CN105017441B - 灵芝多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灵芝多糖的提取方法，包括以下步骤：1)将灵芝乙醇提取，取滤渣备用；2)将滤渣水提，收集滤液备用；3)将滤液浓缩浸膏，乙醇沉淀，离心得沉淀；4)将沉淀依次无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用蒸馏水溶解，过截留分子量为5万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；5)往滤液加入活性炭脱色，过滤，取滤液喷雾干燥，即为灵芝多糖。本发明的灵芝多糖纯度高，色泽洁白，且抗肿瘤活性强。

Description

灵芝多糖的提取方法
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及灵芝多糖的提取方法。
背景技术
灵芝多糖是灵芝的重要化学成分之一，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用，还可作为抗肿瘤和放射治疗的有效辅助治疗药物。然而，灵芝多糖由于提取工艺落后，得到的产品呈黄褐色，这是由于灵芝多糖中色素含量较多，影响了灵芝多糖的色泽，不仅如此，杂质含量过高的灵芝多糖的抗癌活性也较差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵芝多糖的提取方法，该方法得到的灵芝多糖纯度高，且抗癌活性好。
本发明提供的技术方案是灵芝多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)将灵芝破碎，用6～12倍重量80～95v％乙醇回流提取2～3次，每次回流2～3h，过滤，取滤渣备用；
2)将滤渣用6～12倍重量的水回流提取2～3次，每次提取2～3h，过滤，收集滤液备用；
3)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；
4)将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为5万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
5)往滤液加入活性炭脱色，过滤，取滤液喷雾干燥，即为灵芝多糖。
步骤3)中，往浸膏中加入90～95v％的乙醇至乙醇含量为80～85v％。
步骤5)中，活性炭的添加量为滤液重量的1～3％。
步骤4)中，洗涤后的沉淀溶于蒸馏水后，先过截留分子量为5万的中空纤维膜，这样活性分子量低于5万的多糖以及低聚糖、单糖和色素均随着透过液流出，收集的浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，大分子蛋白质以及分子量高于8万的多糖被截留，收集透过液。
本发明两次过中空纤维膜，不仅可以最大程度地去除杂质和色素，以保证成品纯度和色泽，且提取得到的灵芝多糖分子量在5万～8万之间，其抗肿瘤活性比其他区间范围内的多糖活性要高。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)将灵芝破碎，用6倍重量80v％乙醇回流提取2次，每次回流2h，过滤，取滤渣备用；
2)将滤渣用6倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
3)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，往浸膏中加入90v％的乙醇至乙醇含量为80v％沉淀，离心，得到沉淀；
4)将沉淀依次用2倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍蒸馏水溶解，过截留分子量为5万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
5)往滤液加入活性炭脱色，活性炭的添加量为滤液重量的1％，过滤，取滤液喷雾干燥，即为灵芝多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为92.3％，颜色为白色。
对照组
1)将灵芝破碎，用6倍重量80v％乙醇回流提取2次，每次回流2h，过滤，取滤渣备用；
2)将滤渣用6倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
3)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，往浸膏中加入90v％的乙醇至乙醇含量为80v％沉淀，离心，得到沉淀；
4)将沉淀依次用2倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍蒸馏水溶解，上D303型大孔树脂，用水洗脱至流出液无色透明，收集流出液，浓缩，喷雾干燥，即为灵芝多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为88.3％，颜色为浅黄色。
实施例2
1)将灵芝破碎，用12倍重量95v％乙醇回流提取3次，每次回流3h，过滤，取滤渣备用；
2)将滤渣用12倍重量的水回流提取3次，每次提取3h，过滤，收集滤液备用；
3)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，往浸膏中加入95v％的乙醇至乙醇含量为85v％沉淀，离心，得到沉淀；
4)将沉淀依次用4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为5万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
5)往滤液加入活性炭脱色，活性炭的添加量为滤液重量的3％，过滤，取滤液喷雾干燥，即为灵芝多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为91.8％，颜色为白色。
实施例3
1)将灵芝破碎，用10倍重量90v％乙醇回流提取2次，每次回流2h，过滤，取滤渣备用；
2)将滤渣用10倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
3)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.2的浸膏，往浸膏中加入95v％的乙醇至乙醇含量为85v％沉淀，离心，得到沉淀；
4)将沉淀依次用3倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用3倍蒸馏水溶解，过截留分子量为5万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
5)往滤液加入活性炭脱色，活性炭的添加量为滤液重量的2％，过滤，取滤液喷雾干燥，即为灵芝多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为92.0％，颜色为白色。
为验证本发明的灵芝多糖的抗癌活性，现进行以下动物实验。
1、抗Lewis肺癌活性实验
取清洁级C57BL/6小鼠30只，小鼠体重18～20g，随机分为3组，每组10只，分别为实验组，阴性对照组和阳性对照组。
取生长旺盛的小鼠Lewis肺癌肿瘤细胞以常规方法制成匀浆约1～2×107cfu/ml的癌细胞悬浮液，于每只小鼠的右腋皮下接种0.2ml癌细胞悬浮液，24h后，各组开始每日口服给药一次，实验组给药实施例1的灵芝多糖，阴性对照组给药生理盐水，阳性对照组给药对照例1的灵芝多糖，给药剂量见下表1，连续给药10天。停药后次日处死所有动物，截取足趾称重并计算肿瘤抑制率。肿瘤生长抑制率按下列公式计算，抑制率(％)＝(阴性对照组瘤重-实验组/阳性对照组瘤重)/阴性对照组瘤重×100。
表1
剂量(mg/kg) 动物增重(g) 瘤重(g) 抑制率(％)
阴性对照组 1ml 3.0 2.80±0.33
阳性对照组 2000 2.9 1.78±0.07 36.42*
实验组 2000 1.8 1.16±0.16 58.57**
注：与阴性对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
由上表可知，采用常规方法提取的灵芝多糖对小鼠Lewis肺癌的抑制率达36.42％，而本发明提取的灵芝多糖对小鼠Lewis肺癌的抑制率高达58.57％，明显优于常规灵芝多糖。
2、抗C-26结肠癌活性实验
取清洁级C57BL/6小鼠30只，小鼠体重18～20g，随机分为3组，每组10只，分别为实验组，阴性对照组和阳性对照组。
取生长旺盛的小鼠C-26结肠癌肿瘤细胞以常规方法制成匀浆约1～2×107cfu/ml的癌细胞悬浮液，于每只小鼠的右腋皮下接种0.2ml癌细胞悬浮液，24h后，各组开始每日口服给药一次，实验组给药实施例1的灵芝多糖，阴性对照组给药生理盐水，阳性对照组给药对照例1的灵芝多糖，给药剂量见下表2，连续给药10天。停药后次日处死所有动物，截取足趾称重并计算肿瘤抑制率。肿瘤生长抑制率按下列公式计算，抑制率(％)＝(阴性对照组瘤重-实验组/阳性对照组瘤重)/阴性对照组瘤重×100。
表2
剂量(mg/kg) 动物增重(g) 瘤重(g) 抑制率(％)
阴性对照组 1ml 3.8 2.99±0.26
阳性对照组 2000 3.8 2.11±0.23 29.43**
实验组 2000 1.9 1.22±0.06 59.19**
注：与阴性对照组相比，，*p＜0.05，**p＜0.01。
由上表可知，采用常规方法提取的灵芝多糖对小鼠C-26结肠癌的抑制率达29.43％，而本发明提取的灵芝多糖对小鼠Lewis肺癌的抑制率高达59.19％，明显优于常规灵芝多糖。

Claims (3)

1.灵芝多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将灵芝破碎，用6～12倍重量80～95v％乙醇回流提取2～3次，每次回流2～3h，过滤，取滤渣备用；
2)将滤渣用6～12倍重量的水回流提取2～3次，每次提取2～3h，过滤，收集滤液备用；
3)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；
4)将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为5万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为8万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
5)往滤液加入活性炭脱色，过滤，取滤液喷雾干燥，即为灵芝多糖。
2.根据权利要求1所述的灵芝多糖的提取方法，其特征在于：步骤3)中，往浸膏中加入90～95v％的乙醇至乙醇含量为80～85v％。
3.根据权利要求1所述的灵芝多糖的提取方法，其特征在于：步骤5)中，活性炭的添加量为滤液重量的1～3％。
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