, J. Gén. Virol. 80, 2987-2995 (1999)] alkalmaztunk mutációk bevitelére. Az immundomináns epitópot tartalmazó régióba belső deléciókat „quick change site directed mutagenesis kit alkalmazásával vittünk be, a gyártó utasításai szerint (Stratagene). Először előállítottuk az NDV-genom 77-2289. nukleotidjait tartalmazó DNS-fragmenst úgy, hogy pfINDV-plazmidot Mlul-enzimmel emésztettünk, Klenow-fragmenssel feltöltöttünk és Apai-enzimmel kezeltük. A körülbelül 2,2 kb méretű DNS-fragmenst Apal/EcoRI-enzimekkel emésztett, pSKT7T-vektorba ligáltuk. Majd PCR-mutagenezist végeztünk a fentebb leírt templáton, a következő láncindító oligonukleotidkészletet alkalmazva (5-10. azonosító számú szekvenciák):
Az NP 444-455. aminosavaknak megfelelő 1451-1486. nukleotidok deléciójára:
P1A (5’-CCAGAAGCCGGGGATGGG/AATAGCATGAGGGAG-3’) és
P1B (5'-CTCCCTCATGCTATT/CCCATCCCCGGCTTCTGG-3’).
Az NP 443-460. aminosavaknak megfelelő
1448-1501. nukleotidok deléciójára:
P2A (5'-CCAGAAGCCGGGGAT/GCGCCAAACTCTGCACAGG-3') és
P2B (5’-CCTGTGCAGAGTTTGGCGC/ATCCCCGGCTTCTGG-3’).
Az NP 442-489. aminosavaknak megfelelő 1445-1588. nukleotidok deléciójára:
P3A (5’-GGCAACCAGAAGCCGGG/TGATGGACAAAACCCAGC-3')
P3B (5'-GCTGGGTTTTGTCCATCA/CCCGGCTTCTGGTTGCC-3').
Mutagenizált kiónokat AatlI/Apal-enzimekkel emésztettünk, és pfINDV-plazmid ugyanilyen helyére klónoztuk. Az eredményül kapott, teljes hosszúságú kiónok 444-455., 443-460., vagy 442-489. aminosavaknak megfelelő deléciókat tartalmaztak az NP-génben, jelölésük: NDV-Á12, NDV-Á18 és NDV-Á48, sorrendben (1. ábra).
Rekombináns vírusok visszaizolálása
Körülbelül 1,5*106 BSR-T7/5 sejtet, amely stabilan expresszált fág T7-RNS-polimerázt, növesztettünk egy éjszakán át 90%-os konfluenciáig 3,2 cm átmérőjű tenyésztőedényben. A sejteket olyan plazmidkeverékkel transzfektáltuk, amely 5 pg pdte-P-t, 2,5 pg pCite-L-t és az egyik teljes hosszúságú kiónból 10 pg-ot tartalmazott, a transzfekciót emlős transzfekciós raegenskészlet alkalmazásával (kalcium-foszfátos transzfekciós eljárás, Stratagene) végeztük. Három-öt nappal transzfekció után a felülúszót elkülönítettük, és 9-11 napos embriót tartalmazó SPF-csirketojások allantois üregébe oltottuk. Három-négy napos inkubálás után a vírus jelenlétét az allantois folyadékban tálcás hemagglutinációs gyorsteszttel (HA) csirkéből származó eritrociták alkalmazásával határoztuk meg.
Eredmények
Az NP-génen lévő immundomináns epitóp deletálása céljából, vagy abból a célból, hogy blokkoljuk az NP C-terminális részének expresszióját, elvégeztük az „Anyagok és módszerek” részben leírt módosításokat. Az egyes módosított, teljes hosszúságú cDNS-klónokat a három, NDV-NP-, P- és L-fehérjét expresszálni képes, hordozóplazmiddal együtt transzfektáltuk BSRT7/5-sejtekbe. Három-öt napos inkubálás után a felülúszót elkülönítettük, és 9-11 napos, embriót tartalmazó SPF-csirketojások allantois üregébe oltottuk. Három-négy napig tartó inkubálás után allantois folyadékmintát vettünk, és HA-tesztet végeztünk. HA-t detektáltunk a módosítatlan pfINDV-vel transzfektált sejtekből származó felülúszóval oltott tojásokban. Meglepő módon, NDV-A18-at detektáltunk HA-tesztben egy extra tojásban történő passzálást követően. Ezután az NDVÁl8-at sorozatban passzáltunk, összesen nyolcszor, embriót tartalmazó SPF-tojásokban. RNS-t izoláltuk az egyes passzálások után a fertőzött sejtekből, és RT-PCR-t végeztünk. Minden passzálás után megmaradt a bevitt deléció, ami a rekombináns vírus stabilitását bizonyítja. Fertőző vírust nem detektáltunk azokban
HU 226 256 Β1 az embriót tartalmazó tojásokból vett allantois folyadékban, amelyeket az NDV-ΔΙ2- és NDV-A48-transzfekciókból származó felülúszókkal oltottunk, még három egymást követő, tojásban való passzálás után sem.
2. példa
NDV-Al8-at markervakcinaként lehet alkalmazni
Anyagok és módszerek
Csirkék immunizálása NDV-M8-al és szérumok analízise
Tizenöt, háromhetes SPF-csirkét immunizáltunk NDV-ΔΙ 8-al okulonazálisan 0,2 ml-ben 6,5 log10 EID50 dózis alkalmazásával, és az első immunizálás után öt héttel ismétlő immunizálást végeztünk azonos dózissal. Szérummintákat vettünk közvetlenül a vakcináció előtt, valamint 2, 5 és 7 héttel az első immunizálás után. A szérummintákon ezután hemagglutináció-gátlási tesztet (Hl), valamint ELISA-teszteket végeztünk a szerokonverzió mértékének meghatározására.
Enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárás (ELISA)
Nukleoprotein (443-460) aminosavait tartalmazó, 18 tagú szintetikus peptidet (1. azonosító számú szekvencia) szintetizáltunk, és marhaszérum-albuminhoz (BSA) kapcsoltuk. Röviden összefoglalva, a szintetikus peptidet (2 mg) BSA-hoz kapcsoltuk (4:1 moláris arányban, sorrendben), keresztkötőként 20 mM glutáraldehid alkalmazásával, foszfátpufferolt nátrium-kloridban (PBS-ben). Ezzel párhuzamosan előállítottunk negatív kontroliantigént BSA-keverék keresztkötésével, peptid hozzáadása nélkül. Ezután egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a keresztkötési reakciót úgy állítottuk le, hogy glicintartalmú stabilizálópuffert adtunk a reakciókeverékhez. A BSA/peptid keveréket elosztottuk aliquotokra és -20 °C-on tároltuk.
Mikrotitertálcákat egy éjszakán át burkoltunk 2-8 °C-on 0,5 μg BSA-hoz kapcsolt szintetikus pepiiddel vagy BSA-val egyedül burkolópufferben (karbonátpuffer, pH=9,6). A nem kötődött antigént eltávolítottuk úgy, hogy a mérőhelyeket négyszer mostuk PBST-oldattal (PBS, Tween-20). A szérummintákat 50*hígítottuk tesztelés előtt IB-EIA-oldatban (0,2 M Na2HPO4-2H2O-puffer, pH=7,0, 0,05% Tween-20, 0,5 M NaCI, 0,1% BSA), és hozzáadtuk a burkolt mérőhelyekhez. A tálcát 1,5 óra hosszáig, 37 °C-on magas nedvességtartalmú atmoszférában inkubáltuk, majd a mérőhelyeket PBST-oldattal mostuk, és 100 μΙ tormából származó peroxidázzal konjugált, nyúlban termeltetett, anticsirke immunoglobulinnal inkubáltuk, melyet IB-EIA-oldatban hígítottunk. 45 perces, 37 °C-on végzett inkubálás után a mérőhelyeket PBST-vel mostuk, és az antigénellenanyag komplexeket szubsztrátként TMB hozzáadásával detektáltuk. 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd a reakciót úgy állítottuk le, hogy 50 μΙ 2 M kénsavat adtunk az egyes mérőhelyekre. Optikai denzitást 450 nm-nek mértünk. A küszöbérték (cut-off) (COV) SPF-csirkékhez tartozó negatív kontrollminták átlagos P/N-aránya felett háromszoros standard deviációra volt állítva (ahol P=peptiddel burkolt mérőhelyekhez tartozó minták OD-ja; N=BSA-val burkolt mérőhelyekhez tartozó minták OD-ja).
A teljes NDV-specifikus, tesztelt szérumpanelekben kialakult ellenanyagválasz mérése céljából, mikrotitertálcákat szacharózgradiensen tisztított NDV „Clone 30”-ból származó antigénekkel burkoltunk. Röviden összefoglalva, a mérőhelyeket egy éjszakán át burkoltuk 0,5% Triton Χ-100-al kezelt virális antigénekkel (1,0 μg/ml), 40 mM foszfátpufferben (PBS, pH=7,2). A nem kötődött antigéneket PBST-mosással eltávolítottuk, majd mérőhelyeket utóburkoltuk 10 térf% donor lószérummal, PBS-ben. Negatív kontrollként csak utóburkolt antigéneket tartalmazó mérőhelyeket alkalmaztunk. A tesztelt szérummintákat IB-EIA-oldatban hígítottuk (1:150), és hozzáadtuk azokat mind a pozitív, mind a negatív kontrollmérőhelyekre. Az ELISA eljárás hátralévő inkubációs lépései megegyeztek a peptidalapú ELISA-ban alkalmazott lépésekkel a fentebb leírtak szerint, kivéve azt, hogy az IB-EIA konjugátum-hígító puffért 5% donor lószérummal kiegészítettük. A küszöbérték (cut-off) (COV) SPF-csirkékhez tartozó negatív kontrollminták átlagos P/N-aránya felett háromszoros standard deviációra volt állítva.
Eredmények
Szérumokat vettünk a rekombináns NDV-ΔΙ 8-al immunizált állatokból a 2., 5. és 7. héten, és Hl-, valamint ELISA-teszteket végeztünk. A 2. ábrán bemutatottak szerint, a Hl-titerek átlaga 4,7, 4,9 és 7,7 volt 2, 5 és 7 héttel az első immunizálást követően, sorrendben. Ennek megfelelő, erőteljes reakció volt a teljes víruson alapuló ELISA-ban is, ami azt mutatja, hogy a rekombináns vírus ellen jelentékeny immunválasz indukálódott. Ezzel ellentétben a szérumok egyike sem reagált ELISA-ban a peptiddel burkolt mérőhelyeken, ami azt mutatja, hogy NDV-ΔΙ 8-al immunizált csirkékből teljesen hiányoznak az NP-fehérjén lévő immundomináns epitópra specifikus ellenanyagok, még az ismétlő immunizálást követően is (szérumok a 7. héten). Az általánosan alkalmazott, inaktivált vagy élő vírusvakcinákkal immunizált állatokból kinyert szérumok analízise teljes vírusra alapuló ELISA-ban reaktivitást mutatott. Továbbá valamennyi tesztelt szérum pozitív volt a peptiden alapuló ELISA-ban (2. ábra), ami alátámasztja azt, hogy az általánosan alkalmazott ND-vakcinákkal immunizált állatoktól vett szérumokban jelen vannak NP immundomináns epitópja ellen termelődött ellenanyagok. Tehát a peptid-alapuló ELISA képes különbséget tenni a rekombináns NDV-ΔΙ8-ra adott ellenanyagválasz és az általánosan alkalmazott ND-törzsekre adott válasz között.
3. példa
NDV-A18 alkalmazása in ovo markervakcinaként, egyedül vagy más vektorvakcinával kombinációban beadva
Anyagok és módszerek
Vírus szaporítása embriót tartalmazó tojásokban
Vírustiter és embrió mortalitásának meghatározása céljából elkészítettük rekombináns NDV-ó18-vírus tizedelő sorozathígítását, és 9-11 napos embriót tartalma9
HU 226 256 Β1 zó SPF-csirketojások allantois üregébe oltottuk. A tojásokat legalább hét napon keresztül, naponta vizsgáltuk embrió mortalitásra, és meghatároztuk az 50%-os embrió letális dózist (ELD50) Reed és Muench [Am. J.
Hyg. 27, 493-497 (1938)] által leírt módszer szerint. 5 Tálcás HA-gyorstesztet is végeztünk egy másik készlet tojáson négy napos inkubációt követően, és a titert 50%-os embrió-fertőző dózisként (EID50) kifejezve, ugyanilyen módszer szerint számítottuk.
In ovo vakcináció és fertőzés
Tizennyolc napos embriót tartalmazó SPF-csirketojásokat beoltottunk rekombináns NDV-Δΐβ vírussal magában, vagy NDV F-fehérjét expresszáló HVT-vektorral kombinációban [Morgan és munkatársai, Avian Dis. 37, 1032-1040 (1993)]. 23G méretű injekciós tűt alkalmazva 0,1 ml vírusoldatot vagy negatív allantois folyadékot injektáltunk a tojás tompa végén szúrt lyukon keresztül közvetlenül a légzsák membránja alá.
A tojásokat tovább inkubáltuk kikelésig. Mértük a keltethetőség százalékos arányát, és a csirkék általános egészségi állapotát naponta figyeltük. Három hetes korukban vérmintákat vettünk, és a szérumokat NDV-ellenanyagokra teszteltük NDV-hemagglutináció-gátlási (Hl) tesztben és ELISA-ban. Három hetes korukban valamennyi állatot megfertőztünk intramuszkulárisan be- 25 adott virulens NDV Herts-törzzsel. A csirkéket tíz napon keresztül, naponta figyeltük a betegség klinikai tüneteire vagy mortalitásra.
Eredmények
NDV-&18 vírus gyengített patogenitása csirkeembriókra
NDV-A18 által okozott embriómortalitás meghatározása céljából háromszor passzált NDV-ΔΙ 8 tizedelő hígítási sorát beoltottuk 11 napos embriót tartalmazó SPF-csirketojásokba (0,2 ml/tojás), és egy hétig inku- 35 báltuk. Meglepő módon nem detektáltunk a hét napos inkubálás közben specifikus embriópusztulást, ami azt mutatja, hogy az NDV-A18 lényegesen gyengített volt embriókra nézve (3. ábra). A szülői vírussal, rekombináns NDV-vel (rNDV) oltott csirkeembriók már három nappal az oltást követően kezdtek pusztulni 4 log^ 0EID50/ml-nél magasabb dózisnál. Az rNDV 50%-os fertőző dózisa és az 50%-os letális dózisa között csak
0,3 log10 volt a különbség. Ezzel szemben ez a különbség NDV-A18 esetén 0,8 log10, ami azt mutatja, hogy az NDV-ΔΙ8 jelentősen le van gyengítve (3. ábra).
NDV-A18 hatékony in ovo/markervakcina NDV-ΔΙ8 nagymértékben le volt gyengítve csirkeembriókra nézve, 9-11 napos embriókon történő alkalmazása esetén, ezért in ovo (embrió) vakcinációs kísérletet végeztünk NDV-ΔΙ8 biztonságosságának és 10 hatékonyságának meghatározására (1. táblázat). Az in ovo immunizált embriót tartalmazó tojásokból kikelt csirkéket megfertőztük velogén NDV Herts-törzzsel. Embrionális állapotban NDV-ΔΙ8-al immunizált csirkékben sok ellenanyag termelődött, és letális fertőzés15 sel szemben 100%-os védettség alakult ki, attól függetlenül, hogy az NDV-ΔΙ 8-at egyedül, vagy NDV-F-et expresszáló HVT-vel kombinációban adtuk be (1. táblázat). Valamennyi kontrollállat elpusztult a fertőzést követő három napon belül. Ezek az adatok azt mutat20 ják, hogy az NDV-ΔΙ8 teljes védettséget biztosít, 18 napos SPF-csirkeembrióknak beadva.
Annak meghatározására, hogy NDV-Al8-al in ovo immunizált állatokat szerológiailag meg lehet-e különböztetni a fertőzött vagy az általánosan alkalmazott vakcinákkal immunizált állatoktól, vérmintákat vettünk három hetes korban, és a 2. példában leírtak szerint ELISA-t végeztünk. A várakozásnak megfelelően, egyik NDV-Al8-al immunizált állatból származó szérum sem reagált az NP-génen lévő immundomináns 30 epitópot magában foglaló peptidre alapuló ELISA-ban, míg valamennyi szérum reaktív volt a teljes vírusra alapuló ELISA-ban és Hl tesztben (4. ábra). Mindez azt mutatja, hogy NDV-Δΐβ in ovo beadása nem befolyásolja az NDV-Al8-al immunizált állatok megkülönböztethetőségét fertőzött állatoktól. Az NP-génen lévő, immundomináns epitópra adott válasz hiányát szintén igazoltuk abban az esetben, ha NDV-ΔΙ8-at in ovo HVT-NDV/F-el, azaz NDV-ből származó fúziós (F) fehérjét expresszáló vektorvakcinával kombinációban 40 adtuk be (4. ábra). Mindez azt mutatja, hogy NDVΔΐδ-at kombinálni lehet más olyan vektorvakcinákkal, amelyek nem expresszálják az NDV-nukleoprotein immundomináns régióját.
1. táblázat
NDV-ΔΙΘ, vagy NDV-A18 plusz HVT-NDV/F biztonsága és hatékonysága SPF-csirkékben, 18 napos embrió in ovo immunizálásával
| Vírus | Embriók | Dózis3 | Keltethetőség (mennyisé- ge/összes) | Hl titer·5 | Túlélés fertőzés után0 |
| NDV-ΔΙ 8 | SPF | 3,2 | 25/30 (83%) | 5,1±1,2 | 20/20 (100%) |
| NDV-ΔΙ 8+HVTNDV/F | SPF | 4,2 2,8 | 18/27 (67%) | 4,6±07 | 18/18(100%) |
| Kontroll | SPF | - | 26/27 (96%) | 0,0±0,0 | 0/20 (0%) |
a Dózis log10EID50/tojás NDV-re és pfu/tojás HVT-NDV/F-re, melyet a minták visszatitrálása után számítottunk ki. b Hemagglutináció-gátlás (Hl) titere (2 lóg) NDV-vel szemben 3 hetes korban.
c Csirkéket NDV Herts-törzzsel fertőztünk háromhetes korban, 6,0 log10EID50/csirke dózissal, intramuszkulárisan.
HU 226 256 Β1
Az 1. táblázatban bemutatottak szerint, SPF-állatok keltethetőségének mértéke csökkent, különösen akkor, ha nagyobb dózis NDV-A18-at alkalmaztunk. Annak meghatározása céljából, hogy anyai eredetű ellenanyagok (MDA) modulálják-e NDV-A18 biztonságát, kereskedelmi forgalomba kerülő csirkéket immunizáltunk in ovo NDV-A18-al egyedül vagy kombinációban HVT-NDV/F-el. Embriót tartalmazó, nagyüzemi csirketojások keltethetőségére teljes mértékben hatástalan volt NDV-A18-al egyedüli vagy HVT-NDV/F-el kombinációban való in ovo beadása (2. táblázat), ami bizonyítja NDV-A18 biztonságát MDA-val rendelkező állatokban.
2. táblázat
NDV-A18, vagy NDV-A18 plusz HVT-NDV/F kombináció biztonságossága nagyüzemben tenyésztett csirkékben, 18 napos embrió in ovo immunizálásával
| Vírus | Embriók | Dózis3 | Keltethető- . ség (mennyisé- ge/összes) |
| NDV-A18 | Nagyüzemi | 4,2 | 29/30 (97%) |
| NDV-A18+ HVT-NDV/F | Nagyüzemi | 4,2 2,8 | 30/30 (100%) |
| Kontroll | Nagyüzemi | - | 27/30 (90%) |
a Dózis logi0EID50/tojás NDV-re és pfu/tojás HVT-NDV/F-re, melyet a minták vlsszatitrálása után számítottunk ki. b NDV-specifikus MDA átlagos Hl-titere kikeléskor: 5,3±1,1.
Továbbá összehasonlítottuk csirkék keltethetőségét az embrionális kor 18. vagy 19. napján beadott NDV-A18 után. A 3. táblázatban bemutatottak szerint, az embrionális kor 19. napján immunizált SPF-embriók 100%-a keltethető volt az embrionális kor 18. napján immunizált SPF-embriók keltethetőségéhez képest (76%).
3. táblázat
NDV-A18 biztonságossága SPF-csirkékben, 18 vagy 19 napos embrió in ovo immunizálásával
| Vírus | Embrió kora | Dózis log10EID50/ tojás | Keltethető- ség (mennyisé- ge/összes) |
| NDV-A18 | 18 nap | 5,0 | 71% (15/21) |
| Kontroll | 18 nap | 0 | 100% (21/21) |
| NDV-A18 | 19 nap | 5,0 | 100% (22/22) |
| Kontroll | 19 nap | 0 | 96% (21/22) |
4. példa
NDV-ΔΙ 8 hatékony markervakcina tojásból kikelés után
Anyagok és módszerek
Annak meghatározása céljából, hogy NDV-A18 kikelés utáni vakcinaként biztonságos és hatékony-e, egynapos SPF-csirkéket immunizáltunk szemcsepp útján 6 log10 ElDgo/csirke dózissal. A csirkéket naponta vizsgáltuk klinikai tünetekre, és háromhetes korban vérmintákat vettünk, és minden állatot megfertőztük virulens NDV-Herts-törzzsel intramuszkulárisan. A szérumokat NDV-ellenanyagokra teszteltük NDV-hemagglutinációgátlási (Hl) tesztben és ELISA-ban. A csirkéket naponta megfigyeltük a fertőzést követően két hétig arra, hogy előfordulnak-e a betegség klinikai tünetei vagy mortalitás.
Eredmények
A kikelés után NDV-Al8-cal immunizált csirkék NDV-specifikus ellenanyagokat termeltek, és védettségük letális fertőzéssel szemben 90%-nál magasabb volt a beadott dózisnál (4. táblázat). Valamennyi kontrollcsirke elpusztult a fertőzést követő három nap során. A fertőzést megelőző megfigyelési szakaszban nem volt detektálható semmiféle vakcinációval kapcsolatos kóros tünet. Annak meghatározására, hogy az NDV-A18-al immunizált állatokat szerológiailag meg lehet-e különböztetni a fertőzött vagy az általánosan alkalmazott vakcinákkal immunizált állatoktól, vérmintákat vettünk közvetlenül a fertőzés előtt, melyeket a 2. példában leírtak szerint ELISA-ban vizsgáltunk. A várakozásnak megfelelően, valamennyi szérum reagált a teljes víruson alapuló ELISA-ban és Hl-tesztben, de nem reagált az NP-génen lévő immundomináns epitópot felölelő peptiden alapuló ELISA-ban. Összefoglalva, ezek az adatok azt mutatják, hogy NDV-A18 nemcsak in ovo beadásra alkalmas, hanem biztonságos és hatásos kikelés utáni markervakcina.
4. táblázat
NDV-A18 biztonsága és hatékonysága egynapos SPFcsirkékben, szemcseppben immunizálva
| Vírus | Dózis3 | Hl titerb | Túlélés fertőzés után0 |
| NDV-A18 | 6,0 | 3,73 | 11/12(92%) |
| Kontroll | - | 0,0 | 0/5 (0%) |
a Dózis log10EID50/csirke.
b Hemagglutináció-gátlás (Hl) titere (2 lóg) NDV-vel szemben 3 hetes korban.
c Csirkéket NDV Herts-törzzsel fertőztünk háromhetes korban, 6,0 log10EID50/csirke dózissal, intramuszkulárisan.
5. példa
Idegen epitópot expresszáló markervakcina Anyagok és módszerek Rekombináns vírusok felépítése és előállítása Annak meghatározása céljából, hogy van-e arra lehetőség, hogy egy rekombináns NDV idegen epitópot expresszál, rágcsálókban előforduló hepatitiszvlrusból (MHV) származó S2-glikoprotein egy jól jellemzett
HU 226 256 Β1
B-sejtes epitópját [Talbot és munkatársai, Virology 132, 250-260 (1984); Luytjes és munkatársai, J. Virol. 63, 1408-1415 (1989)] választottuk az NDV-ben lévő NP-immundomináns epitóp helyettesítésére. Fázist megtartó helyettesítésben 16 aminosavat (1451-1499. nukleotidhelyzetek, megfelel az NP 444-459. aminosavainak) vagy 12 aminosavat (1451-1486. nukleotidhelyzetek, megfelel az NP 444-455. aminosavainak) 16 aminosavból (MHV epitóp-1), illetve 10 aminosavból (MHV epitóp-2) álló, két átfedő szekvenciával helyettesítettünk, amely az MHV S2-glikoprotein epitópját tartalmazta.
MHV epitóp-1 szekvenciája (nyilvántartási száma: NCBI NC_001846; a teljes genomban 26464-26511. nukleotidok; az S2-fehérje 845-860. aminosávai):
5’ -AGTCCTCTACTTGGATGCATAGGTTCAACATGTGCTGAAGACGGCAAT-3’
Ser Pro Leu Leu Gly Cys Ile Gly Ser Thr Cys Alá Glu Asp Gly Asn
MHV epitóp-2 szekvenciája (nyilvántartási száma: NCBI NC_001846; a teljes genomban 26470-26499. nukleotidok; az S2-fehérje 847-856. aminosavai):
5'-CTACCTGGATGCATAGGTTCAACATGTGCT-3'
Leu Leu Gly Cys Ile Gly Ser Thr Cys Alá
PCR-mutagenezist végeztünk a 2,2 kb méretű MIul/Apal-szubklónon az 1. példában leírtak szerint, megfelelő láncindító oligonukleotidpárok alkalmazásával:
Mutagenizált kiónokat AatlI/Apal-enzimekkel emésztettünk, és pfINDV-plazmid ugyanilyen helyére klónoztuk. A bevitt mutációk jelenlétét a megfelelő kiónok szekvenálásával igazoltuk. Ennek eredményeként kapott, teljes hosszúságú kiónokat, amelyekben az NP 444-459. aminosavait MHV1-epitóp-1 szekvenciájával, vagy az NP 444-455. aminosavait MHV2-epitóp-2 szekvenciájával helyettesítettük, NDV-MHV1-nek és NDV-MHV2-nek jelöltük. A transzfekciót és a vírusok visszaizolálását az 1. példában leírtak szerint végeztük. Három-öt nappal transzfekció után a felülúszót elkülönítettük, és 9-11 napos embriót tartalmazó SPFcsirketojások allantois üregébe oltottuk. Három-négy napos inkubálás után a vírus jelenlétét az allantois folyadékban tálcás hemagglutinációs gyorsteszttel (HA) csirkéből származó eritrociták alkalmazásával határoztuk meg.
Immun fluoreszcens analízis
Abból a célból, hogy a bevitt MHV-epitóp expressziójának mértékét meghatározzuk, BSR-T7-sejteket fertőztünk szülői rekombináns „Clone-30-al, NDVΔΙ 8-al, NDV-MHV1-el és NDV-MHV2-el 0,01 fertőzési egységet (mól) alkalmazva. 24 óra hosszáig inkubáltuk, majd a fertőzött sejteket hideg etanollal (96%) fixáltuk 1 óra hosszáig, szobahőmérsékleten. Háromszor mostuk PBS-el, ezt követően a sejteket F-fehérjére, az NP-fehérje immundomináns epitópjára vagy MHV-epitópra specifikus monoklonális ellenanyagokkal inkubáltuk. A sejteket megmostuk, és megfestettük FITC-konjugált antiegér ellenanyaggal, és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
Csirkék immunizálása NDV-MHV1-gyel vagy NDVMHV2-vel, és a szérumok analízise
Két, egyenként tíz, háromhetes SPF-csirkéből álló csoportot immunizáltunk NDV-MHV1-el vagy NDVMHV2-vel okulonazálisan 0,2 ml-ben 6,5 log10 EID50 dózis alkalmazásával, és az első immunizálás után öt héttel ismétlő immunizálást végeztünk azonos dózissal. Szérummintákat vettünk közvetlenül a vakcináció előtt, valamint 2, 5 és 7 héttel az első immunizálás után. A szérummintákon ezután hemagglutináció-gátlási tesztet (Hl), valamint ELISA-teszteket végeztünk a szerokonverzió szintjének meghatározására.
Enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárás (ELISA)
Annak meghatározására, hogy NDV-MHV1- és NDV-MHV2-vírusokkal immunizált csirkék termeltek-e specifikus ellenanyagot az expresszált MHV-epitóp ellen, ELISA-tálcákat burkoltunk szacharózgradiensen tisztított MHV-törzsből származó A59-antigénnel. A mérőhelyeket egy éjszakán át burkoltuk 1%-os Triton X-100-al kezelt virális antigénekkel 40 mM foszfátpufferben (PBS, pH=7,2). A nem kötődött antigének eltávolítása, a blokkolás és az ELISA eljárás hátralévő inkubációs lépései azonosak a teljes NDV-re alapuló ELISA-ban alkalmazottakkal, a 2. példában leírtak szerint. NP-epitóp elleni válasz hiányának meghatározása céljából, ELISA eljárást végeztünk az NP-immundomináns epitópot felölelő, 18 tagú, szintetikus peptid alkalmazásával, a 2. példában leírtak szerint. Hasonlóan mértünk teljes NDV-re specifikus ellenanyagválaszt szacharózgradiensen tisztított NDV „Clone 30”-ból származó antigénekkel burkolt ELISA-tálcákon, a 2. példában leírtak szerint.
Egerek immunizálása és fertőzése
Annak meghatározása céljából, hogy az NDV által expresszált MHV-epitóp milyen mértékben képes védettséget biztosítani, 4 hetes, Balb/c nőstény MHVszeronegatív egereket alkalmaztunk immunizálási és fertőzési kísérletek céljára. Két, egyenként tíz egérből álló csoportot immunizáltunk NDV-MHV1-el vagy NDV-MHV2-vel 6,0 Iog10 EID50/egér dózissal, és négy hét múlva ismétlő immunizálást adtunk hasonló dózissal. Az immunizált, valamint tíz azonos korú kontrollállatot megfertőztünk 10 hetes korukban (két héttel az ismétlő immunizálás után) vad típusú MHV-A59-törzzsel 10 LD50/egér dózisban, intraperitoneálisan. Az állatokat a fertőzés után két héten át figyeltük, hogy MHV következtében jelentkeznek-e klinikai tünetek és mortalitás.
Eredmények
A transzfektált sejtektől elkülönítettünk felülúszókat, és kétszer passzáltuk 9-11 napos embriót tartalmazó SPF-csirketojásokba. Ezt követően allantois folyadékmintákat gyűjtöttünk, és HA-tesztet végeztünk. HA-t detektáltunk az NDV-MHV1-, valamint NDV-MHV2-rekombinánsokkal fertőzött sejtekből származó felülúszóval beoltott tojásokban. A visszaizolált vírusokat tovább passzáltuk még kétszer embriót tartalmazó tojásokban. A rekombináns vírusok visszaizolálhatósága azt igazolja, hogy az NP-immundomináns epitóp nemcsak nélkü12
HU 226 256 Β1 lözhető a vírusreplikációhoz, hanem helyettesíthető is teljesen idegen szekvenciával vagy epitóppal.
Annak meghatározása céljából, hogy a rekombináns vírusok expresszálják-e az újonnan bevitt epitópot, BSRsejteket fertőztünk az .Anyagok és módszerek részben leírtak szerint, és immunfluoreszcensen analizáltuk. A fúziós fehérére specifikus monoklonális ellenyanyagot (Mab) alkalmazva, az F-fehérje expressziója nem volt megkülönböztethető egyik vírusban sem. Ezzel szemben az NP-immundomináns epitópra specifikus Mab csak a szülői „Clone-30”-vírussal reagált. A várakozásnak megfelelően az MHV-epitópra specifikus Mab csak NDV-MHV1-el vagy NDV-MHV2-vel fertőzött sejtekkel reagált, ami azt mutatja, hogy az epitóp megfelelően expresszálódik az NP-gén nyitott leolvasási fázisában.
Közvetlenül az immunizálás előtt (T=0), és hét héttel az első immunizálás után (T=7) vett szérumokon Hl-tesztet és teljes NDV-ELISA-t végeztünk. Az ábrákon bemutatottak szerint, a Hl-titer a vakcináció után hét héttel valamennyi csirkében 6 log2 Hl egység felett volt, és a teljes NDV-n alapuló ELISA-ban mért értékek szintén figyelemre méltóan magasak voltak (5-8. ábrák). Érdekes módon az NDV-MHV1-el vagy NDVMHV2-vel immunizált csirkék 80-90%-a pozitívan reagált az MHV teljes vírusantigénre alapuló ELISA-ban, ami azt mutatja, hogy a csirkék specifikus ellenanyagokat termelnek rekombináns NDV-k által expresszált MVH-epitóp ellen (9-11. ábrák). Ezzel ellentétben egyik szérum sem reagált a burkolásként 18 tagú peptidet alkalmazó ELISA-ban, ami azt mutatja, hogy NDVMHV1-el vagy NDV-MHV2-vel immunizált csirkékből teljes mértékben hiányoznak az NP-n lévő epitópra specifikus ellenanyagok. Ez a tulajdonság lehetővé teszi extra biztonságot nyújt diagnosztikai tesztben, pozitív és negatív markerként egyaránt, és a rekombináns vírusokat vonzó, szóba jöhető kettős markerré teszi.
Továbbá annak bemutatása céljából, hogy a bevitt epitóp képes védelmet biztosítani letális fertőzés ellen, egereket immunizáltunk a rekombináns vírusokkal, majd az első immunizálás után hat héttel fertőztük őket. Bár egerek nem természetes gazdaszervezetei NDV-nek, jelentős mértékű védettséget értünk el az immunizált egerekben letális MHV-fertőzéssel szemben (5. táblázat). Ezért ezek a rekombináns vírusok nemcsak markervakcinaként alkalmazhatók előnyösen, hanem vektorként is, másféle patogénnel szembeni védelemre szolgáló, idegen epitópok expresszálására.
5. táblázat
| Vírus | Túlélés (%) fertőzés után |
| NDV-MHV1 | 70% (7/10) |
| NDV-MHV2 | 60% (6/10) |
| Kontroll | 20% (2/10) |
Ábrák magyarázata
1. ábra: Rekombináns NDV-konstrukciók. Vázlatosan bemutatjuk az NDV-gén elrendeződését a negatív szálú genomi RNS-ben. Az NP-génen lévő immundomináns epitóp körüli szekvenciákat (1442-1501. helyzetek, 441-460. aminosavak) pozitív értelemben mutatjuk be. Szaggatott vonalakkal jelöljük 12 vagy 18 aminosav delécióját NDV-Al2-ben és NDV-A18-ban, sorrendben. NDV-A48-ban C-terminális rövidítés van (48 aminosav), melyet stopkodon (*) jelöl az utolsó aminosav után.
2. ábra: Tizenöt SPF-csirkét immunizáltunk okulonazálisan NDV-A1 8-al három hetes korban, és ismétlő oltást adtunk 5 hetes korban. Szérummintákat vettünk közvetlenül az immunizálás előtt (D18 0W), az első immunizálás után 2 héttel (D18 2W), 5 héttel (D18 5W) és 7 héttel (D18 7W), és ezeket ELISA-ban és Hl-tesztben vizsgáltuk az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint. Élő, kereskedelmi forgalomban lévő ND-vakcinával (klón—30) szemben kialakult szerológiai választ hasonló módon határoztunk meg 19 SPF-csirkében, melyeket egyhetes korukban immunizáltunk és 4 héttel később vettünk vért. A NEWCAVAC-csoportban (inaktivált, kereskedelmi forgalomban lévő vakcina) 21 csirkét immunizáltunk 3 hetes korukban, és hasonló szerológiai vizsgálati eljárást végeztünk olyan szérummintákon, amelyeket 3 héttel immunizálás után vettünk. (D18=NDV-A18).
3. ábra: rNDV és NDV-A18 patogenitása SPF-csirkeembriókban. Tizenegy napos embrionális állapotban lévő SPF-csirketojásokat oltottunk a szülői rNDV-vel vagy a mutáns NDV-Al8-al, és 7 napig vagy az embrió pusztulásáig inkubáltuk. NDV-A18 nem okozott embriómortalitást 7 napig egyik feltüntetett dózisban sem, míg az rNDV letális volt, még 1 EID50/ml alacsony dózisban is (körülbelül 10%-os mortalitás). Az rNDV-vel oltott embriók már három nappal az oltás után kezdtek elpusztulni magasabb dózisoknál.
4. ábra: NDV-A18-al egyedül, vagy HVT-NDV/F-el (NDV fúziós fehérjét expresszáló vektorvakcina) kombinációban immunizált SPF-csirkékben kialakult szerológiai válasz. 18 napos embrionális állapotban lévő állatokat immunizáltunk, és Hl-tesztet és ELISA-t végeztünk az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint háromhetes korban vett szérumokkal. (D18=NDV-A18).
5-8. ábrák: NDV-MHV1-el vagy NDV-MHV2-vel immunizált SPF-csirkékben kialakult szerológiai válasz. Szérummintákat vettünk közvetlenül az immunizálás előtt (=0) és 7 héttel (T=7) az első vakcináció után, és Hl-tesztben és ELISA-ben vizsgáltuk azokat teljes NDV-antigénre alapozva.
9-11. ábrák: MHV-epitópra specifikus ellenanyagokat termelő csirkék. Ugyanazokat a szérumokat alkalmaztuk teljes MHV-antigénre alapuló ELISA-ban, mint amiket az 5. ábra (NDV-MHV1-re és NDV-MHV2-re) vagy a 2. ábra (NDV-Al8-ra) leírásánál említettünk.
Á szekvencialistában található kötetlen szövegrészek (223 kód) fordításai <210> 1 <223> 9 tagú peptid/epitóp <210>2 <223> 18 tagú peptid
HU 226 256 Β1 <210>3 <223> NP gén: 56-1801. nukleotidok; NP kódolószekvencia: 122-1588. nukleotidok <210>5 <223> Mesterséges szekvencia: NP láncindító <210>6 <223> Mesterséges szekvencia: P1B jelű NP láncindító <210> 7 <223> Mesterséges szekvencia: P2A jelű NP láncindító <210>8 <223> Mesterséges szekvencia: P2B jelű NP láncindító <210>9 <223> Mesterséges szekvencia: P3A jelű NP láncindító <210> 10 <223> Mesterséges szekvencia: P3B jelű NP láncindító
Claims (20)
1. Newcastle-betegség vírusának (NDV) mutánsa, amelyben egy NDV-fehérjében hiányzik egy immundomináns epitóp a fehérjét kódoló génben végbement mutáció eredményeként, amely NDV-mutánsban a nukleoprotein (NP) régióban hiányzik egy epitóp, amely régió 1. azonosító számú aminosavszekvenciával (447-455. aminosavak) rendelkezik.
2. Az 1. igénypont szerinti NDV-mutáns, amely olyan antiszérumot indukál csirkékben, amely nem tartalmaz az NP (447-455) aminosavrégiójában elhelyezkedő, immundomináns epitóppal reagálni képes ellenanyagokat.
3. A 2. igénypont szerinti NDV-mutáns, amely olyan antiszérumot indukál csirkékben, amely nem tartalmaz 2. azonosító számú NP-aminosavszekvenciával (443-460. aminosavak) rendelkező, 18 tagú peptiddel reagálni képes ellenanyagokat.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti NDVmutáns, amely egy vagy több aminosavdeléciót vagy szubsztitúciót tartalmaz az NP-gén (447-455) aminosavszekvenciával rendelkező régiójában.
5. A 4. igénypont szerinti NDV-mutáns, amely a 443±1-460±1. aminosavak delécióját tartalmazza.
6. Az 5. igénypont szerinti NDV-mutáns, amely a 443-460. aminosavak delécióját tartalmazza.
7. A 4. igénypont szerinti NDV-mutáns, amelyben a régióban lévő, egy vagy több aminosavat kódoló nukleotidok szubsztituálva vannak egy polipeptid immundomináns epitópját kódoló, heterológ nukleinsavszekvenciával.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti NDVmutáns, amely további gyengítő mutációkat tartalmaz.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti NDVmutáns, amely továbbá madárban előforduló patogénből származó antigént kódoló, heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
10. Baromfiban előforduló Newcastle-betegség elleni vakcina, amely 1-9. igénypontok bármelyike szerinti NDV-mutánst élő vagy inaktivált formában, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítószert tartalmaz.
11. A 10. igénypont szerinti vakcina, amely továbbá NDV-vel vagy más, madárban előforduló patogénnel szemben védettséget indukálni képes vakcinatörzset tartalmaz.
12. A 11. igénypont szerinti vakcina, amely további vakcinatörzsként NDV-ből származó, fúziós (F) vagy hemagglutinin-neuraminidáz (HN) fehérjét expresszálni képes, rekombináns vakcinavektort tartalmaz.
13. A 12. igénypont szerinti vakcina, amely rekombináns vakcinavektorként herpeszvírust (HVT) tartalmaz.
14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely további vakcinatörzsként embrióra nézve biztonságos vakcinatörzset tartalmaz.
15. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti NDVNP-mutáns alkalmazása baromfiban előforduló Newcastle-betegség elleni, in ovo beadható vakcina gyártására.
16. Eljárás NDV-fertőzés meghatározására baromfiban, azzal jellemezve, hogy egy állatból vett mintát vizsgálunk NP (447-455) aminosavrégiójában elhelyezkedő, immundomináns epitóppal reagáló ellenanyagok jelenlétére vagy hiányára.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) egy olyan mintát, amelyről feltételezzük, hogy antiNDV-ellenanyagokat tartalmaz, inkubálunk (447-455) aminosavrégiót tartalmazó NP-fragmenssel, egyetlen epitóptartalmú régióként, (ii) lehetővé tesszük ellenanyag-antigén komplex kialakulását, és (iii) detektáljuk az ellenanyag-antigén komplexet.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy NP-fragmensként (443-460) aminosavszekvenciával rendelkező, 18 tagú peptidet alkalmazunk.
19. Diagnosztikai teszt-reagenskészlet, amely 16-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására alkalmas, és (447-455) aminosavrégiót, előnyösen (443-460) aminosavrégiót tartalmazó NP-fragmenst tartalmaz.
20. A 10-14. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, Newcastle-betegség leküzdésére szolgáló programban immunizált állatok és természetesen előforduló NDV-vel fertőzött állatok megkülönböztetésére.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00203814 | 2000-11-02 | ||
| PCT/EP2001/012573 WO2002036617A2 (en) | 2000-11-02 | 2001-10-30 | A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0302265A2 HUP0302265A2 (hu) | 2003-10-28 |
| HUP0302265A3 HUP0302265A3 (en) | 2005-11-28 |
| HU226256B1 true HU226256B1 (en) | 2008-07-28 |
Family
ID=8172212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0302265A HU226256B1 (en) | 2000-11-02 | 2001-10-30 | A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7070789B2 (hu) |
| EP (1) | EP1383795B1 (hu) |
| JP (2) | JP4476543B2 (hu) |
| AT (1) | ATE352557T1 (hu) |
| AU (2) | AU2002224815B2 (hu) |
| CA (1) | CA2427578C (hu) |
| CY (1) | CY1106493T1 (hu) |
| DE (1) | DE60126349T2 (hu) |
| DK (1) | DK1383795T3 (hu) |
| ES (1) | ES2278810T3 (hu) |
| HU (1) | HU226256B1 (hu) |
| MX (1) | MXPA03003700A (hu) |
| PL (1) | PL207132B1 (hu) |
| PT (1) | PT1383795E (hu) |
| WO (1) | WO2002036617A2 (hu) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6913751B2 (en) | 1992-06-12 | 2005-07-05 | Schering-Plough Veterinary Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| US7314715B2 (en) | 2001-06-14 | 2008-01-01 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| TW200502402A (en) * | 2002-12-06 | 2005-01-16 | Wyeth Corp | Escape mutants of newcastle disease virus as marker vaccines |
| US7473884B2 (en) | 2005-04-21 | 2009-01-06 | Avago Technologies Ecbu Ip (Singapore) Pte. Ltd. | Orientation determination utilizing a cordless device |
| CN1298845C (zh) * | 2005-09-02 | 2007-02-07 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 |
| CN1293195C (zh) * | 2005-09-02 | 2007-01-03 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用 |
| EP2529747B1 (en) | 2005-12-02 | 2018-02-14 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Chimeric Newcastle Disease viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof |
| MX2008011727A (es) | 2006-03-15 | 2008-12-10 | Intervet Int Bv | Vectores de virus mononegaviral recombinantes. |
| AU2007224430A1 (en) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Intervet International B.V. | Recombinant Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin of avian influenza virus |
| US7796119B2 (en) | 2006-04-03 | 2010-09-14 | Avago Technologies General Ip (Singapore) Pte. Ltd. | Position determination with reference |
| US20080008736A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Thierry Glauser | Random copolymers of methacrylates and acrylates |
| KR100801180B1 (ko) * | 2006-09-26 | 2008-02-05 | 주식회사 고려비엔피 | 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신 |
| WO2008151364A1 (en) * | 2007-06-13 | 2008-12-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Modulating production traits in avians |
| EP2085092A1 (en) | 2008-01-29 | 2009-08-05 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Attenuated oncolytic paramyxoviruses encoding avian cytokines |
| US20090246226A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Zeon Corporation | Avian vaccines possessing a positive marker gene |
| US20120128684A1 (en) * | 2008-08-25 | 2012-05-24 | Burnham Institute For Medical Research | Conserved Hemagglutinin Epitope, Antibodies to the Epitope and Methods of Use |
| SG178523A1 (en) | 2009-08-21 | 2012-03-29 | Merial Ltd | Recombinant avian paramyxovirus vaccine and method for making and using thereof |
| ES2380289T3 (es) | 2009-11-30 | 2012-05-10 | United Cancer Research Institute | Nuevo clon del virus de la enfermedad de Newcastle, su fabricación y aplicación en el tratamiento médico del cáncer |
| PE20121685A1 (es) * | 2009-12-28 | 2012-12-28 | Merial Ltd | Antigeno ndv recombinante y usos del mismo |
| CN107630008B (zh) * | 2016-07-14 | 2021-01-26 | 中国农业大学 | 基因ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株及其应用 |
| CN108956986B (zh) * | 2018-05-24 | 2021-07-02 | 苏州优迪生物科技有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN112111467B (zh) * | 2020-09-27 | 2021-06-22 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种基因vii型新城疫标记疫苗株及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0974660A1 (en) * | 1998-06-19 | 2000-01-26 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays |
| US6146642A (en) * | 1998-09-14 | 2000-11-14 | Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
-
2001
- 2001-10-30 ES ES01992717T patent/ES2278810T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-30 EP EP01992717A patent/EP1383795B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-30 DK DK01992717T patent/DK1383795T3/da active
- 2001-10-30 AU AU2002224815A patent/AU2002224815B2/en not_active Ceased
- 2001-10-30 PL PL365987A patent/PL207132B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-10-30 AU AU2481502A patent/AU2481502A/xx active Pending
- 2001-10-30 US US10/415,981 patent/US7070789B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-30 CA CA2427578A patent/CA2427578C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-30 JP JP2002539375A patent/JP4476543B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-30 AT AT01992717T patent/ATE352557T1/de active
- 2001-10-30 HU HU0302265A patent/HU226256B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-10-30 WO PCT/EP2001/012573 patent/WO2002036617A2/en active IP Right Grant
- 2001-10-30 DE DE60126349T patent/DE60126349T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-30 MX MXPA03003700A patent/MXPA03003700A/es active IP Right Grant
- 2001-10-30 PT PT01992717T patent/PT1383795E/pt unknown
-
2007
- 2007-04-05 CY CY20071100485T patent/CY1106493T1/el unknown
-
2010
- 2010-01-14 JP JP2010006185A patent/JP2010145412A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA03003700A (es) | 2004-05-04 |
| US7070789B2 (en) | 2006-07-04 |
| DE60126349D1 (de) | 2007-03-15 |
| ATE352557T1 (de) | 2007-02-15 |
| AU2002224815B2 (en) | 2006-10-12 |
| HUP0302265A2 (hu) | 2003-10-28 |
| ES2278810T3 (es) | 2007-08-16 |
| JP2010145412A (ja) | 2010-07-01 |
| PL365987A1 (en) | 2005-01-24 |
| WO2002036617A2 (en) | 2002-05-10 |
| EP1383795A2 (en) | 2004-01-28 |
| CY1106493T1 (el) | 2012-01-25 |
| AU2481502A (en) | 2002-05-15 |
| EP1383795B1 (en) | 2007-01-24 |
| JP4476543B2 (ja) | 2010-06-09 |
| CA2427578C (en) | 2011-09-06 |
| US20040043035A1 (en) | 2004-03-04 |
| JP2004517612A (ja) | 2004-06-17 |
| PT1383795E (pt) | 2007-04-30 |
| DK1383795T3 (da) | 2007-05-29 |
| CA2427578A1 (en) | 2002-05-10 |
| HUP0302265A3 (en) | 2005-11-28 |
| DE60126349T2 (de) | 2007-05-31 |
| WO2002036617A3 (en) | 2003-10-23 |
| PL207132B1 (pl) | 2010-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2010145412A (ja) | マーカーワクチンとしての、組み換えニューカッスル病ウイルス核タンパク質の突然変異体 | |
| Miller et al. | Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge | |
| Mebatsion et al. | Newcastle disease virus (NDV) marker vaccine: an immunodominant epitope on the nucleoprotein gene of NDV can be deleted or replaced by a foreign epitope | |
| AU2002224815A1 (en) | A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine | |
| US7252984B2 (en) | Attenuated mutant newcastle disease virus strains for in ovo vaccination, method for preparing and their use | |
| BRPI0822947B1 (pt) | vacina recombinante. | |
| US9790474B2 (en) | Attenuation of infectious bronchitis virus variant GA-13 | |
| AU2002253542B2 (en) | Purified subfragment encoding neuroaminidase, recombinant neuroaminidase and its use in zooprophylaxis | |
| WO2021211553A1 (en) | Recombinant vaccine against marek's disease and newcastle disease | |
| JP2023504225A (ja) | 弱毒化トリレオウイルス９４８２６ ｃ１４０株及び９６１３９ ｃ１４０株 | |
| AU775514B2 (en) | A recombinant Newcastle Disease virus as an embryo vaccine | |
| US8728484B2 (en) | Vaccine for runting-stunting syndrome | |
| KR20050115929A (ko) | 감염성 점액낭병 바이러스 돌연변이체 및 백신 | |
| CA2508139C (en) | Escape mutants of newcastle disease virus as marker vaccines | |
| KR810001063B1 (ko) | 생 뉴캣슬(Newcastle)병 바이러스 백신의 제법 | |
| Moura | Delivery of DNA and recombinant infectious bursal disease virus vaccines in ovo | |
| MXPA00007313A (en) | A recombinant newcastle disease virus for in ovo vaccination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |