RU2335298C2

RU2335298C2 - Способ вакцинации против инфекции семенников bvdv

Info

Publication number: RU2335298C2
Application number: RU2006133328/13A
Authority: RU
Inventors: Майкл Аарон ЭЛЛСВОРТ (US); Майкл Аарон Эллсворт; Кассиус МакАллистер ТАКЕР (US); Кассиус Макаллистер Такер; Морис Дэниэл ГИВЕНС (US); Морис Дэниэл ГИВЕНС
Original assignee: Фармация Энд Апджон Компани Ллс
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2008-10-10
Also published as: AU2005224179B2; PT1727562E; ZA200607132B; EP1727562A1; EP1727562B1; WO2005089793A1; DK1727562T3; UA86405C2; CA2560532A1; JP4105220B2; KR20080036160A; TWI306404B; RU2006133328A; PL1727562T3; BRPI0508941A; AR048671A1; CN1929859A; AU2005224179A1; DE602005007584D1; US20080260778A1

Abstract

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Способ предусматривает введение животному вакцины, выбранной из группы, состоящей (а) из модифицированной живой вакцины BVDV типа 1, (b) из модифицированной живой вакцины BVDV типа 2 и (с) одновременно из модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2. Изобретение эффективно для профилактики или снижения инфекции семенников, вызванной инфекцией BVDV типа 1 и 2. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и животноводстве. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.

Description

Область изобретения

Способы по настоящему изобретению относятся к способам профилактики инфекции семенников вирусом бычьей вирусной диареи путем иммунизации восприимчивых самцов животных против инфекции.

Описание предшествующего уровня техники

Вирус бычьей вирусной диареи (BVDV) представляет собой экономически значимый патоген крупного рогатого скота и других восприимчивых животных, который может выделяться с семенем хронически и остро инфицированных быков и самцов других восприимчивых животных. Этот патоген вызывает у восприимчивых животных заболевания желудочно-кишечного тракта, респираторной и репродуктивной систем.

Хотя желудочно-кишечные и респираторные заболевания, вызванные высокопатогенными штаммами BVDV более значимы с клинической точки зрения, тем не менее репродуктивные потери вследствие BVDV могут быть экономически гораздо более значимыми с экономической точки зрения. В литературных источниках, описывающих передачу BVDV, указано, что вирус в семени быков может инфицировать восприимчивых, осемененных коров, вызывая снижение частоты беременности, раннюю гибель зародыша, выкидыши и рождение телят, хронически инфицированных BVDV.^1-3

Хронически инфицированные быки наиболее часто инфицируют восприимчивых, осемененных коров, так как их семя содержит высокую концентрацию вируса (10^7,6 инфицирующих доз клеточной культуры (50%)/мл) (CCID₅₀/мл).³ При сравнении инфицированные семенники остро инфицированных иммунокомпетентных быков выделяли более низкие концентрации вируса (5-75 CCID₅₀/мл) в семени, но они также способны передавать BVDV.⁴ В одном из исследований сообщалось, что 25-50 CCID₅₀/мл вируса в семени инфицировали 5% осемененных нетелей, и последующая горизонтальная передача BVDV от инфицированных нетелей беременным коровам того же стада приводила к хронической инфекции их плодов.⁵

Две группы исследователей сообщили, что острая инфекция быков после полового созревания может вызвать хроническую инфекцию BVDV, которая локализуется в семенниках.^6,7 Один необычный случай возник у серопозитивного, не имеющего виремии быка, которого держали на станции искусственного осеменения в Новой Зеландии. Быка доставили в центр искусственного осеменения после безрезультатных попыток выделения BVDV из крови. Несмотря на присутствие нейтрализующих антител к BVDV бык постоянно выделял низкие уровни вируса в семя (2х10³CCID₅₀/мл) в течение 11 месяцев, после чего животное забили. Источник острой инфекции был неизвестен. При вскрытии вирус был выделен только из семенников быка.⁶ Вирус в семени этого быка привел к инфекции и последующей сероконверсии 1 из 3 осемененных серонегативных нетелей.⁸ При второй искусственно вызванной инфекции BVDV был выявлен с помощью обратной "гнездовой" полимерной цепной реакции (RT-nPCR) в семени 2 из 3 не имеющих виремии быков после полового созревания в течение периода до 7 мес, но вирус нельзя было выделить стандартными способами тканевой культуры. Семя, собранное через 5 мес после первоначального контакта и введенное внутривенно, вызвало инфекцию BVDV у одного серонегативного теленка. Семя, взятое в день контакта и через 7 мес после контакта, не вызвало инфекцию еще у двух других серонегативных телят.⁷

В двух исследованиях было отмечено, что быки с острой инфекцией могут выделять BVDV в семя с приемлемой концентрацией, подвижностью и морфологией сперматозоидов.^4,5

В другом исследовании было обнаружено снижение подвижности, увеличение венечных дефектов, маленькие головки сперматозоидов и проксимальные капли (было обнаружено у быков с острой инфекцией).⁹

Независимо от неизвестности в отношении деталей передачи при естественном размножении и воздействия на фертильность быков понятно, что инфецирование семенников BVDV у восприимчивых самцов животных является значимой экономической потерей ввиду репродуктивных потерь вследствие передачи BVDV коровам.

Вирусные инфекции семенников представляют серьезную проблему для лечения или профилактики посредством иммунизации, так как известно, что семенники являются иммунологически изолированными. К удивлению, авторы изобретения показали, что иммунизация является эффективным способом борьбы с инфекций семенников BVDV среди восприимчивых животных.

Ссылки

1. Meyling A., Jensen A.M. Transmission of bovine virus diarrhea virus (BVDV) by artificial insemination (AI) with semen from a persistently-infected bull. Veterinary Microbiology 1988;17:97-105.

2. Kirkland P.D., Mackintosh S.G., Moyle A. The outcome of widespread use of semen from a bull persistently infected with pestivirus. Veterinary Record 1994;135:527-529.

3. McGowan M.R., Kirkland P.D. Early reproductive loss due to bovine pestivirus infection. British Veterinary Journal 1995;151:263-270.

4. Kirkland P.D., Richards S.G., Rothwell J.T., et al. Replication of bovine viral diarrhea virus in the bovine reproductive tract and excretion of virus in semen during acute and chronic infections. Veterinary Record 1991;128:587-590.

5. Kirkland P.D., McGowan M.R., Mackintosh S.G., et al. Insemination of cattle with semen from a bull transiently infected with pestivirus. Veterinary Record 1997;140:124-127.

6. Voges H., Horner G.W., Rowe S., et al. Persistent bovine pestivirus infection localized in the testes of an immuno-competent, non-viraemic bull. Veterinary Microbiology 1998;61:165-175.

7. Givens M.D., Heath A.M., Brock K.V., et al. Detection of bovine viral diarrhea virus in semen obtained from inoculation of seronegative postpubertal bulls. AJVR 2003;64:428-434.

8. Niskanen R., Alenius S., Belak K., et al. Insemination of susceptible heifers with semen from a nonviraemic bull with persistent bovine virus diarrhea virus infection localized in the testes. Reproduction in Domestic Animals 2002;37:171-175.

9. Paton D.J., Goodey R., Brockman S., et al. Evaluation of the quality and virological status of semen from bulls acutely infected with BVDV. Veterinary Record 1989;124:63-64.

10. Study Number 393T-60-03-311, Animal Health Veterinary Medicine Research and Development, Medwest Veterinary Services, Inc., 1443 Highway 77, Oakland, Nebraska.

11. Study Number 3131R-60-02-258, Animal Health Veterinary Medicine Research and Development, Medwest Veterinary Services, Inc., 1443 Highway 77, Oakland, Nebraska.

Краткое описание чертежей

На чертеже показан процент образцов биопсии ткани семенников, положительных в отношении BVDV после антигенной стимуляции BVDV типа 2. Надписи: VI = выделение вируса, PCR = полимеразная цепная реакция, IHC = иммуногистохимия, a,b - различия процентных долей с различными подстрочными буквами являются статистически значимыми (P).

Сущность изобретения

Изобретение относится к способу профилактики или лечения инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного, предусматривающему введение животному эффективного количества вакцины, выбранной из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2.

Изобретение также относится к вакцине, выбранной из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, для использования в качестве лекарственного средства для профилактики инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного.

Изобретение, кроме того, относится к применению вакцины, выбранной из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, для получения лекарственного средства для профилактики инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного.

Изобретение также относится к способу профилактики инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного, предусматривающему идентификацию животного с повышенным риском инфекции семенников BVDV и введение животному эффективного количества вакцины, выбранной из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2.

Изобретение также относится к вакцине, выбранной из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, для применения в качестве лекарственного средства для профилактики инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного с повышенным риском инфекции семенников BVDV.

Изобретение, кроме того, относится к применению вакцины, выбранной из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, для получения лекарственного средства для профилактики инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного с повышенным риском инфекции семенников BVDV.

Изобретение также относится к изделию, содержащему сосуд или сосуды, включающие вакцину BVDV, выбранную из группы, состоящей из инактивированной вакцины BVDV типа 1, инактивированной вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, и инструкцию по применению вакцины BVDV для профилактики инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного.

Восприимчивые самцы животных могут включать быков, баранов и хряков. В предпочтительном варианте осуществления животным является бык.

Вакцины и изделия могут включать одновременно как модифицированную живую вакцину BVDV типа 1, так и модифицированную живую вакцину BVDV типа 2.

Вакцины могут быть получены из цитопатогенного и нецитопатогенного вируса.

Необязательно, вакцины и изделия по изобретению могут включать по меньшей мере один дополнительный антиген, выбранный из группы, состоящей из бычьего вируса герпеса (BHV-1); вируса парагриппа типа 3 (PIV3); бычьего респираторного синцитиального вируса (BRSV); Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis и Mycobacterium dispar.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины и изделия по изобретению могут включать по меньшей мере один дополнительный антиген, выбранный из группы, состоящей из бычьего вируса герпеса (BHV-1); вируса парагриппа типа 3 (PIV3) и бычьего респираторного синцитиального вируса (BRSV).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу лечения или профилактики инфекции семенников вирусами BVDV у восприимчивого самца животного. Способ по настоящему изобретению эффективен для профилактики или снижения инфекции семенников, вызванной инфекцией, BVDV типа 1 и 2.

Определения и сокращения

"Вирус бычьей вирусной диареи" ("BVDV") представляет собой мелкий, однонитевой РНК вирус (с положительным геномом) семейства Flaviviridae и рода Pestivirus. Были описаны два биотипа BVDV, цитопатический (СР) и нецитопатический (NC), на основании присутствия или отсутствия видимого цитопатического эффекта in vitro при инфицировании монослоев восприимчивых клеток. В большинстве случаев нецитопатический биотип выделен при вспышках заболевания в поле. На основании значительных различий вирусной РНК штаммы вируса бычьей вирусной диареи можно также разделить на 2 отдельных вида (т.е. генотипа), тип 1 и тип 2.

Термин "восприимчивое животное" означает любое животное, которое восприимчиво к инфекциям BVDV, например крупный рогатый скот, овцы и свиньи.

Термин "восприимчивый самец животного" означает любого самца животного, который восприимчив к инфекциям BVDV семенников, например самец крупного рогатого скота, овец и свиней. Некастрированные самцы крупного скота называются "быками". Некастрированные самцы овец называются "баранами". Некастрированные самцы свиней называются "хряками".

Термин "предотвращение" или "контроль" в отношении инфекции семенников означает снижение или устранение риска инфекции семенников восприимчивого самца животного вирулентными типами 1 и 2 BVDV; ослабление или уменьшение симптомов инфекции или ускорение выздоровления после инфекции. Вакцинация считается терапевтической, если наблюдается снижение вирусной или бактериальной нагрузки, по данным биопсии семенников или о присутствии вируса в семени.

Термин "инфекция" может означать острую или хроническую инфекцию BVDV.

"Острая" или "транзиторная" инфекция BVDV возникает при контакте иммунокомпетентного восприимчивого животного с цитопатическим или нецитопатическим штаммом BVDV. Хотя чаще всего встречается субклиническая инфекция, тем не менее могут наблюдаться такие симптомы как депрессия, отсутствие аппетита, эрозии слизистой и изъязвления ротовой полости, диарея и смерть. Иммунокомпетентное животное с острой инфекцией может передать вирус восприимчивому животному, но гораздо менее эффективно, чем хронически инфицированные животные.

Острая инфекция семенников относится к острой или транзиторной инфекции семенников восприимчивого самца животного, возникшей в результате транзиторной системной инфекции. В некоторых сообщениях указывается на то, что бык с острой инфекцией может выделять вирус в семя, сохраняя приемлемую концентрацию, подвижность и морфологию сперматозоидов. Однако в других сообщениях авторы наблюдали снижение подвижности сперматозоидов и увеличение количества венечных дефектов, маленьких головок сперматозоидов и проксимальных капель, сопровождающих острую инфекцию.

Хроническая инфекция BVDV возникает при инфицировании восприимчивого животного нецитопатическим штаммом BVDV перед развитием иммунокомпетентности приблизительно на 125-й день беременности. У животных с хронической инфекцией развивается иммунотолерантность к штамму, которым они были инфицированы, и они действуют как резервуар патогена и обычно выделяют большие количества вируса с мочой, фекалиями, семенем, слюной, слезной жидкостью и носовой слизью в течение всей жизни.

Хроническая инфекция семенников относится к хронической инфекции семенников восприимчивого самца животного, вызванной острой или хронической системной инфекцией.

Вакцины, используемые в изобретении

Вакцина, используемая в настоящем изобретении, включает вирус BVDV типа 1 и/или 2 и приемлемый в ветеринарии носитель.

Обычно вирусные вакцины делят на 2 класса: живые вакцины, содержащие живые вирусы, которые были подвергнуты обработке или выращивались таким образом, чтобы сделать их менее патогенными (ослабленными), и вакцины, содержащие убитые (инактивированные) вирусные частицы. В контексте вируса BVDV, собственно вирус может быть цитопатическим или нецитопатическим. На основании значительных различий вирусной РНК штаммы вируса вирусной диареи можно также разделить на 2 отдельных вида (т.е. генотипа), тип 1 и тип 2. Таким образом, в принципе существуют восемь основных классов вакцины BVDV, но тем не менее большинство коммерческих вакцин основаны на цитопатогенных вирусах.

Среди вакцин BVDV, которые в настоящее время имеются в продаже, имеются вакцины, в которых вирус был подвергнут химической инактивации McClurkin, et al., Arch. Virol. 58:119 (1978); Fernelius, et al., Am. J. Vet. Res. 33:1421-1431 (1972); и Kolar, et al., Am. J. Vet. Res. 33:1415-1420 (1972). В случае этих вакцин для достижения первичной иммунизации обычно требуется введение множественных доз и достигаемый иммунитет имеет короткую продолжительность и не защищает от передачи эмбриону (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11:615-625 (1995)). Сообщалось, что у овец применима субъединичная вакцина, основанная на очищенном белке Е2 (Bruschke, et al., Vaccine 15:1940-1945 (1997). К сожалению, оказалось, что эта вакцина является единственной вакциной, защищающей эмбрион от инфекции, и эта защита ограничивается одним штаммом гомологичного вируса.

Кроме того, были получены вакцины модифицированного живого вируса (MLV), используя вирус BVD, который был ослаблен повторным пассажем в коровьих или свиных клетках (Coggins, et al., Cornell Vet. 51:539 (1961); и Phillips, et al., Am. J. Vet Res. 36:135 (1975)) или химически вызванными мутациями, которые придают вирусу температурно-чувствительный фенотип (Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 45:2498 (1984); и Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 47:557-561 (1986)). Однократная доза вакцины MLV оказалась достаточной для иммунизации, и длительность иммунитета у вакцинированного крупного рогатого скота может продолжаться в течение нескольких лет (Coria, et al., Can. J. Con. Med. 42:239 (1978)). Кроме того, сообщалось о перекрестной защите у телят, вакцинированных вакцинами типа MLV (Martin, et al., In Proceedings of the Conference Res. Workers' Anim. Dis., 75:183 (1994)). Однако соображения безопасности, например возможная эмбриональная передача вируса, вызывали большое беспокойство в отношении применения этих вакцин (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11:615-625 (1995)).

В предпочтительном варианте осуществления компонент BVDV типа 1 является модифицированным живым цитопатогенным (штамм cpBVD-1 NADL (National Animal Disease Center Министерство сельского хозяйства США, Эймс, Айова, ATCC VR-534)). В другом предпочтительном варианте осуществления компонент BVDV типа 2 является модифицированным живым цитопатогенным (cpBVD-2, штамм 53637, ATCC № РТА-4859). Как описано в одновременно поданной заявке на патент США № 60/490834, поданной 29.07.03, оба изолята содержат вставку в области NS2-3. Ослабленный вирус штамма cpBVDV-1 содержит вставку кодирующей последовательности 3' Bos taurus DnaJ1 тимидина в нуклеотидном положении 4993 (нумерация последовательности NADL), которая представляет собой третий нуклеотид кодона, кодирующего глициновый остаток в положении 1536 аминокислоты. Ослабленный cpBVDV-2 содержит вставку кодирующей последовательности 3' Bos taurus DnaJ1 в том же геномном сайте. В других предпочтительных вариантах осуществления модифицированные живые антигены являются высушенными, лиофилизированными или витрифицированными.

В одном из вариантов осуществления композиции вакцины по настоящему изобретению включают эффективное количество одного или нескольких описанных выше вирусов BVD, предпочтительно штамм cpBVD-1 NADL вируса (штамм cpBVD-1 NADL вируса - National Animal Disease Center Министерства Сельского Хозяйства США, Эймс, Айова ATCC VR-534), 53637 cpBVD-2 штамм (ATCC № РТА-4859), штамм С-13 IBRV вируса (Cutter Laboratories), штамм Reisinger вируса PIV3 (Univ. Nebraska), штамм 375 вируса BRSV (Veterinary Medical Research Institute, Эймс, Айова). Очищенные вакцины BVD можно использовать непосредственно в композиции вакцины или предпочтительно вирусы BVD могут быть подвергнуты дальнейшей модификации путем серийных пассажей in vitro. Обычно вакцина содержит от примерно 1х10² до примерно 1х10¹⁰ бляшкообразующих или TCID₅₀ единиц вируса вместе с приемлемым в ветеренарии носителем и, необязательно, вместе с адъювантом в объеме от 0,1 до 5 мл, предпочтительно примерно 2 мл. Точное количество вируса в композиции вакцины, эффективное для получения защитного эффекта, может быть определено ветеринарным врачом. Приемлемые в ветеренарии носители, подходящие для использования в композициях вакцин, могут представлять собой любые носители, описанные здесь ниже.

Обычно вакцина содержит от примерно 1х10² до примерно 1х10¹⁰ бляшкообразующих или колониеобразующих единиц вируса с приемлемым в ветеренарии носителем и адъювантом в объеме от 0,1 до 5 мл, предпочтительно примерно 2 мл. Точное количество вируса в композиции вакцины, эффективное для получения защитного эффекта, может быть определено ветеринарным врачом. Приемлемые в ветеренарии носители, подходящие для использования в композициях вакцин, могут представлять собой носители, описанные здесь ниже. Обычным путем введения является внутримышечная или подкожная инъекция в объеме от примерно 0,1 до примерно 5 мл вакцины. Композиции вакцин по настоящему изобретению могут также включать дополнительные активные ингредиенты, такие как другие композиции вакцин против BVDV, например композиции вакцин, описанные в WO 95/12682, WO 99/55366, Патент США № 6060457, Патент США № 6015795, Патент США № 6001613 и Патент США № 5593873.

Вакцинацию можно осуществить одной прививкой или посредством множественных прививок. При желании, у привитых животных можно собрать сыворотку и исследовать на наличие антител к вирусу BVD. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиции вакцин используют для лечения инфекций семенников, вызванных BVDV. Соответственно настоящее изобретение относится к способам контроля или профилактики инфекций у животных, вызванных вирусами BVD типов 1 или 2 или сочетанием типа 1 и типа 2, путем введения животному эффективного количества вируса BVDV по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления композиции вакцин по настоящему изобретению эффективны для улучшения фертильности стада и для снижения риска инфекции семенников у восприимчивых самцов животных.

При осуществлении способов по настоящему изобретению композицию вакцин по настоящему изобретению вводят крупному рогатому скоту предпочтительно внутримышечным или подкожным путем, хотя также можно использовать другие пути введения, такие как, например, пероральный, интраназальный пути введения (например, аэрозолем или другим безыгольным способом введения), введение в лимфатический узел, внутрикожный, внутрибрюшинный, ректальный или вагинальный пути введения или сочетание этих путей. Предпочтительным является внутримышечное введение в область шеи животного. Могут потребоваться схемы повторной иммунизации, и можно подобрать схемы дозировки для обеспечения оптимальной иммунизации.

Под "иммуногенным" подразумевается способность вируса BVD вызвать иммунный ответ у животного против вирусов BVD типа 1 или типа 2 или против обоих вирусов BVD типа 1 и типа 2. Иммунный ответ может представлять собой клеточный иммунный ответ, опосредованный прежде всего цитотоксическими Т-клетками, или гуморальный иммунный ответ, опосредованный прежде всего хелперными Т-клетками, что, в свою очередь, активирует В-клетки, приводя к продукции антител.

В соответствии с настоящим изобретением вирусы предпочтительно аттенуируют серийными пассажами в клеточной культуре перед использованием в иммуногенной композиции. Способы модификации хорошо известны специалистам в данной области.

Композиции вакцин, используемые в способах по настоящему изобретению, могут также включать активные ингредиенты, такие как другие иммуногенные композиции против BVDV, например иммуногенные композиции против BVDV, описанные в одновременно поданной заявке № 08/107908, WO 95/12682, WO 99/55366, Патент США № 6060457, Патент США № 6015795, Патент США № 6001613 и Патент США № 5593873 08/107908.

Кроме того, объекты по настоящему изобретению можно осуществить введением других антигенов, а не BVDV типов 1 и/или 2 ("комбинированная вакцина"); такие антигены включают, но ими не ограничиваются, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira bratislava, Campylobacter fetus Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis и Mycobacterium dispar. В нескольких предпочтительных вариантах осуществления источником комбинированной вакцины является Bovi-Shield^® GOLD^TM IBR-BVD, Bovi-Shield^® GOLD^TM 3, Bovi-Shield^® GOLD^TM 5, Bovi-Shield^® GOLD^TM IBR-BVD-BRSV-LP, Bovi-Shield^® GOLD^TM FP 5 L5, Bovi-Shield^® GOLD^TM FP 5 VL5 или Preguard^®GOLD FP 10 (Pfizer, Inc.).

Кроме того, иммуногенные композиции и композиции вакцин, используемые в способах по настоящему изобретению, могут включать один или более приемлемых в ветеринарии носителей. Используемый здесь термин "приемлемый в ветеринарии носитель" включает любой и каждый растворитель, дисперсионную среду, покрытие, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, антибактериальное и противогрибковое средство, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание, и тому подобные. Разбавители могут включать воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы, наряду с другими, включают альбумин. Адъюванты включают, но ими не ограничиваются, наряду с многими другими, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), квасцы, гель гидроксида алюминия, холестерин, эмульсии "масло-в-воде", эмульсии "вода-в-масле", такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимеры (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), AMPHIGEN® адьювант, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) или другие фракции сапонина, монофосфорильный липид А, липид-аминовый адъювант Avridine, термолабильный энтеротоксин из E.coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин или мурамилдипептид. Композиция вакцины может, кроме того, включать один или более других иммуномодуляторных агентов, таких как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Композиции вакцин, используемые в способах по настоящему изобретению, могут также включать гентамицин и мертиолат. Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим от примерно 50 мг до примерно 2000 мг адъюванта, предпочтительно примерно от 500 мг до 2 мл дозы композиции вакцин. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям вакцин, включающим от примерно 1 мг/мл до примерно 60 мг/мл антибиотика, более предпочтительнее менее чем примерно 30 мг/мл антибиотика.

Композиции вакцин, используемые в способах по настоящему изобретению, могут быть получены в разнообразных формах в зависимости от пути введения. Например, композиции вакцин могут быть получены в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для инъекционного введения, или получены в лиофилизированных формах, используя методики лиофилизации. Лиофилизированные композиции вакцин обычно хранятся примерно при 4°С и могут быть растворены в стабилизирующем растворе, например солевом растворе или HEPES, вместе или без адъюванта.

Композиции вакцин по настоящему изобретению можно вводить животным для индукции иммунного ответа против вирусов BVD типа 1 или типа 2 или против обоих вирусов BVD типа 1 и типа 2. Соответственно еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам стимуляции иммунного ответа против вирусов BVD типа 1 или типа 2 или против сочетания вирусов BVD типа 1 и типа 2 путем введения животному эффективного количества описанной выше иммуногенной композиции по настоящему изобретению. Под термином "животное" понимают любое животное, которое восприимчиво к инфекциям BVDV, такое как бык, овца и свинья.

В соответствии со способами по настоящему изобретению предпочтительная иммуногенная композиция для введения животному включает штамм cpNADL вируса BVDV и/или штамм cp53637 вируса BVDV. Иммуногенная композиция, содержащая вирус BVDV, предпочтительно живой, модифицированный несколькими пассажами в культуре, вводится крупному рогатому скоту предпочтительно внутримышечным или подкожным путум, хотя также можно использовать другие пути введения такие как, например, пероральный, интраназальный пути введения, введение в лимфатический узел, внутрикожный, внутрибрюшинный, ректальный или вагинальный путь введения или сочетание этих путей введения.

Протоколы иммунизации могут быть оптимизированы, используя процедуры, хорошо известные в данной области. Животным можно вводить одиночную дозу или, альтернативно, можно проводить 2 или более прививок с интервалами 2-10 нед. В зависимости от возраста животного иммуногенную композицию или композицию вакцин можно вводить повторно. Например, настоящее изобретение предусматривает вакцинацию здорового крупного рогатого скота до возраста 6 мес и ревакцинацию в возрасте 6 мес. В еще одном примере настоящее изобретение предусматривает вакцинацию крупного рогатого скота перед случкой, примерно за 5 недель до случки (или перед введением в стадо) и, необязательно, снова примерно за 2 недели до случки или во время беременности для защиты эмбриона против инфекции, вызванной BVDV типов 1 и 2. Однократные дозы композиций по настоящему изобретению можно также вводить примерно через 3-4 недели после первой дозы. Предусмотрена также ревакцинация 1 раз в полгода одной дозой комбинированной вакцины для профилактики инфекции эмбриона вирусом BVDV.

Степень и природа иммунных ответов, индуцируемых у крупного рогатого скота, можно оценить разнообразными методиками. Например, у привитых животных можно взять сыворотки и исследовать на наличие антител, специфичных для вирусов BVDV, например, обычным анализом нейтрализации вируса.

Термин "эффективное количество" относится к количеству комбинированной вакцины, достаточному для того, чтобы вызвать иммунный ответ у животного, которому оно введено. Иммунный ответ может включать, без ограничения, индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета. Количество вакцины, которое является терапевтически эффективным, может изменяться в зависимости от конкретного используемого вируса, состояния крупного рогатого скота и/или степени инфекции, и его может определить ветеринарный врач.

Инактивированные (частичные или цельноклеточные) и модифицированные живые вакцины

Инактивированные или модифицированные живые вакцины, используемые в способе по настоящему изобретению, могут быть получены, используя разнообразные способы, которые известны в данной области.

Например, изоляты BVDV могут быть получены непосредственно из маток инфицированных коров, используя известные методики.

Изоляты BVDV могут быть аттенуированы, используя разнообразие известных способов, включая, например, серийные пассажи. В дополнение к модифицированным живым вирусным изолятам продукт вакцин, используемый в способах по настоящему изобретению, может также включать подходящее количество одного или нескольких обычно используемых адъювантов. Подходящие адъюванты могут включать, но ими не ограничиваются, минеральные гели, например гидроксид алюминия; поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин; гликозиды, например производные сапонина, такие как Quil A или GPI-0100; плюроновые полиолы; полианионы; неионные блок-сополимеры, например Pluronic F-127 (B.A.S.F., USA); пептиды; минеральные масла, например Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, France), карбопол, Amphigen, Amphigen Mark II (Hydronics, USA), Alhydrogel, масляные эмульсии, например эмульсию минерального масла, такого как BayolF/Arlacel A и воду, или эмульсию растительного масла, воду и эмульгатор, такой как лецитин; квасцы; цитокины быков; холестерин и сочетания адъювантов. В предпочтительном варианте осуществления сапонин, содержащий эмульсию масла в воде, подвергается обычной микрофлюидизации.

Особенно предпочтительным источником вируса BVDV типа 1 и 2 для использования в способе по настоящему изобретению является линия вакцинных продуктов Bovi-Shield® GOLD^TM (PFIZER INC.), содержащая штамм NADL вируса BVDV (приобретенный в National Animal Disease Center (NADC), USDA, Эймс, Айова) и штамм 53637 вируса BVDV типа 2 (Univ. Guelph, Guelph, Ont.) (ATCC No. PTA-4859).

Предпочтительно штаммы NADL и 53637 представляют собой модифицированные живые штаммы. В соответствии с настоящим изобретением штаммы по настоящему изобретению могут быть дополнены коммерчески доступными адъювантами, предпочтительно Quil A-Cholesterol-Amphigen (Hydronics, USA). Предпочтительная доза иммуногенных композиций и композиций вакцин по настоящему изобретению составляет примерно 2,0 мл. В композиции, используемые в способах по настоящему изобретению, можно включить консерванты. Консерванты, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают гентамицин и мертиолат. Можно также добавить носитель, предпочтительно PBS. Получение модифицированных живых вакцин, такое как аттенуирование вирулентных штаммов пассажем в культуре, известно в данной области.

Модифицированные живые изоляты BVDV можно также сочетать со следующими бактериями и вирусами, включая, но ими не ограничиваясь, бычий вирус герпеса (BHV-1); бычий респираторный синцитиальный вирус (BRSV), вирус парагриппа (PIV3), Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis и Mycobacterium dispar.

Дозировка и способы введения

В соответствии с настоящим изобретением эффективное количество BVDV или комбинированной вакцины, введенное восприимчивым самцам животных, обеспечивает эффективный иммунитет против инфекции семенников, вызванной BVDV типа 2. В одном из вариантов осуществления вакцина вводится телятам двумя дозами с интервалом примерно 3-4 недели. Например, первое введение выполняется, когда возраст животного составляет от примерно 1 до примерно 3 мес. Второе введение выполняется примерно через 1-4 недели после первого введения комбинированной вакцины.

В другом предпочтительном варианте осуществления введение выполняется примерно за 4-5 недель перед выведением животного или перед доставкой в учреждение искусственного осеменения. Введение последующих доз вакцины предпочтительно осуществляется ежегодно. В другом предпочтительном варианте осуществления животных, вакцинированных до возраста примерно 6-месяцев, следует повторно вакцинировать после 6-месячного возраста. Введение последующих доз вакцины предпочтительно осуществляется ежегодно, хотя настоящим изобретением также предусматривается последующее введение доз вакцины 1 раз в 2 года и 1 раз в полгода.

Эффективное количество вакцины зависит от ингредиентов вакцины и схемы введения. Обычно, когда в вакцине используется препарат модифицированного живого BVDV, то количество вакцины, содержащей от примерно 10² до примерно 10¹⁰ TCID₅₀ единиц на дозу BVDV, предпочтительно от примерно 10⁴ до примерно 10⁷ TCID₅₀ единиц на дозу BVDV типов 1 и 2, эффективно для однократного введения восприимчивым самцам животных. Предпочтительно вакцина, которая обеспечивает эффективный иммунитет, содержит примерно 10⁴-10⁷ TCID₅₀ единиц/дозу BVDV типов 1 и 2, а предпочтительнее примерно 10⁵ TCID₅₀ единиц/дозу при однократном введении восприимчивым животным. Введение последующих доз вакцины предпочтительно проводят на ежегодной основе. Животных, вакцинированных до возраста примерно 6 мес, следует ревакцинировать в возрасте после 6 мес. Введение последующих доз вакцины предпочтительно проводят ежегодно.

В соответствии с настоящим изобретением при введении предпочтительного продукта Bovi-Shield® GOLD^TM (Pfizer Inc.) продукт вводят предпочтительно однократно в количестве от примерно 0,1 до примерно 5,0 мл, предпочтительно от примерно 1,5 мл до примерно 2,5 мл, предпочтительнее примерно 2 мл. Введение последующих доз вакцины предпочтительно проводят ежегодно. Животных, вакцинированных до возраста примерно 6 мес, следует ревакцинировать после 6-месячного возраста. Введение последующих доз вакцины предпочтительно проводят ежегодно.

В соответствии с настоящим изобретением введение может осуществляться известными путями, включая пероральный, интраназальный, местный, трансдермальный и парентеральный (например, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный или внутримышечный). Предпочтительным путем введения является внутримышечный или подкожный путь введения.

Настоящее изобретение также предусматривает однократную первичную дозу с последующей ежегодной ревакцинацией, которая исключает необходимость введения дополнительных доз телятам перед ежегодной ревакцинацией для создания и/или поддержания иммунитета против инфекции.

Вакцины, вводимые в соответствии с настоящим изобретением, могут включать дополнительные компоненты, такие как адъювант (например, минеральные гели, например гидроксид алюминия; поверхностно-активные вещества, такие как холестерин, лизолецитин; гликозиды, например производные сапонина, такие как Quil A, QS-21 или GPI-0100; плюроновые полиолы; полианионы; неионные блок-сополимеры, например Pluronic F-127; пептиды; минеральные масла, например Montanide ISA-50, карбопол, Amphigen®, Alhydrogel, масляные эмульсии, например эмульсию минерального масла, такого как BayolF/Arlacel A и воду, или эмульсию растительного масла, воду и эмульгатор, такой как лецитин; квасцы; цитокины быка и сочетания адъювантов).

В соответствии с настоящим изобретением введение эффективного количества вакцины, введенной восприимчивым самцам животных в возрасте приблизительно 3 мес, обеспечивает эффективный иммунитет против инфекции семенников.

В предпочтительном варианте осуществления вакцину вводят внутримышечно. В еще одном предпочтительном варианте осуществления вакцину вводят подкожно. Более того, предпочтительно, чтобы доза вакцины содержала от примерно 1 мл до примерно 7 мл, предпочтительно примерно 2 мл, причем чтобы каждый мл содержал от примерно 10² до примерно 10¹⁰ TCID₅₀ единиц на дозу вируса. Комбинированную вакцину желательно вводить животному дважды; один раз в возрасте от примерно 1 до примерно 3 мес и другой раз примерно через 3-5 нед. Настоящее изобретение также предусматривает ежегодную ревакцинацию однократной дозой.

Идентификация животных с повышенным риском инфекции BVDV

Изобретение, кроме того, относится к способу профилактики инфекции семенников BVDV, предусматривающему:

а) идентификацию животного с повышенным риском инфекции семенников BVDV; и

b) введение животному эффективного количества вакцины, выбранной из группы, состоящей из убитой вакцины BVDV типа 1, убитой вакцины BVDV типа 2, модифицированной живой вакцины BVDV типа 1, модифицированной живой вакцины BVDV типа 2.

Для идентификации животного с повышенным риском инфекции BVDV специалист узнает, что животное имеет повышенный риск инфекции, если инфекция BVDV появляется в ранее неинфицированном стаде или если восприимчивое животное контактирует с другим восприимчивым животным с инфекцией BVDV. BVDV передается от животного к животному фекально-оральным способом. Вирусная нагрузка, требуемая для возникновения симптомов инфекции, коррелирует с типом и штаммом вируса BVD, и это коррелируется со скоростью распространения в стаде. Инфицированных животных можно идентифицировать по симптомам заболевания. Общие проявления инфекции BVDV могут включать: массовые выкидыши, бесплодие, неравномерные половые циклы, случаи ранней гибели плода, высыхание плода в матке, подавление иммунитета, дизентерию, тромбоцитопению и гипоплазию мозга. Симптомы заболевания обычно предшествуют лейкопении, и усилия исследования до настоящего времени были сосредоточены на идентификации этого факта.

Серологически исследования показали, что высокая процентная доля крупного рогатого скота, инфицированного BVDV, в том числе та часть, которая считается хронически инфицированной (PI), остается клинически бессимптомной. Поэтому предпочтительным способом идентификации инфицированных животных является выявление присутствия самого вируса, а не отслеживание симптомов. Было разработано несколько различных способов тестирования для выявления вируса BVDV и/или для выявления животных, инфицированных BVDV. Эти способы тестирования включают: обратную "гнездовую" полимерную цепную реакцию, иммуноферментный анализ (ELISA), стандартные методики выделения вируса и иммуногистохимию (Haines et al., "Monoclonal Antibody-Based Immunohistochemical Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus in Formalin- Fixed, Paraffin-Embedded Tissues," Vet. Pathol., 29:27-32 (1992)).

Как и PCR, так и методики выделения вируса, благодаря присущей им чувствительности, способны выявить очень низкие уровни BVDV. Иммуногистохимия образцов ткани, таких как образцы биопсии, полученные выщипом на ухе, является эффективной методикой выявления животных с PI. Технология ELISA также эффективна, хотя она менее чувствительна и хорошо подходит как универсальный диагностический инструмент для выявления инфекции BVDV у животных, так как является недорогой, дает результаты в короткий промежуток времени и для ее проведения не требуются высококвалифицированные специалисты и высокоспециализированное лабораторное оборудование.

Способы ELISA для выявления инфекции BVDV описаны в литературе (см. патент США № 6174667 и WO 99/15900, Huchzermeier et al. и патентную заявку США 20030143573, сравнивались с другими способами "Comparison of an Antigen Capture Enzyme-Linked Assay with Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction и Cell Culture Immunoperoxidase Tests for the Diagnosis of Ruminant Pestivirus Infections," Vet. Microbiol., 43:75-84 (1995)).

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано, но ими не ограничено, следующими примерами.

Пример 1

Защита семенников: анализ исследования

Ряд вакцин Bovi-Shield® GOLD^TM 5, составленных и из BVDV типа 1, и из BVDV типа 2, был внедрен в скотоводческую промышленность в ноябре 2003 г. для оптимизации уровня защиты плодов, которую обеспечивает вакцинация против BVDV типа 2. Здесь представлены результаты предлицензионного исследования эффективности, оценивающего эффективность вакцинации Bovi-Shield® GOLD^TM 5 в период перед половым созреванием в профилактике инфекции семенников в условиях активной антигенной стимуляции с использованием BVDV типа 2 (¹⁰), в сравнении с плацебо (Bovi-Shield®-PI3-BRSV).

Проводили дополнительную оценку состояния всех бычков (n=17), включенных в исследование более широкой антигенной стимуляции с использованием BVDV типа 2, для определения эффективности вакцинации Bovi-Shield GOLD^TM 5® в профилактике инфекции семенников, вызванной BVDV. Все телята в первоначальном исследовании представляли собой 3-4-месячных, лишенных молозива телят (бычков и телочек). На 28-й день после вакцинации препаративной формой, содержащей минимальные иммунизирующие дозы (уровни минимальной иммунизирующей дозы устанавливаются перед лицензированием вакцины и отражают более низкий объем антигенного вируса, чем тот, который присутствует в конечном продукте. Определение минимальной иммунизирующей дозы помогает гарантировать то, что когда продукт будет использоваться на выпускаемых уровнях, он будет последовательно стимулировать адекватную защиту против заболевания) и BVDV типа 1, и BVDV типа 2, у всех вакцинированных и получавших плацебо контроль телят проводили интраназальную антигенную стимуляцию штаммом 24515 нецитопатического BVDV типа 2. Штамм 24515 был выделен в Канаде при тяжелой вспышке BVD, в результате которой погибло более 40% скота в пораженных стадах. После антигенной стимуляции у всех 10 контрольных телят развилось тяжелое заболевание, характеризуемое длительной виремией (9-14 дней), лихорадкой в диапазоне от 105,6F до 107,2F в течение 4-9 дней, дейкопенией (1-9 дней), тромбоцитопенией (<100000 на 1 мкл), развитием осложнений (в диапазоне 4-9 дней) и высокой смертностью (умерли 7 из 10 (70%) контрольных телят). Напротив, только у 1 вакцинированного теленка развилась виремия, у 6 лихорадка продолжалась в течение 1 или 2 дней, у 1 была лейкопения в течение 1 дня, ни у одного не было тромбоцитопении и ни один не умер. Всего 18 из 20 вакцинированных телят оставались здоровыми в течение исследования, и только у 2 телят в 1-й день проявлялась депрессия. Эти 2 наблюдения не были связаны с предшествующей или одновременной виремией, лихорадкой, лейкопенией или тромбоцитопенией.¹¹

Оценки инфекции семенников BVDV начинали приблизительно через 2 нед. после антигенной стимуляции. Как показано в табл. 1, образцы семенников брали при вскрытии у 2 плацебо контролей на 41-й день исследования, а образцы биопсии от каждого из оставшихся 5 контролей и 10 телят, вакцинированных Bovi-Shield® GOLD^TM 5, брали на 42-й день. Второй образец также получали у 7 телят, вакцинированных Bovi-Shield® GOLD^TM 5, которые еще были доступны, на 56-й день. Все образцы тестировали на BVDV, используя способы выделения в культуре ткани, амплификации нуклеиновой кислоты (RT-nPCR) и иммуногистохимического тестирования. У персонала, берущего и тестирующего образцы семенников, не было информации о включении животного в ту или иную группу лечения.

Таблица 1
Структура исследования: защита семенников после антигенной стимуляции с использованием BVDV типа 2
Группа лечения	Кол-во бычков	Внутримышечная вакцинация		Интраназальная антигенная стимуляция*		День взятия образцов ткани
		День	Доза	День	Доза
Плацебо контроли	7	0	2 мл	28	5 мл	41,42^†
Bovi-Shield® GOLD^TM 5	10	0	2 мл	28	5 мл	42,56^‡

* Изолят 24515 получили в Univeristy of Guelph, Guelph, Ontario, Canada.

^†У двух из 7 вакцинированных плацебо бычков образцы брали при вскрытии на 41-й день, а у остальных 5 бычков образцы брали на 42-й день.

^‡У всех 10 бычков образцы брали на 42-й день, а второй образец получали у 7 телят на 56-й день.

Выделение вируса и анализы PCR выполняли в лаборатории Auburn University Veterinary Pathobiology and Clinical Sciences Laboratory, а иммуногистохимический анализ - в University of Nebraska-Linclon Veterinary Diagnostic Center. Данные анализировал представитель Pfizer Animal Health, Veterinary Medicine and Research, Biometrics, Technology and Quality, с использованием категориальной процедуры (SAS/STAT Software Changes and Enhancements through Release 6.12, SAS Institute, Cary, NC, or SAS/STAT User's Guide Version 8 и SAS Procedures Guide Version 8). Точный критерий Фишера использовали для сравнения доли животных в каждой группе лечения, по меньшей мере, с одним положительным результатом теста на BVDV. При целесообразности рассчитывали описательные статистические показатели.

Результаты

В табл. 2 и на чертеже суммированы процентные доли выявления BVDV в образцах биопсии семенников в группах лечения. Нуклеиновая кислота или антиген BVDV были выявлены в 6 из 7 (85,7%) образцах семенников, взятых у вакцинированных плацебо и подвергнутых антигенной стимуляции бычков. Напротив, ни нуклеиновая кислота, ни антиген BVDV не были выявлены ни в одном из образцов ткани семенников (0,0%), взятых после антигенной стимуляции у бычков, вакцинированных Bovi-Shield® GOLD^TM, т.е. различие статистически значимо (P).

Таблица 2
Обобщение результатов анализа BVDV для образцов ткани семенников
Группа лечения	Кол-во бычков	Кол-во BVDV положительных			BVDV положи- тельные	% положитель- ных бычков
		VI	PCR	IHC
Плацебо контроли	7	5	6	4	6	85,7%^а
Bovi-Shield®	10	0	0	0	0	0,0%^b
GOLD^TM 5
Vl = выделение вируса, PCR = полимеразная цепьевая реакция, IHC = иммуногистохимия ^a,b - различие процентов в столбце с различными надстрочными обозначениями более мелкими буквами является статистически значимым (P)

Вывод и обсуждение

Результаты исследования демонстрируют и безопасность, и эффективность вакцинации бычков Bovi-Shield® GOLD^TM 5. Вакцина, составленная с минимальными уровнями иммунизирующей дозы BVDV типа 1 и 2, не только не вызывала инфекции семенников, но также эффективно защищала бычков в период перед половым созреванием против инфекции семенников после активной антигенной стимуляции BVDV типа 2.

Применение Bovi-Shield® GOLD^TM 5 у бычков в период перед половым созреванием может быть важным компонентом программ борьбы с BVD при работах с телками и молочными коровами. Своевременная вакцинация может помочь защитить бычков против острых инфекций, что было связано с преходящей и хронической инфекцией семенников и последующей передачей BVDV в семени восприимчивым коровам. Кроме того, вакцинация бычков в период перед половым созреванием для профилактики острой инфекции BVDV в период после полового созревания может помочь сохранению качества семени, но которая, как было показано, поражается (сниженная подвижность и морфологические аномалии) в течение первых 60 дней после острой инфекции BVDV.⁹

Хотя представленные здесь результаты демонстрируют успешную защиту против антигенной стимуляции BVDV типа 2, следовало бы ожидать, что аналогичные результаты наблюдались бы после антигенной стимуляции BVDV типа 1.

Пример 2

Защита семенников против антигенной стимуляции BVDV типа 1: анализ исследования

Исследование было предпринято для оценки эффективности Bovi-Shield® GOLD^TM 5 в профилактике инфекции семенников в условиях активной антигенной стимуляции с использованием BVDV типа 1. Организация исследования представляла собой генерализованную рандомизированную блоковую организацию с односторонней структурой лечения. Весь лабораторный персонал исследования не имел информации о лечении.

В исследование были включены 45 интактных бычков мясной породы в период перед половым созреванием. Возраст телят составлял от 9 до 15 мес. Все животные были серонегативными в отношении вируса BVD типа 1 и 2, отрицательными в отношении выделения вируса BVD в сыворотке и отрицательными по обратной транскрипции - полимеразной цепьевой реакции (RT-nPCR) по сыворотке. На 42-й день минимальные квадратические средние величины массы тела телят в группе плацебо (n-23) и в испытуемой группе (n=22) были соответственно 625,7±30,94 фунта и 613,5±35,96 фунта. Животных вакцинировали или плацебо (Bovi-Shield® IBR-PI3-BRSV), или Bovi-Shield® GOLD^TM 5 (IBR-BVDV1-BVDV2-PI3-BRSV).

Через 28 дней после вакцинации препаративной формой, содержащей минимальные иммунизирующие дозы, у всех вакцинированных телят и животных из группы контроля проводили интраназальную антигенную стимуляцию штаммом SD-1 нецитопатического вируса BVDV типа 1, выделенного в университете Auburn. Интраназальную антигенную стимуляцию выполняли гипервентиляцией бычков в течение 30 с посредством размещения пластикового мешка над ноздрями, и затем закапывая 5 мл вируса, выращенного в среде МЕМ с солями Earle, с добавлением 10% (об./об.) лошадиной сыворотки, бикарбоната натрия (0,75 мг/мл), L-глутамина (0,29 мг/мл) и антибиотиков (100 единиц пенициллина G, 100 мкг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерицина В/мл). Лошадиная сыворотка не содержала вирус BVD по данным выделения вируса и RT-nPCR.

Оценки семенниковой инфекции, вызванной BVDV, выполняли на 42-й и 93-й дни. Основная структура исследования представлена ниже в табл.3.

Таблица 3
Структура исследования: защита семенников после антигенной стимуляции с использованием BVDV типа 1
Группа лечения	Кол-во бычков	Внутримышечная вакцинация		Интраназальная антигенная стимуляция*		День взятия образцов ткани
		День	Доза	День	Доза
Плацебо контроли	23	0	2 мл	28	5 мл	42,93
Bovi-Shield® GOLD^TM 5	22	0	2 мл	28	5 мл	42,93

После антигенной стимуляции сыворотку животных в обеих группах тестировали для выявления присутствия вируса. По данным выделения вируса из сыворотки, у 18 телят в группе плацебо была виремия на 34-й день, у 9 из этих 18 виремия была также на 35-й день. У 5 телят в группе Bovi-Shield® GOLD^TM 5 виремия была только на 34-й день. Ни один из других тестов выделения вируса не был положительным у телят из любой группы лечения в любой день исследования.

Тесты RT-nPCR также использовали для определения наличия виремии у телят. В группе плацебо было 3, 9, 12 и 6 телят с положительными результатами соответственно на 34, 35, 36 и 37 дни. В группе Bovi-Shield® GOLD^TM 5 был 1, 1, 2 и 1 теленок с положительными результатами соответственно на 34, 35, 36 и 37 дни. Ни один другой из сывороточных тестов RT-nPCR не был положительным у телят из любой группы лечения в любой день исследования.

У обеих групп измеряли величины минимальной квадратической средней температуры. Различие средних величин было статистически значимым (P) только на 36-й день (104,0F для группы плацебо и 102,9F для группы Bovi-Shield® GOLD^TM 5).

Результаты защиты семенников

Результаты тестирования, проведенного на образцах биопсии ткани семенников на 93-й день, показаны в табл. 4. Образцы от 6 из 23 телят (26,1%) в группе плацебо были положительными при тестировании RT-nPCR, тогда как все образцы от 22 телят в группе Bovi-Shield® GOLD^TM 5 были отрицательными. Все образцы биопсии ткани и у группы плацебо, и у группы Bovi-Shield® GOLD^TM 5 были отрицательными в отношении выделения вируса. Образцы биопсии ткани от 5 из 23 телят (21,7%) в группе плацебо и у 0 из 22 телят в группе Bovi-Shield® GOLD^TM 5 были положительными при IHC тестировании.

Все образцы семени телят в обеих группах лечения были отрицательными при тестировании RT-nPCR для выявления вируса BVD на 42-й день (табл. 4). На 93-й день, 10 из 23 (43,5 %) телят в группе плацебо были положительными при тесте RT-nPCR, но все 22 теленка в группе Bovi-Shield® GOLD^TM 5 были отрицательными. Вирус не был выделен ни из одного образца семени у любой группы лечения на 42-й или 93-й день (табл. 4).

В группе плацебо 10 из 23 телят были положительными, по меньшей мере, по одному тесту. 4 из этих 10 телят были положительными только по одному тесту (RT-nPCR семени на 93-день). 1 теленок был положительным по двум тестам (RT-nPCR биопсии семенников и RT-nPCR семени на 93-й день). 5 телят были положительными по трем тестам (RT-nPCR биопсии семенников, RT-nPCR семени и IHC биопсии на 93-й день).

Таблица 4
Обобщение результатов анализа BVDV для образцов ткани семенников и образцов семени
Группа	Кол-во телят	Кол-во положите-льных по BVDV†			Кол-во положи-тельных по BVDV‡		Кол-во положи-тельных по BVDV*		Положительные по BVDV†	% положительных телят
		VI	PCR	IHC	VI	PCR	VI	PCR
Плацебо	23	0	6	5	0	0	0	10	10	43,5%^а
Bovi-Shield GOLD	22	0	0	0	0	0	0	0	0	0%^b
VI = выделение вируса, PCR = полимеразная цепьевая реакция, IHC = иммуногистохимия ^a,b - различие процентов в столбце с различными надстрочными обозначениями более мелкими буквами является статистически значимым (P) †Образцы биопсии ткани семенников на 93-й день ‡Образцы семени на 42-й день * Образцы семени на 93-й день

Для каждого животного определяли присутствие/отсутствие вируса BVD или в семени, или в биопсиях семенников в любую точку времени, суммировали по группе лечения и анализировали, используя точный критерий Фишера, как описано в примере 1.

Вывод

В настоящем исследовании вакцинация бычков Bovi-Shield® GOLD^TM 5 предотвращала хроническую инфекцию семенников вирусом BVD типа 1 и последующее выделение вируса в семени. Различие между животными, получавшими плацебо и вакцину, по меньшей мере, по одному положительному тесту, оцениваемое двухсторонним точным критерием Фишера, было статистически значимым (Р=0,0002).

Все приведенные выше патенты, патентные заявки и публикации полностью включены сюда в качестве ссылки в той степени, в которой они не противоречат представленному здесь описанию.

Настоящее изобретение не ограничивается в объеме определенными описанными вариантами осуществления, которые предназначены только для иллюстрации отдельных аспектов изобретения. Функционально эквивалентные композиции и способы находятся в пределах объема изобретения. Действительно, различные модификации изобретения, в дополнение к показанным и описанным здесь, станут очевидными специалистам в данной области из предшествующего описания. Такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.

Claims

1. Способ профилактики или контроля инфекции семенников, вызванной вирусом бычьей вирусной диареи (BVDV), у восприимчивого самца животного, включающий:

введение животному эффективного количества вакцины, содержащей эффективное количество антигена, выбранной из группы, состоящей (а) из модифицированной живой вакцины BVDV типа 1, (b) из модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, и (с) одновременно из модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что животное выбрано из группы, состоящей из быков, баранов и хряков.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что животное представляет собой быка.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что вакцина содержит как модифицированную живую вакцину BVDV типа 1, так и модифицированную живую вакцину BVDV типа 2.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что по меньшей мере одна модифицированная живая вакцина BVDV получена из цитопатического вируса.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что по меньшей мере одна модифицированная живая вакцина BVDV получена из нецитопатического вируса.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что обе модифицированные живые вакцины BVDV получены из цитопатического вируса.

8. Способ по пп.1-7, отличающийся тем, что вакцина включает по меньшей мере один дополнительный антиген, выбранный из группы, состоящей из бычьего вируса герпеса (BHV-1); вируса парагриппа типа 3 (PIV3); бычьего респираторного синцитиального вируса (BRSV); Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis, и Mycobacterium dispar.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанные дополнительные антигены включают бычий вирус герпеса (BHV-1); вирус парагриппа типа 3 (PIV3) и бычий респираторный синцитиальный вирус (BRSV).

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что животное имеет повышенный риск развития инфекции семенников, вызываемой BVDV.

11. Применение эффективного количества антигена, выбранного из группы, состоящей (а) из модифицированной живой вакцины BVDV типа 1, (b) из модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, и (с) одновременно из модифицированной живой вакцины BVDV типа 1 и модифицированной живой вакцины BVDV типа 2, для получения лекарственного средства для профилактики или контроля инфекции семенников BVDV у восприимчивого самца животного.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что животное выбрано из группы, состоящей из быков, баранов и хряков.

13. Применение по п.12, отличающееся тем, что животное представляет собой быка.

14. Применение по п.11, отличающееся тем, что вакцина содержит как модифицированную живую вакцину BVDV типа 1, так и модифицированную живую вакцину BVDV типа 2.

15. Применение по п.14, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная живая вакцина BVDV получена из цитопатического вируса.

16. Применение по п.14, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная живая вакцина BVDV получена из нецитопатического вируса.

17. Применение по п.14, отличающееся тем, что обе модифицированные живые вакцины BVDV получены из цитопатического вируса.

18. Применение по пп.11-17, отличающееся тем, что вакцина содержит, по меньшей мере, один дополнительный антиген, выбранный из группы, состоящей из бычьего вируса герпеса (BHV-1); вируса парагриппа типа 3 (PIV3); бычьего респираторного синцитиального вируса (BRSV); Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis, и Mycobacterium dispar.

19. Применение по п.18, отличающееся тем, что указанные дополнительные антигены включают бычий вирус герпеса (BHV-1); вирус парагриппа типа 3 (PIV3) и бычий респираторный синцитиальный вирус (BRSV).

20. Применение по п.11, отличающееся тем, что животное имеет повышенный риск возникновения инфекции семенников, вызываемой BVDV.