ES2380289T3 - Nuevo clon del virus de la enfermedad de Newcastle, su fabricación y aplicación en el tratamiento médico del cáncer - Google Patents

Abstract

Un clon del virus de la enfermedad de Newcastle que abarca la secuencia de nucleótido del ADN de Seq. Id. No. 1 o según se depositó con la European Collection of Cell Cultures como Accesión número 06112101 el 21 de noviembre de 2006.

Description

[0001] El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV - Newcastle Disease Virus) es un virus bien conocido [Diseases of poultry, 10ª edición, editado por B.W. Calnek, Mosby International, Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1997]. El virus es responsable de grandes pérdidas económicas en el sector avícola. Asimismo es bien sabido que existen muchas cepas del NDV (EP 0770397 B1) con una extensa gama en cuanto a la intensidad y el tipo de enfermedad provocado en las aves.

[0002] El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es clasificado como un paramixovirus-1 aviar (APMV1), un miembro de la familia de paramixoviridae en el orden mononegavirales. Los miembros de esta familia poseen un ARN monocatenario, con una simetría elíptica. El genoma total es de aproximadamente 16.000 nucleótidos. La replicación del virus tiene lugar en el citoplasma de la célula huésped.

[0003] Esta familia está subdividida en dos subfamilias: los paramixovirinae y los pneumovirinae. En el curso de 1993, el Comité Internacional de la Taxonomía de Virus reclasificó los paramixovirus y asignó el NDV al rubulavirus genus. Los genomas de la mayoría de los rubulavirus, con excepción del NDV contienen un pequeño gen de proteína que no está presente entre otros paramixovirus. A base de las secuencias previstas para cada proteína viral, los clones NDV son agrupados filogenéticamente como un clade separado de los rubulavirus. La secuencia de edición del gen de fosfoproteína policistrónica (O) del NDV y los productos putativos del gen son más similares a los patrones de expresión entre los miembros del respirovirus y morbillivirus. Además, la estructura de la proteína de nucleocapsida se parece más estrechamente a los respirovirus. Hay nueve serotipos reconocidos entre los paramixovirus aviares que infectan en primer lugar sólo especies de aves. Estos tipos de virus son filogenéticamente diferentes del NDV, si bien se separan como un clade con NDV de los otros paramixovirus. Esta relación fue confirmada ulteriormente por un análisis filogenético de las secuencias genómicas de longitud completa.

[0004] Tal como fue la situación para muchos otros virus aviares, el NDV se ha desarrollado entre aves en forma separada de los mamíferos. Debido a ello y a base de varios factores clave, incluyendo genes y secuencias previstas de aminoácidos, los paramixovirus aviares merecen su propia designación de género entre los paramixovirinae.

[0005] La enfermedad de Newcastle (ND) es una enfermedad viral contagiosa que afecta sólo especies de aves. Los indicios clínicos son extremadamente variables en función de la cepa del virus, la especie y la edad de la ave, enfermedades concomitantes y una inmunidad preexistente.

[0006] La vacunación desempeña un papel primordial en el control de la enfermedad de Newcastle (ND) en las aves. Esto puede atribuirse en parte al hecho de que varias cepas virales vivas derivadas en forma natural y menos patogénicas y atenuadas fueron identificadas y han estado disponibles para este fin ya en la segunda mitad de los años 1940 (revisado por Lancaster, 1964).

[0007] La variación extrema en la virulencia de diferentes clones del virus ND y el uso extenso de vacunas vivas significa que la identificación de un clon como virus de ND de pájaros que mostraron indicios clínicos no confirma un diagnóstico de ND, de modo que debe valorarse asimismo la virulencia del clon.

[0008] Las cepas de NDV han sido clasificadas de diferentes maneras por diversos autores e instituciones. Una forma temprana de la clasificación estaba basada en su patogenicidad en la que las cepas fueron clasificadas en grupos velogénicos, mesogénicos, lentogénicos y avirulentes (Hanson y Brandly, 1955).

[0009] Varios ensayos potenciales in vitro para establecer la virulencia habitualmente relacionada con la base molecular de la patogenicidad están siendo investigados por varios grupos en el mundo. Actualmente, una valoración definitiva de la virulencia del virus suele estar basada en uno de los siguientes ensayos in vivo, si bien la definición actual de la OIE permite la valoración molecular de la virulencia.

1.

La relación de tamaño de la placa y la virulencia de las cepas de NDV fue publicada por G. M. Schloer y R.P. Hanson (J Virol. 1968; 2(1): 40-47). Schloer y Hanson encontraron que el tamaño de las placas del NDV estaba relacionado a la virulencia para pollos. Placas marcadamentel as grandes fueron producidas por las cepas velogénicas (alta virulencia) mientras que se encontraron placas pequeñas en las cepas mesogénicas (virulencia intermedia). Este método fue empleado en el pasado como método para clasificar las cepas NDV por medición del tamaño de placa.

2.

Tiempo medio de mortalidad en huevos. El MDT ha sido empleado para clasificar las cepas de virus ND en velogénicas (requiriendo menos de 60 horas para matar), mesogénicas (entre 60 y 90 horas para matar) así como lentogénicas (más de 90 horas para matar).

3.

�?ndice de patogencidad intracerebral (ICPI). Los virus más virulentos ofrecen índices que se acercan a la puntuación máxima de 2,0,mientras que las cepas lentogénicas facilitan valores cercanos a 0,0. Las cepas mesogénicas oscilan entre 0,7 y 1,5.

4.

�?ndice de patogenicidad intravenosa (IVPI). Las cepas lentogénicas y algunas cepas mesogénicas tendrán valores IVPI de 0, mientras que los índices para las cepas virulentas se acercan a 3,0.

5.

Base molecular de la patogenicidad. Durante la replicación, partículas de virus ND fueron producidas con una glucoproteína de precursor, F0, que debe ser escindida en F1 y F2 para las partículas de virus que sean infecciosas. Esta escisión post-traduccional es mediada por proteasas de la célula huésped. La tripsina es capa de escindir F0 para todas las cepas de virus ND. Parece que las moléculas de virus virulentos para pollos pueden ser escindidas por una proteasa huésped o proteasas encontradas en una extensa gama de células y tejidos, difundiéndose de este modo en el huésped entero, dañando los órganos vitales, si bien las moléculas F0 en los virus de una baja virulencia están restringidas en su sensibilidad a proteasas huésped resultante en la restricción de estos virus para crecer sólo en determinados tipos de célula huésped. La mayoría de los virus de ND que son patogénicos para pollos poseen la secuencia 112R/K-R-Q-K/R-R116 en el término C de la proteína F2 y F (fenilalanina) en el residuo 117, el término N de la proteína F 1, mientras que los virus de baja virulencia poseen secuencias en la misma región de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y L (leucina) en el residuo 117. Parece ser el requisito de por lo menos un par de aminoácidos básicos en los residuos 116 y 115 más una fenilalanina en el residuo 117 y un aminoácido básico (R) en 113 si el virus debe mostrar virulencia frente a pollos. A base de estos hallazgos moleculares, la clasificación veterinaria de los virus ND ya no está dividida en tres, sino más bien en dos grupos: patogénicos y apatogénicos.

[0010] Parece que la gran mayoría de aves son susceptibles a una infección con los virus de ND de virulencia tanto elevada como baja para pollos, si bien los indicios clínicos vistos en pájaros infectados con el virus ND varían enormemente y son dependientes de factores tales como: el virus, la especie huésped, la edad del huésped la infección con otros organismos, el estrés medioambiental y el estado inmunológico. En algunas circunstancias, la infección con los virus extremadamente virulentos puede resultar en una elevada mortalidad repentina con relativamente pocos indicios clínicos. Por lo tanto, los indicios clínicos son variables e influenciados por otros factores de modo que ninguna pueda considerarse como patognomónico.

[0011] La enfermedad de Newcastle se define como una infección de aves causada por un virus del paramixovirus aviar del serotipo 1 (APMV-1) que cumple uno de los siguientes criterios de virulencia:

A) El virus posee un índice de patogenicidad intercerebral (ICPI) en pollos de un día (Gallus gallus) de 0,7 ó mayor.

B) Los aminoácidos básicos múltiples han sido demostrados en el virus (bien directamente o bien por deducción) en el término C de la proteína F2 y la fenilalanina en el residuo 117, que es el término N de la proteína F1. El término "aminoácidos básicos múltiples" se refiere a por lo menos tres residuos de arginina o lisina entre los residuos 113 y 116. La falla de demostrar el patrón característico de los residuos de aminoácidos, tal como se describió arriba, supondría la caracterización del virus clonado por un ensayo IPCI. En esta definición, los residuos de aminoácidos son numerados desde el término N de la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia nucleotídica del gen F0, correspondiendo 113-116 a los residuos -4 a -1 del sitio de escisión.

[0012] Los análisis genéticos de cepas NDV clonados en los últimos 80 años han revelado la existencia de por lo menos 9 genotipos (y otros subtipos) que mostraron que no sólo asociaciones específicas de regiones y de especies de huésped sino también su distribución temporal eran aparentes (Lomniczi és Czeglédi, 2005). Se demostró que los genotipos temporales [II-IV y Herts'33(WE)] prevalentes antes de los años 1960 fueron sustituidos por grupos genéticos recientes (V-VIII) después de la introducción de la vacunación. Recientemente, sublinajes del genotipo VII del Lejano Oriente se han difundido a otras áreas geográficas, a saber a Europa (véase el árbol genealógico de las cepas conocidas del virus de NDV (fig. 31)). La sustitución de los genotipos parece ser un proceso evolucionario más bien que un suceso epidemiológico fortuito en la distribución de las cepas de NDV. La emergencia de genotipos virulentos novedosos no parece estar relacionada con la aplicación de la vacunación, mientras que las infecciones experimentales iluminan el proceso con el que la población de pollos inmunizada se convirtió en reservorio de los virus virulentos novedosos.

[0013] En cuanto a la ecología, existen en la naturaleza dos reservorios grandes de cepas de NDV. El reservorio primordial consiste en especies de aves acuáticas salvajes que albergan virus primitivos (apatogénicos), si bien, sorprendentemente, sólo dos linajes genéticos son conocidos en la naturaleza: clase I y genotipo I (perteneciente a la clase II). Contrariamente, el resto (genotipos II-VIII) abarcan cepas virulentas y se mantienen en los reservorios secundarios (artificiales) de pollos. Existe la hipótesis que las poblaciones de pollos fueron sembrados con virus apatogénicos y aparecieron cepas patogénicas en el pollo huésped. Antes del período de inmunización por lo menos dos colonizaciones independientes pueden haber tenido lugar (con los genotipos I y II).

[0014] El análisis genético de una muestra auténtica del primer clon europeo, Herts'33 (clonado en Inglaterra en 1933), revelaron que representaba un linaje temprano novedoso de gran divergencia. Contrariamente a una publicación de 1940 en Inglaterra en la que se informó sobre la derivación de la cepa H, una de las vacunas tempranas más exitosas, de Herts'33(W) por pasaje de huevo, el análisis genético excluyó toda relación entre éstos.

[0015] Los análisis genéticos de las cepas de NDV asimismo indicaron una estabilidad genética considerable de las cepas NDV, incluso después de un pasaje prolongado y repetido. La estabilidad genética es demostrada por la falta de recombinación viral en la naturaleza. Toyoda et al. analizaron las secuencias de los genes NH y F de cepas múltiples de NDV clonadas durante un período de 50 años. No hubo ningún intercambio de genes mediante recombinación en la generación de tres linajes. (Toyoda T., Newcastle disease virus evolution. II. Lack of gene recombination in generating virulent and avirulent strains. Virology 1969: 273-282, 1989).

[0016] El NDV suele considerarse como un virus aviar, si bien también es capaz de infectar al hombre. Si bien el NDV causa una enfermedad potencialmente fatal y no cancerosa (enfermedad de Newcastle) en aves, causa tan sólo una enfermedad ligera, manifestada con síntomas de una gripe discreta o conjuntivitis en humanos expuestos (históricamente observado sobre todo en trabajadores de laboratorio).

[0017] En 1971, una publicación científica en "The Lancet" por el Dr. Laszlo Csatáry describió historias clínicas del tratamiento de cáncer con una cepa no revelada del virus de la enfermedad de Newcastle (The Lancet, 1971, 7728, pág. 825). Después de esta publicación, el Dr. L. Csatáry y colaboradores publicaron varios informes científicos así como solicitudes de patente (v. abajo) basados en el trabajo científico con una cepa de virus designada como "MTH-68/H". Sin embargo, ninguna de estas referencias revelan la naturaleza exacta de la cepa del virus, por lo que ésta jamás fue disponible comercialmente ni tampoco depositada en ninguna biblioteca de virus, por lo que todas estas publicaciones no resultan suficientes para un especialista del ramo. Además, existen otros trabajadores científicos con composiciones de virus referidas como "MTH-68/H" de otros científicos que el Dr. L. Csátary. Sin embargo, no está claro si las composiciones de virus empleadas son idénticas a las que fueron descritas en la publicación susodicha en The Lancet.

[0018] La labor del Dr. Csatáry aparentemente ha estimulado la comunidad médica, publicándose otros trabajos como EP 696326 B1 (Wellstat Biologics Corporation) y otros, tal como se indica más abajo. Sin embargo, la labor científica revelada en ésta no puede ser reproducía por un experto en el ramo, dado que las cepas empleadas, tales como la cepa 73-T o MK-107, igualmente no están disponibles para el público.

[0019] Surgió un interés considerable relativo al potencial de uso del NDV en la terapia del cáncer dado que el NDV ha mostrado poseer propiedades selectivas para matar células en muchos tipos de células cancerosas sin afectar las células normales no neoplásicas. Un informe indicando que el NDV podría ser provechoso como tratamiento canceroso fue publicado a principios de los años 1960. Desde entonces, se ha informado sobre varios estudios.

[0020] Muchas cepas de NDV han mostrado ser citotóxicas para las células cancerosas. Algunas cepas son capaces de replicar y destruir células cancerosas mientras que a la vez no afectan las células normales. Estas cepas han sido calificadas como oncolíticas. Diferentes cepas demostraron niveles diferentes de propiedades de daño de células cancerosas, mientras que diferentes tipos de células cancerosas muestran sensibilidad a diferentes tipos de cepas del NDV. Estas propiedades definen la potencia oncolítica de una cepa. Se considera que la potencia oncolítica posee una correlación clínica a los requisitos de dosificación terapéutica. En condiciones experimentales, cuanto más oncolíticamente potente sea una cepa para un tipo de célula cancerosa, tanto más bajos los múltiplos de partículas virales infecciosas (MOI) por célula requeridas para poder observar un efecto citolítico. La implicación clínica es una necesidad de dosis virales más bajas para lograr un efecto terapéutico. Mientras que no se ha observado que el NDV cause una enfermedad significativa en el hombre (a dosis terapéuticas muy elevadas administradas parenteralmente, tal como en algunas pruebas clínicas), se ha apreciado que es potencialmente capaz de causar efectos colaterales de hipotensión y fiebre elevada, surgiendo la necesidad de encontrar técnicas alternativas de dosificación para desensibilizar al paciente antes de administrar dosis elevadas (v. WO 00/62735).

[0021] Por lo tanto es un objeto del invento ofrecer un nuevo clon del NDV que es oncolítico y que acusa propiedades optimizadas en comparación con las cepas existentes.

[0022] Se ha averiguado que un nuevo clon del NDV conforme a la reivindicación 1 es especialmente beneficioso en la terapia del cáncer con propiedades desconocidas para especialistas del ramo.

[0023] Esta cepa especialmente beneficiosa del NDV para la terapia del cáncer se refiere como "MTH-68H/VB", dado que estudios revelaron que este clon del NDV puede ser exitoso en la destrucción de tumores cuando otras terapias del cáncer, incluyendo otras cepas del NDV y sus formulaciones, han fracasado. Su elevada potencia inherente permite al MTH-68/H-VB ser posiblemente administrado en dosis efectivas más bajas, con lo que es aplicarlo utilizando formas menos invasivas y no intravenosas de administración. El MTH-68/H-VB ha mostrado poseer un efecto pronunciadamente sinergético frente a otros modos de la terapia del cáncer, especialmente la terapia de radiación, mientras que parece poseer un efecto citotóxico sobre las células normales, con lo que se convierte en un candidato ideal no sólo como forma exclusiva de una terapia del cáncer, sino también como oncoterapia a ser empleada como complemento a otras terapias más tradicionales.

Descripción breve del invento

[0024] Sorprendentemente se ha averiguado que un clon de la enfermedad del virus de Newcastle conforme a la reivindicación 1 que es insensible a la interferona y posee un ICPI entre 1,2 y 2,0 (preferiblemente entre 1,2 y 1,5) muestra propiedades oncolíticas superiores en comparación con cepas anteriores.

[0025] Especialmente se ha averiguado que un clon del virus de la enfermedad de Newcastle que abarca la secuencia de nucleótido de ADN de Seq. ID. No. 1 es un ejemplo de tal clon de un virus de la enfermedad de Newcastle. Asimismo se ha averiguado que el virus depositado con la European Collectio nof Cell Cultures como Accesión Número 06112101 es un ejemplo de tal clon del virus de la enfermedad de Newcastle.

[0026] El término clon aquí empleado se refiere a virus que son genéticamente homogéneos dado que se ha comprobado que composiciones previas de virus empleadas en el arte son genéticamente heterogéneas.

[0027] Sorprendentemente, un clon nuevo especial del NDV llamado MTH-68/H-VB, ha mostrado poseer propiedades oncolíticas superiores. El nuevo clon del NDV se caracteriza

(a)

por su nucleótido y sus secuencias previstas de aminoácidos en el gen de proteína de fusión (F). Secuencia de proteína en el término C de la proteína F2 y el término N de la proteína F1. Los residuos de aminoácidos son numerados del término N de la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del gen F0, correspondiendo 113-116 a los residuos -4 a -1 del lugar de escisión

(b)

por su tamaño de placa, forma y aspecto

(c)

por el IPCI del clon

(d)

por su capacidad de inducción singular y significativa de interferona

(e)

por su insensibilidad singular a la interferona y

(f)

por su capacidad de destruir células tumorales bajo diferentes condiciones

(g)

por sus interesantes propiedades de reducir el dolor en el cáncer

(h)

por su efecto potenciador sinergético y fuerte sobre otros modos del tratamiento del cáncer; incluyendo quimioterapia y terapia de radiación

(i)

por su capacidad de reducir los graves efectos colaterales del a quimioterapia y de la terapia de radiación, facilitando con ello la aplicación de otros tratamientos onco-terapéuticos tradicionales

(j)

por la secuencia nucleotídica completa revelada en Seq. ID. No. 1 (Anexo)

(k)

por el cultivo clonado depositado el 21 de noviembre de 2006 con el European Collection of Cell Cultures como Número de Accesión 06112101.

Descripción detallada del invento

[0028] El clon del NDV conforme al invento puede describirse como sigue:

1. Descripción del nuevo clon mediante caracterización del genoma de la cape de virus MTH-68H/VB por

secuenciado.

[0029] El genoma fue aumentado en cinco porciones solapantes. Tres iniciadores específicos de secuencias fueron empleados para RT y tres pares de iniciadores para el aumento de las regiones interiores abarcando el 94% del genoma aumentado en cinco porciones solapantes.

[0030] La secuencia genómica del RNA de MTH-68/VB consiste en 15186 nt. Los extremos 3' y 5' del genoma abarcan regiones leader y tráiler. La secuencia leader tiene un lago de 55 nt, mientras que la secuencia tráiler posee un largo de 113 nt en MTH-68/VB. Las cepas de NDV poseen por lo general una región tráiler de 114 nt.

[0031] El genoma ANR de cadena negativa del MTV-68/VB contiene seis genes que codifican seis proteínas estructurales principales en dirección 3' � 5' (3'NP-P-M-F-HN-L 5') y dos proteínas adicionales no estructurales (V y W). Las proteínas estructurales son NP: 489 aa (aminoácidos), P: 395 aa, M: 364 aa, F: 553 aa, HN: 571 aa, L: 2204 aa en longitud, respectivamente.

[0032] Durante la transcripción uno o dos residuos G no templados pueden ser insertados en el sitio de edición transcripcional conservado (UUUUUCCC) dentro del gen P, produciendo dos ORFs alternativos. La fosfoproteína, V (+1 marco) y W (+2 marco) comparten el amino-terminal y varían en sus extremos carboxi en cuanto a longitud y composición de aminoácidos [Steward et al. 1993]. La secuencia del sitio de edición transcripcional de MTH-68/VB es 2281 UUUUUCCC2288. El ORF de la proteína V tiene una longitud de 717 nt desde la posición nt 1888 a 2607 de la secuencia ARN genómica y codifica una proteína de 239 aa residuos en la cepa MTH-68/VB. El ORF de la proteína W tiene una longitud de 681 nt desde la posición nt 1888 a 2571 de la secuencia ARN genómica y codifica una proteína de 227 aa de longitud.

[0033] La longitud de las regiones intergénicas de MTH-68/VB oscila entre 1 a 47. Las uniones NP-P, P-M y M-F son sólo un nt, consistiendo la secuencia intergénica entre los genes F-NH en 31 nt, mientras que la unión HN-L posee un largo de 47 nt.

[0034] Los detalles de los genes y los marcos de lectura abierta se resumen en las figuras 32 y 33 y trazan el ARN genómico completo de MTH-68/VB se describe en la lista de secuencias adjunta (Seq. ID 1) como copia impresa así como en portador de datos en formato ST.25.

[0035] Un objeto del invento es, por lo tanto, un clon del virus de la enfermedad de Newcastle que abarca la secuencia de nucleótido de Seq. ID. No. 1.

2. Descripción de la virulencia y patogenicidad del nuevo clon mediante determinación de su secuencia prevista de aminoácidos y nucleótido en el gen de proteína de fusión (F)

[0036] El nuevo clon MTH-68H/VB ha sido caracterizado por sus secuencias de nucleótidos y aminoácidos previstos en el gen de proteína de fusión (F), la secuencia de proteína en el término C de la proteína F2 y el término N de la proteína F1.

Los residuos de aminoácidos son numerados desde el término N de la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del gen F0. 113-116 corresponde a los residuos -4 a -1 del sitio de escisión.

[0037] Durante la replicación, las partículas de virus ND son producidas con una glucoproteína de precursos, F0, que debe ser escindido a F1 y F2 para que las partículas de virus sean infecciosas. Esta escisión postraduccional es mediada por proteasis de células huésped. La tripsina es capaz de escindir F0 para todas las cepas del virus ND.

[0038] Parece que las moléculas F0 de los virus virulentos (para pollos) pueden ser escindidos por una proteasis de huésped o proteasis encontrados en una extensa gama de células y tejidos, difundiéndose a través del huésped dañando los órganos vitales, si bien las moléculas F0 en los virus de baja virulencia son restringidas en su susceptibilidad a la escisión para determinadas proteasas huésped resultante en la restricción de estos virus al crecimiento sólo en determinados tipos de células huésped.

[0039] La mayoría de los virus ND que son virulentos (patogénicos para pollos) poseen la secuencia 112R/K-R-Q-K/R-R116 en el término C de la proteína F2 y F (fenilalanina) en el residuo 117, el término N de la proteína F 1, mientras que los virus de baja virulencia poseen secuencias en la misma región de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y L (leucina) en el residuo

117. Así es como parece existir la necesidad de al menos un par de aminoácidos básicos en los residuos 116 y 115 más una fenilalanina en el residuo 117 y un aminoácido básico (R) en 113 si el virus es considerado como velogénico (mostrando virulencia para pollos; OIE Manual)].

[0040] Basada en la secuencia parcial del gen de fusión (F) entre las posiciones de nucleótido 47 y 420, la cepa MTH-68/VB posee una secuencia virulenta del sitio de escisión proteolítica debido al motivo dibásico y un F aa en la posición 117 (ver en rojo). La escisión tiene lugar entre 116 y 117 aminoácidos.

[0041] Por lo tanto es un objeto del invento obtener un clon del virus de la enfermedad de Newcastle que posee una secuencia virulenta del sitio de escisión proteolítica con un motivo dibásico y un F aa en la posición 117. Especialmente es objeto del invento aportar un virus de la enfermedad de Newcastle que posee una secuencia con al menos un par de aminoácidos básicos en los residuos 116 y 115 más una fenilalanina en el residuo 117 y un aminoácido básico en 113.

Figura 1. Secuencia del gen F

R R Q R R F I G secuencia aa

AGG AGA CAG AGA CGC TTT ATA GGT secuencia nt

3. Descripción de la virulencia y de la patogenicidad del nuevo clon mediante determinación de su forma y tamaño de placa por el ensayo descrito por Schloer y Hanson (Journal of Virology, 2 (1968), pág. 40-47).

[0042] Los autores de esta publicación creyeron en 1968 que la capacidad del virus de la enfermedad de Newcastle para producir placas grandes estaba relacionada con su virulencia en pollos. Compararon el tamaño de las placas bajo condiciones estándares en monocapas de células fibroblásticas de embrión de pollo. Fueron producidas placas claramente más grandes por las cepas velogénicas (de elevada virulencia). Sólo placas pequeñas fueron creadas por las cepas mesogénicas (virulencia intermedia), mientras que apenas si se encontraron placas en las cepas lentogénicas (baja virulencia).

[0043] Sin embargo, este ensayo jamás fue aceptado en la comunidad científica como criterio para la descripción de cepas de virus del NDV. Aparte de otros parámetros medidos asimismo estudiamos la capacidad formadora de placas de nuestro nuevo clon del NDV.

[0044] Los cultivos monocapa de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) utilizados para el ensayo de placas fueron preparados de embriones de pollos SPF de 10 días de edad. Las monocapas de células fueron crecidsa en placas Petri (Anumbra) de 5 cm de diámetro (3,5 x 106 células por placa) y fueron infectadas por el virus del clon propagado en embriones de pollo SPF. La formación de placas en el cultivo CEF por la cepa MTH-68HNB se muestra en la figura 2. Las placas formadas dentro de 48 a 72 horas por las cepas del con fueron consideradas como "placas grandes". Las placas de la cepa fueron circulares y estaban claramente definidas. Las placas aparecieron primero 36 o 48 horas después de la infección y midieron entre 2,5 y 4,9 mm el quinto día después de la inoculación. Bajo el microscopio, sus límites no estaban claramente definidos. Conforme a los resultados del ensayo específico descrito por Schloer y Hanson, el nuevo clon puede ser considerado como NDV velogénico y no sería considerado como cepa mesogénica.

4. Descripción del origen del nuevo clon y de la diferencia entre el nuevo clon y el material de virus matriz.

[0045] La cepa matriz del MTH-68HNB fue la "antigua" cepa de vacuna de pollo NDV originaria de Gran Bretaña (en los años 1940) que ofrecía una heterogeneidad llamativa. Para aumentar la homogeneidad del producto y eliminar cualquier partícula defectuosa, se practicaron repetidas veces pasos de purificación. La purificación de placas es una técnica comúnmente empleada por los especialistas para obtener un clon de virus clonal que conserva las características deseadas tipificadas por el tamaño y la forma de la placa y su aspecto (p. ej. Massaab et al, en Plotkin and Mortimer, ed. Vaccines, Philadelphia: WB Saunders Co., 1994, pág. 78-801). La primera purificación parcial resultó en una población de virus ostensiblemente homogénea. Durante la propagación en CEF, las placas formadas por el material "purificado" de virus aún mostraron una variabilidad enorme (figura 3). Desde esta población de virus propagada en cultivo de tejido de monocapa de fibroblasto de pollo se eligió una placa que ofrecía las características deseadas entre varias placas, separándole y propagándose ésta ulteriormente. Más tarde, esta población homogénea de virus fue nuevamente propagada en CEF y se sometió otra vez a una purificación de placa en la que se eligió otra placa individual (tercer aislamiento) basada en su tamaño y el aspecto, efectuándose la propagación en embriones de pollo SPF. Después de un estricto control de calidad, la suspensión cosechada de virus fue empleada para la producción de una nueva inoculación maestra del MTH-68H/VB.

5. Descripción de la virulencia y patogenicidad del nuevo clon mediante determinación de su índice de patogenicidad intracerebral (ICPI)

[0046] Los virus de la enfermedad de Newcastle se dividen en tres patotipos diferentes, caracterizados por el índice de patogenicidad intracerebral [ICPI).

[0047] Las cepas lentogénicas (de baja virulencia) poseen un ICPI de 0-0,7. Las cepas mesogénicas son NDVs de patogenicidad moderada (ICPI 0,7- 1,5) y las cepas velogénicas (muy patogénicas) son caracterizadas por un ICPI > 1,5. El ICPI máximo es 2,0.

[0048] El ICPI es determinado por la inyección intercerebral de 50 μl de una dilución de virus (título de hemaglutinación (HA) de por lo menos 24) en pollos de un día. Los animales fueron observados durante 8 días, siendo valorados una vez por día (sano = 0, enfermo = 1, muerto = 2). El ICPI es calculado dividiendo la suma por el número de evaluaciones.

[0049] Se ha encontrado que un virus de la enfermedad de Newcastle con un ICPI entre 1,2 y 2,0, preferiblemente entre 1,2 y 1,5 posee propiedades oncolíticas mejoradas, especialmente al ser insensible a la interferona (v. más abajo).

[0050] Con la técnica clásica, se registró un ICPI de MTH-68/H-VB entre 1,2 y 1,5, tendiendo hacia una virulencia incrementada.

6. Descripción de la capacidad de inducción de interferona del clon

[0051] Las interferonas (IFNs) son proteínas señalizadoras naturales de células producidas por las células del sistema inmunológico de la mayoría de los vertebrados como reacción a retos como virus, parásitos y células tumorales. Las interferonas son producidas por una amplia variedad de células como reacción a la presencia del ARN bicatenario, un indicador clave de la infección viral. La producción de interferona ha sido estimulada por una variedad de virus que contie3nen ARN y ADN, incluyendo aquellos con propiedades oncogénicas, tales como polioma y el virus Rous sarcoma.

[0052] Para investigar la inducción de interferona de diferentes cepas de NDV (mostradas en la figura 4) se emplearon tres sistemas.

[0053] El contenido viral de los cultivos de embrión de pollo (cavidad alantoidea) o fibroblasto de embrión de pollo (CEF) fue inactivado por calor (65°C durante 30 minutos), siendo los cultivos ensayados en cuanto a la presencia de interferona por medio de un ensayo basado en la reducción del efecto citopático de un virus de desafío (Sindbis).

[0054] En la línea celular humana y del cerdo, la inducción de interferona fue medida con la misma técnica (descrita por Falcoff et al. 1966), si bien para el ensayo basado en la reducción del efecto citopático de un virus de desafío (Sindbis), se empleó la línea celular de amnión (humana) y PK-15 (cerdo).

[0055] Sobre la base de nuestros datos, hemos podido concluir que todas las cepas de virus inactivadas eran capaces de inducir producción de interferona a gran escala. La producción de interferona más pronunciada fue apreciada en la línea celular PK-15 (riñón de cerdo) y en el humano (membrana amniótica) (fig. 5). Estos resultados sugieren que la inducción de interferona por NDV involucra componentes del virión.

[0056] La inducción de interferona del nuevo clon MTH-68H/VB fue significativamente mayor y más consecuente en todos los sistemas ensayados, lo que incluía varias cepas diferentes del NDV de virulencia variable, utilizando varias líneas celulares diferentes bajo diferentes condiciones.

[0057] Es un objeto del invento suministrar un clon del virus del NDV que induce significativamente la interferona en las células. Debido a este comportamiento, el clon del NDV puede ser empleado con éxito para tratar las enfermedades que han mostrado a ser sensibles a la interferona, tales como melanoma, linfomas (non-Hodgkins), leucemias (leucemia mieloide crónica, leucemia de células pilosas), cáncer de mama, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renal, cáncer de cabeza y nuca, tumores carcinoides, cánceres del conducto biliar, cáncer pancreático, mieloma múltiple, sarcoma Kaposi, así como condiciones virales y autoinmunológicas sensibles a interferona y no neoplásicas, tales como esclerosis múltiple, condylomata acuminata, hepatitis,herpes, artritis reumática, enfermedad de Behcet, enfermedad pulmonar idiopática, estomatitis aftosa, osteoporosis maligna grave, cáncer cervical o SARS (grave síndrome respiratorio agudo).

[0058] Dado que las propiedades oncolíticas y significativas inductoras de interferona de los clones NDV conforme al invento (especialmente MTH-68/HVB), podría tratarse de un candidato ideal a ser empleado como parte de una terapia del tipo de vacuna del cáncer, donde se combina con células tumorales autólogas del paciente y se usan en combinación con otros factores moduladores de la inmunidad como parte de una oncoterapia inmunológica específica.

7. Descripción de la falta de sensibilidad singular del clon a interferona

[0059] Es bien sabido que la mayoría de los virus incluyendo la mayoría de las cepas NDV son sensibles a la interferona ß [IFNß]. La IFBß inhibe la replicación del NDV sensible a la interferona en células sensibles. Es de esperar que el efecto citotóxico de las cepas de NDV sensibles a la interferona disminuye al aumentar la concentración de IFNß.

[0060] Investigamos si el clon MTH-68HNB es sensible a la interferona ß y si la presencia de la interferona ß es capaz de modificar la replicación del virus en varias líneas celulares que son sensibles a la infección de MTH-68HNB.

[0061] En el primer juego de experimentos, las líneas celulares HEK293 sensibles a MTH-68HNB fueron infectadas a varias multiplicidades de infección (MOI, virus/células) con MTH-68HNB en presencia de diferentes concentraciones de IFNß.

[0062] En el segundo juego de experimentos, células fibroblásticas humanas primarias resistentes a MTH-68HNB fueron tratadas con diferentes concentraciones del virus en presencia de un anti-IFNß. Bajo estas condiciones, el efecto citotóxico de MTH-68HNB debería haber aumentado si IFNß influenciara la replicación viral.

[0063] Durante los estudios, se empleó la línea celular HEK293 (riñón embriónico humano transformado con adenovirus del tipo 5) y la línea celular F11 (fibroblasto humano primario). Ambas líneas celulares fueron cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco conteniendo antibióticos (penicilina, estreptomicina y anfotericina B) así como suero fetal de ternera (10% y 20% para células HEK293 y F11, respectivamente), 2x103 células fueron tratadas en discos de cultivo de 96 cavidades en 100 μl de volumen final. Veinticuatro horas después las células fueron infectadas con MTH-68HNB a diferente multiplicidad de la infección (MOI). Las células fueron asimismo tratadas bien con IFNß (sistemas R y D) o bien con un anticuerpo contra IFNß (sistemas R y D). Setenta y dos horas después de la infección del NVD, 20 μl de reactivo WST-1 (Roche) fueron agregados y la citotoxicidad fue ensayada 2 horas después por medición de los valores OD490 con un fotómetro de cavidades múltiples.

Exp. A. Las células HEK293 fueron plateadas el día 0. Las células fueron tratadas con 20, 200 o 2000

U/ml IFNß el día 0, 1, 2 y 3. La infección con MTH-68H/VB fue efectuada el día 1 a 0,001 o 0,01 MOI. La citotoxicidad fue medida el día 4.

Exp. B. Las condiciones experimentales eran similares al Exp. A, con excepción de que las células

fueron infectadas a 0,01 y 0,1 MOI.

Exp. C. Las células F11 fueron plateadas el día 0. Las células fueron tratadas con 2, 10, 20 μg/ml anti-

IFNß el día 0, 1, 2 y 3. La infección con MTH-68H/VB fue efectuada el día 1 a 0,001 o 0,01 MOI.

La citotoxicidad fue medida el día 4.

Exp. D. Las condiciones experimentales eran similares al Exp. C, con excepción de que las células

fueron infectadas a 1 o 10 MOI. La concentración final de anti-IFNß fue 2 y 15 μg/ml.

[0064] Efecto del tratamiento con IFNß en el efecto citotóxico de MTH-68HNB: cuando los resultados fueron analizados se concluyó que

•

IFNß no afecta la proliferación celular (figura 6 y 7).

•

IFNß no inhibe el efecto citotóxico de MTH-68HNB

El efecto de IFNß en la citotoxicidad de MTB-68HNB fue investigada en células HEK293 empleando dos replicaciones del estudio (Exp. A y B). En ambos estudios, el MTH-68HNB era citotóxico para las células HEK 293 a una MOI baja (menos de 1 MOI), mostrando que MTH-68HNB es capaz de replicar en esta línea celular (figuras 8 y 9, columnas 1-3). Como conclusión final comprobamos que IFNß no inhibe el efecto citotóxico de MTH-68HNB, ni siquiera a concentraciones muy elevadas de IFNß (figura 9, columnas 4-12).

[0065] Por lo tanto, fue un objeto del invento ofrecer un clon de virus del NDV que no sea sensible a las interferonas, especialmente la interferona ß. Se supone que la falta de sensibilidad a la interferona parece suponer que la proliferación celular no cambia en presencia de la interferona en comparación con la ausencia de la interferona.

El efecto del tratamiento con anticuerpos de IFNß en la citotoxicidad del MTH-68H/VB en células fibroblásticas humanas primarias

[0066] Luego analizamos el efecto de un anticuerpo obtenido a la IFNß sobre el efecto citotóxico del MTH-68HNB en células de fibroblasto humano primarias F11. Los anti-IFNß no afectaron la proliferación de las células F11 en dos experimentos independientes (experimentos C y D, fig. 10 y 11). Utilizando dos muestras diferentes de MTH-68HNB no pudimos detectar un efecto citotóxico en las células fibroblásticas (figura 12 y 13, columnas 1-3). Ni las concentraciones bajas ni tampoco las concentraciones altas de tratamientos anti-IFNß eran capaces de aumentar el efecto citotóxico de MTH-68H/VB (figura 12, columnas 4-12; y figura 13, columnas 4-9).

[0067] Hubo indicios de que el efecto citotóxico del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se basa en la producción de interferona de las líneas celulares. Conforme a esta sugerencia, las células (por lo general células normales) capaces de mostraron una fuera reacción de interferona son resistentes a la infección con NDV, mientras que las células tumorales que perdieron su reacción a IFN son sensibles al efecto citotóxico del NDV. Si esta hipótesis fuera correcta, la adición de IFNß a las células tumorales restablecerá su resistencia contra el NDV. Por otro lado, la eliminación del IFNß de la vecindad o del medio de cultivo de células normales (fibroblastos, por ejemplo) aumentará su sensibilidad a la infección del NDV. Nuestros datos contradicen esta hipótesis, al menos en caso del MTH-68HNB, en los modelos experimentales descritos.

[0068] El tratamiento con IFNß de células HEK293 sensibles al MTH-68HNB no mejoró su resistencia frente a la infección con MTH-68HNB. Además, la eliminación del IFNß del medio de cultivo de células de fibroblasto humano primario mediante el tratamiento de anticuerpo no aumentó su sensibilidad al MTH-68HNB. Nuestros datos demuestran que el efecto citotóxico del MTH-68HNB no dependía de la producción de interferona de las células infectadas.

8. Estudios comparativos del efecto citotóxico de MTH-68NB y de otras cepas NDV en varias líneas celulares de crecimiento in vitro (incluyendo líneas celulares de tumores cerebrales humanas y de roedores así como células fibroblásticas humanas primarias normales)

8.1 Replicación de MTH-68/H-VB en diferentes líneas celulares 8.1.1 El efecto citotóxico de MTH-68HNB fue estudiado bajo condiciones in vitro en diferentes líneas celulares establecidas y primarias utilizando suero fetal de ternera del 20 %.

[0069] En este estudio se emplearon las siguientes líneas de células:

-

293N3S - riñón embriónico humano transformado con adenovirus del tipo 5, adaptado a crecer en cultivo de suspensión (comprado a ATCC)

-HeLa - líneas celular epitelial humana obtenidas de un tumor cervical (compradas a ATCC)

-

9L - líneas celulares de glioma establecida de rata (compradas a ECACC)

-

línea celular fibroblástica humana H-primaria (obtenida de biopsia de la piel)

-

línea celular fibroblástica humana V-primaria (obtenida de biopsia de la piel)

-

línea celular fibroblástica humana A-primaria (obtenida de biopsia de la piel)

[0070] Las células fueron crecidas en presencia de suero fetal de ternera al 20%, lo que representa la concentración óptima del suero para las células de fibroblasto humano primario. A esta elevada concentración del suero, MTH-68H/VB no tuvo ningún efecto citotóxico en los fibroblastos humanos normales. Tuvo un efecto sólo moderado en las células de glioma de rata (9L) (fig. 8 aprox. 50% de tasa de supervivencia a 50 MOI). Contrariamente a ello, las células 293N3S y HeLa eran muy sensibles al tratamiento de MTH-68H/VB. Incluso después de una infección a un MOI muy bajo (0,005), todas las células fueron matadas por el virus.

[0071] Los ensayos de citotoxicidad sugirieron que MTH-68/H-VB fue capaz de replicar en células 293N3S y células HeLa, si bien no se formaron partículas virales formadas en el curso de otras líneas celulares investigadas.

8.1.2 El efecto citotóxico de MTH-68H/VB en diferentes líneas celulares bajo condiciones in vitro empleando suero de ternera fetal al 10%.

[0072] Para estudiar ulteriormente las potenciales replicaciones virales, se emplearon las siguientes líneas celulares:

-

riñón embrionario humano 293 transformado con el adenovirus tipo 5 (comprado a ATCC)

-

HeLa líneas celulares epitelial humana establecida de un tumor cervical (comprado a ATCC)

-

línea celular fibroblástica humana H-primaria (establecida en nuestro laboratorio por la biopsia de

la piel)

-

961107 células de mingeoma fibromatoso humano primario obtenidas en NINS

-

960612 células de mingeoma fibromatoso humano primario obtenidas en NINS

-

980128/2 células multiformes de glioblastoma humano primario obtenidas en NINS

[0073] 5x103 células fuero plateadas en platos de cultivo de 96 cavidades en 100 μl de volumen final. Veinticuatro horas después, las células fueron infectadas con el virus correspondiente a diferente multiplicidad de infección (MOI, relación virus/célula: 0; 0,01; 0,1; 1; 10; 100) mediante adición de 50 μl de medio completo que contenía el virus. Setenta y dos horas después, 15 μl de WST-1 (Roche) fueron agregados y se ensayó la citotoxicidad 1 hora más tarde por medición de valores OD450 con un fotómetro de cavidades múltiples. Los valores OD450 fueron convertidos en tasas de supervivencia (%).

[0074] Es bien sabido que las elevadas concentraciones séricas podrían inhibir la infectividad de determinados virus (por ejemplo del adenovirus). Por lo tanto, en estos experimentos sólo el 10% de suero de ternera fetal fue agregado al medio de cultivo celular. Esta concentración de suero es óptima para todas las líneas celulares, con excepción de los fibroblastos primarios, si bien células de fibroblastos humanos primarios son asimismo capaces de crecer en este medio. En presencia de MTH-68HNB sérica al 10%, un MOI elevado (10 y 100) fue tóxico para todas las células, si bien ligeramente para las células de fibroblasto humano primario (H-fibroblastos, fig. 15). Las diferentes líneas celulares de tumor cerebral primario humano (980128/2, 960612 y 961107) mostraron una sensibilidad mucho mayor a MTH-68H/VG que los fibroblastos primarios.

[0075] Aparte de las líneas celulares del tumor cerebral y de fibroblastos, asimismo ensayamos la sensibilidad de las células HeLa al tratamiento con MTH-68HNB. Las células HeLa eran casi tan sensibles como las células 293, sugiriendo que el virus puede replicar asimismo en estas células.

8.2 Citotoxicidad de MTH-68/H-VB y otras cepas NDV en diferentes líneas celulares

[0076] En este estudio comparativo, la citotoxicidad de diferentes cepas de NDV fueron comparadas con la citotoxicidad de MTH-68H/VB. En el estudio, las cepas NDV eran

-

H/W - la línea Weybridge de la cepa Hertfordshire

-

Mukteswar (cepa "mesogénica" de Veterinarski Zavod, Subotica)

-LaSota - la cepa de vacuna estándar de aves

-VP - la cepa de vacuna estándar "avirulenta"

[0077] La citotoxicidad fue estudiada en las líneas celulares 293, HeLa y H-fibroblasto.

-

riñón embrionario humano -293 transformado con adenovirus del tipo 5 (comprada a ATCC)

-HeLa - línea celular epitelial humana obtenida de un tumor cervical (comprada a ATCC)

-

línea celular fibroblástica humana H-primaria (obtenida de nuestro laboratorio de una biopsia de piel)

[0078] Para el ensayo se platearon 5x103 células en platos de cultivo de 96 cavidades en un volumen final de 100 μl. Veinticuatro horas más tarde las células fueron infectadas con el virus correspondiente a una multiplicidad diferente de la infección (MOI, relación virus/célula: 0; 0,01; 0,1; 1; 10; 100) mediante adición de 50 μl de medio completo conteniendo el virus. Setenta y dos horas más tarde, 15 μl de WST-1 (Roche) fue agregada, ensayándose la citotoxicidad 1 horas más tarde por medición de los valores OD450 con un fotómetro de cavidades múltiples. Los valores OD450 fueron convertidos en tasas de supervivencia (%).

8.2.1 Estudio comparativo en línea celular de fibroblasto humano H-primario.

[0079] En estos experimentos, se agregó suero fetal de ternera al 10% al medio de cultivo celular. Esta concentración sérica es óptima para todas las líneas celulares, con excepción de los fibroblastos primarios, si bien las células de fibroblasto humano primario son asimismo capaces de crecer en este medio. En presencia de suero al 10%, MTH68H/VB era ligeramente tóxico para la célula fibroblástica, si bien sólo a un MOI muy alto (10 y 100, fig. 16).

[0080] El efecto más pronunciado fue apreciado en las células tratadas con MTH-68H/VB y efectos menores, pero aún apreciables fueron provocados por cepas de H/W mientras que los demás no tenían efecto alguno.

[0081] Puede concluirse que bajo condiciones normales, a saber a no ser que se aplica a múltiplos muy elevados de infección, las cepas de NDV estudiadas no son citotóxicas para células humanas normales.

8.2.2 Estudio comparativo en la línea celular HeLa (líneas celular epitelial humana obtenida de un tumor cervical)

[0082] En estos experimentos, asimismo se agregó suero fetal de ternera al 10% al medio de cultivo celular. Esta concentración de suero es óptima para todas las líneas celulares. En presencia de suero al 10%, MTH-68H/VB era altamente tóxico para las células HeLa en un MOI muy bajo (figura 11). El efecto citotóxico de MTH-68H/VB era significativamente más alto que el de cualquier otro virus estudiado especialmente a un valor MOI bajo (0,01 y 0,1).

[0083] La sensibilidad de las células HeLa sugiere que sólo algunas de las cepas del virus ND pueden replicar en estas células. Entre las cepas estudiadas, MTH-68H/VB es la más efectiva.

8.2.3 Estudio comparativo en la línea celular 293 (riñón embrionario humano transformado en el tipo 5 de adenovirus)

[0084] Similarmente al experimento anterior y en presencia de suero al 10%, MTH-68H/VB era altamente tóxico para las células 293, incluso a un valor MOI muy bajo (fig. 12). El efecto citotóxico de MTH-68H/VB era significativamente más alto que cualquier otro virus estudiado a un valor MOI bajo (0,01 y 0,1).

[0085] La sensibilidad de las células 293 sugiere que sólo algunas de las cepas del virus ND son capaces de replicar en estas células. Entre las cepas estudiadas, la MTH-68H/VB es la más efectiva.

8.3. El efecto citotóxico y la replicación potencial de la cepa MTH-68H/VB en diferentes líneas celulares de origen tumoral humano.

Líneas celulares

[0086]

Tumores cerebrales:

HTB-186 (Daoy) meduloblastoma cerebelar, niño de 4 años

CCL-127 (IMR-32) neuroblastoma cerebral. Esta línea celular es sensible a herpes, coxsackie y

virus de vaccinia, niño de 13 meses

CRL-2142 (SK-N-FI) neuroblastoma, niño de 11 años Sarcoma Kaposi

CRL-2230 (BC-1) linfocitos, linfoma; contiene EBV y KSHV Tumores cervicales

CRL-1594 (C-41) tumor cervical epitelial, contiene y expresa HPV-18

HTB-32 (HT-3) cérvix epitelial que proviene clonado de metástasis de nódulo linfático, HPV negativo, p53+, Rb+ Tumor ovárico

OVCAR, carcinoma ovárico Riñón embrionario

293 - células de riñón embrionario humano transformado con adenovirus del tipo 5 Ensayo de citotoxicidad [0087] 5x103 células fuero plateadas en placas de cultivo de 96 cavidades en un volumen final de 100 μl. Un día

después, las células fueron transducidas con MTH-68/H-VB a diferentes multiplicidades de la infección (MOI) (100/1;

10/1; 1/1; 1/10 y 1/100). El efecto citotóxico fue ensayado 72 horas después con kit WST-1 de Roche. [0088] El efecto citotóxico de MTH-68HNB fue estudiado bajo condiciones in vitro en diferentes líneas celulares primarias y establecidas. Las células 293 fueron empleadas como control positivo dado que se había establecido que MTH-68HNB replica en estas células. MTH-68HNB era citotóxico en células BC-1 (linfoma) y HT-3 (tumor cervical). La citotoxicidad era muy similar a la observada en las células 293 (figura 19). El virus era muy tóxico incluso a una baja multiplicidad de la infección para estas células.

[0089] Se observó un efecto citotóxico pronunciado en células DAOY (meduloblastoma), IMR-32 (neuroblastoma), SK-N-FI (neuroblastoma) (fig. 20). Se detectó una toxicidad menor, pero aún considerable en las células OVCAR (tumor ovárico) (fig. 21). Las células del tumor cervical C-41 fueron matadas por MTH-68/H-VB sólo a una elevada multiplicidad de la infección (figura 22).

[0090] MTH-68HNB mató eficazmente las células BC-1, HT-3, DAOY, IMR-32, SK-N-FI y OVCAR incluso a una baja multiplicidad de la infección. Se apreció un efecto similar en las células 293. Antes habíamos probado que en 293 células pudo explicarse la elevada toxicidad de MTH-68HNB con la replicación del virus. Estos datos sugieren, por lo tanto, que MTH-68HNB puede replicar eficazmente en células BC-1, HT-3, DAOY, IMR-32, SK-N-FI y OVCAR. En las células C-41, la citotoxicidad fue detectada sólo a una alta multiplicidad de la infección. Sugiere que no hay replicación viral en esta línea celular.

[0091] Es un objeto importante del invento ofrecer clones de virus NDV con un potencial oncolítico mejorado en comparación con las preparaciones virales disponibles en la actualidad.

9. Descripción de MTH-68H/VB como agente potenciador empleado junto con otras modalidades oncoterapéuticas incluyendo agentes quimioterapéuticos y terapia de radiación in vivo.

[0092] Después de observar la actividad oncolítica potencial de la terapia viral como único agente terapéutico capaz de tratar a pacientes de cáncer en estadios avanzados de la enfermedad, cuando ya se había agotado el efecto de otras modalidades de tratamiento del cáncer, el efecto del uso de MTH-68HNB en combinación activa con tratamiento quimioterapéutico y/o de radiación fue investigada ulteriormente en un fuero experimental. En nuestros experimentos intentamos averiguar la evolución actual de la terapia del paciente señalando una aplicación práctica actual (en un paciente con un tumor cerebral), específicamente utilizando el glioma como modelo, el modo estándar de la terapia siendo la intervención posquirúrgica, cuando el paciente fue tratado primero con un curso de terapia de radiación seguido por una quimioterapia específica, a saber BCNU o temozolamida.

[0093] Es un objeto del invento ofrecer un clon del virus de NDV terapéuticamente eficaz en combinación con otros modos terapéuticos, tales como la quimioterapia, la radioterapia o la intervención quirúrgica.

9.1 Aplicación in vivo de MTH-68H/VB solo o en combinación con la irradiación.

[0094] El objetivo del estudio fue estudiar in vivo el efecto antitumoral de MTH-68HNB, bien solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas. Asimismo fue investigada la influencia de la dosis de MTH-68HNB y del esquema de dosificación.

[0095] Los materiales de virus fueron disueltos en 1 ml PBS. Los materiales fueron divididos en partes alícuotas de 200 μl y almacenados a -70°C. Durante nuestro trabajo algunas partes alícuotas fueron descongeladas y vueltas a congelar repetidas veces.

[0096] GI261 - se empleó una línea celular de glioma murino establecido (NCI, EE UU). Las células fueron mantenidas en medio DME que contenía un 10% de suero de ternero fetal y antibióticos.

[0097] Células GI261 fueron recogidas, lavadas una vez en PBS y suspendidas en un pequeño volumen de PBS (12x107 células/ml). Se obtuvieron tumores subcutáneos en ratas C57BI/6 mediante trasplante de 1-2x106 células GI261 en el miembro derecho de los animales en 200 μl de volumen final de PBS. Los diámetros de los tumores subcutáneos fueron medidos a intervalos de 3-4 días mediante una pinza y se calculó el volumen tumoral como longitud x anchura x altura x n/6. Los ratones fueron sacrificados cuando estaban moribundos o bien cien d

ías después de la inducción del tumor. En todos los ratones se practicó una autopsia. Todos los grupos de tratamiento estaban integrados por 5 ratones.

[0098] En el primer protocolo, los tumores fueron inducidos con inyección subcutánea de 2x106 células GI261. Los tumores eran claramente palpables (aprox. 3-4 mm de diámetro del tumor) después de una semana y comenzó el tratamiento del tumor con una inyección intratumoral de MTH-68HNB en un volumen final de 50 μl. Varias pistas de agujas fueron empleadas cada vez para asegurar una distribución intratumoral uniforme. Los ratones de control no fueron tratados o bien fueron tratados sólo con una inyección intratumoral de PBS.

Protocolo de tratamiento I

[0099]

Grupo 1 - controles sin tratar

Grupo 2 - tratados con inyecciones diarias de PBS

Grupo 3 - tratados con una inyección por semana de PBS

Grupo 4 - tratado con inyecciones diarias de 1x107 MTH-68HNB

Grupo 5 - tratado con inyecciones diarias de 1x105 MTH-68HNB

Grupo 6 - tratado con una inyección por semana de 1x107 MTH-68HNB Grupo 7 - tratado con una inyección por semana de 1x105 MTH-68HNB

[0100] El tratamiento fue aplicado durante un período de dos semanas.

[0101] En el segundo protocolo, los tumores fueron inducidos con la inyección subcutánea de 1x106 células GI261. Los tumores eran palpables discretamente (aprox. 1-2 mm de diámetro del tumor) después de dos semanas y comenzó el tratamiento del tumor con una inyección intratumoral de MTH-68HNB en un volumen final de 50 μl, tal como se mencionó arriba.

Protocolo de tratamiento II

[0102]

Grupo 1 - controles sin tratar

Grupo 2 - tratados con inyecciones diarias de PBS

Grupo 3 - tratados con dos inyecciones por semana de PBS

Grupo 4 - tratado con inyecciones diarias de 1x107 MTH-68H/VB

Grupo 5 - tratado con dos inyecciones /semana de 1x107 MTH-68HNB

Grupo 6 - tal como el grupo 2, si bien antes del primer tratamiento con PBS, el

miembro portador del tumor fue irradiado con radiación de 4 Gy

Grupo 7 - tal como el grupo 4, si bien antes del primer tratamiento con MTH-68H/VB, el

miembro portador del tumor fue irradiado con radiación de 4 Gy

[0103] El tratamiento fue aplicado durante un período de dos semanas.

Irradiación del tumor

[0104] El miembro derecho portador del tumor de los ratones anestesiados fue irradiado con 4 Gy (THX-250 como fuente radiológica terapéutica, Medicor, Budapest, Hungría, tasa de dosis: 1,003 Gy/min). Un tubo de plomo protegió la otra parte del cuerpo contra la radiación.

Resultados

[0105] En el primer juego de experimentos, tumores algo más grandes fueron tratados bien una vez por semana o bien con inyecciones intratumorales diarias de dos dosis diferentes de MTH-68HNB (1x107 y 1x105 partículas virales/inyecciones) (fig. 23 y 24, respectivamente).

[0106] El falso tratamiento con inyecciones intratumorales de PBS resultó en un crecimiento tumoral ligeramente retardado. Sin embargo, las inyecciones intratumorales de MTH-68HNB mostraron claramente un efecto de retardo del crecimiento tumoral superior. Asimismo fue claro que el tratamiento viral diario fue mucho más eficaz que una inyección viral por semana, siendo las dosis virales altas superiores a las dosis bajas.

[0107] Por lo general, un protocolo anti-tumor es mucho más eficaz si los tumores son pequeños en el momento del tratamiento. Esta posibilidad fue modelada en el segundo juego de experimentos. Los tumores fueron inducidos con el trasplante de menos células tumorales GI261. Además, en el segundo protocolo, se aplicaron sólo las dosis elevadas de MTH-68HNB (1x107) y el tratamiento de una aplicación por semana fue sustituido por dos inyecciones virales intratumorales por semana. Nuevamente, la inyección intratumoral de MTH-68HNB resultó en un retraso del crecimiento tumoral en comparación con los controles del falso tratamiento, siendo el tratamiento diario superior al tratamiento de dos inyecciones virales por semana (fig. 25).

[0108] Resultaba interesante que las inyecciones intratumorales o peritumorales de MTH-68HNB previnieron el crecimiento de los tumores en unos pocos animales (fig. 25). Debe tenerse en cuenta que la curva del crecimiento tumoral al principio muestra el volumen promedio de cinco tumores por grupo de tratamiento. La disminución brusca del volumen tumoral se debe a que uno o dos de los ratones moribundos portadores de grandes tumores fueron sacrificados por anestesia por motivos éticos. El retorno del crecimiento tumoral a un nivel cerca de la línea base se refiere a ratones curados del tumor por tratamientos de MTH-68HNB (fig. 25). La eliminación completa de tumores pequeños por tratamientos repetidos de MTH68/H es más aparente en la figura 26, donde se aprecia la supervivencia de ratones portadores de tumores.

Conclusión:

[0109] Cuando el efecto combinado de tratamiento con MTH-68HNB e irradiación local del tumor fue analizada se concluyó que la radiación por sí sola eliminó el crecimiento tumoral sólo en un pequeño porcentaje de los animales. Sin embargo, la combinación de inyecciones intratumorales de MTH-68HNB con irradiación del tumor local eliminó el crecimiento de todos los tumores (fig. 25 y 26).

[0110] Asimismo se concluyó que las inyecciones intratumorales de elevadas inyecciones de MTH-68HNB por lo menos retrasa el avance de los tumores grandes, pudiendo los pequeños tumores ser eliminados completamente por MTH68HNB. El tratamiento intratumoral con MTH-68HNB puede combinarse muy eficazmente por una irradiación local del tumor. La explicación más probable es el efecto citotóxico de MTH-68/HNB. El efecto dramático de la terapia de combinación con MTH-68HNB y terapia de radiación en esta línea celular específica fue apreciado a pesar de la falta de sensibilidad relativa de esta línea celular específica a MTH-68HNB en comparación con otras líneas celulares ensayadas (tal como se describió antes en el texto), demostrando ulteriormente el efecto sinergético positivo de de terapia viral y terapia de radiación.

9.2 Efectos antitumorales de la terapia de MTH68-H/VB, combinada con quimioterapia con temozolamida y radioterapia

[0111] Los gliomas son tratados rutinariamente con cirugía, seguida a menudo por radiación y quimioterapias. Entre los agentes quimioterapéuticos empleados, la administración de temozolamida (Temodar, Temodal) para sustituir BCNU (bis-cloronitrosourea, Carmustine) se está convirtiendo en una modalidad estándar del tratamiento. El objetivo del presente estudio fue investigar los efectos antitumorales combinados de la terapia

viral con MTH-68HNB, con quimioterapia tal como quimioterapia con temozolomida y radioterapia.

9.2.1 Modelo de tumor

[0112] Se recogieron células GI261 crecidas in vitro, se lavaron dos veces en PBS y se suspendió en un pequeño volumen de PBS (1-2x107 células/ml). Los tumores subcutáneos fueron obtenidos en C57BI/6 ratas hembra mediante trasplante de 1-2x106 células GI261 en el miembro derecho de los animales en 100 μl de volumen final de PBS. La línea celular de glioma murino GI261 fue cultivada en la modificación de Dulbecco del medio esencial mínimo de Eagle (DME), tal como fue descrito (T. Szátmári, K. Lumniczky, S. Désaknai, S. Trajcevski, EJ. Hidvégi, H. Hamada, G. Sáfrány. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for glioblastoma therapy. Cancer Science, 97. 546-553, 2006).

[0113] Para seguir el crecimiento tumoral, los diámetros de los tumores subcutáneos fueron medidos a intervalos de 3-4 días mediante una pinza y se calculó el volumen tumoral como longitud x anchura x altura x n/6. Los ratones fueron sacrificados cuando estaban moribundos. Todos los ratones fueron sometidos a una autopsia detallada.

[0114] Los estudios en animales fueron llevados a cabo conforme a la normativa húngara con permiso de la entidad institucional y nacional de cuidado y ensayos de animales. Todos los grupos de tratamiento estaban integrados por 5 ratones.

9.2.2 Tratamiento combinado de tumores subcutáneos con MTH-68H/VB, irradiación local y Temodar

[0115] El tratamiento tumoral comenzó 7 días después de los implantes de células tumorales. Las siguientes modalidades fueron empleadas en varias combinaciones.

1.

Inyecciones tumorales locales diarias de MTH-68H/VB (1x107 partículas virales/inyección en 50 μl de volumen final) durante 2 semanas (total de 10 inyecciones, 5 inyecciones/semana). En los protocolos combinados, la inyección de MTH-68HNB fue aplicada inmediatamente después de la irradiación y/o tratamiento con Temodar (100 mg de temozolomida/cápsula, Schering Corp. Kenilworth, NJ 07033). Las cápsulas fueron abiertas con cuchillas estériles y se suspendió su contenido en 2,5 ml de dimetil-sulfóxido por sonicación. Después de la sonicación, el volumen final de la solución homogénea fue ajustado a 20 ml con PBS resultante en 5 mg/ml de concentración final de Temodar. Esta solución fue almacenada a 4°C durante 3-5 días.

2.

Inyección intraperitoneal (ip) de Temodar (100 mg de Temodar / 1 kg de peso corporal) durante 3 días seguidos.

3.

La terapia de radiación fue aplicada en tres días seguidos. El miembro derecho portador de tumor de ratones anestesiados fue irradiado con 2 Gy (fuente de radiación terapéutica THX-250, Medicor, Budapest, Hungría, tasa de dosis: 1,003 Gy/min). Cuando la irradiación del tumor fue combinada con el tratamiento con Temodar, la irradiación fue aplicada 1 hora después de la quimioterapia.

[0116] Se aplicaron dos esquemas de tratamiento diferentes. En el primer protocolo, los tumores fueron inducidos con inyección subcutánea de 1x106 células GI261. Los tumores eran palpables (aprox. 1-2 mm de diámetro del tumor) después de una semana. En el segundo protocolo, los tumores fueron inducidos con inyección subcutánea de 2x106 células GI261. Los tumores eran claramente palpables (aprox. 3-4 m de diámetro tumoral) después de una semana.

Grupos de tratamiento del esquema I (5 ratones/grupo)

[0117]

Grupo 1 - controles sin tratar

Grupo 2 - controles con falso tratamiento (PBS)

Grupo 3 - tratamiento de MTB-68HNB (inyección de 1 x 107 MTH-68HNB durante 10 días)

Grupo 4 - irradiación de tumor local con 3x2 Gy

Grupo 5 - MTH-68HNB (10 días) + irradiación (3x2 Gy)

Grupo 6 - tratamiento intraperitoneal con Temodar (3x)

Grupo 7 - MTH-68HNB (10 días) + Temodar (3x)

Grupo 8 - MTH68H/VB (10 días) + irradiación (3x2 Gy) + Temodar (3x)

Grupos de tratamiento del esquema II (5 ratones/grupo)

[0118] Tal como el protocolo I, con excepción de que el grupo I fue tratado con 10 inyecciones intraperitoneales de MTH68/HNB.

Resultados

[0119] En el primer juego de experimentos se trataron tumores pequeños. El falso tratamiento con inyecciones intratumorales de PBS resultó en el mismo crecimiento tumoral que en los ratones portadores de tumores que no fueron tratados (figura 25).

[0120] Las inyecciones intratumorales de MTH-68HNB retrasaron claramente el avance del tumor. Se observó un efecto antitumoral un poco más fuerte después de tratamientos individuales de Temodar e irradiación local del tumor. La combinación de MTH68/H/VB bien con Temodar o con irradiación era superior a los protocolos de un solo agente terapéutico. Se observó un efecto antitumoral muy fuerte después del tratamiento combinado con Temodar e irradiación del tumor que mejoró ulteriormente con inyecciones intratumorales locales de MTH-68H/VB (figura 27).

[0121] En el segundo juego de experimentos se trataron tumores más grandes con las combinaciones antitumorales arriba mencionados. Puede haber dos posibilidades para explicar el efecto antitumoral de MTH-68HNB. Una es el efecto citotóxico directo del virus. Asimismo es posible que el virus indusza un ataque inmunológico antitumoral. Para ensayar la segunda opción, ratones portadores de tumores fueron tratados con inyecciones intraperitoneales de MTH68/HNB. Contrariamente al resultado del primer experimento, el tratamiento intratumoral de MTH68/H/VB no detuvo el avance del tumor (figura 28).

[0122] El tratamiento aislado con Temodar resultó en una inhibición moderada del crecimiento del tumor. Sin embargo, esto fue mejorado ulteriomente al combinarlo con inyecciones intratumorales de MTH68/HNB. El tratamiento aislado con radiación suprimió el crecimiento del tumor. La combinación de la aplicación viral de MTH68/H/VB con el tratamiento de radiación era claramente superior a la radiación aislada. Esta combinación fue superior a la observada en la combinación de la radiación tumoral con el tratamiento con Temodar. La supresión más fuerte del crecimiento tumoral fue observada cuando se aplicaron los tres agentes (figura 28).

Conclusiones

[0123] Las inyecciones intratumorales de MTH-68HNB atrasó la progresión del tumor cuando el volumen tumoral era pequeño.

[0124] Nuestros datos demuestran que el tratamiento con MTH-68HNB puede ser combinado en forma potente con la irradiación tumoral local. El efecto antitumoral de los tratamientos combinados de MTH68/H/VB y radiación es similar al efecto combinado de Temodar e irradiación del tumor. La ventaja grande al emplear MTH68/H/VB en combinación con la terapia de radiación es que MTH68/H/VB como terapia viral no es tóxico incluso si se administra durante períodos prolongados, especialmente a dosis bajas más probablemente necesarias para ver la eficacia en la cepa potente MTH-68/H/VB, mientras que la eficacia de los tratamientos con quimioterapia es afectada gravemente por sus efectos secundarios tóxicos a corto y largo plazo.

[0125] El tratamiento con MTH-68/HVB asimismo estimula el potencial inhibidor de crecimiento tumoral de Temodar, siendo por ello un complemente muy provechoso del tratamiento estándar del cáncer.

[0126] El efecto más dramático fue observado cuando los tres agentes, MTH-68HNB viroterapia, quimioterapia y radiación feron aplicados en estrecha combinación. Estos hallazgos son especialmente significativos con la incidencia cada vez mayor y la letalidad implacable de los gliomas, especialmente los glioblastomas responsables de los resultados más fatales de todos los tipos de cáncer.

9.3 Tratamiento combinado de tumores subcutáneos con MTH-68H/VB, irradiación local de tumor y BCNU

[0127] En este estudio, el efecto del tratamiento con MTH-68HNB y/o irradiación fue estudiado en la actividad antitumoral o BCNU. BCNU (ingrediente activo: Carmustine, nombres comunes: BCNU, BiCNU, Carmustina, clasificación: agente alquilante, nitrosurea). BCNU fue empleado como quimioterapia de tratamiento único durante muchos años en los tumores cerebrales primarios y desempeñó un papel significativo durante más de 30 años en la quimioterapia estándar para glioblastomas multiformes.

[0128] El tratamiento tumoral comenzó 7 días después de los implantes de células tumorales. Se aplicaron las siguientes modalidades en varias combinaciones:

1.

Inyecciones diarias de tumores locales con MTH-68H/VB (1x107 partículas virales/inyección en un volumen final de 50 μl) durante 2 semanas (total de 10 inyecciones, 5 inyecciones/semana). En los protocolos combinados, la inyección de MTH-68HNB fue aplicada inmediatamente después de la irradiación y/o del tratamiento con BCNU.

2.

Tratamiento intraperitoneal (ip) con BCNU.

3.

El tratamiento de radiación fue aplicado en tres días seguidos. El miembro derecho portador del tumor de ratones anestesiados fue irradiado con 2 Gy. Cuando la irradiación tumoral fue combinada con tratamiento BCNU, la irradiación fue practicada 1 hora después de la quimioterapa.

[0129] En el protocolo, los tumores fueron inducidos con inyección subcutánea de 2x106 células GI261. Los tumores eran palpables claramente (diámetro del tumor de 3-4 mm aprox.) después de una semana.

Grupos de tratamiento del esquema I (5 ratones/grupo)

[0130]

Grupo 1 - controles sin tratar

Grupo 2 - controles con falso tratamiento (PBS)

Grupo 3 - tratamiento de MTB-68HNB (inyección de 1 x 107 MTH-68HNB durante 10 días)

Grupo 4 - irradiación de tumor local con 3x2 Gy

Grupo 5 - MTH-68HNB (10 días) + irradiación (3x2 Gy)

Grupo 6 - tratamiento intraperitoneal con BCNU

Grupo 7 - MTH-68HNB (10 días) + BCNU

Grupo 8 - MTH68HNB (10 días) + irradiación (3x2 Gy) + BCNU

[0131] El tratamiento con BCNU aislado resultó en una inhibición moderada del crecimiento tumoral. Sin embargo. Esto fue mejorado ulteriormente por la combinación con inyecciones intratumorales de MTH68/H/VB. El tratamiento de radiación por sí solo suprimió el crecimiento tumoral en forma moderada. Sobre todo la combinación de la aplicación viral de MTH-68HNB con tratamiento de radiación era claramente superior a la radiación aislada. Esta combinación fue superior a la observada en la combinación de irradiación del tumor con tratamiento con Temodar. La supresión más pronunciada del crecimiento tumoral fue observada cuando se aplicaron los tres agentes (figuras 29 y 30).

[0132] Llamaba la atención que las inyecciones intratumorales de MTH-68HNB previnieron el crecimiento de los tumores en algunos animales (fig. 30). Efectivamente, la curva del crecimiento del tumor al comienzo muestra el volumen promedio de cinco tumores por grupo de tratamiento. La disminución brusca del volumen tumoral se debe a que uno o dos de los ratones moribundos portadores de grandes tumores fueron sacrificados por anestesia por motivos éticos. La parte final de algunas líneas en la figura 29 antes del día 50 indica que todos los animales fueron perdidos en el grupo. El retorno del crecimiento tumoral a un nivel cerca de la línea base se refiere a ratones curados del tumor por los tratamientos (fig. 30). Se muestra la supervivencia de los ratones portadores de tumores.

Conclusiones

[0133] Nuestros datos demuestran que el tratamiento con MTH-68H/VB puede ser combinado provechosamente con la irradiación tumoral local y la quimioterapia. La ventaja grande del uso de MTH-68HNB - en combinación con la terapia de radiación - es que MTH-68HNB como terapia viral es no tóxica al ser administrada durante períodos largos de tiempo.

[0134] El tratamiento con MTH-68/HVB estimula asimismo el potencial inhibidor del crecimiento tumoral del tratamiento con BCNU.

[0135] El efecto terapéutico más dramático fue observado cuando los tres agentes -terapia viral con MTH-68HNB, quimioterapia y radiación - fueron aplicados en estrecha combinación. Estos hallazgos son especialmente significativos con la incidencia cada vez mayor y la letalidad implacable de los gliomas, especialmente los glioblastomas responsables de los resultados más fatales de todos los tipos de cáncer.

[0136] Debe entenderse que los datos experimentales facilitados en la sección 9 de esta solicitud son ejemplos de clones del NDV conforme al invento. Sirven para describir las propiedades específicas de estos clones mediante ejemplos sin limitación alguna de los clones específicos empleados.

10. Uso de MTH-68H/VB para tratamiento médico

[0137] Los clones NDV conforme al invento pueden ser empleados para el tratamiento de enfermedades neoplásicas. El tratamiento puede ser definido como sigue:

1 - causante de regresión del tumor, definiéndose la regresión como disminución del tamaño del tumor, tal como puede ser medida objetivamente con el examen físico o técnicas conocidas de visualización, incluyendo lesiones ocupadoras de espacios, así como otras, por ejemplo tal como en la enfermedad hematológica, en la leucemia una disminución de células malignas o según se manifestó en la enfermedad metastásica.

2 - la aplicación concomitante del clon viral MTH-68/HVB con otras modalidades del tratamiento del cáncer, incluyendo por ejemplo la quimioterapia y la radiación, a fin de permitir un fomento sinergético de sus propiedades anticancerosas respectivas,

3 - la aplicación concomitante del clon viral MTH-68/H-VB con otras modalidades para reducir los efectos secundarios negativos - incluyendo, a título de ejemplo, náusea, vómitos, pérdida de pelo, fatiga, falta de apetitos - o radionecrosis.

4 - el alivio del dolor relacionado con el cáncer, especialmente, pero sin limitarse a ello, el dolor provocado por la enfermedad metastásica y/o lesiones ocupadoras de espacio; por consiguiente reduciendo la necesidad de una medicación analgética, tal como codeína y/o morfina,

5 - el tratamiento de los pacientes que padecen de cáncer terminal y que agotaron todas las modalidades terapéuticas tradicionales y en los que la regresión tumoral puede esperarse aún después del tratamiento viral, con la expectativa de una prolongación de la vida

6 - a fin de mejorar la calidad de vida del paciente de cáncer o de paciente terminal de cáncer mediante alivio de sus síntomas relacionados con el tumor incluso en la evidencia directa de regresión del tumor. Los síntomas relacionados con el tumor pueden definirse como fatiga, dolor, falta de apetito (la forma extrema manifestada como caquexia), falta de energía, pérdida de la sensación de bienestar, pérdida de libido.

[0138] Los tipos de cáncer que pueden ser exitosamente tratados mediante una formulación farmacéuticamente acpetable de los clones aquí descritos incluyen, sin limitarse a estas formas, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer renal, tumor de Wilm, cáncer de próstata, cáncer pulmonar (incluyendo bronquial), linfoma, leucemia, tumores del sistema nervioso central (incluyendo meningeoma, meduloblastoma, glioblastoma, astrocitoma, neuroblastoma); cáncer pancreático, cáncer de piel (incl. melanoma), cáncer del colon, ósea (tanto lesiones primarias como metastásicas) y cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer esofágico, cáncer del tiroides, sarcomas, mesotelioma, cánceres de cabeza y nuca (incluyendo oro-naso-faríngeo, paratiroides), malignancias hematológicas, carcinomas vulvares, vaginales o endometriales, carcinoma testicular, cánceres ano-rectales, cánceres hepáticos y extrahepáticos (conducto biliar), sarcomas (incluyendo Ewings), cáncer de ojo (incluyendo retinoblastoma), carcino tímico, cánceres uretrales, tumores carcinoides y cánceres adrenocorticales así como lesiones metastásicas como resultado de ello y los síntomas paraneoplásicos y estados debilitantes como consecuencia de los estadios avanzados, por ejemplo, de las condiciones neoplásicas susodichas.

[0139] En una expresión ventajosa del invento, un potente clon viral oncolítico es administrado terapéuticamente para tratar el cáncer.

[0140] Los pasos de fabricación y purificación descritos a continuación son los que aseguran la capacidad de garantizar un producto terapéutico viral libre de contaminante, puro, no alergénico, estandarizado, homogéneo, estable, robusto y resistente a temperaturas, transportable, práctico, fácil de usar para el tratamiento de enfermedades en el hombre,

especialmente el cáncer y sus síntomas concomitantes o resultantes, en forma aislada o como complemento de otras formas terapéuticas, siendo adaptable a diversas vías de administración, incluyendo, entre otras, la administración parenteral, con exclusión y eliminación de cualquier presencia contaminante, incluyendo posibles factores alergénicos como las proteínas de huevos derivadas de los propios huevos inoculados. El siguiente método se ha aplicado exitosamente para la fabricación y purificación y liofilización:

I. Generación de un clon viral clonal purificado (p. ej. mediante purificación de placas múltiples)

II. Inoculación de huevos de pollo específicamente libre de patógenos (SPF) con el clono clonal

III. Incubación de huevos SPF

IV.

Enfriamiento de huevos SPF

V.

Recogida del fluido alantoideo de los huevos SPF

VI. Eliminación de partículas ajenas del fluido alantoideo - posiblemente con filtración y/o

centrifugación

VII. Ultracentrifugación del fluido alantoideo

VIII. Formulación y llenado de recipientes individuales

IX.

Liofilización y secado por congelación del producto acabado

X.

Ensayos de control de calidad y métodos para permitirlo, incluyendo neturalización del clon y uso de líneas celulares, modelos de animales y PCR.

[0141] El especialista en este sector tiene conciencia de maneras alternativas para fabricar y purificar los virus derivados del huevo. (Para más detalles sobre la fabricación y purificación consulte: Vaccine Manual. The production and quality control of veterinary vaccines for use in developing countries, FAO Animal Production and Health Series, 1997; Newcastle disease vaccines, their production an use, FAO Animal Health Series No. 10, 1978; Development in Veterinary Virology: Newcastle Disease: 1988. Editado por D.J. Alexander, Kluver Academic Publisher).

[0142] Para el fin del tratamiento médico, el clon del virus es formulado como preparación farmacéutica llevándolo a una forma de dosificación estandarizada junto con estabilizadores, tales como almidones, y/o azúcares para convertirlo en un producto estable. El producto luego es liofilizado para garantizar su termoestabilidad relativa y está contenido en viales individuales con dosis específicas, con lo que es transportable, pudiendo ser empleado no sólo en ámbitos hospitalarios pero también para la terapia de pacientes ambulatorios. Esto aumenta la viabilidad económica y hace el tratamiento más accesible como tratamiento de largo plazo, lo que resulta especialmente significativo en el caso de una terapia de mantenimiento y de prevención. La terapia ambulatoria garantiza un compliance a largo plazo del paciente y fomenta su viabilidad económica.

[0143] Para el fin del tratamiento médico, el clon viral será aplicado como sigue: debido a su potencia, un clon del NDV conforme al invento, tal como MTH-68/HNB, puede ser administrado efectivamente no sólo por vía parenteral e invasiva sino que también puede aplicarse en forma terapéutica eficaz empleando una vía no invasiva de administración -es decir por ejemplo en gotas, sprays, forma sublingual o aerosol utilizando un nebulizador.

[0144] En función de la ruta de administración, la dosis puede cambiar - la terapia puede ser efectiva ya a una dosis de 107 a 109 de partículas virales/por dosis por día - y puede ser administrada en una dosis única o repetidas veces por día. La dosis puede ser incrementada y puede mostrar su eficacia en múltiplos de dosis individuales, p. ej. 2 veces, 5 veces

o incluso 10 veces, de 107 a 109 partículas virales/por dosis, o bien alternativamente dosis pueden ser administradas varias veces por día; o bien puede ser que se administra una dosis de carga mayor al comienzo del ciclo terapéutico, es decir, por ejemplo, durante las primeras semanas a meses, seguido por dosis más bajas o puede luego ser reducida en su dosis administrando las partículas virales/vial con una frecuencia menor, a saber, sustituyen el esquema de dosis diarias múltiples a una dosis diaria; o bien pasar de una dosis diaria a la administración en días alternos. Típicamente, el virus conforme al invento es ofrecido en viales con una cantidad estandarizada de partículas de virus por vial, tales como 1x107, 2,5x107, 5x107, 1x108, 2,5x108, 5x108, 1x109, 2,5x109, 5x109 o 1x1010 de partículas de virus/vial. En función del protocolo de dosificación se aplica un número predeterminado de viales al paciente en un determinado momento. La terapia habitual está basada en la aplicación de una dosis estándar diaria (p. ej. de 1x108 o 1x109 de partículas virales por día). Habitualmente, la dosis estándar se ofrece en un vial único aplicado una vez por día. Sin embargo y por varios motivos, puede haber circunstancias en un individuo que requieren la aplicación de una dosis más alta o más baja. La dosificación individual puede adaptarse a los individuos conforme a métodos conocidos del arte. Un paciente pudo, por ejemplo, recibir dos o tres dosis estándares por día cuando se precisan dosis más altas. Un paciente pudo también recibir una dosis estándar cada segundo día o una vez por semana o incluso una vez por semana o por mes cuando se precisan dosis más bajas. La dosis estándar también puede ser aplicada por infusión durante un período de tiempo en contraste a la aplicación de un bolo. Los especialistas pueden adaptar el protocolo de dosificación a los requisitos del individuo (especialmente la enfermedad concreta y su avance) en relación al modo de aplicación. El protocolo de dosificación terapéutico es determinado inicialmente y ajustado en función de la sensibilidad del tipo de tumor específico a la viroterapia, pudiendo ser ajustado ulteriormente conforme a la reacción clínica del paciente, reduciéndose continuamente la dosis original. Después de apreciarse el efecto terapéutico deseado puede ser conveniente proseguir con un régimen de mantenimiento con un esquema de dosificación semanal o bimensual o mensual durante un período prolongado. Incluso es posible una terapia de mantenimiento durante años y no existe contraindicación alguna relativa a una toxicidad acumulada.

[0145] Gracias a su eficacia, la dosis individual relativamente baja de MTH-68/H/VB necesaria para resultar en un efecto terapéutico en tipos de tumores sensibles con la posibilidad significativa de aplicar el tratamiento por rutas no invasivas de administración, nos enfrentamos con un tratamiento especialmente adecuado para pacientes ambulatorios siendo asimismo capaz de aumentar la compliance a largo plazo del paciente. Debido a la dosis relativamente baja requerida para un efecto terapéutico beneficioso a ser observado, el paciente debe someterse a un tratamiento de desensibilización tal como se aprecia en otros tratamientos virales de cáncer intravenosos y de elevadas dosis de NDV, donde se aplicaron dosis mucho más elevadas.

[0146] Una forma prolongada de terapia frente a una intervención sólo aguda permite al MTH-68/H/VB, así como a otras formas de la terapia viral, ser empleado como forma preventiva de la terapia biológica del cáncer, destruyendo células cancerosas nacientes o residuales y reduciendo el riesgo e una reaparición, disminuyendo a la vez el riesgo del desarrollo de lesiones metastásicas, incluso y en caso dado, la viro-terapia con MTH-68/H/VB y otras viro-onco-terapias pueden emplearse como una forma de terapia preventiva en pacientes con un elevado riesgo comprobado de la aparición de tipos específicos virosensibles de tumores (p. ej. mediante ensayos genéticos).

[0147] La administración del virus puede ser efectuada por métodos y vías de administración diferentes; mediante inhalación, aplicación intravenosa, intraarterial, enteral, parenteral, intratecal, intraperitoneal, intratorácica, intrapleural, oral, sublingual, bucomucosal, intranasal, intracística, intrauretral, rectal, vaginal, subcutánea, intratumoral, peritumoral, local, intramuscular, intrabronquial, intarterial, intracraneal y/o tópica o por cualquier otra vía. El clon viral puede ser suministrado por endoscopia o catéter o nebulizador o goteador o jeringa o spray o cualquier otro medio técnico requerido para un suministro terapéutico eficaz. Para pacientes que requieren un tratamiento intravenoso a largo plazo o de mantenimiento, esto puede implicar también la aplicación a través de un catéter venoso central (Hickman, Neostar, Broviac, por ejemplo) o bien se requiere, para la aplicación tumoral directa del virus, un catéter arterial. Algunos pacientes eventualmente se benefician del aporte transdérmical por medio de parches dermales.

[0148] El clon del virus puede ser administrado en forma de bolo durante un corto período de tiempo o en forma de infusión durante varias horas o bien en caso de la administración oro-bucal-sublingual o intranasal en forma de de gotitas o en un spray o en forma de aerosol, utilizando un nebulizador, especialmente en caso de los tumores pulmonares o bronquiales. En caso de la administración rectal o vaginal puede emplearse la forma de administración de un supositorio.

[0149] Otro aspecto del invento es la terapia de combinación usando el virus conforme al invento en combinación con uno o varios agentes quimioterapéuticos. Puede ser empleado tanto como agente adyuvante potenciador empleando el efecto destructor de células sinergético entre la terapia viral y los agentes quimioterapéuticos. Los posibles agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores mitóticos, terapias encauzadas, agentes diferenciadores u otros. Los ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitarse a ello, trióxido arsénico, adriamicina, BCNU, bexaroteno, bleomicina, carboplatina, cisplatina, decarbazina, doxorubicina, 5-fluorouracilo, metotraxato, taxo, temozolomida, vinblastina, vincristina. Otras agentes incluyen azacitidina, azatioprina, capecitabina, clorambucilo, ciclofosfamida, citarabina, daunorubicina, docetaxel, doxifluridina, epirubicina, eptilona, etoposido, gemcitabina, hidroxiurea, idarubicina, imatinib, mecloretamina, mercaptopurina, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, teniposido, tioguanina, tretinoína, valrubicina, vindesina, vinorelbina, imitanib, gefitinib, erlotinib, sunitinib, bortezomib.

[0150] En tal modalidad administrativa, el virus puede ser administrado concomitantemente con otro agente quimioterapéutico dentro del mismo régimen terapéutico, incluso dentro del mismo día en el lapso de veinte minutos a veinticuatro horas; o bien puede ser administrado en diferentes momentos, tales como antes del comienzo o después de concluir el ciclo quimioterapéutico (medido en días o semanas) precedido o seguido por un ciclo terapéutico viral de la terapia; o bien puede ser administrado intermitentemente, resaltando el régimen quimioterapéutico. En otra variante del invento, el virus puede ser administrado simultáneamente junto con el agente quimioterapéutico, por cualquiera de las rutas de administración, es decir la administración nasal (spray o gotitas), o sublingualmente o intravenosamente o bien puede ser administrado a un lugar específico (p. ej. intratumoralmente).

[0151] MTH-68/HNB asimismo puede considerarse como terapia adyuvante al enfrentarse a un tumor grande inoperable

o irradiable. La quimioterapia se emplea a veces para reducir el tamaño de un tumor para que pueda ser extirpado mejor

o para ser mejor definido para una radioterapia. Es posible que MTH-68/H/VB pueda reducir o eliminar las lesiones metastásicas con lo que el paciente se convierte en candidato para una terapia quirúrgica de la lesión primaria grande, pasando de la categoría de inoperable a operable. Con ello, el uso de la terapia MTH-68/H/VB puede considerarse también como terapia adyuvante para procedimientos quirúrgicos eventualmente curativos.

[0152] Otra variante del invento es la aplicación del virus en combinación con la radioterapia. En tal caso, el tumor puede recibir radiación (radiación a, ß o Y, radiación de rayos X, radiación de partículas tal como radiación de protones, aplicadas de las siguientes maneras, pero no limitada, a la radiación de haz externa, la terapia de radiación endocavitaria, la radiación intersticial, la braquiterapia u otros).

[0153] En tal caso, la radiación puede aplicarse primero, sensibilizando con ello las células tumorales, y luego podrá aplicarse el virus. Un ciclo completo de terapia de radiación puede aplicarse, seguido por la terapia con MTH-68/HNB. Sin embargo y bajo determinadas circunstancias puede ser ventajoso aplicar primero el virus y luego la radiación del tumor. O bien puede apreciarse el efecto sinergético también cuando se aplican simultáneamente - en paralelo - ambos modos terapéuticos. Asimismo puede ser beneficioso agregar MTH-68/H/VB a un régimen de quimioterapia y radioterapia administradas conjuntamente, tal como suele hacerse en el cáncer avanzado de cabeza y nuca, bien simultáneamente en forma conjunta o bien en tándem, es decir un ciclo terapéutico seguido por el otro. La quimioterapia se administra a menudo al mismo tiempo que la radiación para que la radioterapia sea más eficaz. La quimioterapia puede administrarse a la vez en diferentes formas, incluyendo una dosis diaria baja, una dosis semanal moderadamente baja o bien una dosis relativamente alta cada tres a cuatro semanas. Al usar este régimen de tratamiento potenciador, el MTH-68/HNB podría administrarse simultáneamente a la quimioterapia o bien antes o después de la misma. Tal como se observado en los datos registrados en nuestras investigaciones, la combinación de los tres modos de terapia ha mostrado poseer un efecto terapéutico sinergético extremadamente positivo - en estudios experimentales en animales, induciendo a un elevado porcentaje de curaciones (en contraste a la remisión parcial). Se ha demostrado asimismo que incluso una exposición aislada o limitada a una dosis terapéutica de radiación seguida por quimioterapia y terapia viral puede sensibilizar enormemente las células tumorales garantizando una eficacia mayor de la quimioterapia en unión con la viroterapia.

[0154] Contrariamente al tratamiento con otras cepas del NDV, los pacientes tratados con el clon conforme al invento mostraron síntomas dramáticamente reducidos de dolor. Mientras ello fue registrado como una característica de menor importancia en publicaciones anteriores, resulta que con el MTH-68/HNB es de importancia destacada y altamente significativo. Esto representa una mejora considerable frente a otras terapias del cáncer, en las que el dolor del paciente no es atendido directamente; incluso en los tratamientos basados en otras aplicaciones virales. Este efecto del MTH-68/H/VB es apreciado especialmente en cáncer ósea, típicamente asociado a un elevado grado de dolor y sufrimiento. Habitualmente, los pacientes de cáncer óseo reciben elevadas dosis de analgésicos, tales como morfina, a fin de aliviar su dolor, los cuales enmascaran el dolor hasta cierto grado, sin jamás eliminarlo completamente. Asimismo y como en todos los narcóticos conlleva el problema de una eventual tolerancia, debiendo aumentarse la dosis para conseguir el efecto terapéutico deseado. Es bien sabido que los narcóticos en altas dosis incluso con analgésicos asociados al cáncer conllevan efectos secundarios, incluyendo una tolerancia cada vez mayor, una eventual adicción y un efecto terapéutico que va disminuyendo, mientras aumenta el riesgo legal. La terapia viral con MTH-68/H/VB conforme al invento reduce significativamente la percepción del color en los pacientes con cáncer. Muchos pacientes pueden reducir significativamente su ingestión de analgésico e algunos incluso pueden suspender completamente el uso de la medicación contra el dolor.

[0155] Se ha apreciado que los pacientes acusan una mejora significativa de los síntomas clínicos al someterse al tratamiento de una terapia viral tal como se describe en el invento, reflejada en su calidad de vida, a saber los síntomas relacionados con tumores, como por ejemplo anorexia grave, pérdida de energía, depresión, inercia, náusea, fatiga que se ponen de manifiesto en la mayoría de los pacientes del cáncer en un determinado momento durante la evolución clínica de su enfermedad. Se ha observado una mejora de la calidad de vida en los pacientes que recibieron viroterapia con MTH-68/H/VB incluso en pacientes con cáncer avanzado que ya no están susceptibles de otras modalidades tradicionales y también en aquellos en los que la regresión objetiva del tumor está limitada o imposible o inesperada o difícil de observar resulta que se da una mejora pronunciada y significativa de su estilo y calidad de vida, más allá de la prolongación objetiva de la vida, a saber un tiempo esperado de supervivencia incrementada, al añadirse la terapia viral MTH-68/HNB a su régimen terapéutico habitual. Con ello y conforme al invento, el MTH-68/H/VB puede ser un candidato de tratamiento incluso en pacientes en una fase avanzada de su enfermedad más allá de toda esperanza de una remisión a largo plazo aumentando su funcionalidad y calidad de vida en presencia de una enfermedad neoplásica avanzada.

[0156] Otro aspecto del invento es el alivio significativo de los efectos secundarios esperados y observados como resultado de la quimioterapia, especialmente la de elevadas dosis, requerida para un tratamiento curativo efectivo necesario en determinados tipos de cáncer, como por ejemplo aquel empleado en los ajustes pediátricos hemooncológicos. Los efectos secundarios potencialmente evitados son, por ejemplo, náusea y vómitos, fatiga extrema, problemas intestinales y pérdida del apetito y cambios de peso.

[0157] Esto se ha observado también en el tratamiento viral combinado con la terapia de radiación, como alivio de los efectos secundarios prevalentes y frecuentes e fatiga y anorexia.

[0158] Este efecto sorprendentemente del MTH-68/H/VB podría permitir a un paciente someterse a estas formas tóxicos y muy molestas de tratamiento del cáncer con una morbilidad y unas molestias claramente reducidas. Con ello, aumentaría posiblemente la tolerancia de los pacientes, los cuales podrán reasumir sus actividades diarias normales mientras se someten a un tratamiento tradicional del cáncer, reduciéndose con ello la carga financiera y emocional potencial de inactividad y discapacidad aguda, apreciada a menudo en pacientes sometidos a estas formas de tratamiento del cáncer. Otro aspecto del invento es el posible papel radio-protector del MTH-68/H/VB para los órganos y las células expuestas a la radiación, más allá del efecto curador que posee; ello fomentan la curación y previene los efectos a largo y corto plazo de la radioterapia. Mientras los efectos secundarios agudos suelen ser de tipo transitorio, tal como los síntomas arriba descritos, como la fatiga y la anorexia, que se ponen de manifiesto durante la propia terapia de radiación, también puede haber cambios agudos locales a corto plazo, como alteraciones de la piel u otros síntomas agudos dependiendo la intensidad de los órganos expuestos, a saber, diarrea, incontinencia, micción dolorosa, micción frecuente, dificultad al tragar, sequedad bucal, blandura, ulceración, tos, dificulta respiratoria, dolor de garganta, ronquera. Esto síntomas son provocados por el efecto patológico local de la radiación en los tejidos de los órganos involucrados, provocando, por ejemplo, una reacción inflamatoria, descamación seca y mojada o necrosis incipiente. Asimismo hay otros síntomas de secuelas prolongadas , los cuales, si bien son menos frecuentes, afectan a 10% aproximadamente de los pacientes tratados, pudiendo provocar una debilitación intensa a largo plazo, a menudo bien como resultado de los cambios mencionados que no desaparecen con el tiempo, volviéndose crónicos, o bien secuelas prolongadas que pueden aparecer durante semanas a meses o incluso años después de la exposición a la radiación. Los efectos a largo plazo de la exposición a la radiación pueden provocar una afección de los órganos expuestos lo que podría resultar en un proceso irreversible con un resultado a menudo fatal, como por ejemplo en el tratamiento de los tumores del SNC como los tumores del cerebro o de la médula espinal, resultando en una radio-necrosis del tejido cerebral o en un grave daño de la médula espinal. Otros ejemplos de secuencias a largo plazo son, por ejemplo, la necrosis de tejidos blandos, tal como los radio-tratamientos intersticiales oro-faríngeos, la osteo-radionecrosis apreciado en los cambios necróticos de la mandíbula/maxilar o los efectos secundarios a largo plazo apreciadas en lesiones cutáneas, tales como fibrosis subcutánea, atrofia, telangiestasia, necrosis crónica, ulceración no resuelta y, tal como puede verse en el ejemplo de la tratamiento por radiación de los cánceres de cabeza y nuca, el desarrollo de estenosis que puede conllevar problemas al tragar, o la formación muy reducida de saliva, xerostomía, provocando graves problemas al masticar, tragar, formación de caries. O bien pueden desarrollarse mielopatías locales en tejido muscular expuesto o condro-necrosis apreciada en el daño del cartílago debido a la radiación del laringe, o ulceración o estenosis del esófago, provocando disfagia e incapacidad para tragar. La radiación del pulmón puede provocar fibrosis y/o neumonitis, secuelas a largo plazo del tratamiento de radiación del colon con irritación crónica del intestino o recto, causando diarrea crónica y molestias, requiriendo las estenosis obstructivas de una intervención quirúrgica.

[0159] El muestreo susodicho de efectos secundarios potenciales a corto y largo plazo de la terapia de radiación afecta seriamente las dosis máximas consideradas como seguras, ya que tiene consecuencias prácticas directas en tanto que limita las posibles dosis de radiación curativa o terapéutica prescritas en el curso de la terapia de radiación. Esto impone graves límites a la dosificación terapéutica de la radiación, ya que debe considerarse la relación de riesgo/beneficio terapéuticos.

[0160] La aplicación concomitante, precedente o posterior de la radioterapia con la viroterapia de MTH-68/H/VB no sólo puede causar un sinergismo de las calidades de destrucción de células del tumor de ambos tipos de terapias, tal como se describió previamente sino que también puede ser que la viroterapia con MTH-68/H/VB surta un efecto citoprotector en células sanas, con lo que la radioterapia será más segura y más selectiva con vista a las células tumorales. Más allá de ello, el MTH-68/H/VB es capaz de fomentar la curación de las células no tumorales sanas expuestas a la radiación, a través de su mecanismo citoprotector, tal como puede observarse en el tratamiento a largo plazo en tejido mucosal ulcerativo necrótico, apreciado en el tratamiento después de la radiación del cáncer de cabeza y nuca mediante posible aplicación intraoral de MTH-68/H/VB a la membrana mucosal afectada.

[0161] El presente invento puede asimismo servir como ejemplo en la necrosis por radiación, debido a la radioterapia intensiva a menudo requerida en su tratamiento. A menudo, la necrosis por radiación puede ser confundida con un nuevo crecimiento del tumor, siendo problemático de diferenciar, ya que el proceso de expansión continuo de la necrosis por radiación puede ofrecer el aspecto de una lesión ocupadora de espacio con consecuencias fatales. En tal caso podría administrarse MTH-68/H/VB y evitar con ello toda consecuencia fatal.

11. Ejemplos

[0162] El presente invento es ilustrado ulteriormente en los siguientes ejemplos que no limitan en forma alguna el invento.

Ejemplo 1: (fabricación del clon)

Preparación del cultivo maestro MTH68H/VB

[0163] El cultivo maestro MTH68H/VB fue derivado de la placa única singular que había sido elegida durante la purificación de placa del material matriz.

[0164] El cultivo maestro es propagado en huevos embrionarios de pollo, obtenidos de aves SPF. Ensayos rigurosos del cultivo maestro no revelaron indicio alguno de contaminación con bacterias aeróbicas o anaeróbicas, micoplasmas, hongos u otros virus que el virus de la enfermedad de Newcastle. El fluido alantoico fue diluido con una solución protectora del virus basada en leche no desnatada y liofilizado en una ampolla de vidrio.

Producción de la fórmula de prueba MTH68H/VB

[0165]

•

Eliminar y deshelar una parte alícuota del cultivo maestro reconstituido del congelador de -70°C. Diluir ulteriormente la suspensión de virus descongelada para asegurar que cada huevo reciba 0,1 ml de inóculo de la suspensión viral diluida cuyo título es 103,0 EID50, preferiblemente 105,0 EID50 por 1,0 ml (la determinación de EID50 es efectuada según los métodos habituales).

•

Los embriones de pollo SPF de 9 a 11 días de edad, preferiblemente de 10 días de edad, son inoculados con 0,1 ml de inóculo viral diluido en la cavidad alantoidea conforme al método regular.

•

Después de 24 horas de incubación, los huevos son sujetos a ovoscopía, desechándose los embriones muertos.

• Después de 4 días de incubación, los embriones son retirados de la incubadora y enfriados durante al menos 2 horas, preferiblemente durante la noche.

•

El fluido alantoideo es cosechado de los huevos, destinándolo a contenedores estériles, preferiblemente capaces de ser centrifugados.

•

Después del ensayo de esterilidad, la suspensión viral es recogida y prepurificada mediante centrífuga, luego

•

la concentración y la purificación ulterior se efectúan por ultracentrifugación.

•

La preparación de partes alícuotas en recipientes estériles ayuda a preparar la cantidad adecuada para una plena carga del liofilizador.

•

Almacenar a -70°C hasta el procesamiento ulterior.

•

El proximo paso es la produccion del producto a granel liofilizado que consiste en la suspension viral purificada con la EID50 requerida, preferiblemente de 109,2 de 1,0 ml y agentes protectores.

•

El virus mezclado con el agente protector es liofilizado.

[0166] Con vista a la producción en masa de preparados farmacéuticos de virus NDV, el producto a granel puede ser liofilizado, dividiéndose el pastel resultante y llenándolo en recipientes individuales.

Ejemplo 2: (formulación del clon)

[0167] El MTH68-H/VB que contiene la suspensión viral es liofilizado en viales estériles de vidrio que se cierran con un tapón de goma. Antes de la disolución del virus liofilizado que contiene el pastel con solución salina estéril, debe desinfectarse el tapón de goma.

[0168] Un ml de solución estéril es vertido en el vial para obtener la formulación final del producto listo para el uso.

Ejemplo 3: (tratamiento de pacientes)

Estudio de caso A - Dolor - Expectativa de vida prolongada - Calidad de vida - Efectos secundarios.

[0169] En una paciente de avanzada edad se diagnosticó un cáncer mamario de estadio cuatro, tres años antes. La paciente había sido sometida a varios ciclos de quimioterapias múltiples así como al tratamient6o con radioterapia local y a la medicación oral del dolor por sus extensas metástasis dolorosas hasta el hueso, incluyendo lesiones metastásicasencontradas en las vértebras, el fémur y la pelvis. Ésta experimentó repentinamente un empeoramiento de su estado clínico con anorexia, pérdida de peso, debilidad, se quedó postrada en la cama, fue incapaz de sentarse, con tos persistente y disnea grave que requería oxígeno suplementario continuo. Se le diagnosticaron lesiones pulmonares metastásicas. Se le comunicó a la paciente que ya no era elegible para un tratamiento oncológico ulterior. Se le trasladó a un hospicio, se le recetó oxígeno y morfina con una breve expectativa de supervivencia. La paciente inició la terapia con MTH-68/H/VB, que recibió diariamente hasta seis veces al día utilizando un vial por administración conteniendo 108 partículas virales por vial vía gotitas nasales empleando un spray nasal. Dentro de una semana del tratamiento viral, su tos disminuyó, desapareciendo luego completamente. Se volvió más fuerte, pudiendo sentarse nuevamente, recibiendo el tratamiento viral en forma intermitente utilizando un nebulizador inhalador conteniendo 108 partículas virales por administración. Finalmente fue nuevamente ambulatoria con ayuda de un caminador. Ya no necesitaba oxígeno. Su apetito volvió, comía con ganas y aumentó de peso. Ya no necesitaba las cantidades prescritas de medicación dolorosa por sus dolores metastásicas óseas. Un mes después, la paciente volvió para una radiografía de control que reveló que ya no tenía lesiones metastásicas en el pulmón. Dos meses más tarde su médico consideró que podía someterse nuevamente a un ciclo de quimioterapia. Comenzó con una baja dosis de tratamiento quimioterapéutico oral. Continuó su terapia viral tal como se había descrito, reduciendo la dosis diaria de 108 partículas virales de dos a tres veces por día, administrada bien por vía de gotas nasales o por nebulizador. La paciente siguió con buen apetito, sin experiencias de náusea o fatiga. Siguió siendo ambulatoria, volvió a participar en la fisioterapia y gozaba de una alta calidad de vida. Ya no experimentó dolores o molestias de sus lesiones óseas metastásicas, lo que le permitió suspender completamente su medicación contra el dolor. Si bien en los escaneos óseos sus lesiones metastásicas óseas no desaparecieron, tampoco hubo indicios de una progresión ulterior. Un año más tarde, la paciente murió de una embolía súbita. Había suspendido recientemente la administración de su dosis diaria profiláctica de Coumadin (las condiciones metastásicas avanzadas conllevan un elevado riesgo de hipercoagulación) que había tomado continuamente desde que se le diagnosticara hace cuatro años el cáncer de estadio IV.

Estudio de caso B - Quimioterapia - Efectos secundarios - Expectativa de vida prolongada - Calidad de vida.

[0170] El paciente fue un hombre de edad media en el que se diagnosticó un cáncer de vejiga. La patología confirmó un alto grado de carcinoma celular transicional que había invadido la pared muscular, registrándose asimismo una afección significativa del nódulo linfático. Se le diagnosticó el estadio IV. Después de la cirugía el paciente fue sometido a un régimen agresivo de quimioterapia de combinación. Sin embargo y debido a efectos secundarios, incluyendo un WBC bajo peligroso, el paciente ya no pudo concluir el ciclo completo de la quimioterapia. Algunos meses más tarde, las imágenes revelaron que el paciente tenía nuevas masas pélvicas inoperables. El paciente fue informado de que le quedaba sólo un tiempo de supervivencia limitado de menos de dos años. Se le ofreció un régimen paliativo de un protocolo quimioterapéutico. Después de comenzar la quimioterapia, el paciente comenzó a recibir una viroterapia concomitante con MTH-68/H/VB, empleando la aplicación de 108 partículas virales por dosis una vez por día. El paciente registró inmediatamente una reducción dramática de todos los efectos secundarios de la quimioterapia, siendo capaz de reanudar su vida deportiva anterior, incluyendo el deporte a vela y la equitación, mientras continuaba con su tratamiento quimioterapéutico. El paciente fue capaz de concluir el ciclo quimioterapéutico completo que ahora tan sólo le causaba molestias mínimas. Luego, un CT de seguimiento reveló una disminución del tamaño de sus masas pélvicas hasta que casi un año después ya no se apreció indicio alguno de una enfermedad metastásica. Suspendió la terapia con MTH-68/H/VB. En el curso de un año, el paciente volvió a acusar en el CT masas pélvicas, resolviendo someterse nuevamente a un ciclo de quimioterapia, añadiendo la viroterapia MTH-68/H/VB como tratamiento concomitante. Tal como había sucedido antes volvió a experimentar ausencia de efectos secundarios de la quimioterapia. Después de concluir el ciclo continuó el uso de la viroterapia con MTH-68/H/VB cambiando a una aplicación sublingual diaria de 107,4 partículas virales por dosis y permaneciendo libre de síntomas.

Estudio de caso C - Radio-necrosis

[0171] En una paciente de edad media se diagnosticó un carcinoma de células escamosas de la cavidad oral. Sólo hubo una afección local y ninguna lesión metastásica. Se le diagnosticó el estadio II. La paciente fue sometida a una terapia ablativa, pero no recibió ninguna quimioterapia. La paciente recibió una terapia de radiación intensiva después de la intervención quirúrgica. Después de la radiación experimentó disgeusia, ulceración, dolor, hemorragias, síntomas de mucositis que también afectaron su manera de hablar, y su capacidad de comer o beber o tomar una medicación oral, por lo que debía utilizar una paja, bajando considerablemente de peso. Sus síntomas persistieron durante seis meses sin alivio alguno y fue aparente que lo que parecía ser una condición aguda y transitoria se había convertido en una radio-necrosis. La paciente también sufrió una extracción dental considerable que suponía una desfiguración cosmética significativa. La paciente comenzó a recibir una terapia local con MTH-68/H/VB de 108,7 partículas virales/por aplicación dos veces al día, aplicados como lavado bucal. Asimismo se administró el MTH-68/H/VB de 108,7 en una sola aplicación diaria usando un spray intranasal. Después de una semana de tratamientos diarios, sus síntomas comenzaron a mejorar y después de un mes ya no hubo molestias, habiendo desaparecido las hemorragias y el dolor. Asimismo era capaz de ingerir nuevamente nutrición por vía oral. A pesar de que había curado su membrana mucosal, aún no se le consideraba apta para implantes dentales posterapéuticos a causa del daño irreversible a la mucosa. Sin embargo, la paciente ya no sufría de dolores u otras molestias.

Estudio de caso D - Radio necrosis

[0172] Un varón de 12 años presentó una masa cerebral grande. El tumor fue reducido extensamente por vía quirúrgica. La patología consideraba como diagnóstico un glioblastoma multiforme. El paciente fue sometido a un ciclo completo de radiación focal intensa. La condición del paciente permaneció estable y no recibió ninguna terapia ulterior. 9 meses después, el paciente comenzó a referir cefalalgia persistente. El MRI reveló la reaparición del tumor. El paciente inicio una quimioterapia intensiva, si bien durante la terapia su tumor aumentó constantemente. Hubo un grave deterioro de los signos clínicos, pasando en los próximos cinco meses a un estado de debilidad periférica en aumento y afasia, hasta el punto de quedar postrado en la cama. Se le informó de que sólo le quedaba corto tiempo para vivir y se suspendió toda terapia con excepción de esteroides intravenosos para tratar paliativamente el edema cerebral prominente. En la revisión del MRI se consideró la posibilidad de que la imagen reflejaba en realidad una radionecrosis crónica y no un tumor activo, dado que pueden apreciarse imágenes similares en la radionecrosis que a menudo son difíciles de distinguir de un tumor. Debido al carácter propagador y ocupador de espacio de la radionecrosis dentro de los límites estrechos de la estructura ósea del cráneo, la radionecrosis posnecrótica en los tumores cerebrales puede ser fatal. Sin embargo y debido a la condición clínica del paciente y la ubicación de la lesión no pudo practicarse ninguna biopsia. El paciente comenzó diariamente a recibir intravenosamente MTH-68/HNB 107,4 por dosis en hasta tres aplicaciones por día. Mejoró la condición clínica del paciente y su "tumor" comenzó a desaparecer en tamaño durante los primeros seis meses del tratamiento hasta que 1 año después había desaparecido completamente. El paciente sigue bajo un esquema de viroterapia de 108,0 partículas virales por dosis, aplicadas una vez por semana, por medio de un nebulizador. Si bien no ha podido comprobarse la existencia de una radio-necrosis en contraste al GBM, la mejora dramática y rápida del paciente y su remisión por lo visto curativa indujo a algunos oncólogos dudar el diagnóstico inicial de GBM, consideran seriamente que la condición había reflejado una radionecrosis.

Estudio de caso E -Quimioterapia - Efectos secundarios

5 [0173] Un joven se presentó con un nudo en la región de las amígdalas. La biopsia mostró un linfoma no-Hodgkin de célula B. No tenía lesiones metastásicas y se determinó el estadio I - II. El paciente fue tratado con una modalidad multiquimioterapéutica agresiva durante cuatro meses. El paciente recibió asimismo una terapia de radiación regional. Tres semanas después del alta se descubrió un nuevo tumor de la glándula salival, volviendo asimismo a aparecer el nudo meso-faringeal. Entonces la familia del paciente fue informado por los médicos de que hubo una esperanza tan sólo

10 limitada de una supervivencia a largo plazo. El paciente fue sometido a varios ciclos de una poli-quimioterapia intravenosa y agresiva y comenzó concomitantemente la viroterapia con MTH-68/HNB recibiendo una dosis diaria por aplicación de inhalación con un nebulizador de 108 partículas virales por dosis durante el año entero de su tratamiento quimioterapéutico. La modalidad del tratamiento poli-quimioterapéutico de altas dosis exigió varias estadías en el hospital. Llamó la atención que el paciente era capaz de someterse al agresivo tratamiento quimioterapéutico prescrito

15 sin la habitual náusea, anorexia y fatiga, contrariamente a los demás niños que compartían el mismo destino en el pabellón pediátrico. Durante toda su estadía en el hospital permaneció físicamente activo, jugaba y tenía buen apetito. La terapia fue exitosa y se mantuvo la remisión en el paciente.

11. Bibliografía

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<213> Virus de la enfermedad de Newcastle

<400> 1.

accaaacaga gaatccgtga gatacgataa aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgaacggg 60 tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagaccg aagcttaaac tcgagagagc cttctgccaa 120 catgtcttcc gtatttgacg agtatgaaca gctcctcgcg gctcagactc gccctaatgg 180 agctcacgga ggaggagaga aggggagcac cttaaaagtt gaagtcccgg tattcactct 240 5 taacagtgac gacccagaag atagatggaa ctttgcagta ttctgtctta agattgctgt 300 tagcgaagat gccaacaaac cactcagaca aggtgctctc atatctctct tatgctccca 360 ttctcaagtg atgaggaacc atgtcgccct tgcagggaaa cagaatgagg ccacactggc 420 tgttcttgag atcgatggtt tcaccaacag cgtgcctcaa tttaacaaca ggagtggagt 480 gtctgaggag agagcacaga gattcttgat gatagcaggg tccctccctc gggcatgcag 540 10 caacggtacc ccgttcatca cagctggggt tgaagataat gcaccagaag acatcactga 600 tactctggaa agaatcatct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtag caaaggccat 660 gactgcatat gagacagcgg atgagtcgga aacaagaaga atcaataagt atatgcagca 720 aggcagagtc caaaagaagt acatcctcca ccccgtatgt aggagcgcaa ttcaactcac 780 gattagacaa tctctggcag tccgcatttt cttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840 15 cacggcaggt ggaagttcca cttattatag cttggtaggg gacatagact catacatcag 900 gaacaccggg cttactgcat tcttcctgac actcaggtat ggaattaaca ccaagacatc 960 agcccttgca ctcagcagcc tcgcaggcga tatccaaaaa atgaagcagc tcatgcgtct 1020

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tgcctgtaga ggggatatgg agtgttacct gatatttgtc atgggctacc taggcgggcc 14280 tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc aaaaacgcta gtacagcggc atggcacact 14340 tttgtctaag tcagatgaga ttacactgac taggttattt acttcacagc aacagcgtgt 14400 aacagacatc ctatccagcc ctttaccgag actaatgaag tacttgagag agaatattga 14460 5 tactgcactg attgaagccg ggggacagcc tgtccgtcca ttctgtgcag agagtttagt 14520 gagcacacta acagacatga ctcagacaac ccagatcatc gccagccaca ttgatacagt 14580 cattcgatct gtgatctata tggaagcaga gggtgatctt gctgacacag tattcttatt 14640 taccccttac aacctctcta tggacgggaa aaagagaaca tcacttaaac agtgcacaag 14700 acagatctta gaggtcacaa tactgggtct cagagtcaaa aatctcaata aagtaggtga 14760 10 tgtaatcagc ctagtactca gaggtatgat ttctctggag gaccttctcc cactgagaac 14820 ctacttgaag tgtagtacct gccctaagta tttgaaggct gtcctaggta ttaccaaact 14880 caaagaaatg ttcacagacg cctctttatt atacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 14940 catgaaaact ataggcaatg cagtcaaggg atactatagt aactgtgact cttaaaggca 15000 accacatatc aataggccct ctttctagcc gatcgtattc ttgttgactt cattatacca 15060 15 tattagaaaa aaattgaatt ccgacccttt aagactcgta ttcggattca aataattatc 15120 tcagaaaaaa agtgcacgta gttgttcttg attatagtcc cgtcattcac caaatctttg 15180 tttggt 15186

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un clon del virus de la enfermedad de Newcastle que abarca la secuencia de nucleótido del ADN de Seq. Id. No. 1

   o

   según se depositó con la European Collection of Cell Cultures como Accesión número 06112101 el 21 de noviembre de 2006.

2. 2.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer que causa la muerte de las células tumorales

   o bien de una forma preventiva de terapia biológica de cáncer que destruye células cancerosas nacientes o residuales o que reduce el riesgo del desarrollo de lesiones metastásicas.

3. 3.

   El uso conforme a la reivindicación 2 en el que el tratamiento con el virus es combinado con la quimioterapia, la radioterapia (radiación a, ß o Y, radiación de rayos X, radiación de partículas), inmunoterapia o intervención quirúrgica.

4. 4.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de condiciones neoplásicas sensibles a la interferona, especialmente melanoma, linfomas (non-Hodgkins), leucemias (leucemia mieloide crónica, leucemia de células pilosas), cáncer de mama, carcinoma de vejiga, carcinoma de células renal, cáncer de cabeza y nuca, tumores carcinoides, cánceres del conducto biliar, cáncer pancreático, mieloma múltiple, sarcoma Kaposi, así como condiciones virales y autoinmunológicas sensibles a interferona y no neoplásicas, tales como esclerosis múltiple, condylomata acuminata, hepatitis, herpes, artritis reumática, enfermedad de Behcet, enfermedad pulmonar idiopática, estomatitis aftosa, osteoporosis maligna grave, cáncer cervical o SARS.

5. 5.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la reducción de la percepción del color en un paciente con cáncer.

6. 6.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la reducción de efectos secundarios de la quimioterapia en un paciente con cáncer tratado con agentes quimioterapéuticos, siendo el medicamento conteniendo el clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 administrado al paciente de cáncer antes, junto con o después del agente quimioterapéutico.

7. 7.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la reducción de la radionecrosis en un paciente con cáncer tratado con radiación, siendo el medicamento conteniendo el clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 administrado al paciente de cáncer antes, junto con o después de la radioterapia.

8. 8.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la reducción de efectos secundarios incluyendo las secuelas agudas o crónicas de la radioterapia en un paciente con cáncer tratado con radiación, siendo el medicamento conteniendo el clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 administrado al paciente de cáncer antes, junto con o después de la radioterapia.

9. 9.

   El uso de un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para mejorar la calidad de vida en un paciente con cáncer.

10. 10.

    Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que abarca como ingrediente activo un clon del virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación 1 junto con aditivos fisiológicamente aceptables.

11. 11.

    Un virus de la enfermedad de Newcastle conforme a la reivindicación que es purificado y congelado.

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