TWI306404B - Method of vaccination against testicular bvdv infection - Google Patents

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1306404 九、發明說明： 【發明戶斤雇之技術領域】 發明領域 本發明係關於經由對易感性雄性動物免疫接種對抗咸 染來預防受牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)之睪丸感染之方法。 發明背景 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是牛隻及其他易感性動物 就經濟方面相當有意義之病原’ BVDV可能持久且急性排入 1〇 感染公牛及其他易感性雄性動物之精液。此種病原造成易 感性動物之胃腸道疾病、呼吸道疾病及生殖疾病。 雖然因BVDV之高度病原性種系所引發之胃腸道疾病 及呼吸道疾病臨床上較為引人注意，但因BVDV所引發之生 殖方面的損失於經濟上遠更顯著。BVDV傳播之參考文獻已 15 經確立公牛精液之病毒可感染易感性接受授精的母牛，造 成受孕率的降低，胎牛早期的死亡、流產、及生下持續性 感染BVDV的小牛。1_3 持續性感染之公牛大部分必然感染易感性接受授精的 母牛，原因在於公牛精液中含高濃度病毒（1〇7.6細胞劑量 20 ((50%)/毫升)((CCID5〇/毫升）。3比較上，急性感染之免疫勝 任公牛之受感染的睪丸排出較低浪度病毒(5至75 CCID5q/ 毫升)於精液，但也可能傳播BVDV。4一項調查研究報告25 至50 CCID5〇/毫升病毒於精液可感染5%接受授精的小母 牛’以及隨後由被感染的小母牛水平傳播BVDV給孕母牛牛 5 1306404 群’結果導致胚胎的持續感染。 二調查人㈣也報告後青春期公母牛急性錢可能造

成睪丸的持續BVDV感染。I獨特病例出現在紐西蘭人工 授精站所養_血清陽性非赫血症公牛。綱公牛於試 圖由血清分離BVDV呈陰性反應後被‘人^授精中㈣ 管公牛_存在有抗BVDVM和抗體，該公牛仍㈣續排 出低濃度(2xl〇3cciDw毫升)病毒之精液連續⑽月被犧 牲為止。急性錢來源未明。於該公牛之屍體雜，只由 公牛睪丸分離出病毒。6此公牛精液中的病毒導致三頭接受 授經之8血清陰性小料巾的-頭㈣_且隨後出現血清 轉變。8第二人工誘生感染之案例中，三頭非病毒血症後青 10 春期公牛中之2頭#液藉反錄巢套聚合喊鎖反應 (RT-nPCR)檢測得BVDV長達7個月時間但無法藉標準組 織培養方法分離出病毒。初次暴露後5個月收㈣血清於靜 脈/主射頭血,月陰性小牛後造成小牛之感染。暴露當 天收集的血以及暴露後7個月收集的血清於另外兩頭血 清陰性小牛並未造成感染。7 兩項研九$發現，急性錢的公牛可排丨BVD^ 液，該精液具対接料精蟲濃度 、活動力及形態。4’5另 —項研究發現急性感染的公牛精蟲活動力降低 ，頭帶缺損 增加，精蟲頭部小，以及近端小滴。9 _雖然藉自然育種傳播力以及對公牛生育力的影響的細 P上未確立但喊由於BVDV傳播給母牛造成的生殖的損 失’易感㈣__㈣丸I感染具有 顯著經濟衝擊。 6 1306404 由於已知睪丸為免疫阻隔，因此睪丸的病毒感染造成 透過免疫接種進行治療或預防上的重大挑戰。出乎意外 地，發明人顯示免疫接種為控制易感性動物之BVDV睪丸感 染的有效手段。 5 參考文獻

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Paton DJ. Goodey R, Brockman S, et al. Evaluation of 15 quality and virological status of semen from bulls acutely infected with BVDV. Veterinary Record 1989;124:63-64. 【明内j 發明概要 本發明包含一種於一易感性雄性動物預防或治療睪丸 20 BVDV感染之方法’該方法包含對該動物投予有效量之一種 疫苗’該疫苗係選自由去活化第1型BVDV疫苗、去活化第2 型BVDV疫苗、改性活第1型BVDV疫苗、及改性活第2型 BVDV疫苗組成之群組。 本發明也包含一種疫苗，該疫苗係選自由去活化第i 8 1306404 型BVDV疫苗、去活化第2型BVDV疫苗、改性活第⑼ BVDV疫苗、及改性活第2型则¥疫苗組成之群組。用作 為於易感性雄性動物預防睪丸BVDV感染之藥物。 本發明包含-種疫苗之用途，該疫苗係選自由去活化 5第1型BVDV疫苗、去活化第2型勵乂疫苗、改性活第工型 BVDV疫苗、及改性活第2彻聊疫苗組成之群組該疫

20 苗係用於製造-種於一易感性雄性動物預防畢丸物 染用藥。 & 10 群組 本發明進一步包含一種預防一易感性雄性動物之睪丸 BVDV感染之方法’該方法包含識別一具有較高BVDV睪丸 感染風險之動物；以及對該動物投予有效量之—種卢—， 選自由去活化㈣BVDV疫苗、去活化第2_VDV:、 改性活第咖VDV疫苗、及改性峨型BVDVW组成之 型BVDV疫苗、去活化第2型BVDV疫苗、改性活匕第: BVDV疫及改性活第2_dv疫苗組成之群組用^ 為於有較高BVDV睪丸感染風險之 丸BVDV感染之藥物。 处動物預防晕 本發明包含一種疫苗之用途，該疫苗係 第】型则V疫苗、去活化第2型_疫苗 '、改自由去^化 _疫苗、及改性峨彻Dv疫苗組成之群/弟1型 田係用於f造—餘魏高bvdv睪⑼ I錢 性雄性動物預防翠丸BVDV感染用藥。…之一易感 9 1306404 本發明也包含-製造物品，其包含一容器或多個容器 含有-種BVDV疫苗’該疫苗係選自由去活化第丨型抑⑼ 疫田、去活化第2型BVDV疫苗、改性活第^ΒνΕ)ν疫苗、 及改性活第2型BVDV疫苗組成之群組； 5 以及將該BVDV疫苗用於預防易感性雄性動物之 BVDV感染之指示。 易感性雄性動物包括公牛、公羊及公豬。較佳具體例 之動物為公牛。 疫®及製造物品包含改性活第1型BVDV疫苗及改性 10 活第2型BVDV疫苗。 疫苗可衍生自細胞病原性病毒或非細胞病原性病毒。 選擇性地’本發明之疫苗及製造物品可包含至少另一 種抗原’該抗原係選自由牛疱疹病毒(BHV-1);副流行性感 冒病毒第3型(PIV3);牛呼吸道融合病毒(BRsv);犬鉤端螺 15 旋體（Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體 (Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體 (Leptospira borgpertersenii hardio-prajitno)、出血性黃疫鉤 端螺旋體(Leptospira icterohaemmorrhagia)、問號形巴姆那 鉤端螺旋體（Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈 20 鉤端螺旋體（Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第 斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospira Bratislava)、胚胎彎曲桿菌 (Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌（Mannheimia (Pasteurella) haemolytica)、出血敗血性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)及迪斯伯分 10 、l3〇64〇4 . 枝桿菌（Mycobacterium dispar)組成之群組。 較佳具體例中，本發明之疫苗及製造物品包含至少另 ~種選自由牛疱疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型 (PIV3)、及牛呼吸道融合病毒(BRSV)組成之群組之抗原。 5圖式簡單說明 . 第1圖一第2型BVDV挑戰後睪丸活體剖檢檢體之 BVDV陽性百分比。圖說：VI=病毒分離，PCR=聚合苷連 φ 鎖反應，IHC=免疫組織化學〇一欄内有不同小寫字母上標 之百分比之差異顯著（Ρ$〇.〇5)。 10 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 較佳實施例本發明提供一種於一易感性雄性動物治療 或預防受BVDV病毒之睪丸感染以及結果導致排放BVDV 病毒於精液之方法。本發明方法可有效預防或減少因第1型 15 BVDV及第2型BVDV引發感染所造成之睪丸感染。 定義與縮寫 「牛病毒性腹瀉病毒」（「BVDV」）是一種屬於黃病毒 科（Flaviviridae)及癌病毒屬（pestivjrus)之小型正訊息單股 - RNA病毒。基於試管試驗感染易感性細胞單層時是否存在 — 20有可目測之細胞致病效應，說明有二生物型BVDV，亦即細 胞致病型（cp)及非細胞致病型（NC)。非細胞致病生物型可 由大部分田野爆發感染病例分離出。牛病毒性腹瀉病毒種 系基於病毒RNA内部的實質差異，而被分類為兩種（亦即基 因型），包括第1型及第2型。 11 1306404 「易感性動物」-詞表示對bvdv感染易感之任何動 物，例如牛、羊、及豬。 「易感性雄性動物」一詞表示任何對BVDV睪丸感染 易感之雄性動物’例如雄性牛、4、及豬。未經去勢之雄 5牛稱作「公牛」。未經去勢之雄羊稱作「公羊」。未經去勢 之雄豬稱作「公豬」。 就睪丸感染而言之「預防」或「控制」等詞表示減少 或去除易感性雄性睪丸受毒力第J型BVDV及第2型BVDV 感染之風險；改善或減輕感染症狀，或加速感染的復原。 ⑽若藉睪丸活體剖檢評估有病毒或細菌負載或精液存在有病 毒’而該負載或病毒減少，則該免疫接種視為治療性。 「感染」一詞表示急性或持續性感染BVDV。 「急性感染」或「一過性感染」BVDV出現於免疫勝 任易感性動物暴露於BVDV2細胞致病種系或非細胞致病 15種系。雖然以臨床前期感染為最常見，但可觀察得例如抑 鬱、缺乏食欲、口腔糜爛與潰瘍、腹瀉及死亡等徵象。受 到急性感染的免疫勝任動物可傳播病毒給易感性動物，但 傳播力比持續性感染動物之效力遠更低。 急性睪丸感染表示由於一過性系統性感染結果，易感 2〇性雄性動物之睪丸出現急性感染或一過性感染。若干報告 指出急性感染的公牛可能排出病毒於精液，而該精液具有 可接受的精蟲濃度、活動力及形態。但於其他報告，發明 人觀察得吻合急性感染之精蟲活動力降低，頭帶缺損增 加’精蟲頭部小，以及近端小滴。 12 1306404 持續性❹娜v係出現於易感性動物感染非細胞致 病種系BVDV而於胁細日發展出免疫勝任<前。持續 性感染動物對其感染的病毒種㈣展出免疫耐受性，持續 性感染動物作為病原儲存場所，常見終生排 二 尿液、糞便、精液、唾液、淚液及鼻黏膜。里病甘於 持續性睪丸感染表示由於急性或持續性 果’易感性雄性動物之睪丸之持續性感染。 感“

本發明使用之疬钴 本發明使用之疫苗包含第1型3¥〇¥及/或第 10以及獸醫上可接受之載劑。 傳統上病毒疫苗分成兩類： 活疫苗含有已經經過處理或生長讓病毒較不具有病原 性（減毒）之活病毒；以及含有殺死的（去活化）病毒粒子之疫 苗。就B V D V而言，病毒本身可為細胞病原性或非細胞病原 I5丨生。牛病毋性腹渴病毒種系基於病毒rna内部之實質差 異，也可分成兩種（亦即基因型）包括第！型及第2型。如此， 原則上可能存在有八大類BVDV疫苗，但大部分商用疫苗係 基於細胞病原性病毒。 目前市售BVDV疫苗包括經過化學方式去活化之病毒 20 (McClurkin，等人，Arch. Virol. 58:119 (1978); Fernelius， 等人，Am. J· Vet. Res. 33:1421-1431 (1972);及Kolar等人， Am_ J. Vet. Res. 33:1415-1420 (1972))。此等疫苗典型係投 予多劑來達成初步免疫接種，提供短時間免疫力，且無法 保護胚胎的傳染（Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. 13 1306404

Pract. 11:615-625 (1995))。於羊隻，曾經報告基於經純化之 E2蛋白質之亞單位疫苗（Bruschke等人，疫苗15:1940-1945 (1997))。不幸只有一種疫苗顯然可保護胚胎不受感染，此 項保護僅限於同源病毒中之一種系。 5 此外’曾經使用已經減毒之BVD病毒來製造改性活病 毒MLV疫苗’該BVD病毒的減毒係經由於牛細胞或豬細胞 重複繼代培養來減毒（Coggins等人，Cornell Vet. 51:539 (1961);及Phillips等人 ’ Am. J. Vet Res. 36:135 (1975));或 以化學方式誘生突變造成病毒之溫度易感性表現型來減毒 10 (Lobmann等人 ’ Am. J. Vet. Res. 45:2498 (1984);及Lobmann 人，Am. J. Vet. Res. 47:557-561 (1986))。單一劑 MLV疫苗 證實可充分提供免疫力’於接受疫苗接種的牛隻，免疫力 持續時間長達數年(Coria等人，Can. J. Con. Med. 42:239 (1978))。此外，對以MLV型疫苗免疫接種之小牛也報告可 15 產生交叉保護效果(Martin等人，動物疾病研究工作人員會 議議事錄，75:183 (1994))。但有關此等疫苗使用之安全性 考量，例如可能於胚胎傳播病毒造成重大問題(Bolin，Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11:615-625 (1995)) ° 較佳具體例中，第1型BVDV成分為改性活細胞病原性 2〇 病毒(cpBVD-Ι種系NADL-國家動物疾病中心，美國農業 部，愛荷華州，ATCC VR-534)。另一較佳具體例中，第2 型BVDV成分為改性活細胞病原性病毒（cp BVD-2種系 53637 (ATCC No. PTA-4859)。如共同審查中之美國專利申 請案60/490,834，申請日2003年7月29日所述，二單離株皆 14 1306404 含有一插入於NS2-3區。經過減毒之cp bvDV-1含有Bos Taurus DnaJ 1編碼序列插入於核苷酸位置# 4993 (NAD1^ 列編號)之胸腺苗之3’端，該胸腺誓為於胺基酸位置1536之 甘胺酸殘基之編碼密碼子之第三核苗酸。減毒Cp BVDV-2 5含有一個B〇s Taurus DnaJl編碼序列插入同一個基因體位 置。另一具體例中，改性活抗原經過乾燥、凍乾、或玻化。 一具體例十，本發明之疫描組成物包括有效量之一或 多種前述BVD病毒’較佳為CpBVD-l種系NADL (cpBDV-1 種系NADL-國家動物疾病中心，美國農業部，愛荷華州， 10 ATCC VR-534) ; cpBVD-2 種系 53637 (ATCC No. PTA-4856)、IBRV種系 C-13 (卡特(Cutter)實驗室）；PIV3種 系Reismger(内布拉斯加大學）；BRSV種系375(動物用藥研 究所，愛荷華州艾米斯）。純化後之BVD病毒可直接用於疫 田組成物，或較佳BVD病毒進一步於試管内藉一連串的繼 15代培養改性。典型地，疫苗含有約1 X 102至約1 X 1〇10溶菌 斑生成單位或TCIDso單位病毒，含有獸醫上可接受之載劑 以及選擇性含有輔劑，體積為約〇1毫升至5毫升，且較佳 約2毛升。疫苗組成物中可有效提供保護效果之病毒精碟數 S可由技藝精湛的獸醫師判定。適合用於疫苗組成物之獸 2〇商上可接受之載劑可為後文說明之任一種載劑。 典型地，疫苗含有約lxl02至約1χ1〇ιο溶菌斑生成單位 或群洛生成單位病毒，含有獸醫上可接受之載劑以及選擇 眭含有輔劑，體積為約0.1毫升至5毫升，且較佳約2毫升。 疫苗組成物中可有效提供保護效果之病毒精確數量可由技 15 1306404 藝精湛的獸醫師判定。適合用於疫苗組成物之獸醫上可接 受之載劑可為後文說明之任一種載劑。典型投藥途徑為肌 肉注射或皮下注射約0.1毫升至約5毫升疫苗。本發明之疫 苗組成物也包括其他活性成分例如其他抗BVDV之疫苗組 5 成物，例如述於wo 95/12682、WO 99/55366、美國專利第 6,060,457號、美國專利第6,015/795號、美國專利第6,〇〇1，613 號及美國專利第5,593,873號。 疫苗接種可藉單次接種或多次接種達成。若有所需可 由接受接種的動物收集血清，測試是否存在有BVD病毒抗 體。本發明之另一具體例中，疫苗組成物用來處理BVDV 睪丸感染。如此本發明提供控制或預防動物體因第丨型或第 t BVD病毋、或苐1型與弟2型病毒之組合感染之方法，該 方法係經由投予有效量之本發明之B v D v病毒給動物。另一 八歧例中，本發明之疫苗組成物可有效改善牛群生育力， 以及減少易感性雄性動物之睪丸感染風險。 /一於實施本發明方&，本發明之疫苗組成物係經肌肉途 杈或皮下途徑投予牛隻’但其他投藥途徑也可使用，例如 經口、經鼻内（例如喷霧劑或其他無針投藥）、淋巴結内、皮 20 ^。腹内、直腸或陰道投藥、或藉組合途徑投藥。以動物 2〇 «之肌肉投藥為佳。可能需要追加接種，可調整劑量來 提供優化免疫接種。 ,「免疫原性」一詞表示BVD病毒可於動物激發抗第工 型或第2型BVD病毒或抗第丨型與第2型BVD病毒二者之免 疫反應。这免疫反應可為主要由胞毒性丁細胞媒介之免疫反 16 1306404 應’或主要由助手τ細胞媒介之體液免疫反應，該體液免疫 反應又活化Β細胞結果導致抗體的製造。 根據本發明，病毒較佳係於用於免疫原性組成物之前 藉細胞培養之一系列繼代培養減毒。改性方法為熟諳技藝 5 人士眾所周知。 本發明方法使用之疫苗組成物也包括其他活性成分， 例如其他抗BVDV之免疫原性組成物，例如述於同在審查中 之專利申請案第 08/107,908、WO 95/12682、WO 99/55366、 美國專利第6,060,457號、美國專利第6,〇15,795號、美國專 10利第6,001，613號及美國專利第5,593,873號。 此外’本發明之目的可經由投予BVDV第1型及/或第2 型以外之其他抗原（「組合疫苗」）達成，此等抗原包括但非 限制性BRSV、、PTV3、犬鉤端螺旋體、流行性傷寒 鉤端螺旋體、伯格彼德西奈鉤端螺旋體（Lept〇spim I5 b〇rgpertersenii hardi〇-prajitno)、出血性黃疸鉤端螺旋體、 問號形巴姆那鉤端螺旋體、伯格彼德西奈鉤端螺旋體 (Leptospira b〇rgpertersenii hardj〇_prajitn〇)、伯拉第斯拉瓦 鉤端螺旋體、胚胎彎曲桿菌、溶血巴氏桿菌'出血敗血性 巴氏桿菌、牛分枝桿菌及迪斯伯分枝桿菌組成之群組。若 20干較佳具體财，'组合疫苗來源為牛屏⑽ον·· GOLD) TBR-BVD、牛屏金3、牛屏金5、牛屏金 BVD-BRSV-LP、牛屏金FP5L5、牛屏金沖5似或普 立葛（Preguard)金FP 1〇(輝瑞公司）。 此外，本發明方法採用之免疫原性組成物及疫苗組成 J7 1306404 物可包括一或多種獸醫上可接受之載劑。如此處使用，「獸 邊上可接文之載劑」包括任一種及全部溶劑、分散介質、 塗覆劑、輔齊卜安定劑、稀釋劑、保藏劑、抗菌劑及抗真 菌劑、等張劑、吸附延遲劑#。稀釋劑可包括水、食鹽水、 5 :萄糖、乙醇、甘油等。等張劑包括氣化鈉、葡萄糖、甘 路糖醇&梨糖醇及乳糖等。安定劑包括白蛋白等。輔劑 包括(但非限制性)RIBI輔劑系統氓出丨公司）、礬土、氫氧化 铭政膠、膽固醇、水包油型乳液、油包水型乳液，諸如傅 朗氏(Freund’s)完全輔劑及不完全輔劑、布拉克_⑻共聚 1〇物（CytRX，杳治亞州亞特蘭大），SAF-M(奇隆(Chir〇n)，加 州艾密麗微爾)、安非京(AMPHIGEN)輔劑、皂素、奎爾(Qu山 A、QS-21(康橋生技公司，麻省康橋）、Gn 〇i〇〇(葛蘭尼卡 (Galemca)製藥公司，阿拉巴馬州伯明罕）或其他皂素部分、 -墙醯基脂質A、抗生物素脂質_胺輔劑、得自大腸桿菌（ε· 15 c〇li)(重組或其他)之熱不穩定性内毒素、霍亂毒素、或胞壁 醯基二肽等。疫苗組成物進一步包括一或多種其他免疫調 節劑，諸如介白素類、干擾素類、或其他細胞激素類。本 發明方法採用之疫苗組成物也包括健他黴素（Gentamicin) 及美賽爾雷特(Merthiolate)。雖然本發明之上下文有用之輔 20 劑及添加劑之數量及濃度方便由熟諳技藝人士測定，但本 發明意圖涵蓋包含約50微克至約2000微克輔劑及較佳約 500微克/2毫升劑量疫苗組成物之疫苗組成物。另一較佳具 體例中’本發明涵蓋疫苗組成物其包含約1微克/毫升至約 60微克/毫升抗生素，以及較佳小於約30微克/毫升抗生素。 18 1306404 本發明方法採用之疫苗組成物依據投藥途徑而定町黎 作為各種形式。例如疫苗組成物可製作成為適合注射用之 無菌水性溶液劑或分散液劑劑型，或使用凍乾技術製造為 凍乾劑型。凍乾疫苗組成物典型係維持於約4°C，且可於含 5 或不含輔劑之穩定性溶液例如食鹽水及/或HEPES重新調 製。 本發明之疫苗組成物可投予動物體來誘生對第1蜇或 第2型BVD病毒或對第1型及第2型BVD病毒二者之免疫反 應。如此’本發明之另一具體例提供刺激抗第1型或第2塑 10 BVD病毒’或抗第1型與第2型BVD病毒之組合之免疫反應 之方法，該方法係經由對動物體投予有效量之如前述本發 明之免疫原性組成物。「動物體」一詞表示包括任一種對 BVDV感染易感之動物，諸如牛、羊、及豬。 於根據本發明之方法，投予動物體之較佳免疫原性組 15成物包括BVDV cpNADL病毒及/或BVDV cp53637病毒。含 有較佳於培養中藉一系列繼代培養而改性之活病毒之 BVDV病毒之免疫原性組成物透過肌肉途徑或皮下途徑投 予牛’但也可使用其他投藥途徑，例如藉經口、經鼻内、 經淋巴結内、經皮内、經腹内、經直腸或經陰道、或藉各 20 種途徑之組合投藥。 免疫接種方案可使用技藝界業界眾所周知之程序最佳 化。可對動物投予單-劑量，或可間隔二週至十週免疫接 種兩次或兩-人以上。依據動物年齡而定，可再产於予免产 原性組成物或疫苗組成物。例如本發明涵蓋於六月齡之前 19 1306404 免疫接種健康牛隻，而於六月齡之時再度免疫接種。另一 例中’本發明涵蓋於約育種前5週（或於加至牛群前5週）免疫 接種育種W之牛，以及選擇性地，於育種前約2週或於妊娠 期間再度免疫接種來保護胚胎不受BVDV第i型及第2型感 5 ^ 單劑本發明組成物也可於第一劑後約3至4週投予。使

用單劑組合疫苗每半年再度免疫接種，預期也可預防B V D V _ 胚胎感染。 •於牛隻誘生免疫反應之程度及本質可使用多項技術評 ® 比。例如可由免疫接種動物收集血清，測試例如於習知病 10 毋中和檢疋分析測试疋否存在有BVDV病毒之特異性抗體。 「有效量」一詞表示可對所投予之動物足夠提引出免 疫反應之組合疫苗數量。免疫反應包含(但非限制性)誘生細 胞免疫力及/或體液免疫力。治療有效量之疫苗可依據使用 之特殊病毒、牛隻情況及/或感染程度而改變，治療有效量 15 可由獸醫師決定。 去活化（部分或全細胞)疫苗及改性活痛结 ^ 用於本發明之去活化或改性活疫苗可使用技藝界已知 之多種方法製備。 例如，BVDV單離株可使用已知技術直接得子感染母 . 20 牛子宮。 BVDV單離株可使用多種已知方法例如包括一系列繼 代培養而減毒。除了改性活病毒單離株之外，本發明方法 採用之疫苗產品也包括適量之一或多種常用輔劑。適當輔 劑包括（但非限制性）：礦物凝膠類例如氫氧化鋁；界面活性 20 1306404 物質例如溶卵磷脂；糖苷類如皂素衍生物如奎爾A或 GPI-0100 ;普隆尼克(pluronic)多元醇類；聚陰離子類；非 離子性嵌斷聚合物例如普隆尼克F-127 (B.A.S.F.，美國）； 胜肽類；礦物油類如蒙太得(Montanide) ISA-50 (塞皮克 5 (Seppic)，法國巴黎）、卡玻坡（carbopol)、安非京 (Amphigen)、安非京馬克(Mark) II (海卓尼克(Hydronics)， 美國）、鋁水凝膠(Alhydrogel)、油乳液類例如礦油如貝尤 (Bayol)F/阿拉瑟(Arlacel) A之與水之乳液；或植物油、水及 乳化劑如卵磷脂乳液；礬土、牛細胞激素；膽固醇；及輔 10劑組合。較佳具體例中’含皂素之水包油型乳液習知係經 過微流體化。 用於本發明方法之特佳BVDV第1型及第2型來源為牛 屏金疫苗產品系列（輝瑞公司）其含有BVDV種系NADL[得 自國家動物疾病中心NADC]、USDA，愛荷華州阿米斯]及 15 BVDV第2型種系cp BVDV種系53637(貴爾夫（Guelph)大 學’加拿大安大略省貴爾夫)(ATCC No. PTA-4859)。 較佳種系NADL及53637為改性活病毒種系。根據本發 明’本發明之種系可以市售輔劑較佳為奎爾A-膽固醇-安非 京（海卓尼克，美國）輔助。本發明之免疫原性組成物及疫苗 20組成物之較佳劑量為約2.0毫升。本發明方法採用之組成物 可含括保藏劑。本發明涵蓋之保藏劑包括健它黴素及美赛 爾雷特。也可添加載劑較佳為PBS。改性活疫苗的製備例如 藉繼代培養將由毒力種系減毒而製備為技藝界已知。 改性活BVDV單離株也可組合下列細菌及病毒，包括 21 1306404 (但非限制性)牛范療病毒第1型(BHV-1)、牛呼吸道融合病毒 (BRsv)、副流行性感s病毒(piV3)、犬鉤端螺旋體、流行 ! 生傷寒鉤端螺旋體、伯格彼德西奈鉤端螺旋體、出血性黃 症釣端螺旋體、問號形巴姆那鉤端螺旋體、伯格彼德西奈 5鉤端螺旋體、伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體、胚胎彎曲桿菌、 溶血巴氏桿菌、出血敗血性巴氏桿菌、牛分枝桿菌及迪斯 伯分枝桿菌組成之群組。 迄藥劑量輿描:气 根據本發明，有效量BVDV疫苗或組合疫苗投予易感 1〇性雄性動物可提供抗第1型BVDV及第2型BVm^聯之睪 丸感染之有效免疫力。一具體例中，疫苗以兩劑，間隔約3 至4週投予小牛。例如初次投予係於動物約1月齡至約3月 齡。第二劑投予係於初次投予組合疫苗後之約i週至約4週。 另一較佳具體例中，投予係於動物育種前或進住人工 15授精設施前約4至5週進行。隨後各劑疫苗之投予較佳係以 每年一劑之基準進行。另一較佳具體例中，約6月齡之前接 受疫苗接種的動物須於6月齡之後再度接種疫苗一次。投予 隨後各劑疫苗較佳係以每年一劑為基準進行，但預期每兩 年及每半年投予隨後各劑疫苗也涵蓋於本發明之範圍。 20 有效疫苗劑量係依據疫苗成分及投藥計晝決定。典型 地，當改性活BVDV製劑用於疫苗時，當—次投予易感性雄 性動物時S亥疫苗較佳含有每劑約1 〇2至約1 〇10 TCIf)留 早位之 BVDV，以及較佳每劑約1〇4至約1〇7 TCID5〇單位之第1型 BVDV及第2型BVDV。較佳一次投予易感性動物時，可提 22 1306404 供有效免疫力之疫苗含有約1 ο4至107 Τα〇5〇單位/劑量第i 型BVDV及第2型BVDV，及更佳約1〇5 τα〇5〇單位/劑量。 隨後各劑疫苗之投予較佳係以每年一次為基準進行。約6月 齡之前接受疫苗接種之動物較佳於6月齡之後再度接受疫 5苗接種。隨後各劑疫苗之投予較佳係以每年一次為基準進 行。

根據本發明，當投予較佳產品亦即牛屏金5(輝瑞公司） 時，產品較佳係以一次約0.1毫升至約50毫升，較佳約1 5 毫升至約2.5毫升’及更佳約2毫升投予。隨後各劑疫苗之 1〇杈予軚佳係以每年一次為基準進行。約6月齡之前接受疫苗 接種之動物較佳於6月齡之後再度接受疫苗接種。隨後各劑 疫田之投予較佳係以每年一次為基準進行。 根據本發明，投予可藉已知途徑達成，包括經口、經 鼻内、局部、經皮及經腸道外(例如靜脈、腹内、皮内、皮 15下或肌肉）途徑投予。較佳投藥途徑為肌肉投予或皮下投 予。 ........八刮里，筏著為每年再度接 20 ，疫苗’而統料年再度接種之前對小牛投予額外劑量 疫省的需求’俾產生及/或維持對抗感染的免疫力。 根據本發明投予之疫苗包括其他成分例如輔劑（例如 =物凝膠類例如氫氧驗；界面活性物質例如膽固醇、冰 二苗㈣脂；糖„員如急素衍生物： =麵；普隆尼克多元醇類；聚陰離子類；非離子^ 5物例如普隆尼克F·127 (B.A.S.F.，美國）；料t 23 1306404 礦物油類如蒙太得ISA-5G、卡玻坡 ^ , 女非不、銘水凝膠、 油礼液類例如礦油如貝尤F/阿拉瑟八之 油、水及乳化劑如卵磷脂乳 η 、之’友勿 劑組合)。 I土、牛細胞激素；及輔 根據本㈣，财效量之疫苗奸、纟 性動物’可提供抗睪域染之有效核力。 :交佳具體例中’疫苗係經肌肉投予+較佳具體例 中’疫田係經皮下投^此外，較佳疫苗劑量包含則毫升 残7宅升’較佳約2毫升，每毫升含有⑽2至約⑹。職5。 單位/每翻毒。組合疫苗較佳投讀物兩次；—次於約】 月齡至約3月齡’以及―:欠於約5週至3猶。本發明也涵蓋 每年重新疫苗接種單劑。 有較高BVDV磾染風險之動物之識试 本發明進-步包含-種對B v D v感染易感性之雄性動 15物預防睪丸BVDV感染之方法，包含一種於—易感性雄性動 物預防或治療睪丸BVDV感染之方法，該方法包含： a) 識別一具有較高BVDV睪丸感染風險之動物；以及 b) 對該動物投予有效量之—種疫苗’選自由死第is BVDV疫苗、死第2型BVDV疫苗、改性活第疫 20苗、及改性活第2型BVDV疫苗組成之群組。 為了識別有較高BVDV感染風險之動物，熟諳技藝人 士瞭解當BVDV感染被導入先前未感染之牛群時，或易感性 動物接觸另一患有B V D V感染之易感性動物時，動物有較高 感染風險。BVDV係以糞-口方式於動物間傳播。激發有症 24 1306404 狀感染所需病毒負載係與BVD病毒的型別及種系關聯，且 與病毒於牛群間傳播的快速程度有關。感染動物可以症狀 識別*見BVDV感染的表徵包括：流產風暴、不孕症、不 規則發燒週期、胚胎早期死亡'胎牛木乃伊化、免疫抑制、 5 ^>血小㈣少及腦部發育不全。出現疾病症狀之前通 ㊉先有白血球減少，至今為止的試驗注意力都放在識別此 種白血球減少徵象。 _ A/月子研究顯不有高百分比之感染BVDV之牛，包括 聲被視騎久性❹(PI)之牛維持臨床上無徵狀 。因此較佳識 10別感染動物之方法係檢測是否存在有病毒本身，而非仰賴 疾病的徵&已經發展出數種不同試驗方法來檢測BVDV， 及/或檢測BVDV感染動物。此等試驗方法包括：反錄聚合 酶連鎖反應、梅聯結免疫檢定分析(ELISA)、標準病毒分離 技術及免疫組織化學(Haines等人，「於經過福馬林固定於嵌 Μ有軟石堪之組織基於單株抗體之免疫組織化學檢測牛病毒 _ 性腹;寫病毒」，Vet. path〇i·，29:27 32 (1992》。 PCR及病毒分離技術由於其特有的靈敏度因此皆可檢 測極低濃度的BVDV。組織樣本例如耳刻痕活體剖檢樣本的 《疫組織化學也是檢測持久性感染動物的有效技術。 .2〇 ELISA技術雖然略微較不敏感，但適合作為於動物體檢測 BVDV感染之寬廣範圍診斷卫具，因此似技術價廉，可於 短時間内獲得結果，且無需高度熟練技術與高度特殊實驗 室設備。 檢測BVDV感染之ELISA方法述於參考文獻。參考 25 1306404

Huchzermerier等人之美國專利第6,174,667號及WO 99/15900及美國專利申請公開案20030143573及ELISA方法 與其他方法之比較，「抗原捕捉酶聯結檢定分析與反錄聚合 酶連鎖反應及細胞培養免疫過氧化酶試驗用於診斷反芻動 5 物之瘟病毒感染之比較」，Vet. Microbiol., 43:75-84 (1995)。 將藉下列實施例進一步舉例說明本發明，但非限制性。 實施例1 睪丸之保護：研穿姹論 使用第1型BVDV及第2型BVDV調製之牛屏金5疫苗系 10於2〇〇3年11月介紹給牛飼養產業，來獲得疫苗接種提供對 抗第2型BVDV之最佳化胚胎保護程度。此處報告於本藥獲 得許可執照前期之功效研究結果，該研究評比青春期前期 使用牛屏金5疫苗接種是否可有效預防嚴重第2型bvDv挑 戰之睪丸感染10 ’且與安慰劑（牛屏（B〇vi Shield) 15 IBR-PI3-BRSV)作比較。 全部納入較密集第2型BVDV挑戰研究的小公牛(n=17) 接受進一步評比，來判定疫苗接種牛屏金5是否可有效預防 BVDV之睪丸感染。本初期調查研究之小牛皆為3月齡至4 月齡初乳斷乳小牛(雄性及雌性）。使用含有最低免疫接種劑 20量（最低免疫接種劑量係於疫苗許可執照核發之前確立，且 反應出比終產物中存在的抗原病毒更低量，最低免疫劑量 的測定有助於確保產品以核准的濃度使用時將可一致性地 刺激足夠對抗疾病的保護效果）之第1型BVDV及第2型 BVDV4之調配物免疫接種後则，全部接受疫苗接種之 26 1306404 小牛及接受安慰劑的對照組之小牛經鼻内以非細胞病原性 第2型BVDV種系24515挑戰。種系24515係於加拿大由一次 嚴重的BVD暴發感染，殺死感染牛群超過40%時分離。挑 戰後，全部10頭對照組小牛皆出現嚴重發病’發病特徵為 5長時間有病毒血症(9曰至14曰）’發燒105.6卞至l〇7.2°F經歷 4至9曰，白血球減少（1日至9日），血小板減少（<100,000/微 升），罹病（4曰至9曰），及高死亡率（10頭對照組中7頭死亡 (70%))。相反地，免疫接種組的小牛只有1頭出現病毒血 症’ 6頭發燒1或2日，1頭的白血球減少經歷1日時間，皆未 10 出現血小板減少，且無任何小牛死亡。整體言之20頭接受 疫苗接種的小牛中有18頭於整個研究期間維持健康，只有2 頭於第1曰顯示抑鬱。此二項觀察皆未關聯先前或目前的病 毒血症、發燒、白血球減少或血小板減少。11 BVDV睪丸感染的評比係始於挑戰後約2日。如表 15示，睪丸樣本係對2安慰劑對照組小牛於研究的第41日由屍 體剖檢收集。而其餘5頭對照組小牛以及1〇頭牛屏金5疫苗 接種小牛於第42日由活體剖檢取得晕丸樣本。第二樣本係 得自1〇頭牛屏金5疫苗接種中的7頭，於第56日仍然可取得 樣本。全部樣本皆使用培養分離法、核酸放大法 20 (RT-nPCR)、及免疫組織化學試驗法而試驗bvdv。收集及 試驗睪丸樣本的工作人員未知處理組別的分配。 27 1306404 jl-研究設計:BVDV第2型挑戰後之睪丸保護 肌肉接種疫苗 鼻内挑戰― 處理組 _^公牛頭數 曰 劑量 _!_ 劑量 取樣日 安慰劑 對照組 7 0 2毫升 28 5毫升 --------- 41,421 牛屏金5 10 〇 ~~------ 2毫升 28 _5毫升 42, 56* t單離株24515係得自錢夫大學，加拿大安大略省貴爾夫。 7,安=對照㈣、公牛中的兩頭係於第41日時藉剖檢採樣 5頭小公牛係於第42日時採樣。 ， ，而其餘 王部10頭小公牛係於第42日採樣，於第56日由7頭小公牛取得第二樣本 病毒分離及PCR檢定分析係於奥本(Auburn)大學獸醫 病理生物學及臨床科學實驗室進行，而免疫組織化學分析 係於内布拉斯加大學，林肯獸醫診斷中心進行。資料係由 10輝瑞公司動物健康、動物用藥與研究、生物統計、技術與 品質代表分析，係以分類程序分析（s AS/STAT軟體改變與升 級第6.12版’北卡羅納州卡里SAS研究所；或SAs/sTAfm

用者指南第8版，及SAS程序指南第8版）。費雪確切測試 (Hsher’s Exact Test)用來比較各處理組中至少有一項bvdV 15陽性試驗結果的動物比例。計算適當描述性統計數字。 結果 表2及第1圖摘述於睪丸生物剖檢檢體檢測得Βν〇ν之 處理組百分比。於收集自安慰劑對照組及挑戰組小牛之睪 丸檢體中7檢體有6 (85.7%)檢測得BVDV核酸或抗原。相反 20地，於收集自以牛屏金疫苗接種之經過挑戰之小公牛的華 丸檢體並未(〇.〇%)檢測得任何BVDV㈣或抗原，差異顯箸 (PS0.05)。 28 1306404 表2-睪丸檢體之BVDV檢定分析結果摘要 組別 BVDV陽性數目 小牛頭數 VI PCR IHC BVDV 陽性 %小牛 陽性 安慰劑 7 5 6 4 6 85.7%a 牛屏金5 10 0 0 0 0 0.0% 2=病毒分離’ PCR=聚合酶連鎖反應，IHC=免疫組織化學 一攔内有不同小寫字母上標之百分比之差異顯著(ρ$〇〇5)。 Μ論輿討論 5 研究證實使用牛屏金5對公牛作免疫接種的安全性與 效果。使用最低免疫接種劑量之第iSBVDV及第2型BVDV δ周配的疫苗不僅不會造成睪丸的感染，反而可有效保護青 春期前期小公牛以第2型Β V D V嚴重挑戰後不會出現睪丸感 染。 10 使用牛屏金5於青春期前期公牛屬於母牛-小牛及乳牛 的BVD控制計畫中的重要一環。即時接種疫苗有助於保護 小公牛不會受到急性感染可能關聯一過性及持久性睪丸感 染’隨後由精液傳播BVDV給易感性母牛。此外，青春期前 期小公牛接種疫苗可預防急性青春期後期的BVDV感染，輔 15助維持精液的品質，急性BVDV感染後的最初60曰期間顯示 精液品質受影響(精蟲活動力降低，以及形態異常）。9 雖然此處結果驗證以第2塑Β V D V挑戰後可成功地獲 得保護’但預期於使用第1型BVDV挑戰後也可觀察得類似 結果。 29 20 1306404 實施例2 對第1型BVDV挑戰之睪丸保護-¾综論 進行研究來評比牛屏金5用於預防面對嚴重第1型 BVDV挑戰時之睪丸感染之功效。本研究設計為一般隨機方 5 塊設計，具有單向處理結構。全部研究室工作人員皆未知 處理資訊。 45頭青春期附近之完好肉用小公牛分配至實驗研究。 小公牛為9月齡至15月齡。全部動物皆為BVD病毒第1型及 ® 第2型血清陰性，血清BVD病毒陰性，及血清反錄峰巢套聚 10 合酶連鎖反應(RT-nPCR)陰性。於第42日，安慰劑組(η=23) 及試驗組(η=22)之小牛之最小均方體重分別為625.7±30.94 磅及613.5±35.96磅。動物與安慰劑（牛屏ibr—pd-brsv)或 牛屏金5 (IBR-BVDV1-BVDV2-PI3-BRSV)接受疫苗接種。 使用含最低免疫接種劑量之調配物接種後28日，全部 15 接種小牛及安慰劑對照組小牛皆經鼻内接受奥本大學分離 的非細胞病原性1 a型BVDV病毒種系SD-1挑戰。鼻内挑戰 ® 之進行方式係套塑膠袋在鼻孔上讓小公牛過渡換氣3〇秒， 然後滴入5毫升病毒生長於MEM，該MEM含有鷹式鹽且補 - 充10% (v/v)馬血清碳酸氫鈉(0.75毫克/毫升）、L麩胺(〇 29 • 20 毫克/毫升）及抗生素（100單位青黴素G，100微克鏈黴素及 0.25微克親兩性素(amphotericin) B/毫升）。藉病毒分離及 RT-nPCR測得馬血清不含BVD病毒。 BVDV睪丸感染之評比係於第42日及93日進行。基本 研究設計摘述於下表3。 30 25 1306404 表3 ·研究設計 BVDV第1型挑戰後之睪丸保護 肌肉接種疫苗 鼻内挑戰* 處理組 小公牛頭數 a 劑量 曰 劑量 取樣曰 安慰劑 對照組 23 0 2毫升 28 5毫升 42, 93 牛屏金5 22 0 2毫升 28 _ 5毫升 42, 93 挑戰後，得自兩組動物的血清試驗是否存在有病毒。 因试驗係藉血清分離病毒來進行，安慰劑組的18頭小牛於 5第34日皆為病毒血症。18頭中的9頭於第35日也有病毒血 症。牛屏金5組的5頭小牛只有在第34日為病毒血症。任何 研九日由任一處理組小牛皆未發現病毒分離試驗呈陽性結 果。 RT-nPCRs式驗也用來測定小牛是否患有病毒血症。安 10慰劑組於第34、％、36及37曰分別有3、9、12及6頭小牛有 陽性結果。而對牛屏金5組，於第34、35、36及37日分別有 1、1、2及1頭小牛呈陽性結果。任何其他研究日任—處理 組的小牛皆未見其他血清RT_n_PCR試驗呈陽性反應。 對兩組測最小均方肛溫。只有第36日的平均（安慰劑組 15為104.0卞及牛屏金5組為102.9T)有顯著差異(pg〇.〇5)。 睪丸保護結果 弟93日進行睪丸活體剖檢樣本之試驗結果顯示於表 4。安慰劑組之23頭小牛中有6頭（26.1%)取得之樣本於 RT-nPCRT#式驗呈陽性，而牛屏金5組全部22頭小牛的樣本 20皆為陰性。安慰劑組及牛屏金5組之活體剖檢樣本之病毒分 31 1306404 離皆呈陰性結果。安慰劑組的23頭小牛中的5頭（21.7%)以 及牛屏金5組的22頭小牛中的〇頭之活體剖檢樣本於mc試 驗時呈陽性反應。 二處理組之小牛精液樣本於第42日進行BVD病毒之 5 RT_nPCT^驗呈陰性結果（表4)。於第93日，安慰劑組的23 頭小牛中的10頭(43.5%)之RT_nPCR試驗呈陽性，但牛屏金5 組的全部22頭小牛皆呈陰性。於第42日或第％日由任一處 理組的精液樣本皆未分離得任何病毒(表4)。 安慰劑組的23頭小牛中有丨0頭對至少一項試驗呈陽性結 10果。此10頭小牛中的4頭只對一項試驗呈陽性（第93日的精 液RT-nPCR)。只有一頭小牛兩項試驗呈陽性（睪丸活體剖檢 RT-nPCR及第93日之精液RT-nPCR)。有3頭小牛對三項試驗 呈陽性結果（睪丸活體剖檢RT_nPCR、第93曰之精液 RT-nPCR及活體剖檢IHC)。 表4 -睪丸檢體及精液樣本之bvdv檢定分析結果摘要 組別 小牛 頭數 η BVDV Η生數目t BVDV 陽性數目$ BVDV 陽性數目* BVDV 陽性 %小牛 陽性 VI PCR me VI PCR VI PCR 安慰劑 23 0 6 5 0 0 0 10 10 43.5%a 牛屏金5 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0% 病毒分離’ PCR=聚合酶連鎖反應，mo免疫組織化學 31 —攔内有不同小寫字母上標之百分比之差異顯著(PS〇〇〇〇2)。 ^93日之睪丸活體剖檢樣本 了第42曰之精液樣本 *第93日之精液樣本 32 1306404 對各頭動物，測定任何時間點的精液或睪丸活體剖檢 是否存在有BVD病毒，以處理組摘述，使用如實施例1所述 之費雪確切試驗分析。 結論 5 本研究中，小公牛接種牛屏金5疫苗可預防睪丸持續性 感染BVD病毒第1型，以及預防隨後排出病毒於精液。藉雙 尾費雪確切試驗證實至少一項陽性試驗反應之安慰劑組與 接受疫苗接種組動物間的對比為顯著(P=〇.〇〇〇2)。 B 前文引用之全部專利案、專利申請案及公開文獻全文 10 以引用方式併入此處至其不會不符合本文揭示的程度。 本發明之範圍不受所述特定具體例所限，引用的特定具體 例僅供單純舉例說明本發明之各方面之用。功能相當之組 成物及方法係屬於本發明之範圍。確實除了此處所示及所 述之外，本發明之各項修改對熟諳技藝人士由前文說明顯 15 然易明。此等修改意圖落入隨附之申請專利範圍。 L圖式簡單說明3 ® 第1圖一第2型BVDV挑戰後睪丸活體剖檢檢體之 BVDV陽性百分比。圖說：VI=病毒分離，PCR=聚合酶連 - 鎖反應，IHC=免疫組織化學a’b—欄内有不同小寫字母上標 . 20 之百分比之差異顯著（PS0.05)。 【主要元件符號說明】 (無） 33

Claims (1)

1306404 · ιι Π >v 十、申請專利範圍：........J L」 第94108014號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：97年11月 1. -種疫苗之用途’該疫苗係包含—或多種選自於由去活 5 化第1型BVDV、去活化第2型BVDV、改性活第2型 BVDV、及改性活第_彻組成之群組的抗原，該疫 苗係用於製造-種於-有較高BVDV畢丸感染風險之易 感性雄性動物預防睪丸BVDV感染用藥。 2_如申凊專利範圍第1項之用途，其中該動物係選自由公 10 牛、公羊及公豬組成之群組。 3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該動物為公牛。 4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該疫苗包含改性活 第1型BVDV及改性活第2型BVDV。 5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中至少一種改性活 15 BVDV係衍生自細胞病原性病毒。 6. 如申請專利範圍第4項之用途，其中至少一種改性活 BVDV係衍生自非細胞病原性病毒。 7. 如申請專利範圍第4項之用途，其中二種改性活BVDV 係衍生自細胞病原性病毒。 20 8.如申請專利範圍第1-7項中任一項之用途，其中該疫苗 包含至少一種額外抗原選自由牛疱疹病毒(BHV-1);副 流行性感冒病毒第3型（PIV3);牛呼吸道融合病毒 (BRSV);犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷 寒釣端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈 34 1306404 鉤端螺旋體（Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno)、 出血性黃疸鉤端螺旋體 （Leptospira icterohaemmorrhagia)、問號开j巴姆那鉤端螺旋體 (Leptospira interrogans pomona) ' 伯格彼德西奈鉤端螺 5 旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯 拉瓦鉤端螺旋體(Leptospira Bratislava)、胚胎彎曲桿菌 (Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌（Mannheimia (Pasteurella) haemolytica)、出血敗止性巴氏桿菌 (Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌（Mycobacterium 0 bovis)及迪斯伯分枝桿菌（Mycobacterium dispar)組成之 群組。 9·如申請專利範圍第8項之用途，其中該額外抗原包含牛 癌疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、及 牛呼吸道融合病毒(BRSV)。 35