CN1929859A - 抗睾丸bvdv感染的疫苗接种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使易感性雄性动物对感染免疫来预防由牛病毒性腹泻病毒引起的睾丸感染的方法。

Description

抗睾丸BVDV感染的疫苗接种方法
技术领域
本发明涉及通过使易感性雄性动物对感染免疫来预防由牛病毒性腹泻病毒引起的睾丸感染的方法。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛及其它易感性动物具有经济意义的病原，其能够排入持久且急性感染的公牛及其它易感性雄性动物的精液。此种病原造成易感性动物的胃肠道疾病、呼吸道疾病及生殖疾病。
虽然因BVDV的高度病原性菌株所引发的胃肠道疾病及呼吸道疾病在临床上较为剧烈，但因BVDV所引发的生殖方面的损失于经济上更为显著。BVDV传播的参考文献已经确立公牛精液中的病毒可感染易感性的、授精的母牛，造成受孕率的降低、胎牛早期死亡、流产、及生下持续性感染BVDV的小牛。1-3
持续性感染的公牛大部分必然感染易感性的、授精的母牛，原因在于公牛精液中含高浓度病毒(107.6细胞培养感染剂量(50％)/mL)(CCID50/mL)。3比较上，急性感染的免疫活性公牛的感染睾丸在精液中排出较低浓度病毒(5至75CCID50/mL)，但也能够传播BVDV。4一项调查研究提出，在精液中25至50CCID50/mL的病毒可感染5％授精的小母牛，并且随后由被感染的小母牛水平传播BVDV给怀孕母牛群，结果导致其胚胎的持续感染。5
两组调查人员也报导后青春期公牛的急性感染能够造成睾丸的持续BVDV感染。6，7一独特病例出现在新西兰人工授精站所养殖的血清阳性非病毒血症(nonviremic)公牛。该头公牛于试图由血液中分离BVDV呈阴性反应后被纳入人工授精中心。尽管存在有抗BVDV中和抗体，该公牛仍然持续在精液中排出低浓度(2×103CCID50/mL)病毒，且在被处死前持续11个月。急性感染来源未明。通过对该公牛的尸体剖检，只由公牛睾丸中分离出病毒。6此公牛精液中的病毒导致三头接受授精的血清阴性小母牛中的一头出现感染和随后的血清转变。8第二个人工诱生感染的案例中，3头非病毒血症的后青春期公牛中的2头的精液通过逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测到BVDV长达7个月时间，但无法通过标准组织培养方法分离出病毒。初次暴露后5个月收集的血清于静脉注射一头血清阴性小牛后造成小牛的BVDV感染。暴露当天收集的血清以及暴露后7个月收集的血清对另外两头血清阴性小牛并未造成感染。7
两项研究皆发现，急性感染的公牛可排出BVDV精液，该精液具有可接受的精子浓度、活力及形态。4，5另一项研究发现急性感染的公牛精子活力降低，头带缺损增加，精子头部小，以及近端小滴(proximaldroplet)。9
虽然通过自然育种的传播力以及对公牛生育力的影响的细节上未确立，但显然由于BVDV传播给母牛造成的生殖损失，使易感性雄性动物睾丸感染具有显著的经济冲击。
由于已知睾丸为免疫阻隔，因此睾丸的病毒感染造成透过免疫接种进行的治疗或预防上的重大挑战。出乎意外地，发明人显示免疫接菌株控制易感性动物的BVDV睾丸感染的有效手段。
参考文献
1.Meyling A，Jensen AM.Transmission of bovine virus diarrhea virus(BVDV)by artificial insemination(AI)with semen from apersistently-infected bull.Veterinary Microbiology 1988；17：97-105.
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3.McGowan MR，Kirkland PD.Early reproductive loss due to bovinepestivirus infection.British Veterinary Journal 1995；151：263-270.
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6.Voges H，Homer GW，Rowe S，et al.Persistent bovine pestivirusinfection localized in the testes of an immuno-competent，non-viraemicbull.Veterinary Microbiology 1998；61：165-175.
7.Givens MD，Heath AM，Brock KV，et al.Detection of bovine viraldiarrhea virus in semen obtained from inoculation of seronegativepostpubertal bulls.AJVR 2003；64：428-434.
8.Niskanen R，Alenius S，Belak K，et al.Insemination of susceptibleheifers with semen from a nonviraemic bull with persistent bovine virusdiarrhea virus infection localized in the testes.Reproduction in DomesticAnimals 2002；37：171-175.
9.Paton DJ，Goodey R，Brockman S，et al.Evaluation of the quality andvirological status of semen from bulls acutely infected with BVDV.Veterinary Record 1989；124：63-64.
发明内容
本发明包括一种在易感性雄性动物中预防或治疗睾丸BVDV感染的方法，该发明包括对所述动物施用有效量的疫苗，所述疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本发明也包括一种选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗的疫苗，其用作预防易感性雄性动物睾丸BVDV感染的药物。
本发明进一步包括一种疫苗在制备用于在雄性动物中预防睾丸BVDV感染的药物中的应用，所述疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本发明进一步包括一种预防易感性雄性动物中睾丸BVDV感染的方法，该方法包括识别具有较高BVDV睾丸感染风险的动物；以及对该动物施用有效量的疫苗，该疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本发明也包括一种用作在对BVDV睾丸感染高度易感性的雄性动物中预防睾丸BVDV感染的药物的疫苗，所述疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本发明进一步包括一种疫苗在制备用于在对BVDV睾丸感染高度易感性的雄性动物中预防睾丸BVDV感染的药物中的应用，所述疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本发明也包括一种制品，其包括含有BVDV疫苗的一个或多个容器，该疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗；以及将该BVDV疫苗用于预防易感性雄性动物的睾丸BVDV感染的说明书。
易感性雄性动物包括公牛、公羊及公猪。较佳具体方式中的动物为公牛。
疫苗及制品可以同时包括第1型BVDV改性活疫苗及第2型BVDV改性活疫苗。
疫苗可得自致细胞病变的病毒或非致细胞病变的病毒。
可选择地，本发明的疫苗及制品可包括至少一种附加抗原，该抗原选自牛疱疹病毒(BHV-1)；副流行性感冒病毒第3型(PIV3)；牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemmorrhagia)、问号形巴姆那钩端螺旋体(Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospira bratislava)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝杆菌(Mycobacterium dispar)。
在优选的实施方式中，本发明的疫苗及制品可包括至少一种选自牛疱疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的附加抗原。
附图说明
图1-第2型BVDV激发后睾丸活体剖检样品的BVDV阳性百分比。图例：VI＝病毒分离，PCR＝聚合酶链反应，IHC＝免疫组织化学a，b有不同小写字母上标的百分比的差异显著(P≤0.05)。
具体实施方式
本发明提供一种对易感性雄性动物治疗或预防受BVDV病毒的睾丸感染及其所导致的排放BVDV病毒于精液中的方法。本发明的方法有效预防或减少因第1型BVDV及第2型BVDV引发感染所造成的睾丸感染。
定义与缩写
“牛病毒性腹泻病毒”(“BVDV”)是一种属于黄病毒科Flaviviridae)及瘟病毒属(Pestivirus)的小型正义单股RNA病毒。基于感染易感性细胞单层时体外是否存在可见的细胞致病效应，说明有两生物型BVDV，即细胞致病型(CP)及非细胞致病型(NC)。非细胞致病生物型可由大部分田野爆发(field outbreak)感染病例分离出。牛病毒性腹泻病毒菌株可基于病毒RNA内部的实质差异，被分类为两种(即基因型)，第1型及第2型。
术语“易感性动物”表示对BVDV感染易感的任何动物，例如牛、羊、及猪。
属于“易感性雄性动物”表示任何对BVDV睾丸感染易感的雄性动物，例如雄性牛、羊、及猪。未经去势的雄牛称作“公牛”。未经去势的雄羊称作“公羊”。未经去势的雄猪称作“公猪”。
就睾丸感染而言的术语“预防”或“控制”表示减少或去除易感性雄性动物睾丸受毒性第1型BVDV及第2型BVDV感染的风险；改善或减轻感染症状，或加速感染的复原。如果通过睾丸活体剖检或精液中存在的病毒评估病毒或细菌负载减少，则该免疫接种被视为治疗性。
术语“感染”可表示急性或持续性感染BVDV。
“急性”或“短暂”BVDV感染出现于免疫活性易感性动物暴露于BVDV的细胞致病菌株或非细胞致病菌株。虽然以亚临床感染最为常见，但可观察得例如抑郁、缺乏食欲、口腔糜烂和溃疡、腹泻及死亡等症状。受到急性感染的免疫活性动物可传播病毒给易感性动物，但传播力远低于持续性感染动物的效力。
急性睾丸感染表示由于短暂系统性感染，易感性雄性动物的睾丸出现急性感染或短暂感染。若干报告指出急性感染的公牛能够排出精液中病毒，而该精液具有可接受的精子浓度、活力及形态。但于其它报告中，作者观察到与急性感染一致的精子活力降低，头带缺损增加，精子头部小，以及近端小滴。
持续性感染BVDV出现于在妊娠大约125日发展出免疫活性之前，易感性动物感染BVDV非细胞致病菌株。持续性感染动物对感染其的菌株发展出免疫耐受性，其作为病原储存场所，并且一般会终生排出大量病毒于尿液、粪便、精液、唾液、泪液及鼻粘液中。
持续性睾丸感染表示由于急性或持续性的系统性感染，易感性雄性动物的睾丸的持续性感染。
本发明使用的疫苗
本发明使用的疫苗包括第1型BVDV和/或第2型BVDV以及兽医上可接受的载体。
传统上病毒疫苗分成两类：
活疫苗含有已经经过处理或生长而使病毒较不具有病原性(减毒)的活病毒，以及含有杀死的(灭活)病毒粒子的疫苗。就BVDV而言，病毒本身可为致细胞病变的或非致细胞病变的。牛病毒性腹泻病毒菌株也可以基于病毒RNA内部的实质差异，分为两种(即基因型)，第1型及第2型。如此，原则上可能存在八大类BVDV疫苗，但大部分商用疫苗是基于致细胞病变的病毒。
目前市售BVDV疫苗是经过化学方式灭活的病毒(McClurkin等人，Arch.Virol.58：119(1978)；Fernelius等人，Am.J.Vet.Res.33：1421-1431(1972)；及Kolar等人，Am.J.Vet.Res.33：1415-1420(1972))。此等疫苗一般需要施用多剂来达成初步免疫接种，提供短时间的免疫力，且无法保护胚胎的传染(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.11：615-625(1995))。对于羊，曾经报告基于经纯化的E2蛋白质的亚单位疫苗(Bruschke等人，Vaccine 15：1940-1945(1997))。不幸地是，似乎只有一种疫苗可保护胚胎不受感染，此项保护仅限于同源病毒中的一种菌株。
此外，曾经使用已经减毒的BVD病毒来制造改性活病毒(MLV)疫苗，该BVD病毒的减毒通过于牛细胞或猪细胞重复继代培养来进行的(Coggins等人，Comell Vet.51：539(1961)：及Phillips等人，Am.J.Vet Res，36：135(1975))，或以化学方式诱生造成病毒的温度易感性表现型的突变来进行(Lobmann等人，Am.J.Vet.Res.45：2498(1984)；及Lobmann等人，Am.J.Vet.Res，47：557-561(1986))。单一剂MLV疫苗证实可充分提供免疫力，且接受疫苗接种的牛只的免疫力持续时间长达数年(Coria等人，Can.J.Con.Med.42：239(1978))。此外，对以MLV型疫苗免疫接种的小牛也报导可产生交叉保护效果(Martin等人，In Proceedings of the Conference Res.Workers’Anim.Dis.，75：183(1994))。但有关此等疫苗使用的安全性考虑，例如可能于胚胎传播病毒，造成重大问题(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food.Anim.Pract.，11：615-625(1995))。
在优选的实施方式中，第1型BVDV成分是改性活致细胞病变的病毒(cpBVD-1菌株NADL-国家动物疾病中心，美国农业部，Ames，Iowa，ATCC VR-534)。在另一优选的实施方式中，第2型BVDV成分为改性活致细胞病变的病毒(cp BVD-2菌株53637，ATCC No.PTA-4859)。如共同审查中的美国专利申请第60/490,834号，申请日2003年7月29日所述，二分离物皆含有NS2-3区的插入物。经过减毒的cp BVDV-1含有编码核苷酸位置#4993(NADL序列编号)的胸腺嘧啶核苷的3’端序列的Bos taurus DnaJ1，该胸腺嘧啶核苷是于氨基酸位置1536的甘氨酸残基的编码密码子的第三核苷酸。减毒cp BVDV-2含有编码同一个染色体组位置序列的Bos Taurus DnaJ1的插入物。在另一优选的实施方式中，改性活抗原经过干燥、冻干、或玻璃化。
在一个实施方式中，本发明的疫苗组合物包括有效量的一种或多种前述BVD病毒，优选为cpBVD-1菌株NADL(cpBDV-1菌株NADL—国家动物疾病中心，美国农业部，Ames，Iowa，ATCC VR-534)；cpBVD-2菌株53637(ATCC No.PTA-4856)、IBRV菌株C-13(CutterLaboratories)；PIV3菌株Reisinger(Univ.Nebraska)；BRSV菌株375(Veterinary Medical Research Institute，Ames，Iowa)。纯化后的BVD病毒可直接用于疫苗组合物，或优选地，BVD病毒可进一步于体外通过一连串的继代培养而改性。典型地，疫苗含有约1×102至约1×1010噬斑形成单位或TCID50单位病毒，含有兽医上可接受的载体以及可选地辅剂，体积为约0.1毫升至5毫升，且优选约2毫升。疫苗组合物中可有效提供保护效果的病毒的精确数量可由熟练的兽医师判定。适合用于疫苗组合物的兽医上可接受的载体可为后文说明的任一种载体。
典型地，疫苗含有约1×102至约1×1010噬斑或群落生成单位病毒，含有兽医上可接受的载体以及辅剂，体积为约0.1毫升至5毫升，且优选约2毫升。疫苗组合物中可有效提供保护效果的病毒的精确数量可由熟练的兽医师判定。适合用于疫苗组合物的兽医上可接受的载体可为后文说明的任一种载体。典型给药途径为肌肉注射或皮下注射约0.1毫升至约5毫升疫苗。本发明的疫苗组合物也包括其它活性成分，例如其它抗BVDV的疫苗组合物，例如W95/12682、WO99/55366、美国专利第6,060,457号、美国专利第6,015,795号、美国专利第6,001,613号及美国专利第5,593,873号。
疫苗接种可通过单次接种或多次接种达成。若需要，可由接种的动物收集血清，并测试是否存在BVD病毒抗体。在本发明的另一实施方式中，疫苗组合物用来处理BVDV睾丸感染。因此，本发明提供控制或预防动物体因第1型或第2型BVD病毒、或第1型与第2型病毒的组合所引起的感染的方法，该方法通过将有效量的本发明的BVDV病毒为动物给药。在另一实施方式中，本发明的疫苗组合物可有效改善兽群生育力，并减少易感性雄性动物的睾丸感染风险。
在实施本发明方法时，本发明的疫苗组合物优选经肌肉或皮下途径施予牛只，但其它给药途径也可使用，例如经口、经鼻内(例如喷雾剂或其它无针给药)、淋巴结内、皮内、腹膜内、直肠或阴道给药、或通过组合途径给药。优选动物颈区的肌肉给药。可能需要追加接种，且可调整剂量，从而提供优化的免疫接种。
“免疫原性”表示BVD病毒能够于动物中激发抗第1型或第2型BVD病毒或同时抗第1型与第2型BVD病毒的免疫反应。该免疫反应可以是主要由胞毒性T细胞媒介的细胞免疫反应，或主要由辅助T细胞媒介的体液免疫反应，其又反过来活化B细胞从而导致抗体的制造。
根据本发明，病毒优选在用于免疫原性组合物之前通过细胞培养中的一系列继代培养而减毒。改性方法是本领域技术人员所公知的。
本发明方法使用的疫苗组合物也可包括其它活性成分，例如其它抗BVDV的免疫原性组合物，例如在共同审查中的专利申请第08/107,908、WO 95/12682、WO 99/55366、美国专利第6,060,457号、美国专利第6,015,795号、美国专利第6,001,613号及美国专利第5,593,873号。
此外，本发明的目的可通过施用BVDV第1型和/或第2型以外的其它抗原(“组合疫苗”)来实现，此等抗原包括但不限于BRSV、BHV-1、PTV2、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemmorrhagia)、问号形巴姆那钩端螺旋体(Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospira bratislava)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝杆菌(Mycobacterium dispar)。在一些优选的实施方式中，组合疫苗来源于Bovi-ShieldGOLDTM IBR-BVD、Bovi-ShieldGOLDTM3、Bovi-ShieldGOLDTM 5、Bovi-ShieldGOLDTM IBR-BVD-BRSV-LP、Bovi-ShieldGOLDTM FP 5L5、Bovi-ShieldGOLDTM FP 5VL5或PreguardGOLD FP 10(Pfizer，Inc.)。
此外，本发明方法采用的免疫原性组合物及疫苗组合物可包括一种或多种兽医上可接受的载体。如本文所使用的，“兽医上可接受的载体”包括任一种及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、辅剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。辅剂包括但不限于RIBI辅剂系统(Ribi Inc.)、矾土、氢氧化铝凝胶、胆固醇、水包油型乳液、油包水型乳液，例如Freund’s完全辅剂及不完全辅剂、Block共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、AMPHIGEN辅剂、皂苷、Quil A、QS-2J(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)或其它皂苷部分、一磷酰基脂质A、Avridine脂质-胺辅剂、得自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、或胞壁酰基二肽等。疫苗组合物可进一步包括一种或多种其它免疫调节剂，例如介白细胞间介素、干扰素、或其它细胞因子。本发明方法采用的疫苗组合物也可包括艮他霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。虽然本发明的上下文中有用的辅剂及添加剂的数量及浓度可以方便地由技术人员测定，但本发明要涵盖在2毫升剂量的疫苗组合物中包括约50ug至约2000ug辅剂的组合物，且优选约500ug/2毫升剂量疫苗组合物。在另一优选的实施方式中，本发明涵盖的疫苗组合物包括约1ug/ml至约60ug/ml抗生素，并且优选小于约30ug/ml抗生素。
本发明方法采用的疫苗组合物可以依据给药途径制作为各种形式。例如疫苗组合物可制作成适合注射用的无菌水性溶液或分散液，或使用冻干技术制造为冻干剂型。冻干疫苗组合物一般维持于约4℃，且可于含有或不含有辅剂的稳定性溶液(例如盐水和/或HEPES)中重新调制。
本发明的疫苗组合物可施予动物体来诱生对第1型或第2型BVD病毒、或对第1型及第2型BVD病毒的免疫反应。如此，本发明的另一个实施方式提供刺激抗第1型或第2型BVD病毒、或抗第1型与第2型BVD病毒的组合的免疫反应的方法，该方法通过对动物体施用有效量的如本发明前面所述的免疫原性组合物。“动物体”表示包括任一种对BVDV感染易感性的动物，诸如牛、羊、及猪。
根据本发明的方法，施予动物体的优选免疫原性组合物包括BVDV cpNADL病毒和/或BVDV cp53637病毒。含有BVDV病毒的免疫原性组合物，特别是在培养中通过一系列继代培养而改性的，优选透过肌肉或皮下途径施予牛，但也可使用其它给药途径，例如通过经口、经鼻内、经淋巴结内、经皮内、经腹膜内、经直肠或经阴道给药、或通过各种途径的组合给药。
免疫接种方案可使用本领域公知的程序优化。可对动物施用单一剂量，或可间隔两周至十周接种两次或多次。依据动物年龄，可再度施用免疫原性或疫苗组合物。例如，本发明涵盖于六月龄之前对健康牛只免疫接种，而于六月龄之时再度免疫接种。在另一实施例中，本发明涵盖于育种前约5周(或于加至牛群前5周)对育种前的牛免疫接种，并且可选地于育种前约2周或于妊娠期间再度免疫接种来保护胚胎不受BVDV第1型及第2型感染。单剂本发明组成物也可于第一剂后约3至4周施用。使用单剂组合疫苗半年再度接种疫苗，预期也可预防BVDV胚胎感染。
在牛只中诱生免疫反应的程度及本质可使用多项技术评估。例如可由免疫接种动物收集血清，测试是否存在有BVDV病毒的特异性抗体，例如通过传统的病毒中和化验。
术语“有效量”表示对给药动物足够引起免疫反应的组合疫苗的量。免疫反应可不受限制地包括诱生细胞免疫力及/或体液免疫力。疫苗的治疗有效量可依据使用的特殊病毒、牛只情况和/或感染程度而改变，治疗有效量可由兽医师决定。
灭活(部分或全细胞)和改性活疫苗
用于本发明方法的灭活或改性活疫苗可使用本领域公知的多种方法制备。
例如，BVDV分离物可使用已知技术直接从感染母牛的子宫得到。
BVDV分离物可使用多种已知方法减毒，例如包括一系列继代培养。除了改性活病毒分离物外，本发明的方法采用的疫苗产品也可包括适量的一种或多种常用辅剂。适当辅剂可不受限制地包括：矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂；糖苷，例如皂苷衍生物，如Quil A or GPI-0100；Pluronic多聚醇；聚阴离子类；非离子性嵌段聚合物，例如Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；肽：矿物油，如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，France)、聚羰乙烯、Amphigen、Amphigen Mark II(Hydronics，USA)、Alhydrogel、油乳液，例如BayolF/Arlacel A之类的矿物油和水的乳液、或植物油、水及卵磷脂之类的乳化剂的乳液；矾土；牛细胞因子；胆固醇：及辅剂组合。在优选的实施方式中，含皂苷的水包油型乳液通常经过微流体化。
用于本发明方法的特别优选的BVDV第1型及第2型源为Bovi-ShieldGOLDTM系疫苗产品(PFIZER INC.)，其含有BVDV菌株NADL(得自国家动物疾病中心(NADC)，USDA，Ames，IA)及BVDV第2型菌株cp BVDV菌株53637(Univ.Guelph，Guelph，Ont.)(ATCC No.PTA-4859)。
优选地，菌株NADL及53637为改性活菌株。根据本发明，本发明的菌株可以用市售辅剂辅助，优选为Quil A-Cholesterol-Amphigen(Hydronics，USA)。本发明的免疫原性和疫苗组合物的优选剂量为约2.0毫升。本发明方法采用的组合物中可包括防腐剂。本发明涵盖的防腐剂包括艮他霉素及硫柳汞。也可添加载体，优选为PBS。改性活疫苗的制备，例如通过继代培养将有毒菌株减毒，是本领域已知的。
改性活BVDV分离物也可结合下列细菌及病毒，包括但不限于牛疱疹病毒第1型(BHV-1)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、副流行性感冒病毒(PIV3)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemmorrhagia)、问号形巴姆那钩端螺旋体(Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospira bratislava)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝杆菌(Mycobacterium dispar)。
给药剂量和方式
根据本发明，将有效量的BVDV或组合疫苗施予易感性雄性动物，提供与第1型及第2型BVDV有关的抗睾丸感染的有效免疫。在一个实施方式中，疫苗分两剂，间隔约3至4周施予小牛。例如，初次给药是在动物约1月龄至约3月龄。第二次给药是在初次施用组合疫苗后的约1周至约4周。
在另一优选实施方式中，给药是在动物育种前或进入人工授精设施前约4至5周进行。随后各剂疫苗的施用优选以每年一剂的基准进行。在另一优选的实施方式中，约6月龄之前接受疫苗接种的动物须于6月龄之后再度搂种疫苗。随后各剂疫苗的给药优选以每年一剂为基准进行，但预期每两年及每半年施用随后各剂疫苗也包括在本发明的范围中。
有效疫苗剂量依据疫苗成分及给药计划决定。典型地，当改性活BVDV制剂用于疫苗时，当一次施予易感性雄性动物时，该疫苗含有每剂约102至约1010 TCID50单位的BVDV，并且优选每剂约104至约107 TCID50单位的第1型BVDV及第2型BVDV。优选地，对易感性动物一次给药时，可提供有效免疫力的疫苗含有约104至107 TCID50单位/剂量第1型BVDV和第2型BVDV，并且优选约105 TCID50单位/剂量。随后各剂疫苗的给药优选以每年一次为基准进行。约6月龄之前接种疫苗的动物应在6月龄之后再度接种疫苗。随后各剂疫苗的给药优选以每年一次为基准进行。
根据本发明，当施用优选产品Bovi-ShieldGOLDTM 5(Pfizer，Inc.)时，该产品优选以一次约0.1毫升至约5.0毫升的量给药，更优选约1.5毫升至约2.5毫升，进一步优选约2毫升。随后各剂疫苗的给药优选以每年一次为基准进行。约6月龄之前接种疫苗的动物应在6月龄之后再度接种疫苗。随后各剂疫苗的给药优选以每年一次为基准进行。
根据本发明，给药可通过已知途径达成，包括经口、经鼻内、局部、经皮、及经肠道外(例如静脉、腹膜内、皮内、皮下或肌肉)。优选的给药途径为肌肉或皮下给药。
本发明也涵盖单一施用初次剂量，接着为每年再度接种疫苗，而免除每年再度接种之前对小牛施用额外剂量疫苗而产生和/或维持抗感染的免疫力的必要性。
根据本发明施用的疫苗可包括其它成分，例如辅剂(例如矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如胆固醇、溶血卵磷脂；糖苷，例如皂苷衍生物，如Quil A、QS-21或GPI-0100；Pluronic多聚醇；聚阴离子；非离子性嵌段聚合物，例如Pluronic F-127；肽；矿物油，例如Montanide ISA-50、聚羰乙烯、Amphigen、Alhydrogel、油乳液，例如矿物油，如BayolF/Arlacel A和水、或植物油、水及卵磷脂之类的乳化剂的乳液；矾土；牛细胞因子；及辅剂组合。
根据本发明，将有效量的疫苗施予约3月龄的易感性雄性动物，可提供抗睾丸感染的有效免疫力。
在优选的实施方式中，疫苗经肌肉给药。在另一优选的实施方式中，疫苗经皮下给药。此外，优选疫苗剂量包括约1毫升至约7毫升，优选约2毫升，每毫升含有约102至约1010 TCID50单位/每剂病毒。组合疫苗优选施予动物两次；一次于约1月龄至约3月龄，一次于约5周至3周后。本发明也涵盖每年重新疫苗接种单剂。
有较高BVDV感染风险的动物的识别
本发明进一步包括一种在对BVDV感染易感性的雄性动物中预防睾丸BVDV感染的方法，包括：a)识别具有较高BVDV睾丸感染风险的动物；以及b)对该动物施用有效量的疫苗，该疫苗选自第1型BVDV死疫苗、第2型BVDV死疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
为了识别有较高BVDV感染风险的动物，熟练的技术人员了解当BVDV感染被导入先前未感染的兽群时，或易感性动物接触另一患有BVDV感染的易感性动物时，动物有较高感染风险。BVDV是以粪-口方式在动物间传播的。激发有症状的感染所需的病毒负载与BVD病毒的型别和种系有关，且与病毒于兽群间传播的速度有关。感染动物可以由症状识别。常见BVDV感染的表征包括：流产发作(abortionstorm)、不孕症、不规则发热周期、胚胎早期死亡、胎儿干尸化、免疫抑制、痢疾、血小板减少及脑部发育不全。出现疾病症状之前通常先有白血球减少，至今为止的试验都致力于识别此种效应。
血清学研究显示有高百分比BVDV感染的牛，包括被视为持久性感染(PI)的，维持临床上无征状。因此，识别感染动物的优选方法是检测是否存在病毒本身，而非仰赖于疾病的征状。已经发展出数种不同试验方法来检测BVDV，和/或检测BVDV感染动物。此等试验方法包括：逆转录聚合酶链反应、酶联免疫测定法(ELISA)、标准病毒分离技术、及免疫组织化学(Haines等人，“MonoclonalAntibody-Based Immunohistochemical Detection of Bovine Viral DiarrheaVirus in Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissues，”Vet.Pathol.，29：27-32(1992))。
PCR及病毒分离技术由于其特有的灵敏度，因此皆可检测极低浓度的BVDV。例如耳刻痕活体剖检样本(ear notch biopsy sample)的组织样本的免疫组织化学，也是检测持久性感染动物的有效技术。ELISA技术虽然略微不敏感，但适合作为检测动物BVDV感染的无限诊断工具，因ELISA技术价廉，可于短时间内获得结果，且无需高度熟练的技术人员和高度特殊的实验室设备。
检测BVDV感染的ELISA方法在参考文献中描述。参见Huchzermeier等人的美国专利第6,174,667号及WO99/15900和美国专利申请第20030143573号，并与其它方法比较，“Comparison of anAntigen Capture Enzyme-Linked Assay with Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction and Cell Culture Immunoperoxidase Tests forthe Diagnosis of Ruminant Pestivirus Infections，”Vet.Microbiol.，43：75-84(1995))。
通过下列实施例进一步举例说明本发明，但不被限制于以下实施例。
实施例1
睾丸的保护：研究综述
使用第1型BVDV及第2型BVDV调制的Bovi-ShieldGOLDTM 5疫苗系，于2003年11月引进给牛饲养产业，来获得疫苗接种提供的对第2型BVDV的最佳胚胎保护程度。此处的报告是获得许可执照前期的功效研究结果，起评估青春期前期使用Bovi-ShieldGOLDTM 5疫苗接种是否可有效预防严重的第2型BVDV激发的睾丸感染10，且与安慰剂(Bovi-ShieldIBR-PI3-BRSV)作比较。
全部纳入较广泛的第2型BVDV激发研究的小公牛(n＝17)接受进一步评比，来判定疫苗接种Bovi-Shield GOLDTM 5是否可有效预防BVDV的睾丸感染。初期调查研究的小牛皆为3月龄至4月龄断初乳的小牛(雄性及雌性)。使用含有最低免疫剂量(最低免疫剂量是在疫苗许可执照核发之前确立的，且反应比终产物中存在的抗原病毒更低量。最低免疫剂量的测定有助于确保产品以释放浓度使用时，一致性地刺激足够对抗疾病的保护)的第1型BVDV及第2型BVDV二者的配制物免疫接种后28日，全部接种疫苗的小牛及接受安慰剂的对照组小牛经鼻内以非致细胞病变的第2型BVDV菌株24515激发。菌株24515分离自加拿大一次严重的BVD暴发感染，杀死感染牛群超过40％。激发后，全部10头对照组小牛皆严重发病，发病特征为长时间的病毒血症(9至14日)，发烧4至9日达到105.6至107.2，白血球减少(1至9日)，血小板减少(＜100,000每μL)，发病(4至9日)，及高死亡率(10头对照中7头死亡(70％))。相反地，免疫接种组的小牛只有1头出现病毒血症，6头发烧1或2日，1头的白血球减少经历1日，皆未出现血小板减少，且无死亡。整体而言，20头接受疫苗接种的小牛中18头于整个研究期间维持健康，只有2头于第1日显示抑郁。此二项观察皆未关联先前或目前的病毒血症、发烧、白血球减少或血小板减少。11
BVDV睾丸感染的评估是始于激发后约2周。如表1所示，睾丸样本是对2头安慰剂对照组小牛于研究的第41日由尸体剖检收集，而其余5头对照组小牛以及Bovi-ShieldGOLDTM 5疫苗接种小牛于第42日由活体剖检取得睾丸样本。第二样本也是得自10头Bovi-ShieldGOLDTM 5疫苗接种组中的7头，其于第56日仍然可取得样本。全部样本皆使用组织培养分离法、核酸放大法(RT-nPCR)、及免疫组织化学试验法来检测BVDV。收集及检测睾丸样本的工作人员未知处理组别的分配。
                   表1-研究设计：第2型BVDV激发后的睾丸保护
 治疗组   小公牛数目     肌肉接种疫苗       鼻内激发*   取样日
  日   剂量   日   剂量
 安慰剂组Bovi-ShieldGOLDTM 5   710   00   2毫升2毫升   2828   5毫升5毫升   41，4242，56
*分离物24515从the University of Guelph，Guelph，Ontario，Canada获得。
7头接种安慰剂的小公牛中的两头在第41日剖检取样，其它5头小公牛在第42日取样。
全部10头小公牛在第42日取样，第2份样品在第56日从7头小牛中取样。
病毒分离和PCR化验在the Auburn University VeterinaryPathobiology和Clinical Sciences Laboratory进行，免疫组织化学分析在the University of Nebraska-Lincoln Veterinary Diagnostic Center进行。数据由Pfizer Animal Health，Veterinary Medicine and Research，Biometrics，Technology and Quality的代表以分类程序进行分析(SAS/STATSoftware Changes and Enhancements through Release 6.12，SAS Institute，Cary，NC，或SAS/STAT User’s Guide Version 8和SAS Procedures GuideVersion 8)。使用Fisher’s Exact Test比较每个治疗组中具有至少一个BVDV阳性测试结果的动物的比例。适当地计算描述统计。
结果
表2和图1总结了治疗组在睾丸组织剖检样本中BVDV检测的百分比。7个得自接种安慰剂和激发的公牛的睾丸样本中的6个(85.7％)检测到BVDV核酸或抗原。相反地，在得自激发并接种Bovi-ShieldGOLDTM的小公牛的睾丸样本中没有检测到BVDV核酸或抗原(0％)，由显著差异(P≤0.05)。
                        表2-睾丸样本BVDV化验结果的概要
  组   小牛数目      BVDV阳性数目   BVDV阳性   阳性小牛％
  VI   PCR   IHC
  安慰剂Bovi-Shield GOLD   710   50   60   40   60   85.7％a0.0％b
VI＝病毒分离，PCR＝聚合酶链反应，IHC＝免疫组织化学
a，b栏内有不同小写字母上标的百分比的差异显著(P≤0.05)。
结论与讨论
研究结果证明了接种Bovi-ShieldGOLDTM 5的小牛的安全性和功效。用最小免疫剂量的第1型和第2型BVDV配制疫苗不仅没引起睾丸感染，而且有效地保护青春期前的小公牛免受第2型BVDV严重激发后的睾丸感染。
在青春期前的公牛中使用Bovi-ShieldGOLDTM 5在母牛-小牛和牛乳操作中可以是BVD控制程序的重要组成。及时的疫苗接种能够有助于保护小公牛免受急性感染，急性感染与暂时和持久的睾丸感染以及随后的精液中BVDV传播给易感性母牛有关。此外，为防止青春期后BVDV感染而对青春期前公牛接种疫苗可有助于保持精液质量，其在急性BVDV感染之后的首60日显示可被影响(降低活力和形态异常)。9
尽管这里的结果证明用第2型BVDV激发后的成功保护，可以预测到用第1型BVDV激发后将观察到相似的结果。
实施例2
对第1型BVDV激发的睾丸保护—研究综述
进行研究来评估Bovi-ShieldGOLDTM5在面对严重第1型BVDV激发时预防睾丸感染的功效。本研究设计为一般随机区组设计(blockdesign)，具有单向处理结构。全部研究室人员皆未知处理信息。
45头青春期附近的完好肉用小公牛分配进行研究。小公牛为9月龄至15月龄。全部动物皆为BVD病毒第1型及第2型血清阴性，血清中BVD病毒分离物阴性，及血清逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)阴性。于第42日，安慰剂组(n＝23)及试验组(n＝22)中的小公牛的最小均方体重分别为625.7±30.94lbs和613.5±35.96lbs。动物接种安慰剂(Bovi-ShieldIBR-PI3-BRSV)或Bovi-ShieldGOLDTM 5(IBR-BVDV1-BVDV2-PI3-BRSV)。
使用含最小免疫剂量的制剂疫苗接种后第28日，全部疫苗接种小牛及安慰剂对照组小牛皆经鼻内接受Auburn University分离的非致细胞病变第1a型BVDV病毒菌株SD-1激发。鼻内激发以如下反式进行，将塑胶袋置于公牛鼻孔使其强力呼吸30秒，然后渗入5毫升生长于MEM的病毒，该MEM含有Earle’s盐且补充10％(vol/vol)马血清碳酸氢钠(0.75mg/mL)、L-谷氨酰胺(0.29mg/mL)及抗生素(100单位青霉素G，100μg链霉素及0.25μg两性霉素B/mL)。通过病毒分离及RT-nPCR测得马血清不含BVD病毒。
BVDV睾丸感染的评估是于第42日及93日进行的。基本研究设计摘在下表3中描述。
                        表3-研究设计：第1型BVDV激发后的睾丸保护
 治疗组   小公牛数目     肌肉接种疫苗       鼻内激发*   取样日
  日   剂量   日   剂量
 安慰剂组Bovi-ShieldGOLDTM 5   2322   00   2毫升2毫升   2828   5毫升5毫升   42，9342，93
激发后，检测两组动物的血清是否存在有病毒。乳血清病毒分离物所检测的，安慰剂组的18头小牛于第34日皆为病毒血症。这18头中的9头于第35日也有病毒血症。Bovi-ShieldGOLDTM5组只有5头小牛在第34日为病毒血症。任何研究日任一治疗组的小牛在其它病毒分离检测中都不呈阳性反应。
RT-nPCR检测也用于测定小牛是否患有病毒血症。安慰剂组于第34、35、36及37日分别有3、9、12及6头小牛有阳性结果。而对Bovi-ShieldGOLDTM 5组，于第34、35、36及37日分别有1、1、2及1头小牛呈阳性结果。任何研究日任一治疗组的小牛皆在其它血清RT-nPCR检测中都不呈阳性反应。
对两组测量最小均方直肠温度。只有第36日的平均(安慰剂组为104，Bovi-Shield GOLD 5组为102.9)有显着差异(P≤0.05)。
睾丸保护结果
第93日进行睾丸活体剖检样本的测试结果显示于表4中。得自安慰剂组23头小牛的样本中有6头(26.1％)于RT-nPCR检测中呈阳性，而Bovi-ShieldGOLDTM 5组全部22头小牛的样本皆为阴性。安慰剂组及Bovi-ShieldGOLDTM 5组的活体剖检样本的病毒分离检测皆为阴性。来自安慰剂组23头小牛中的5头(21.7％)和来自Bovi-ShieldGOLDTM5组22头小牛中的0头的活体剖检样本在IHC检测中为阳性。
治疗组中的所以血清样本小牛在第42日于RT-nPCR检测BVD病毒中呈阴性(表4)。在第93日，安慰剂组23头小牛中的10头(43.5％)在RT-nPCR检测中呈阳性，但Boyi-ShieldGOLDTM 5组中的全部22头小牛皆呈阴性。在第42日或第93日，没有从任何治疗组的任何血清样本中分离出病毒(表4)。
安慰剂组23头小牛中的10头在至少一种测试中呈阳性。这十头小牛中的四头仅对一种测试(第93日的血清RT-PCR)呈阳性。一头小牛对两种测试(第93日的睾丸活体剖检RT-nPCR和血清RT-nPCR)呈阳性。五头小牛对三种测试(第93日的睾丸活体剖检RT-nPCR、血清RT-nPCR和活体剖检IHC)呈阳性。
                         表4-睾丸样本和血清样本的BVDV化验结果概述
组   小牛数目 BVDV阳性数目   BVDV阳性数目   BVDV阳性数目*   BVDV阳性   小牛阳性％
  VI   PCR   IHC   VI   PCR   VI   PCR
  安慰剂   23   0   6   5   0   0   0   10   10   43.5％a
  Bovi-ShieldGOLD 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0％b
VI＝病毒分离，PCR＝聚合酶链反应，IHC＝免疫组织化学
a，b栏内有不同小写字母上标的百分比的差异显著(P≤0.0002)。
第93日睾丸活体剖检样本
第42日血清样本
*第93日血清样本
对每个动物，检测在任何时间点血清或睾丸活体剖检中是否存在BVD病毒，根据治疗组来进行总结，并使用实施例1中的Fisher’s Exact检测来分析。
结论
在本研究中，用Bovi-ShieldGOLDTM 5进行疫苗接种的小公牛预防第1型BVD病毒的持久睾丸感染和随后的将病毒排入精液。安慰剂与疫苗接种动物之间的对比在双尾Fisher’s Exact Test中的至少一个阳性测试中是显著的(P＝0.0002)。
以上引用的全部专利、专利申请、和出版物都完整地引入本文以供参考，相当于它们都在本文中不矛盾地提供。
本发明不限制于具体实施方式中描述的范围，这些具体实施方式仅是本发明单个方面的单个例证。功能上等价的成分和方法在本发明的范围中。事实上，除了本文所描述和显示的以外，本发明的各种修改对于阅读了前述说明书的本领域技术人员来说将是显而易见的。这些修改是要包括在所附权利要求的范围中的。

Claims (18)

1.一种在易感性雄性动物中预防睾丸BVDV感染的方法，包括：对所述动物施用有效量的疫苗，所述疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述动物选自公牛、公羊及公猪。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述动物为公牛。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述疫苗包括第1型BVDV改性活疫苗及第2型BVDV改性活疫苗。
5.如权利要求4所述的方法，其中至少一种BVDV改性活疫苗来自致细胞病变的病毒。
6.如权利要求4所述的方法，其中至少一种BVDV改性活疫苗来自非致细胞病变的病毒。
7.如权利要求4所述的方法，其中两种BVDV改性活疫苗均来自致细胞病变的病毒。
8.如权利要求1-7中任何一项所述的方法，其中所述疫苗包括至少一种附加抗原，所述抗原选自牛疱疹病毒(BHV-1)；副流行性感冒病毒第3型(PIV3)；牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpeterseniihardio-prajitno)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemmorrhagia)、问号形巴姆那钩端螺旋体(Leptospirainterrogans pomona)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospiraborgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospirabratislava)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝杆菌(Mycobacterium dispar)。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述附加抗原包括牛疱疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)。
10.一种疫苗在制备用于在对BVDV睾丸感染高度易感性的雄性动物中预防睾丸BVDV感染的药物中的应用，所述疫苗选自灭活第1型BVDV疫苗、灭活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述动物选自公牛、公羊及公猪。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述动物为公牛。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述疫苗包括第1型BVDV改性活疫苗及第2型BVDV改性活疫苗。
14.如权利要求13所述的方法，其中至少一种BVDV改性活疫苗来自致细胞病变的病毒。
15.如权利要求13所述的方法，其中至少一种BVDV改性活疫苗来自非致细胞病变的病毒。
16.如权利要求13所述的方法，其中两种BVDV改性活疫苗均来自致细胞病变的病毒。
17.如权利要求10-16中任何一项所述的方法，其中所述疫苗包括至少一种附加抗原，所述抗原选自牛疱疹病毒(BHV-1)；副流行性感冒病毒第3型(PIV3)；牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流行性伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospira borgpeterseniihardio-prajitno)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemmorrhagia)、问号形巴姆那钩端螺旋体(Leptospirainterrogans pomona)、伯格彼德西奈钩端螺旋体(Leptospiraborgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospirabratislava)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝杆菌(Mycobacterium dispar)。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述附加抗原包括牛疱疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)。
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